Контраст соответствия моющего средства в малых угол нейтронного рассеяния экспериментов мембраной протеина структурного анализа и моделирования Ab Initio

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Этот протокол демонстрирует как получить модель с низким разрешением ab initio и структурные детали моющих средств солюбилизирован мембранный белок в растворе с использованием малых угол нейтронного рассеяния с контраст подбор моющего средства.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss, K. L., Pingali, S. V., Lieberman, R. L., Urban, V. S. Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling. J. Vis. Exp. (140), e57901, doi:10.3791/57901 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Биологических малого угол нейтронного рассеяния инструмент в высоких-Flux изотоп реактора из Oak Ridge национальной лаборатории предназначен для исследования биологических материалов, переработка биотоплива и био вдохновил материалы, охватывающие нанометр до Микрометр длина шкалы. Методы, представленные здесь для изучения физических свойств (например, размер и форма) мембранных белков (здесь, MmIAP, intramembrane аспартил протеазы от Methanoculleus marisnigri) в растворах формирования мицеллы являются моющих средств хорошо подходит для этого инструмента рассеяния нейтронов небольшой угол, среди других. Другие методы биофизические характеристики препятствуют их неспособность решить стиральный порошок взносы в сложной структуре белка-моющего средства. Кроме того доступ к био-Deuteration Lab предоставляет уникальные возможности для подготовки крупномасштабного культивирования и выражая дейтерия меченых белков для расширения рассеяние сигнала от белка. Хотя этот метод не предоставляет структурные детали в высоком разрешении, структурного разрыва для мембранных белков содержит много адресуемой области исследований не требуя вблизи атомных резолюции. Например эти области включают определение олигомерных государств, комплекс формирования, конформационные изменения во время возмущений и складные/разворачивающихся событий. Эти расследования может быть легко достигнуто путем применения этого метода.

Introduction

Мембранные белки кодируются с примерно 30% от всех генов1 и представляют собой значительное большинство целей для современных лекарственных препаратов. 2 эти белки выполняют множество жизненно важных клеточных функций,3 , но несмотря на обилие и важности — представляют только около 1% от общей структуры, депонируется в совместную исследований для протеина структурного биоинформатики (RCSB) Банк данных. 4 из-за их частично гидрофобная природа, структурные определения белков мембранных привязкой был чрезвычайно сложным. 5 , 6 , 7

Как многие биофизические методы требуют монодисперсных частиц в растворе для измерения, изолируя мембранных белков из родной мембраны и стабилизации этих белков в растворимые мнемосхемы родной мембран был активной областью исследований в последние годы десятилетия. 8 , 9 , 10 эти исследования привели к разработке многих Роман амфифильных сборок солюбилизировать последнего мембранных белков, таких как nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 и amphipols. 16 , 17 однако, использование моющего средства мицеллы остается одним из наиболее распространенных и простой подходов для удовлетворения требований растворимость данного белка. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 к сожалению, нет единого моющего средства или Волшебная смесь моющих средств в настоящее время существует удовлетворяющего всех мембранных белков; Таким образом эти условия должны проверяться эпирически для уникальных потребностей каждого белка. 26 , 27

Моющие средства самостоятельно собрать в растворе выше их концентрации мицеллообразования критической форме статистические структуры, называемые мицеллы. Мицеллы состоят из многих стиральный порошок мономеров (обычно начиная от 20-200) с гидрофобным алкил цепи, образуя ядром мицеллы и гидрофильные головы группы организованы в слое оболочки мицеллы, стоящих перед водного растворителя. Поведение моющих средств и формирования мицеллы классически был описан Чарльзом Tanford Гидрофобным эффектом,28 и размеров и формы мицелл из часто используемых моющих средств в мембранных белков исследования были характеризуется, с помощью малых угол рассеяния. 29 , 30 моющего средства Организации о мембранных белков также были изучены, и образование комплексов протеина-моющее средство (PDC) ожидается молекулами моющего средства, окружающих белка в договоренность, которая напоминает аккуратно моющего средства Мицеллы. 31

Один добавил, что преимущество использования моющих средств, что результирующая мицеллы свойств может быть манипулирован включения других моющих средств. Многие моющие средства экспонат идеальное смешивание, и выберите пункт Свойства смешанные мицеллы даже может быть предсказано от компонентов и соотношение смешивания. 22 однако, присутствие моющего средства может по-прежнему создают проблемы для биофизические характеристики, способствуя общий сигнал. Например с рентгеновской и рассеяние света методы, сигнал от моющих средств в PDC практически неотличима от белка. 32 с одной частицы крио электронной микроскопии (крио ЭМ) расследования обычно полагаются на ловушку частицы (замороженных); структурные детали белка по-прежнему скрываются определенного моющих средств или высокой концентрации моющего средства, который добавляет к фону. 33 альтернативные подходы к интерпретации полную структуру PDC (включая моющих средств) были сделаны через вычислительных методов, которые стремятся восстановить моющее вокруг данной мембранный белок. 34

В случае рассеяния нейтронов ядро оболочка расположение моющего средства в мицеллы производит форм-фактор, который способствует наблюдаемых рассеяния. К счастью компоненты решения могут быть изменены таким образом, что они не способствуют чистой наблюдаемых рассеяния. Этот процесс «контраст соответствия» достигается путем замены дейтерия для водорода для достижения рассеяния длина плотности, что соответствует фона (буфер). Разумный выбор моющего средства (с доступных транс коллегами) и их соотношение смешивания должны рассматриваться. Для моющего средства мицеллы эта замена могут выполняться с использованием моющих средств с той же головы группы, но имеющие транс алкильной цепи (d хвост вместо h хвост). Так как моющие средства перемешанных,35 их агрегатов будет иметь рассеяния длина плотности, что моль фракция взвешенный средний из двух компонентов (h хвосты и d хвосты). Когда этот контраст средней согласуется с этим глава группы, чтобы удалить все взносы в наблюдаемых рассеяния единообразные статистические структуры могут совпасть полностью.

Мы представляем здесь протокол манипулировать нейтронов контраст стиральный порошок мицелл, включив химически идентичны стиральный порошок молекул дейтерия меченых алкильной цепи. 19 , 36 , 37 это позволяет полный Одновременный контраст соответствия мицеллы ядро и оболочка, которая является уникальной возможностью рассеяния нейтронов. 35 , 38 с этим значительно изысканный уровнем детализации, контраст соответствия можно включить иначе неосуществимым исследования мембранных белков структур. Кроме того этот контраст соответствующий подход может быть распространен на другие системы, связанные с моющим средством, например полимер обмен реакции39 и нефть вода диспергентов,40 или даже другие solubilizing агентов, таких как bicelles,41 nanodiscs,42 или блок сополимеры. Аналогичный подход 43 A как указано в этой рукописи, но применение одного вида моющего средства с частичным дейтерия замен на алкильной цепи и/или руководитель группы, был недавно опубликован. 37 в то время как это можно ожидать улучшения случайное распределение водорода и дейтерия во всем моющего средства по сравнению с подходом, представленные здесь, ограниченное количество доступных позиций на моющее средство для замещения и двухступенчатый стиральный порошок синтеза требуются создает дополнительные проблемы для рассмотрения.

Шаги 1 и 2 протокола подробно ниже часто перекрываются, так как начальный эксперимент планирование должно быть сделано представить предложение качества. Однако, считается представления предложений здесь как первый шаг, чтобы подчеркнуть, что этот процесс должен быть запущен задолго до начала эксперимента нейтронов. Следует также отметить, что необходимого шага, который должно быть подкреплено предложение, должен иметь биохимические и физические характеристики (в том числе чистоту и стабильности) образца, поддерживая необходимость нейтронных исследований. Общее обсуждение малых угол нейтронного рассеяния (SANS) выходит за рамки этой статьи. Краткий, но тщательное введение доступен в работе ссылка, которую Характеризация материалов Кауфман,44 и всеобъемлющий учебник сосредоточена на биологических малых угол решение рассеяния недавно был опубликован. 45 далее рекомендовал чтение приводится в разделе обсуждения. Малоуглового рассеяния использует так называемые рассеяния вектора Q в качестве центральной количество, которое описывает процесс рассеяния. Эта статья использует широко признанного определения Q = 4π sin (θ) / λ, где θ — половина угол между входящей и рассеянного пучка и λ является длина волны нейтронного излучения в ангстремы. Существуют другие определения, что использовать различные символы, такие как ' вектор рассеяния и что могут отличаться 2π фактор или с помощью нанометров вместо Ангстрем (см. также обсуждение рис. 10).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. подготовить и представить нейтрона фонда луч время и предложение инструмент

  1. Обратитесь к онлайн-ресурсы для выявления помещений рассеяния нейтронов, которые обеспечивают общего пользователя нейтрона луч время доступа, например Oak Ridge национальной лаборатории (ORNL). Карта нейтрона объектов и сведений о нейтронных исследований во всем мире доступна онлайн. 46 осознавать, что эти учреждения, как правило, имеют регулярные звонки предложений; Это определяет, когда в следующий раз луч будет доступен. Нейтроны используются для разнообразных приложений; Поиск для малого угол нейтронного рассеяния (SANS) инструментов, особенно те, с возможностями для биологических образцов.
  2. Используйте ресурсы, предоставляемые услуги нейтронов, чтобы помочь навигации нейтронов луч время предложение представление процесса. Проконсультироваться с ученый нейтронного рассеяния (NSS), связанный с данным документом, для которого будет применяться. Обзор нейтронов объекта текущей информации о предложение звонки, сроки и советы для представления; для Оук-Ридж это доступно онлайн. 47 представить луч время предложение после всех руководящих принципов для успешного представления.
  3. Если транс белка требуется (см. 2.2), зал рассеяния нейтронов часто поддерживаются лаборатории и опыта, посвященный производству транс материалов. Чтобы запросить доступ к био-Deuteration Lab (BDL) на ORNL, выберите BDL как второй инструмент в системе предложение. В то время как предложение SANS рассматривается целесообразность и научного комитета по рассмотрению, BDL запросы только анализируются на предмет целесообразности. Чтобы помочь с BDL обзор целесообразности, представить полную информацию запроса формы48 , описывающий протокол выражения протеина и оценкам урожайности (доступно онлайн).
  4. После успешного рецензирования предложения время луча подтверждают награжден дату пучка до начала эксперимента. Убедитесь, что в предложении для надлежащего рассмотрения правильно перечислены все образца и буфер данные и формулы. Любые изменения в предлагаемый экспериментальный план, включая изменения в составе выборки и буфера, требуют уведомления объекта.
    Примечание: Изменения следует как можно скорее обсудить с назначенным NSS.

2. Определите нейтрона контраст матч точек и необходимые контраст для измерения протеина

  1. Сбор информации (от поставщика продукта информации, интерактивных баз данных, опубликованных значений и т.д.) связанных с атомной композиции и томов для моющего средства системных компонентов сочетаться контраст. Эта информация используется для определения нейтронного рассеяния длина плотности (ПВР) и таким образом контраст очка матча (CMPs) в растворе, который имеет решающее значение для получения качества данных и структурной информации для мембранных белков интерес в контексте PDC. Таблица, Резюмируя, физические свойства и контраст очков матч для моющих средств, широко используемых в биофизические исследования мембранных белков включены (Таблица 1).
  2. Определить SLDs нейтронов с помощью веб-приложения, мульча: модули для анализа контраст вариации данных49 (доступны онлайн50 -бесплатно). Ссылка на руководство пользователя расположен на домашней странице. Доступ к веб-сайт и прочтите сопроводительную документацию. Рисунок 1 и на рисунке 2 представлен обзор контраст модуль ввода и вывода для двух соответствующих примеров.
    Примечание: Другие веб-сайты для расчета SLDs доступны, например поддерживается Национальным институтом стандартов и технологий США (NIST) центр нейтронных исследований. 51
    1. Откройте модуль контраст, нажав «Контраст» расположен в левой навигационной панели. Предоставить текст для названия проекта и введите детали ниже двух компонентов (например, стиральный порошок начальник группы и хвост) как ' Субблок 1' и ' субъединица 2'.
    2. Введите молекулярную формулу для каждого компонента в текстовом поле «Формула».
      Примечание: переключатель ам ' должен быть выбран под «Вещества типа» ввести молекулярную формулу. Кроме того используйте буквы «X» в формуле для обозначения атомов водорода легко заменяемые. РНК, белков и ДНК последовательности могут быть введены, если соответствующий «P», «R», или имел ' выбираются переключателями. Если в субъединицы существуют несколько экземпляров компонента, значение для «Nmolecules» может быть изменено соответственно. Практический пример здесь относится к липидов как моющие средства, содержащие два идентичных хвосты, позволяя формула один хвост должен быть заключен с Nmolecules равным 2.
    3. Введите объем в кубических ангстремы для каждого компонента в поле ниже «Тома (Å3)». Используйте Tanford формула28 для алкильной цепи длины n, Vхвост = 27,4 + n * 26,9, рассчитать объем приблизительное хвост, или получить молекулярные тома из продукта информация представлена или опубликованных значений в литература.
    4. Введите сведения для буфера компонентов. Изменить «количество растворенных видов в растворителе» с помощью раскрывающегося меню для добавления или удаления строк для каждого буфера компонента. В случае формирования мицеллы моющих средств, включают в себя бесплатный стиральный порошок мономеров как отдельный буфер компоненты на критических мицеллы концентрации моющего средства (CMC).
    5. Нажмите кнопку «Отправить», чтобы выполнить вычисления контраст нейтронов и генерировать страницы результатов, которая предоставляет таблицу рассеяния длина плотности и контраст матч точек, а также формулы для определения этих параметров в любой заданный процент D2O в буфер. Просмотрите параметры рассеяния с уделением особого внимания CMPs компонента. Если точки матча похожи (в пределах 10% D2O) и бесплатно мицеллы концентрация низкая, то средний CMP может быть используется для сопоставления контраст стиральный порошок взносов. В большинстве случаев CMP стиральный порошок группы голову и хвост будет отличаться более чем на 10-15%, производство ядро оболочка форм-фактор в SANS данных запутывает прямого сбора рассеяние сигнала от белка только.
  3. Оцените контраст между стиральный порошок группы голову и хвост. Когда стиральный порошок головы группы и алкильной цепи хвост CMPs не хорошо подобранная, доступность и включение дейтерия замещенных моющего средства может разрешить рассеяния длина плотности выбора компонентов, чтобы манипулировать. В большинстве случаев это потребует, образуя смешанные мицеллы путем включения идентичные моющего средства с дейтерия замещенных алкильной цепи. Добавление дейтерия повышает плотность рассеяния длина ядро формируется алкильной цепи хвосты. Требуемой конечной точки, в данном случае, такова, что начальник группы оболочки CMP и алкильной цепи ядро CMP имеют примерно равные значения.
    1. Поднимите CMP ядром мицеллы стиральный порошок равным примерно СС оболочки глава группы, определяя соответствующие соотношения смешивания между h хвосты и d хвосты, обеспечивающее полный контраст, совпадающие с головы группами. Предпосылкой для этого определения является знание CMP для дейтерия замещенных алкильной цепи хвост. Имеющиеся аналогом н додецил β-D-maltoside (DDM) доступен со всех алкильной цепи водорода заменены дейтерия (d25-DDM). Повторить расчеты контраст, описанные в шаге 2.1 для имел хвост ' вместо «h хвост».
    2. Рассчитайте коэффициент моль h-хвост к d хвост, необходимых для соответствия контраст с головы группой CMP. С этой решимостью может помочь следующая формула:
      CMPголова = CMPh хвост * χh хвост + CMPd хвост * χd хвост
      где CMP — рассеяния длина плотности и χ — объёмная для компонента стиральный порошок головы, h хвост, или d хвост. Для буферизации решения DDM включение 44% по весу (43% моль) общей моющего средства как d25-DDM с дейтерия замещенных алкильной цепи производит одну CMP 48,5% D2O head и tail компонентов.
  4. Рассмотреть степень замещения дейтерия для мембранных белков. Для измерения достаточно рассеяние сигнала от белка, CMP для белка должно быть по меньшей мере 15% D2O в растворе от моющих средств CMP и условий измерения. Сигнал увеличивается с площади этой % разницы. Так как CMP немеченого белка обычно происходит с ~ 42% D2O в растворе (CMP похож на многие стиральный порошок начальник группы), дейтерий маркировки белка почти всегда является необходимостью. 52

3. Экспресс и очистить Выделительный протеин интереса

  1. Подготовка среднего фунтов (lysogeny бульон) и расти Escherichia coli (E. coli) клетки укрывательство вектор индуцибельной выражение для белка последовательности целевого объекта.
    1. Подготовьте минимальный СМИ. В H2O или D O2, растворяют 7,0 г/Л (NH4)2так4, 5,25 г/Л Na2HPO4, KH 1,6 г/Л2PO4, 0,50 г/Л диаммония водорода цитрат, 5,0 г/Л глицерина, 1.0 мл/Л 20% w/v MgSO 4·7H2O и 1,0 мл/Л Holme микроконцентраций металлов (0,50 г/Л CaCl2·2H2O, 0.098 г/Л CoCl2, 0,102 г/Л CuSO4, 16,7 г/Л FeCl3·6H2O, 0,114 г/Л MnSO4· H2O, 22,3 г/Л Na2EDTA·2H2O и 0,112 г/Л ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Подготовить соответствующие антибактериальной акций решения с использованием H2O или D2O.
    3. Подготовить раствор изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид с использованием H2O или D2O.
    4. Стерильными фильтр все решения в сухой, стерильных контейнеров с помощью верхней бутылки вакуум и шприц фильтры с размером пор 0,22 мкм.
  2. Адаптировать клеток E. coli к дейтерия меченых средних перед масштабирования для гиперэкспрессия белка транс.
    1. Прививать 3 мл среды фунтов с изолированной колонии из плиты Lysogeny бульон (LB) агар или клетки из замороженных глицерин запас. Рост клеток при 37 ° C в тряску инкубатор на 250 об/мин или уменьшить температуру до 30 ° C или ниже при инкубации на ночь во избежание разрастание культуры.
      Примечание: Процесс адаптации может быть изменено. 55 , 56 , 57
    2. После того, как культура LB выросла до оптической плотности на 600 Нм (600OD) ~ 1, разбавьте 1:20 в 3 мл H2O минимальный средний и расти ОД600 ~ 1. Повторить 1:20 разведений, с использованием минимальной среде, содержащей 50, 75 и 100% D2O (или до желаемый процент D2O).
      Примечание: как D2O содержание увеличивается, темпы роста будут уменьшаться. Отношения между2O процент D в рост средств массовой информации и дейтерий замещения в протеине сообщалось в литературе. 58 , 59 , 60
    3. Продолжать расти культура в биореакторе увеличить доходность транс клеточной массы (рис. 3).
      Примечание: Пошаговые процедуры для биореактора операции были рассмотрены в других местах. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Урожай и лизировать клетки Escherichia coli для очистки добычи и белков мембранных
    1. Пелле клетки центрифугированием в ~ 6000 x g ~ 30-45 мин при 4 ° C.
    2. Смягчают Пелле клеток путем замачивания в буфере на льду ~ 30 мин. Затем нежно ресуспензируйте Пелле ячейки в буфер, нежно дозирование с Серологические Пипетки, или нежно покачиваясь на 2D рокер, до конечной концентрации ~ 1 g мокрой клеточной массы/10 мл буфера.
      Примечание: пример буфера составляет 50 мм HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота), pH 7.5, 200 мм NaCl дополнены таблетки ингибитор протеазы.
    3. Во время охлаждения отток лизируют ресуспензированы клетки с тремя проходит через высокого давления гомогенизатор на 10 000 psi.
      Примечание: В зависимости от масштаба необходимых другие лизис методы могут быть использоваться (например, французская пресса или sonication).
    4. Пелле мусора клетки центрифугированием в ~ 4000-5000 x g 15 мин при 4 ° C. Повторите этот шаг, пока не уточюнено супернатант.
    5. Ультрацентрифуги (~ 150 000 x g для 30-45 мин) супернатант предварительного шага, который содержит водорастворимые и мембраны фракций. Пелле после ultracentrifugation содержит часть мембраны.
    6. Ресуспензируйте Пелле мембраны в большой гомогенизатор Dounce и снова изолировать часть мембраны, ultracentrifugation (шаг 3.3.5). Повторите этот шаг по крайней мере один раз, чтобы удалить слабо связанных белков.
    7. Солюбилизировать последнего мембраны, плавное покачивание ~ 30 мин при температуре 4 ° C в буфер, содержащий моющего средства для очистки. Солюбилизация является очевидной, когда подвеска превращается из облачно прозрачным. Удаление нерастворимый материал по ultracentrifugation (~ 150 000 x g для 30-45 мин.).
      Примечание: В пример буфера составляет 50 мм HEPES, рН 7,5, 500 мм NaCl, 20 мм имидазола и 4% (w/v) DDM для очистки, Ni2 + аффинной хроматографии.
  4. Очищайте протеин после протокол, ранее разработанных для протонированные форм.
    Примечание: Смотрите Наинг et al. пример очистки протокола для intramembrane аспартил hexahistidine меткой в . м. marisnigri JR1 протеазы (d-MmIAP). Был окончательный выход 65 ~ 1 мг транс от роста культуры клеток 5 Л транс, все из которых использовалась в эксперименте SANS (рис. 4).
  5. Обмен очищенный протеин в «Последний буфер обмена» для соответствия контраст.
    1. Подготовка 200 мл «Последний буфер обмена», содержащий правильную смесь для контраста, сопоставления, например,20 мм HEPES, рН 7,5, 250 мм NaCl и 0,05% всего DDM (0,028% DDM и 0,022% d25-DDM) в 49% D2O.
    2. Сбалансировать размер столбца исключение с > 2 тома (CV) колонки «Окончательный буфера обмена» в 3.5.1, используя систему быстро белок жидкий хроматографии (ПСОК).
    3. После парентерального введения образца, запустите столбце и изолировать фракций, соответствующий протеина интереса.
    4. Концентрат белка до требуемой концентрации выпускных (2-5 мг/мл).
      Примечание: Объем ~ 300 мкл требуется заполнить кювет цилиндрического кварца 1 мм, используемые для сетей SAN.
    5. Заповедник Алиготе соответствует буфера для SANS вычитание фона.
      Примечание: Алиготе могут приниматься непосредственно из подготовленных буфера, или идеально чистой элюции фракция в конце выполнения ПСОК.

4. Сделайте последние приготовления к Луч времени и собрать данных

  1. После того, как предложение было принято и утверждено доступ к сайту, выполните все необходимые подготовки назначенных луч время. Это включает в себя prearrival, веб-обучение на месте Радиологическая лаборатория, а также инструмент конкретной профессиональной подготовки.
    Примечание: Обучение требования могут диктовать прибытия заранее для впервые пользователей. Более подробная информация доступна в Интернете. 66
  2. Загрузить образцы и буферы для сбора данных.
    Примечание: Обзор биологических малого угол нейтронного рассеяния (био-SANS) область окружающей среды образца инструмента показан на рисунке 5.
    1. Загрузить образцы и буферов в кварцевые клетки. Кварц клетки доступны от ученый документа или объекта. Используйте гель загрузки советы для доступа узкое отверстие большинства образец клеток.
    2. Убедитесь, что луч затвор закрыт, затем подход в области окружающей среды образца и место кварц клеток в образце смены. Запишите позицию смены образца для каждой ячейки выборки.
    3. Проверьте область и убедитесь, что путь луча является свободным от препятствий, затем оставить области среды образец и открыть затвор луч.
      Примечание: Тщательно следуйте всем правилам Фонда и правила, подчиняться все проводки и прислушаться к рекомендации ученого инструмента. Образцы не могут быть удалены из пучка и манипулировать после воздействия луча без следующих специальных мер предосторожности. Проконсультироваться с радиологического контроля техник (РКИ) до этих процедур.
  3. Выполнить сканирование таблицы для автоматизации сбора данных
    1. Управлять инструментом, с помощью пользовательского элемента управления на основе LabVIEW программного обеспечения, спектрометр инструмент управления среды (Спайс). Следуйте инструкциям для работы инструмент, предоставляемый ученый рассеяния нейтронов. Обзор окна операции сканирования таблицы приводится на рисунке 6.
    2. После ввода информации, необходимой в соответствующих областях, выполнить сканирование таблицы и начнется процесс сбора данных. Отслеживать прогресс через вкладку «Таблицы сканирования статус».

5. сократить с 2D изображения данных до 1D участок

  1. Идентифицировать каждый образец и буфера данных файл из числа зарегистрированных сканирования. Каждое измерение будет присвоен номер уникальный сканирования. Эта информация полезна во время сокращения данных для идентификации каждого соответствующего образца и пара буфера.
  2. Использование MantidPlot программного обеспечения и сценарий Python для сокращения
    1. С данные учетной записи для доступа к их данным в удаленном кластере анализа предоставляются пользователям рассеяния нейтронов. 67 войти на удаленный кластер анализ и выполнение «MantidPlot» из командной строки. Рисунок 7 и 8 цифра предоставляются для оказания помощи эти шаги.
    2. Получить сценарий уменьшения пользователя от рассеяния нейтронов ученый (обычно это произойдет во время эксперимента); Этот сценарий основан на Python и будет содержать все необходимые калибровки и масштабирования корректировок для уменьшения изображения 2D рассеяния в 1D участок рассеянного света как функция угол рассеяния, I(Q).
    3. Откройте предоставленный сценарий уменьшения пользователя в MantidPlot и место соответствующие проверки номера или идентификации для образца и буфера пар в соответствующем списке.
    4. Выполнить сценарий для создания снижение данных как 4 колонки текстового файла (порядок столбцов является Q, I(Q), I(Q) ошибка, ошибка Q) в указанном месте. Щелкните правой кнопкой мыши соответствующую область в MantidPlot и выберите пункт «Печать с ошибками...» для первоначального изучения рассеяния профилей.

6. анализ данных за структурные параметры рассеяния частиц

  1. Передача файла снижение данных от анализа сервера на локальный компьютер с использованием безопасной передачи файлов FTP. Это может быть выполнена с использованием программного обеспечения таких как FileZilla или CyberDuck. На странице входа analysis.sns.gov предоставляются дополнительные инструкции и сведения для подключения к файловой системе сервера анализа.
  2. Скачайте ATSAS программного обеспечения комплект65,68 (весь ATSAS Люкс). 69 70 индивидуальных программ также доступны онлайн для анализа данных SANS, а именно определение структурных параметров и ab initio модели.
    Примечание: Многие параметры доступны для SANS анализ данных биомакромолекулах. 45
  3. Использовать Примус71 для построения данных, буфера масштабирования и вычитание и Guinier анализ.
    1. Запуск ATSAS «Анализ данных SAS» приложения и загрузки снижение данных файлы, соответствующие пары образца и буфера.
      1. Для масштабирования буфера правильно, выберите диапазон данных в высокой Q (Q > 0.5 Е-1) где оба профили похожи и плоский и нажмите кнопку «Масштаб», расположенную под «Деятельности» вкладки. Масштабный коэффициент будет применяться в буфер, таким образом, что эти два плоских областей должны совпадать. Осторожность: должно быть правдоподобной физической причиной что оправдывает масштабирования интенсивности буфер в соответствии с образцом. Если несоответствие является большой, консультироваться ученый инструмент для допустимых подходов к вычитание фона. 44 , 45 , 72
      2. Увеличение диапазона данных для просмотра всех точек. Щелкните «Вычитание» для выполнения этой операции. Щелкните правой кнопкой мыши буфера вычитается datafile в легенде и сохраните этот файл для последующего анализа. Figure 9 возможности использования на вкладке «Операции».
    2. Анализ Guinier вычитается буфер образца данных, используя вкладку «Анализа» приложения «Анализ данных SAS».
      1. Убедитесь, что выбран правильный файл в списке и нажмите кнопку «Радиус инерции». Автоматизированный попытка выполнить Guinier подходят будет оказываться, нажав на кнопку «Autorg».
      2. Расширить круг данных, используемых для включают все данные, низкой Q и начать сужение диапазона данных, забрав high-Q пунктов до Qmax * Rg предел находится ниже 1.3. Используйте график остатков для проверки линейной форме диапазона данных. Guinier подходят дает приблизительные Rg и я0 для рассеяния частиц.
      3. Сделать небольшие изменения в регионе подходят и контролировать чувствительность этих значений для диапазона данных, используемых в форме. Рисунок 10А демонстрирует использование инструмента «Радиус инерции».
  4. Получить функцию распределения вероятности (P(r)) в "Гном". 73 в выходной файл, созданный здесь будет использоваться в качестве входных данных для ab initio процесса моделирования.
    1. Запуск мастера распространения расстояние в закладке «Анализ», получение хорошо подходят для данных имеет важное значение для получения качества модели. Дополнительные сведения о получении точных подходит пожалуйста, смотрите Обзор74 , Putnam, et al.
      Примечание: гном программа предоставляет дополнительные сведения о fit за пределами мастера распространения расстояние. Рисунок 10B показывает правильное использование инструмента «Расстояние распределения», и Рисунок 11 иллюстрирует некоторые из распространенных ошибок.
    2. Определите Dmax, максимальная межатомного расстояния в молекуле.
      1. Оценить значение для Dmax, сняв соответствующий флажок, чтобы заставить Rmax = 0 и указав большое значение для Dmax (150 Å, например). Первый x перехват в участок P(r) дает этой оценки.
      2. Сделать это значение Dmax и диапазона данных, используемых или количество точек, используемых в подходят для оптимизации гном, подходят для данных и результирующая кривая P(r) добавочные изменения.
    3. Продолжать совершенствовать гном fit и сохранения выходных файлов гном с хорошей форме параметрами для последующего ab initio моделирования шаги.
  5. Имитировать SANS профили с высоким разрешением модели PDB с помощью программы CRYSON. 75
    1. Откройте программу и выберите параметр '0'. Выберите имя PDB-файла в браузере файл всплывающего окна. Нажмите enter, чтобы принять параметры по умолчанию, за исключением указания цепи deuteration фракций и часть D2O в растворителе для достижения надлежащего контраста параметров.
    2. Соответствуют модели в набор экспериментальных данных, введя «Y» и выбрав файл данных в браузере файл всплывающего окна. Примите остальные значения по умолчанию, и выходные файлы будут записаны в местоположение файла PDB. «.fit» файл содержит информацию для профиля предсказал рассеяния с высоким разрешением 3D-модели.

7. Создание модели Ab Initio от данных.

Примечание: DAMMIF76 и77 в пакете программного обеспечения ATSAS DAMMIN используется для воссоздания Макетные атом модели (плотин) с помощью имитации отжига процесса от гном, выход, который содержит P(r) данных, или сведения о вероятности или частот межатомного расстояния в пределах рассеяния частиц. Эти программы могут работать в пакетном режиме или на ATSAS-онлайн веб-сервере.

  1. Запуск мастера PRIMUS формы с помощью кнопки «Dammif» на вкладке «Анализа» «Анализа данных SAS» и использовать ручной выбор параметров. Вход для мастера это показано на рисунке 12.
    1. Определить в Guinier диапазоне от fit (шаг 6.3.2) и переходите к следующему шагу, с помощью кнопок навигации. Задать значения посадки с P(r) участка (шаг 6.4) и переходите к следующему шагу.
    2. Предоставляют параметры для ab initio процесса моделирования. Введите префикс для имен файлов вывода модели (например, SANSEnvelope), выбрать либо «быстрой» или «slow» режим моделирования, введите значение для числа моделей (17 рекомендуется для статистической значимости), выберите один из доступных вариантов для частиц симметрии, anisometry и угловой масштаб (если известен). Убедитесь, что флажки проверяются на средние модели с DAMAVER и уточнить окончательную модель с DAMMIN.
    3. Инициировать процесс, используя кнопку «фиксации». Как только процесс завершится, просмотр и сохранение рабочего каталога.
      Примечание: процесс моделирования типичной для одного, небольшой белок может занять несколько часов с типичный персональный компьютер. Файлы хранятся в каталогах временных до тех пор, пока сохраняется.
  2. Наложение и наложения окончательного SANS конверт с связанной с высоким разрешением модели с помощью SUPCOMB в пределах ATSAS. Поместите копию с высоким разрешением модели PDB подогнать на SANS конверт в рабочем каталоге. Выполнение SUPCOMB из командной строки с помощью файлов PDB как два аргумента с структурой шаблона указано первым: supcomb $ HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Примечание: Имя второго файла перечисленные будет переписана как новый файл с «r» добавляется в конец и имеющие новые координаты для наложения на структуре шаблона.
  3. Визуализируйте ab initio модели результаты с помощью PyMOL (pymol.org), программа просмотра 3D молекулярной графики. Рисунок 13 обзор PyMOL операций.
    Примечание: Существуют руководящие принципы публикации для структурного моделирования данных малых угол рассеяния от биомолекул в растворе. 78
    1. Запустите приложение PyMOL и открыть PDB-файлы, соответствующие 3D SANS конверт и по краю SUPCOMB структуры с высоким разрешением для просмотра.
    2. Визуализируйте SANS конверт, представляющий эту модель в качестве поверхности. Нажмите на ' рядом модель и выберите ' Показать: как: поверхность '.
    3. Визуализируйте структуру белка с высоким разрешением позвоночника, представляя эту модель как мультфильм. Выберите в ' кнопку рядом с этой модели и выберите ' Показать: как: мультфильм '. Отображение цепи как радуга от N-C-конечная, выбрав кнопку «C» и ' по цепи: Chainbows'.
    4. Измените прозрачность поверхности представительства для ясности. Выберите из меню «Настройка», ' прозрачности» поверхность» 40% '.
    5. Сделайте белый фон и не непрозрачный. В строке меню «Экран», выберите ' фон»' и выберите «Укрывистая» снимите этот параметр и «Белый» чтобы пометить этот цвет для фона.
      Примечание: дополнительные операции и использует для PyMOL можно найти на PyMolWiki.org.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Луч время и инструмент предложение должно четко передают всю информацию, необходимую для Комитета по обзору, таким образом, чтобы можно было произвести действительный оценку предлагаемого эксперимента. Связь с NSS настоятельно рекомендуется для неопытных пользователей. NSS можно оценить первоначальные осуществимость и руководство предложение представить подчеркнуть возможности, безопасность и потенциал для высокой отдачей науки. Информация, представленная в предложении должно включать справочную информацию и контекст для значения исследования; знания, которые, как ожидается, будут получены, и как это влияет текущего взаимопонимании в соответствующей области науки; Описание работы, образцы, методов и процедур, которые будут использоваться; и, если применимо, ранее производительность команды на объекте, включая соответствующие публикации и результаты. Полезные ресурсы, такие как шаблоны предложения и советы по подготовке предложения, доступны для пользователей через нейтронных наук пользовательский портал (neutrons.ornl.gov/users).

Планирования эксперимента представляет собой динамичный процесс, который часто начинается на начальных этапах представления предложений, но не может быть полностью задуман просто до начала эксперимента. Однако имейте в виду, что любые изменения, которые значительно отклоняться от описания в предложении (включая изменения условий буфера или составом образца) должны быть одобрены объекта до начала эксперимента.

Этот протокол предполагает, что метод для выражения и очистки мембраной протеина интереса в стиральный порошок мицеллы в растворе было успешно продемонстрировано. В этом случае мембранный протеин интереса является протеазы аспартил intramembrane (IAP), которая имеет протокол установленного очистки и ранее установлено быть растворимы и активным в буфер, содержащий DDM мицеллы.

Здесь, мы демонстрируем нейтрона контраст вычисления с помощью мульчи: контраст модуля для решения МАП белка в контраст согласованной смешанные DDM / d25-DDM мицеллы. Стратегия, изложенная в настоящем документе был сначала определить степень смешивания между двумя моющих средств, необходимых для достижения матч полный контраст мицеллы. В итоге было определить относительный контраст каждого компонента и фон (H2наружного соотношением2O) необходимые для контраста матч рассеяния от моющих средств для того, чтобы наблюдать только белок рассеяния.

Рисунок 1 демонстрирует правильного ввода для модуля мульчи контраст и конечные выходные данные для расчетов контраст DDM стиральный порошок группы голову и хвост как подразделения 1 и 2, соответственно. Формула, используемая для головы группы является C12H14X7O11 с объемом 348 Å3и формула хвост алкильной цепи дается как C12H25 с объемом 350 Е3.

Это очевидно из контраст модуль вывода что DDM начальник группы и хвост имеют различные рассеяния длина плотности, и таким образом будет соблюдаться контраст между двумя компонентами. Для DDM начальник группы имеют CMP в 49% D2O а хвосты алкильной цепи CMP в 2% D2O, с их средняя CMP, происходящих в 22% D2O. Таким образом цель следующий шаг будет заключаться в разработке смешанные мицеллы, которая включает дейтерия замещенных алкильной цепи для увеличения среднего CMP стиральный порошок хвосты соответствовать CMP головы групп. Расчет контраст был повторен для замещенных моющего средства, DDM с полностью транс хвостом (d25-DDM), который аналогичным образом результаты в отличие между хвостом и головой группой. Однако, напротив значения h хвосты и d хвосты значительно отличаются. Напомним, что моющее средство, смеси, как известно, производят перемешанных мицеллы в растворе,22 таким образом смесь из этих h - и d хвосты в ядре мицеллы следует производить равной средняя УОС, руководителя группы оболочки, уступая мицеллы с одной CMP. Поскольку глава группы является общей для DDM и d25-DDM, стратегия заключается в том, чтобы найти смесь этих моющих средств, которые производит контраст средней значение из смешанных хвосты, который соответствует контраст головы групп.

Средний целевой CMP для моющего средства хвосты является то, что maltoside головы групп, или 49% D2O. Чтобы оценить соотношение смешивания средняя CMP каждого компонента h хвост и d хвост должен быть известен. Эти значения для некоторых общих моющих и коммерчески доступные дейтерия названы коллегами приводятся в таблице 1. Используя эти значения CMP DDM и d25-DDM, Мольная доля h хвосты и d хвосты, который удовлетворяет уравнению, заданное на шаге 2.2 являетсяd хвосты χ = 0.43.

Рисунок 2 демонстрирует более продвинутые ввод мульчу контраст модуль, который может использоваться для подтверждения условий соответствия окончательного смешанные мицеллы контраст и определить степень deuteration, необходимые на белок. Здесь Субблок 1 относится к контраст согласованной смешанные мицеллы с 2 компонентов, DDM и d25-DDM, в то время как субъединица 2 относится к intramembrane аспартил протеазы м. marisnigri JR1 (MmIAP), предоставляемых аминокислотной последовательности. СДЛС протеина подняло выражением в транс роста СМИ приносить CMP для белка в буфер, содержащий ~ 92% D2O. Степень разделения между белка матч-пойнт в 92% D2O и измерения состояния (48,5% D2O) предполагает, что достаточно сигнал рассеяния будет получено из белка.

Производство d-MmIAP была проведена с Rosetta 2 E. coli клетки укрывательство вектор pET22b-MmIAP. Минимальный средний с неподписанных глицерина в 90% D2O был выбран в качестве среднего роста. После адаптации к 90% D2O минимальный средний объем культуры был масштабируется до 400 мл и используется для инокуляции 3.6 Л свежих 90% D2O минимальный средний в сосуд биореактора 5,5 Л.

Рисунок 3 обеспечивает след значения процесса во время выращивания ФРС партии. В то время прививки уставка температуры было 30 ° C, уставка растворенного кислорода (ДУ) составил 100%, уставка агитации было 200 об/мин и скорость потока сжатого воздуха было 4 Л/мин. Был проведен рН выше уставка 6.9 с помощью 10% w/v раствор гидроксида натрия в 90% D2O. После делать Спайк сигнал истощения первоначальных 5 г/Л глицерина, кормления (30% w/v глицерина, 0,2% MgSO4 в 90% D2O) было начато, которая продолжалась на протяжении всего культивирования. После около 7 часов после кормления температуры культуры был сокращен до 18 ° C и изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид был добавлен в конечной концентрации 1 мм. После уборки культуры, было собрано приблизительно 145 г сырого веса клеток пасты через центрифугирования (6000 x g 45 мин)

Очистка d-MmIAP приступил что касается протонированных фермента за исключением того, что выход фермента был значительно ниже и окончательный чистоты был несколько ниже, чем типичный. От 5 Л, ~ 20 г мокрой мембран был изолирован, все из которых был солюбилизирован в УНБ для очищения и погружены на первый столбец на Ni2 + сродства. Для максимизации доходности очистки, фракция потока через был разведен и повторно повторно на Ni2 + близость столбца. Процедура повторяется третий раз прежде чем полировка образец концентрированной d-MmIAP, размер гель-проникающей хроматографии (рис. 4).

На рисунке 5 изображена ячейки выборки кварца и его соответствующий пример смены установки. Пример среды управляются био-без операций команды и NSS. Целый ряд различных средах могут быть организованы для выполнения измерений с контроля температуры, влажности, механические акробатика, высокой температуры и постоянное давление, среди прочих.

Рисунок 6 иллюстрирует био-без операций и выполнения автоматических таблицы сканирует. Удобный и интуитивно настроена проверка таблицы. На первой вкладке (образцы нагрузки) предоставляется информация о Пример смены и установки, такие как идентификация образцов на каждой позиции в пример смены, клетки толщины и типа образца (открытые балки, образец, фон, и т.д.). Дополнительные метаданные теги могут быть применены здесь также. На следующей вкладке (план эксперимента) определяются настройки документа и любые связанные параметры (например, температуры). Этот шаг аранжирован СНБ в начале эксперимента. Пользователь просто должен ввести измерения времени для каждого образца (в секундах). Закладке окончательный (выполнить сканирование) обеспечивает резюме таблицы данных сканирования и автоматического сканирования должен быть выполнен.

После рассеяния 2D изображения записываются, эти данные должны быть сокращены до 1D сюжет интенсивности по сравнению с Q - функция угол рассеяния. Во время сокращения данных применяются также корректировки изображения как пиксель чувствительности маски и темном фоне вычеты. MantidPlot программное обеспечение было разработано для интерпретации сырье био-данных документа. NSS обычно поможет в сокращении и получение окончательных данных в конце эксперимента.

Рисунок 7 Обзор удаленного анализа кластера доступа к MantidPlot и окно «сценарий» используется для уменьшения данных. Необработанные данные доступны на удаленного анализа кластера (analysis.sns.gov) через UCAMS/XCAMS аутентификации пользователя. После входа в удаленный рабочий стол, MantidPlot программное обеспечение могут быть запущены из окна терминала, просто выполнив «MantidPlot» под любой путь. Откройте окно «сценарий» в MantidPlot и редактировать сценарий уменьшения пользователя как режиссер СНБ. Выполнение этого сценария будет генерировать снижение данных файлов, которые затем могут быть переданы на локальный компьютер для анализа с использованием безопасного FTP.

Рисунок 8 показывает, печать и просмотр данных после выполнения скрипта пользователя сокращение данных будет отображаться в окне рабочих областей. По умолчанию окончательные Объединенные данные будут иметь суффикс _f приложили. Щелкните правой кнопкой мыши позволит участок спектра с ошибками выбираться и данных печати. Параметры отображения доступны путем выбора настроек из меню «Вид». Форматирование осей и заговоре диапазон легко доступна, дважды щелкнув осей. Рассеяние профили буферов, которые содержат не рассеяния частиц значительных размеров должен появиться как относительно плоская линия (постоянной интенсивности). Для образцов должны соблюдаться интенсивности на нижних углах рассеяния (Q) с экспоненциального распада в плоской бессвязные фон.

Рисунок 9 обзор вычитания надлежащего буфера с использованием программного пакета анализа данных SAS (или primusqt) после сокращения данных. Довольно часто бессвязные фон (интенсивность на high-Q) слегка несоответствие между образцом и буфера. Для правильного вычитание данные в этом регионе должны перекрываться. Шкала коррекции применяется масштабный коэффициент интенсивности к данным, которые приводит к дублирование данных и вычитания может быть выполнена. Если коэффициент масштабирования точек данных буфера с большей интенсивностью, чем соответствующих точек в выборке, эти точки будет отрицательным и не оказанных в участке журнала. Если отрицательные значения в файле буфера вычитается обильные, внести незначительные сокращения в буфер масштабный коэффициент и выполнять вычитание снова.

Рисунок 10 обеспечивает примеры использования Примус Guinier и мастеров распространения расстояние. Guinier анализ обеспечивает предварительную оценку частиц радиуса инерции от данных низким углом рассеяния. Поскольку данные приближаться к нулю, линейной региона должны присутствовать в данных. Установка линии в этом регионе позволяет Rg определяются от склона и я0 быть заимствованы из интенсивности перехвата при Q = 0. Повышательная тенденция в данных как Q приближается к нулю указывает агрегации в образце, в то время как тенденция обычно свидетельствует о interparticle repulsions. Эти тенденции наиболее очевидны, когда распределение остатков не стохастические. Верхний предел Guinier, пригодный для шаровых частиц ограничивается Q * Rg < 1.3 ('s' используется вместо Q в программе ATSAS).

Rg определяется для d-MmIAP от этой Guinier подходят составила 15,4 ± 1.1 Å оценкам я0 как 0,580 ± 0,001.

Мастер распространения расстояние позволяет систематические изменения должны быть внесены в параметры подходят P(r). P(r) кривая является косвенным Фурье кривой, подходят для экспериментальных данных. Таким образом важно, чтобы убедиться, что вписывается в левой панели точно отражает экспериментальных данных. Для fit, показанный в этом примере, Dmax 46 Å был получен.

Рисунок 11 иллюстрирует распространенные ошибки в подборе Dmax. Dmax, которая искусственно большой часто вызывает значения P(r) стать отрицательным, как функция P(r) колеблется относительно оси x. Dmax, который искусственно мал приводит к кривой усеченной P(r) с резким переходом к Rmax = 0.

Первые шаги в мастере Primus формы идентичны Guinier и мастеров распространения расстояние. Как только эта информация для получения хорошо подходит для экспериментальных данных, ab initio модель установки настраивается.

Рисунок 12 иллюстрирует правильного ввода для мастера фигур Primus. Здесь экспериментальный SANS данных для МАП была представлена в ангстремы в масштабах, и ожидаемый файл префикс «SANSEnvelope» было дано. Набор 17 первоначальных Макетные атом моделей было предложено быть создан с помощью применяется режим «быстрые» модель с не симметрии (P1) и не anisometry выбран. Набор 17 моделей будут выровнены, среднем и отфильтрованы с DAMAVER и средняя модель, изысканный, с помощью DAMMIN. Проверка префикса-damsel.log текст документа приводится краткое изложение критерием отбора и любые модели, отброшены из набора. Окончательная модель изысканный был написан как SANSEnvelope-1.pdb.

Программа, которую SUPCOMB используется для выполнения накладывание SANS конверт модель с высоким разрешением модели, с только два файла PDB структуры как входные данные. По умолчанию «r» добавляется к имени файла переориентирована и накладывается.

После SANS наложилось конверт и высоким разрешением структуры, эти модели могут быть визуализированы с помощью любого молекулярной графика, просмотр программы. Результаты от PyMOL подходят для публикации качество изображения и может использоваться для подчеркнуть биофизических результаты, касающиеся структурных расследования. Здесь мы демонстрируем несколько основных операций PyMOL используется для предоставления 3D представления и представления полученных накладного структур.

Рисунок 13 обзор PyMOL визуализации процесса. После того, как в PyMOL были открыты PDB-файлы структуры, модели должны быть видны в окне просмотра PyMOL. Изменить представления о каждой модели с использованием 'S' кнопку рядом с именем файла. Используйте представление поверхности для SANS конверт и представление мультфильм позвоночника белка с высоким разрешением модели. Выберите подходящую цветовую схему из вариантов под кнопкой «C». Для цепи белка окраски «chainbow» обеспечивает градиент цвета от N - до C-конечная помощи интерпретации. Прозрачность применяется к поверхности представление позволяет лучше визуализация структуры белков в конверт. Для публикации изображений рекомендуется белый фон. После применения этих очередей визуализации трехмерных структур может быть проверен. Манипуляции зрения и молекулы вращение/перевода может выполняться путем щелчка и перетаскивания структуры.

Figure 1
Рисунок 1. Использование мульчи контраст модуля для определения параметров контраста для компонентов Додециловый maltoside (DDM). Входные значения отображаются на экране слева с последующим выходом на право. Контраст модуль ввода страницы доступен, нажав «Контраст» (зеленый кружок) из меню навигации в левой части каждого экрана. Области ввода для названия проекта, буфера компонентов и подразделений 1 и 2 помечены как таковые. Вывод страницы содержат важные частиц информации и контраст свойства для описываемой системы. Соответствующие таблицы и расчетные точки матча были зажаты в оранжевый для ясности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Использование мульчи контраст модуля для определения параметров контраста для компонентов комплекса белков-моющее средство мембраны. В этом случае ввод дал для описания общей системы PDC в раствор. Субблок 1 описывает, контраст согласованной смешанные мицеллы, состоящей из DDM с 43% моль как d25-DDM. Субъединица 2 описывает мембранный белок, с аминокислотной последовательности для MmIAP ввода формулы. На deuteration уровне (зеленый кружок) описывает белка степень замещения дейтерия и имеет прямое влияние на SLD и вычисляемые матч пойнт, что будут оцениваться для белка. Результаты (оранжевая коробка) показывают что матч пойнт для смешанных моющего средства будет происходить на 48,5% D2O, в то время как белок матч пойнт происходит на ~ 90% D2O. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3. Подготовка образца – биореактор трассировки. Процесс отображения значений температуры застывания (оранжевая линия), растворенного кислорода (ДУ) Уставка (синяя линия), агитации уставка (красная линия) и скорость потока сжатого воздуха (розовая линия). Насос 1 (зеленая линия) был использован для контроля рН. Спайк в 18:40 сигнал истощения первоначальной глицерина и был использован для начала подачи раствора глицерина через насос 2 (черная линия). Ось x обозначает часов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4. Пробоподготовка – ПСОК и SDS-PAGE характеристика образца. Окончательный размер Хроматограмма исключения для d- MmIAP, достижение равновесного уровня с 20 мм HEPES, рН 7,5, 250 мм NaCl, 48,5% D2O и 0,05% всего DDM, из которых 44% (w/v) это хвост транс d25-DDM. Вставка: SDS-PAGE анализ с Окрашивание Кумасси. Обобщённые фракций помечены как A, B, и C. региона «B» был использован в эксперименте SANS. Аннотированная молекулярный вес маркер находится в кДа. Изображение воспроизводится с разрешения от Найнга и др. 65 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 5
Рисунок 5. Сбор данных – кварцевые банджо образец клеток и автоматический пробоотборник установки. (A) ячейку пустой кварц банджо показано покоится против блока Автоматический пробоотборник. Клетки заполнены с образцом и вставляется в один из 15 имеющихся позиций. (B) образца блок монтируется за селектора диафрагмы (не показан) между расширитель луча трубки и окно кремния на въезде в детектор танк. Шланги, соединения к контролируемой температуры водяной бани и каналы во всем блоке образца обеспечивают регулирование температуры на позициях образца. Стрелка указывает направление луча нейтронов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6. Сбор данных – обзор операций СПЕЦИЙ и сканирование таблицы. Операции сканирования таблицы доступны из «Table Scan» кнопку на крайнем левом меню программного обеспечения инструмент управления SPICE. Зеленые стрелки обозначают активной вкладки в верхней части экрана и Оранжевые прямоугольники выделите области в таблице для активного пользователя входов. (A) первой закладке сканирование таблицы используется для предоставления сведений о смена образцов и образцов клеток позиций. Обеспечивают этикетки, толщины образцов и образцов типы для каждой позиции, используемые в образце смены. Флажок «Делать Scan» будет добавить соответствующую строку в очередь сканирования таблицы. (B) на второй закладке, записываются сведения о инструмент конфигурации и измерения времени для каждого образца (в секундах). Инструмент конфигурации предварительно ученый рассеяния нейтронов и предоставляется пользователям на основе реквизитами, указанными в предложении луч время и инструмент. Инструмент управления, например возможность определить уставки температуры и провести время, в течение измерения очереди могут добавляться дополнительные параметры. (C) вкладке окончательный обзор измерения производятся для каждой строки в таблице. Если изменения не требуются, Автоматизированная Сканирование инициируется, нажав кнопку «Выполнить сканирование». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7. Данные сокращение – обзор сценария сокращения и MantidPlot операций. MantidPlot программное обеспечение доступно на кластере анализ «mantidplot», введя в командную строку терминала в любой Служба каталогов active directory (желтого круга и стрелки добавлены для акцент). После того, как программное обеспечение является открытым, доступа окна «сценарий» (переключается кнопкой, отмеченные зеленым) и откройте сценарий предоставляемых ученый рассеяния нейтронов. Следуйте инструкциям, приведенным в сценарий, который должен только требуют сканирования номеров для каждого образца и буфера вошел в список для автоматического уменьшения, а также проверять номера для пустых ячеек для вычитания и пустой луч для передачи и луч определение центра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8. Анализ данных – построение данных с использованием MantidPlot. Данных упоминаются как «Рабочие» в MantidPlot. В рабочей области будет заполняться с именами файлов, как производимые сокращения сценарий пользователя. Область данных для наборов данных 1D могут быть отображены, щелкнув правой кнопкой мыши рабочую область и выбрав «Участок спектра с ошибками...». Дополнительные данные могут добавляться к текущей сюжет, просто перетаскивая рабочих областей. Форматирование окна сюжет (таких как log-log – участки) можно выполнить, выбрав «Настройки» из меню «Вид», или дважды щелкнув на метках оси. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 9
Рисунок 9. Анализ данных – ATSAS программное обеспечение: основные операции и вычитание буфера. Primusqt приложения (анализ данных SAS) обеспечивает визуализацию для вычитания надлежащего фон (буфер). Файл буфера должен быть масштабируется для вычитания таким образом, что данные пересекаются на high-Q (где рассеяния плоский результате оставшиеся сигнал от бессвязные фона). Когда выбран этот высокий Q диапазон данных, операция масштабирования будет применяться коэффициент масштабирования в нижней файл данных в таблице, которая производит дублирование в регионе определенных. После масштабирования, файл буфера может быть вычитанным приносить профиль чистой рассеяние частицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 10
Рисунок 10. Анализ данных – определение Guinier и P(r) (расстояние распределение). (A) мастера Guinier Primus используется для выполнения Guinier анализа, предоставляя первоначальная оценка я0 и Rg. Частицы типа и диапазона данных, чтобы соответствовать используются для определения соответствия. Участок fit и соответствующие остатки отображаются слева, а Guinier условия (я0 и Rg), Q * Rg ограничения и качество линейные посадки предоставляются в качестве вывода в области отмечен Оранжевая коробка. (B) мастер распространения расстояние Primus используется для выполнения анализа распределения расстояния, обеспечивая P(r) кривой, которая определяет вероятность межатомного расстояния в пределах рассеяния частиц и включает в себя Dmax или максимум межатомного расстояния. Параметры, указанные в поле оранжевый может расследоваться систематически определить функцию распределения надлежащего расстояния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 11
Рисунок 11. Неправильное результаты анализа распределения расстояние. Правильно подобранный Dmax должна производить P(r) кривой, что пики с постепенный распад до нуля. Слишком большие значения DMax скорее всего будет производить отрицательные значения P(r) или колебаний вблизи оси при высоких значениях р. Dmax ценностей, которые зачастую искусственно малых привести к P(r) кривых, где появляется усеченная верхняя граница. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 12
Рисунок 12. Моделирование – Ab initio модель установки с использованием мастера фигур Primus. Ab initio моделирования параметры приведены в одном окне ввода. Префикс поставляется с других вариантов для обработки доступны для вывода имен файлов. Отжиг процедура может быть быстро (больше шариков с быстрее охлаждения) или медленно (мелких бусин с медленным охлаждением). Количество повторений должно быть достаточного размера для изучения воспроизводимость характеристик модели. Частица симметрии и anisometry могут быть предоставлены, если оно известно. Угловая шкала должна соответствовать единиц измеренных данных. DAMAVER в среднем будет выровнять и средняя все модели Макетные атома, а затем применить критерий отбора, который исключает любые модели останец. Ядро фиксированной атомов из усредненной модели будет и далее уточнены с помощью DAMMIN, если этот параметр выбран. Этот изысканный модель должна представлять 3D разрешением конверт экспериментальных SANS профиль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 13
Рисунок 13. Визуализация – экспериментальной SANS конверт и оверлея с высоким разрешением модели с использованием PyMOL. После открытия структуры файлов PDB в PyMOL, модели отображаются в средстве просмотра PyMOL. Активные модели перечислены в таблице справа, наряду с кнопок действий, который может использоваться для манипулирования моделью и его представление. Основные операции предоставляются для визуализации этих моделей, которые позволяют регионов соглашения (или несоответствие) между SANS конверт и высоким разрешением структуры должны быть определены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблицы 1. Физические свойства моющих средств, широко используемых в мембранных белков расследований. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Структурная биология исследователи воспользоваться преимуществами дополнительных структурных методов как решение рассеяния для получения биохимических и структурных деталей (например, общий размер и форма) от биомолекул в растворе. SANS является особенно привлекательным техника для определения структуры низким разрешением мембранных белков, одним из основных направлений современной структурной биологии и биохимии. SANS требует количества очищенных белков сопоставимы с кристаллографических испытаний (1 мг/образец). Недавно расширение коммерческой доступности высокой чистоты транс моющих отношение к мембранных белков исследования делает доступным средство для манипулирования этой водорода/дейтерием контента для SANS эксперименты мембранных белков-моющее средство комплексов, позволяя белков сигнал быть записаны непосредственно. При успешном завершении, ab initio модель молекулярной конверт может рассчитываться из данных, собираемых в течение всего нескольких часов. Таким образом мембранных белков биохимики, биофизиков и структурные биологи могут легко воспользоваться SANS для получения желанной первоначальный 3D моделей мембранных белков в растворе, структуры в комплексе с обязательными партнерами или субстраты и модели полученные SANS может использоваться для поэтапного дифракции данных. Регулярное использование SANS характеризовать мембранных белков будет преобразующей для поля биохимии белков мембранных и волновой эффект от функции базовой структуры для обнаружения наркотиков и развития. Дополнительное преимущество нейтрона контраст, совпадающие с замещением дейтерия делает SANS полезен для изучения протеин протеина, белок ДНК или других биомолекулярных комплексов, которые можно легко манипулировать в их содержание водорода/дейтерием.

Для получения дополнительной информации о малых угол рассеяния приборостроения и теории, рекомендуются следующие обзоры: био-SANS инструмент высокого потока изотоп реактора из Oak Ridge национальной лаборатории,79 малых угол рассеяния для структурная биология – расширяет границы избегая ловушек,72 и малым угол рассеяния исследования биологических макромолекул в растворе. 80 нейтронного рассеяния ученый также может обсудить текущий инструмент конфигурации и оптимальные параметры для данной системы. Например данные на нижней Q (который является функцией длины волны угол и нейтронного рассеяния) обычно требуемый для крупных систем. Наиболее распространенные конфигурации инструмента на био-SANS обеспечивает Qмин 0,003 Е-1 и подходит для крупных белковых комплексов до сотни кДа. Раствор, содержащий мг ~ 3 мл-1 мембранных белков приблизительный размер 30 кДа (мономер) в контраст согласованной мицеллы с 48,5% D2O в растворе требует типичные измерения времени около 8 часов для образца, буфера и пустых клеток (24 hours = 1 день всего). Инструмент измерения раз в условие данного контраст можно приблизительно масштабируется в соответствии продукт молекулярной массы и концентрации рассеяния частиц. Однако не взаимодействующих условиях, включая любые неспецифических белков агрегации, которая ставит практические верхний предел на концентрацию образца должна быть измерена рассеяния частиц. Часовую измерения существуют ограничения на стабильность определенных белков. К счастью, измерений может быть сделано регулярно на охлажденных температурах для улучшения жизни время белка, и занятых луча низкой энергии нейтронов не наносить ущерб радиации во время измерения.

Обзор этого процесса и определения многих ключевых факторов к успешной записи рассеяния нейтронов из образца измеряется на матч-пойнт контраст моющего средства представлены в этой рукописи. Это включает в себя критическим шагом на пути получения полный матч совокупных моющего средства, разработав стиральный порошок смеси с единой нейтрона контраст между стиральный порошок начальник группы и алкильной цепи компонентов. Измерения на этот матч одноточечное моющего средства предоставляют рассеяния профиль приписываются только мембраной протеина интереса и позволило ab initio конверт представляющие мембранный белок будет реконструирован из данных. Анализ данных и ab initio моделирования протоколы также продемонстрировать потенциал информации, полученной от таких расследований, которые могут стремиться адрес общей структуры, конформационные изменения, олигомерных государств, среди прочих. Одно ограничение является то, что на сегодняшний день только очень несколько моющих коммерчески доступных с подстановками дейтерия. 19

В то время как perdeuteration не может быть необходимым, цель в данном случае должно быть достижение белок с > 65% дейтерия маркировки в протеине. В качестве альтернативы Если моющее средство с выборочно транс групп головы и хвосты доступен и CMP стиральный порошок мицеллы происходит около 100% D2O, то достаточного контраста из белка может быть достигнуто без необходимости маркировки дейтерия. Определите соответствующие deuteration уровень белка для достижения достаточной рассеяния при измерении на контраст матч-пойнт моющего средства. Существуют многочисленные проблемы, связанные с мембранных белков и очистки,81 , которые остаются за рамками этой статьи. К сожалению высокий уровень deuteration в настоящее время не являются (пока) для eukaryotic систем. Хотя мы понимаем, что это ограничение для некоторых эукариотических белков, большинство мембранных белков у бактериальных Ортологи, для которого этот метод подходит.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы Volker S. Urban, Сай Венкатеш Pingali, Кевин л Вайс и Райан Оливер C. привлекаются через UT-Battelle с US DOE для поддержки программы пользователя науки нейтронов и био-инструмента в Окриджской национальной лаборатории, используемый в этой статье.

Эта рукопись была соавтором, UT-Battelle, ООО, по контракту де-AC05-00OR22725 с нас Департамент энергетики (DOE). Правительство США сохраняет и издатель, приняв статьи для публикации, признает, что правительство США сохраняет неисключительное, оплаченного, безотзывное, во всем мире лицензию публиковать или воспроизвести опубликованной формы этой рукописи, разрешить или другие сделать, для целей правительства США. Доу будет предоставлять общественности доступ к эти результаты федерально спонсируемых исследований в соответствии с планом Доу доступа общественности. 82

Acknowledgments

Отделение биологических и экологических исследований поддерживает исследования в центре ORNL в структурной молекулярной биологии (CSMB) и био-использования средств, поддерживаемых научный отдел помещений пользователя, Управление основных энергетических наук, Департамента США энергии. Строительные работы на мембранных белков в лаборатории Либерман была поддержана NIH (DK091357, GM095638) и NSF (0845445).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7, (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR structures in drug design, emerging opportunities with new structures. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, (17), 4073-4079 (2014).
  3. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. The Journal of Membrane Biology. 248, (4), 611-640 (2015).
  4. Doerr, A. Membrane protein structures. Nature Methods. 6, 35 (2008).
  5. Bill, R. M., et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nature Biotechnology. 29, 335 (2011).
  6. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18, (5), 581-586 (2008).
  7. Sanders, C. R., Sönnichsen, F. Solution NMR of membrane proteins: Practice and challenges. Magnetic Resonance in Chemistry. 44, (S1), S24-S40 (2006).
  8. Garavito, R. M., Ferguson-Miller, S. Detergents as tools in membrane biochemistry. Journal of Biological Chemistry. 276, (35), 32403-32406 (2001).
  9. Privé, G. G. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods. 41, (4), 388-397 (2007).
  10. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138, (1), 141-143 (1984).
  11. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2, (8), 853-856 (2002).
  12. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Letters. 584, (9), 1721-1727 (2010).
  13. Skar-Gislinge, N., et al. Elliptical structure of phospholipid bilayer nanodiscs encapsulated by scaffold proteins: Casting the roles of the lipids and the protein. Journal of the American Chemical Society. 132, (39), 13713-13722 (2010).
  14. Sanders, C. R., Schwonek, J. P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31, (37), 8898-8905 (1992).
  15. Vestergaard, M., Kraft, J. F., Vosegaard, T., Thøgersen, L., Schiøtt, B. Bicelles and other membrane mimics: comparison of structure, properties, and dynamics from MD simulations. The Journal of Physical Chemistry B. 119, (52), 15831-15843 (2015).
  16. Popot, J. -L., et al. Amphipols From A to Z. Annual Review of Biophysics. 40, (1), 379-408 (2011).
  17. Tribet, C., Audebert, R., Popot, J. -L. Amphipols: Polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, (26), 15047 (1996).
  18. Fernández, C., Wüthrich, K. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Letters. 555, (1), 144-150 (2003).
  19. Hiruma-Shimizu, K., Shimizu, H., Thompson, G. S., Kalverda, A. P., Patching, S. G. Deuterated detergents for structural and functional studies of membrane proteins: Properties, chemical synthesis and applications. Molecular Membrane Biology. 32, (5-8), 139-155 (2015).
  20. Krueger-Koplin, R. D., et al. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. Journal of Biomolecular NMR. 28, (1), 43-57 (2004).
  21. Linke, D. Methods in Enzymology. Burgess, R. R., Deutscher, M. P. 463, Academic Press. 603-617 (2009).
  22. Oliver, R. C., et al. Tuning micelle dimensions and properties with binary surfactant mixtures. Langmuir. 30, (44), 13353-13361 (2014).
  23. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, (1), (2016).
  24. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Biomembranes. 457, (2), 133-170 (1976).
  25. Tulumello, D. V., Deber, C. M. Efficiency of detergents at maintaining membrane protein structures in their biologically relevant forms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818, (5), 1351-1358 (2012).
  26. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86, (1), 12-20 (2012).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666, (1), 105-117 (2004).
  28. Tanford, C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. 2nd edn, John Wiley. (1980).
  29. Littrell, K., Urban, V., Tiede, D., Thiyagarajan, P. Solution structure of detergent micelles at conditions relevant to membrane protein crystallization. Journal of Applied Crystallography. 33, (3 Part 1), 577-581 (2000).
  30. Oliver, R. C., et al. Dependence of micelle size and shape on detergent alkyl chain length and head group. PLOS ONE. 8, (5), e62488 (2013).
  31. Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508, (1), 86-111 (2000).
  32. Hong, X., Weng, Y. -X., Li, M. Determination of the topological shape of integral membrane protein light-harvesting complex LH2 from photosynthetic bacteria in the detergent solution by small-angle X-ray scattering. Biophysical Journal. 86, (2), 1082-1088 (2004).
  33. Vinothkumar, K. R. Membrane protein structures without crystals, by single particle electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 33, 103-114 (2015).
  34. Pérez, J., Koutsioubas, A. Memprot: A program to model the detergent corona around a membrane protein based on S-SAXS data. Acta Crystallographica Section D. 71, (1), 86-93 (2015).
  35. Oliver, R. C., Pingali, S. V., Urban, V. S. Designing mixed detergent micelles for uniform neutron contrast. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8, (20), 5041-5046 (2017).
  36. Hiruma-Shimizu, K., Kalverda, A. P., Henderson, P. J. F., Homans, S. W., Patching, S. G. Synthesis of uniformly deuterated n-dodecyl-β-D-maltoside (d39-DDM) for solubilization of membrane proteins in TROSY NMR experiments. Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals. 57, (14), 737-743 (2014).
  37. Midtgaard, S. R., et al. Invisible detergents for structure determination of membrane proteins by small-angle neutron scattering. The FEBS Journal. 285, (2), 357-371 (2018).
  38. Gabel, F. Biological Small Angle Scattering: Techniques, Strategies and Tips. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S. Springer. Singapore. 201-214 (2017).
  39. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO Block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50, (6), 2484-2494 (2017).
  40. Liyana-Arachchi, T. P., et al. Bubble bursting as an aerosol generation mechanism during an oil spill in the deep-sea environment: Molecular dynamics simulations of oil alkanes and dispersants in atmospheric air/salt water interfaces. Environmental Science: Processes & Impacts. 16, (1), 53-64 (2014).
  41. Dos Santos Morais, R., et al. Contrast-matched isotropic bicelles: A versatile tool to specifically probe the solution structure of peripheral membrane proteins using SANS. Langmuir. 33, (26), 6572-6580 (2017).
  42. Maric, S., et al. Stealth carriers for low-resolution structure determination of membrane proteins in solution. Acta Crystallographica Section D. 70, (2), 317-328 (2014).
  43. Pedersen, J. S., Svaneborg, C., Almdal, K., Hamley, I. W., Young, R. N. A small-angle neutron and x-ray contrast variation scattering study of the structure of block copolymer micelles: Corona shape and excluded volume interactions. Macromolecules. 36, (2), 416-433 (2003).
  44. Urban, V. S. Characterization of Materials. Kaufmann, E. N. John Wiley and Sons. (2012).
  45. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S., et al. Advances in Experimental Medicine and Biology. Cohen, I. R. 1009, Springer Singapore. Singapore. 1-268 (2017).
  46. Neutron Facilities WorldWide. Available from: http://neutronsources.org (2018).
  47. Submitting a Research Proposal. Available from: https://neutrons.ornl.gov/users/proposals (2018).
  48. Accompanying Bio-Deuteration Laboratory Proposal. Available from: https://www.ornl.gov/sites/default/files/BDL_info_request.docx (2014).
  49. Whitten, A. E., Cai, S., Trewhella, J. MULCh: Modules for the analysis of small-angle neutron contrast variation data from biomolecular assemblies. Journal of Applied Crystallography. 41, (1), 222-226 (2008).
  50. MULCh: ModULes for the Analysis of Contrast Variation Data. Available from: http://smb-research.smb.usyd.edu.au/NCVWeb/ (2018).
  51. Scattering Length Density Calculator by National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Neutron Research. Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2018).
  52. Ibel, K., Stuhrmann, H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. Journal of Molecular Biology. 93, (2), 255-265 (1975).
  53. Holme, T., Arvidson, S., Lindholm, B., Pavlu, B. Enzymes: Laboratory-scale production. Process Biochemistry. 5, (9), 62-66 (1970).
  54. Larsson, G., Enfors, S. -O. Protein release and foaming in Escherichia coli cultures grown in minimal medium. Bioprocess Engineering. 15, (5), 231-237 (1996).
  55. Artero, J. -B., Hartlein, M., McSweeney, S., Timmins, P. A comparison of refined X-ray structures of hydrogenated and perdeuterated rat [gamma]E-crystallin in H2O and D2O. Acta Crystallographica Section D. 61, (11), 1541-1549 (2005).
  56. Paliy, O., Bloor, D., Brockwell, D., Gilbert, P., Barber, J. Improved methods of cultivation and production of deuteriated proteins from E. coli strains grown on fully deuteriated minimal medium. Journal of applied microbiology. 94, (4), 580-586 (2003).
  57. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Science. 18, (5), 936-948 (2009).
  58. Hoopes, J. T., Elberson, M. A., Preston, R. J., Reddy, P. T., Kelman, Z. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 27-44 (2015).
  59. Leiting, B., Marsilio, F., O'Connell, J. F. Predictable deuteration of recombinant proteins expressed in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 265, (2), 351-355 (1998).
  60. Perkins, S. J. Estimation of deuteration levels in whole cells and cellular proteins by 1H n.m.r. spectroscopy and neutron scattering. Biochemical Journal. 199, (1), 163-170 (1981).
  61. Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a benchtop bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (79), e50582 (2013).
  62. Duff, A. P., Wilde, K. L., Rekas, A., Lake, V., Holden, P. J. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 3-25 (2015).
  63. Haertlein, M., et al. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 566, Academic Press. 113-157 (2016).
  64. Meilleur, F., Weiss, K. L., Myles, D. A. A. T Micro and Nano Technologies in Bioanalysis. Methods in Molecular Biology. 544, 281-292 (2009).
  65. Naing, S. -H., Oliver, R. C., Weiss, K. L., Urban, V. S., Lieberman, R. L. Solution structure of an intramembrane aspartyl protease via small angle neutron scattering. Biophysical Journal. 114, (3), 602-608 (2018).
  66. Training Requirements for First Time and Repeat Users. Available from: https://neutrons.ornl.gov/users (2018).
  67. Remote Analysis Cluster. Available from: https://analysis.sns.gov (2018).
  68. Franke, D., et al. ATSAS 2.8: A comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50, (4), 1212-1225 (2017).
  69. Software Suite. Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html (2018).
  70. Software Individual Programs. Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html (2018).
  71. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36, (5), 1277-1282 (2003).
  72. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Science. 19, (4), 642-657 (2010).
  73. Svergun, D. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25, (4), 495-503 (1992).
  74. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40, (3), 191-285 (2007).
  75. Svergun, D. I., et al. Protein hydration in solution: Experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, (5), 2267-2272 (1998).
  76. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42, (2), 342-346 (2009).
  77. Svergun, D. I. Restoring Low Resolution Structure of Biological Macromolecules from Solution Scattering Using Simulated Annealing. Biophysical Journal. 76, (6), 2879-2886 (1999).
  78. Jacques, D. A., Guss, J. M., Svergun, D. I., Trewhella, J. Publication guidelines for structural modelling of small-angle scattering data from biomolecules in solution. Acta Crystallographica Section D. 68, (6), 620-626 (2012).
  79. Heller, W. T., et al. The Bio-SANS instrument at the High Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory. Journal of Applied Crystallography. 47, (4), 1238-1246 (2014).
  80. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66, (10), 1735 (2003).
  81. Johnson, J. L., Kalyoncu, S., Lieberman, R. L. Heterologous Expression of Membrane Proteins: Methods and Protocols. Mus-Veteau, I. Springer. New York. 281-301 (2016).
  82. Department of Energy Public Access Plan. Available from: http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics