用于膜蛋白结构分析和从头建模的小角中子散射实验中的对比匹配洗涤剂

Biochemistry

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Summary

该协议演示了如何获得一个低分辨率的从头模型和洗涤剂-溶解膜蛋白在溶液中使用小角中子散射与洗涤剂的对比匹配的结构细节。

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Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss, K. L., Pingali, S. V., Lieberman, R. L., Urban, V. S. Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling. J. Vis. Exp. (140), e57901, doi:10.3791/57901 (2018).

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Abstract

橡树岭国家实验室高通量同位素反应器生物小角中子散射仪致力于生物材料、生物燃料加工和生物启发材料的研究, 涵盖纳米到微米长度刻度。本文介绍了在胶束成型洗涤剂溶液中研究膜蛋白 (这里, MmIAP, intramembrane aspartyl 蛋白酶, Methanoculleus marisnigri) 的物理性质 (尺寸和形状) 的方法。非常适合这种小角度中子散射仪器, 等等。其他生物物理表征技术由于无法在蛋白质洗涤剂复合结构中处理洗涤剂的贡献而受到阻碍。此外, 对生物氘化实验室的访问提供了独特的能力, 以制备大规模培养和表达氘标记蛋白, 增强散射信号从蛋白质。虽然这种技术不提供高分辨率的结构细节, 但膜蛋白结构知识缺口包含许多可寻址的研究领域, 而无需近原子分辨率。例如, 这些区域包括寡聚状态的测定、复杂的形成、摄动过程中的构象变化和折叠/展开事件。通过这种方法的应用, 可以很容易地完成这些调查。

Introduction

膜蛋白是由估计的30% 的所有基因1编码, 并代表了大多数现代药物的目标。2这些蛋白质执行一系列重要的细胞功能,3但尽管它们的丰度和重要性-仅代表在结构生物信息学 (蛋白质) 蛋白研究磁场中沉积的总结构的约1%数据银行。4由于其部分疏水性, 对膜结合蛋白的结构测定一直是极其具有挑战性的。5,6,7

由于许多生物物理技术需要在溶液中单分散颗粒进行测量, 因此在本机膜中隔离膜蛋白和稳定这些蛋白质是近年来研究的一个活跃领域。几十 年。8,9,10这些调查导致许多新的两亲性组件的发展溶解膜蛋白, 如 nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15和 amphipols。16,17然而, 洗涤剂胶束的使用仍然是满足给定蛋白质溶解度要求的最常见和最直接的方法之一。18,19,20,21,22,23,24,25不幸的是, 目前尚无单一洗涤剂或混合洗涤剂, 满足所有膜蛋白的存在;因此, 这些条件必须经过经验筛选, 以满足每种蛋白质的独特要求。26,27

洗涤剂在其临界胶束浓度以上的溶液中自组装, 形成称为胶束的聚合结构。胶束由许多洗涤剂单体组成 (通常范围从 20-200), 疏水性烷基链形成胶束芯和亲水性头组排列在胶束壳层, 面对水性溶剂。洗涤剂和胶束形成的行为是典型的查尔斯 Tanford 在疏水性作用,28和大小和形状的胶束从常用洗涤剂在膜蛋白研究已采用小角度散射特征。29,30对膜蛋白的洗涤剂组织也进行了研究, 并预期蛋白质洗涤剂复合物 (PDCs) 的形成与洗涤剂分子周围的蛋白质在一个安排, 类似于整洁的洗涤剂胶 束。31

使用洗涤剂的一个优点是, 所产生的胶束特性可以通过结合其他洗涤剂来操作。许多洗涤剂表现出理想的混合, 而混合胶束的选择性能甚至可以从组分和混合比例预测。22然而, 洗涤剂的存在仍然会给整个信号带来生物物理表征的挑战。例如, 使用 X 射线和光散射技术, PDC 中洗涤剂的信号与蛋白质几乎没有区别。32使用单粒子低温电子显微镜 (低温 EM) 进行的调查通常依赖于被困 (冰冻) 粒子;蛋白质的结构细节仍然被某些洗涤剂或高浓度的洗涤剂掩盖, 增加了背景。33通过计算方法来解释整个 PDC 结构 (包括洗涤剂) 的替代方法, 它试图在给定的膜蛋白周围重建洗涤剂。34

在中子散射的情况下, 胶束中洗涤剂的芯壳排列会产生一种有助于观测散射的形状因子。幸运的是, 可以更改解决方案组件, 使其不会对观察到的网络散射造成影响。这种 "对比匹配" 过程是通过用氘代替氢气来实现与背景 (缓冲器) 相匹配的散射长度密度来实现的。明智的选择洗涤剂 (与可用的氘代对应) 和他们的混合比例必须考虑。对于洗涤剂胶束, 这种替代可以使用同一头组的洗涤剂进行, 但具有氘代烷基链 (d-尾部而不是 h 尾)。由于洗涤剂混合良好,35它们的骨料将具有散射长度密度, 这是两个分量 (h 尾和 d 尾) 的摩尔分数加权平均值。当这种平均对比度与头部组一致时, 可以完全匹配均匀骨料结构, 以消除所有对观测到散射的贡献。

我们在这里介绍了一种通过将化学相同的洗涤剂分子与氘标记的烷基链结合在一起来操纵洗涤剂胶束中子对比度的协议。19,36,37这使得胶束核和壳体的同时对比度匹配, 这是一种独特的中子散射能力。35,38有了这一显著细化的细节水平, 对比度匹配可以使膜蛋白结构的其他不可行的研究。此外, 这种对比匹配方法可以扩展到其他涉及洗涤剂的系统, 如聚合物交换反应39和油水分散剂,40甚至其他增溶制剂, 如 bicelles,41nanodiscs,42或嵌段共聚物。43本手稿中概述的类似方法, 但在烷基链和/或头组采用了单一的含氘替代剂, 最近发表。37虽然这可以预期改善氢和氘在整个洗涤剂中的随机分布与此处介绍的方法相比, 在替代品和两个步骤的洗涤剂的可用位置数量有限洗涤剂的合成需要考虑更多的挑战。

下面详细介绍的协议步骤1和2经常重叠, 因为必须进行初步的实验规划才能提交质量建议。然而, 提案提交在这里被认为是第一步, 强调这一过程应该在中子实验之前很好地开始。还应指出的是, 建议应说明的一个先决条件步骤是对需要进行中子研究的样品进行生化和物理表征 (包括纯度和稳定性)。关于小角中子散射 (san) 的一般讨论超出了本文的范围。考夫曼44材料的参考工作表征中提供了一个简短而全面的介绍, 最近出版了一本以生物小角度溶液散射为重点的综合教科书。45在讨论部分给出了进一步建议的阅读。小角度散射使用所谓的散射矢量 Q 作为描述散射过程的中心量。本文使用广泛接受的定义 Q = 4π sin (θ)/λ, 其中θ是入射和散射光束的一半角, λ是埃中子辐射的波长。还存在使用不同符号 (如 "散射矢量") 的其他定义, 并且可能因2π或使用纳米代替埃而有所不同 (参见图 10的讨论)。

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Protocol

1. 准备并提交中子设施光束时间和仪器方案

  1. 请查阅在线资源, 以确定提供一般用户中子束时间访问的中子散射设施, 如橡树岭国家实验室 (ORNL)。有关中子设施的地图和有关全球中子研究的信息可在线获得。46请注意, 这些设施通常有定期要求的建议;这将确定下一个光束时间何时可用。中子用于各种应用;搜索小角度中子散射 (san) 仪器, 特别是那些具有生物样品能力的设备。
  2. 使用中子设施提供的资源帮助导航中子束时间提案提交过程。请咨询与您将应用的仪器相关的中子散射科学家 (NSS)。查看中子设施的当前有关建议要求、截止日期和提交建议的信息;对于橡树岭这是可用的在线。47提交成功提交的所有指导方针后, 提出梁时间建议。
  3. 如果需要氘代蛋白 (参见 2.2), 中子散射设施通常由实验室和专门用于生产氘代材料的专业技术支持。要请求访问 ORNL 的生物氘化实验室 (BDL), 请选择 BDL 作为建议系统中的第二个工具。虽然未就可行性和科学审查委员会审查无计划建议, 但 BDL 的要求仅限于可行性。为帮助进行 BDL 可行性审查, 请提交完整的信息请求表48 , 其中描述了蛋白质表达协议和估计产量 (在线提供)。
  4. 在对梁时间方案进行了成功的同行评审后, 在实验前确认了光束时间的授予日期。确保在建议中正确列出所有示例和缓冲区详细信息和公式, 以便进行正确的审核。对拟议的实验计划的任何更改, 包括样品和缓冲成分的变化, 都需要通知设施。
    注意:应尽快与分配的 NSS 讨论更改。

2. 确定中子对比度匹配点和蛋白质测量的必要对比度

  1. 收集与原子组成和体积有关的信息 (从供应商的产品信息、在线数据库、已发布的值) 与洗涤剂系统组件进行对比匹配。此信息用于确定中子散射长度密度 (SLDs), 从而使溶液中的对比度匹配点 (中医师), 这对于获得质量无数据和结构信息的相关的膜蛋白感兴趣的环境下是至关重要的。Pdc。包括用于膜蛋白生物物理研究中常用洗涤剂的物理性质和对比度匹配点的表 (表 1)。
  2. 使用 web 应用覆盖物确定中子 SLDs: 对比度变化数据分析的模块49 (免费在线50 )。"用户手册" 的链接位于主页上。访问网站并阅读随附的文档。图 1图 2提供了两个相关示例的对比模块输入和输出的概述。
    注意:其他用于计算 SLDs 的网站可用, 例如由国家标准和技术研究所 (NIST) 中子研究中心维护。51
    1. 单击左侧导航窗格中的 "对比度" 打开对比度模块。为项目标题提供文本, 并在下面输入有关两个组件 (洗涤剂头组和尾部) 的详细信息, 如 "亚基 1" 和 "亚基 2"。
    2. 在 "公式" 文本框中输入每个组件的分子公式。
      : 单选按钮 "M" 必须在 "物质类型" 下选择以进入分子公式。此外, 使用公式中的字母 "X" 表示易交换的氢原子。如果选择了相应的 "P"、"R" 或 "D" 单选按钮, 则可以输入蛋白质、RNA 或 DNA 序列。如果子单位中存在多个组件的副本, 则可以相应地更改 "Nmolecules" 的值。这里的一个实际例子涉及含有两个相同尾部的脂类洗涤剂, 允许一条尾巴的公式输入 Nmolecules 等于2。
    3. 在 "卷 (3)" 下面的框中为每个组件输入立方埃的体积。对长度为n、 V = 27.4 + n * 26.9 的烷基链使用 Tanford 公式28 , 以计算近似尾部体积, 或从提供的产品信息或发布的值中获取分子量文学。
    4. 输入缓冲区组件的详细信息。使用下拉菜单更改 "溶剂中的溶解物种数量" 以添加或删除每个缓冲区组件的行。在胶束成型洗涤剂的情况下, 在洗涤剂的临界胶束浓度 (CMC) 中包括游离洗涤剂单体作为单独的缓冲成分。
    5. 单击 "提交" 执行中子对比度计算, 并生成一个结果页, 其中提供了一个散射长度密度和对比度匹配点的表格, 以及用于在 D2O 的任意给定百分比中确定这些参数的公式。缓冲区。检查散射参数, 特别注意成分中医。如果匹配点相似 (10% D2O 以内), 且游离胶束浓度较低, 则平均 CMP 可用于与洗涤剂的配比相匹配。在大多数情况下, 洗涤剂头组和尾部的 CMP 会有10-15% 以上的差异, 在 san 数据中产生一个核壳形状因子, 混淆直接从蛋白质中收集散射信号。
  3. 评估洗涤剂头组和尾部的对比度。当洗涤剂头组和烷基链尾中医不匹配时 , 氘取代洗涤剂的可用性和加入可以允许纵的选择组分的散射长度密度。在大多数情况下, 这将需要形成一个混合胶束通过加入与氘取代烷基链相同的洗涤剂。氘的加入提高了烷基链尾形成的核的散射长度密度。在这种情况下, 所需的端点是, 头组壳 cmp 和烷基链核心 cmp 具有近似相等的值。
    1. 将洗涤剂胶束芯的 cmp 提高到与头组壳体的 cmp 大致相等, 方法是确定 h-尾和 d 尾之间混合的适当比例, 从而实现与头组的完全对比度匹配。这种测定的先决条件是对氘取代烷基链尾的 CMP 的了解。与麦芽糖苷 (DDM) 的商业可用的对应物是可用的所有烷基链氢取代氘 (d25-DDM)。重复步骤2.1 中概述的对比度计算, 以代替 "h 尾"。
    2. 计算与头组 CMP 的对比度所需的 h 尾与 d 尾的摩尔比。以下公式可协助确定:
      cmp= cmph 尾* χh-尾部+ CMPd-尾部 * χd-尾部
      其中 CMP 是散射长度密度, χ是洗涤剂头、h 尾或 d 尾分量的体积分数。对于 DDM 的缓冲解决方案, 将总洗涤剂的44% 重量 (43% by 摩尔) 作为 d25-DDM 使用氘取代烷基链, 在 48.5% D2O 中为头部和尾部组件生成一个 CMP。
  4. 考虑膜蛋白的氘替代程度。为了从蛋白质中测量足够的散射信号, 该蛋白质的 cmp 应至少 15% D2O 在溶液中远离洗涤剂 CMP 和测量条件。信号随着 this% 差的平方而增加。由于未标记蛋白的 cmp 通常发生在溶液中的约 42% D2O (cmp 类似于许多洗涤剂头组), 因此蛋白质的氘标记几乎总是必要的。52

3. 表达和纯化感兴趣的膜蛋白

  1. 准备 LB (溶源性汤) 培养基和生长大肠杆菌 (大肠杆菌)细胞, 为靶蛋白序列提供诱导表达载体。
    1. 准备最少的媒体。在 H2o 或 D2o, 溶解7.0 克/升 (NH4)2所以4, 5.25 克/升 Na2HPO4, 1.6 克/升 2 PO4, 0.50 克/升柠檬酸氢, 5.0 克/升甘油, 1.0 毫升/升的20% 瓦特/v MgSO4· 7H2o 和1.0 毫升/升的霍姆微量金属 (0.50 克/升 CaCl2· 2H2O, 0.098 克/升 CoCl2, 0.102 克/升丘索4, 16.7 克/升 FeCl3· 6H2O, 0.114 克/升 MnSO4·H2o, 22.3 克/升 Na2EDTA·2H2O 和0.112 克/升硫酸锌4·H2O)。53,54
    2. 使用 H2o 或 D2o 制备适当的抗生素库存解决方案。
    3. 使用 H2o 或 D2o 准备 isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside 库存解决方案。
    4. 无菌-使用0.22 微米孔径的瓶顶真空和注射器过滤器将所有溶液过滤成干燥、无菌容器。
  2. 在扩大氘代蛋白的过度表达之前, 将大肠杆菌细胞适应氘标记培养基。
    1. 接种3毫升磅培养基与一个孤立的殖民地从溶源性汤 (LB) 琼脂板或从冷冻甘油库存的细胞。在振动孵化器中以 250 RPM 的37摄氏度生长细胞, 或将温度降至30摄氏度或以下, 以避免在夜间孵化时培养出过度的文化。
      注意:适应程序可以改变。55,56,57
    2. 一旦 LB 文化增长到光密度在 600 nm (OD600) 的 ~ 1, 稀释它1:20 在3毫升的 H2O 最小培养基和增长到 OD600的 ~ 1。使用包含50、75和 100% D2o (或达到所需的 d2o 百分比) 的最小培养基重复1:20 稀释。
      : 随着 D2O 含量的增加, 增长率将会下降。文献中报道了生长培养基中 D2O 的比例与蛋白质氘替代的关系。58,59,60
    3. 继续发展生物反应器中的培养, 以提高氘代细胞质量 (图 3)。
      注意:在别处对生物反应器操作的分步程序进行了审查。61,62,63,64
  3. 采集和裂解大肠杆菌细胞, 用于膜萃取和蛋白质纯化
    1. 在4摄氏度下离心 6000 x g, 在30-45 分钟内将细胞颗粒沉淀。
    2. 在冰上浸泡缓冲液, 使细胞颗粒软化30分钟。然后, 轻轻地将细胞颗粒悬浮在缓冲液中, 用血清吸管轻轻移液, 或在2D 摇杆上轻柔摇动, 最终浓度为 1 g 湿细胞 mass/10 毫升缓冲液。
      : 一个示例缓冲区是50毫米 HEPES (4-(2-羟乙基)-1-piperazineethanesulfonic 酸), pH 7.5, 200 毫米氯化钠辅以蛋白酶抑制剂片剂。
    3. 裂解重悬细胞三通过高压均质机在 1万 psi, 同时冷却流出。
      注意:根据所需的比例, 可以使用其他裂解方法 (例如,由法国媒体或超声)。
    4. 颗粒细胞碎片离心在约 4000-5000 x g 15 分钟在4摄氏度。重复此步骤, 直到澄清上清。
    5. 超速离心 (约 15万 x g 30-45 分钟) 上一步中的上清液, 其中含有可溶性和膜组分。超速离心后的颗粒包含膜的分数。
    6. 在大型冲击均质机中重悬膜球团, 再通过超速离心 (步骤 3.3.5) 分离膜组分。重复此步骤至少一次删除松散绑定的蛋白质。
    7. 溶解膜通过轻柔摇动在4摄氏度的30分钟, 在含有适合纯化的洗涤剂的缓冲液中。当悬浮液从多云变为透明时, 溶解是明显的。通过超速离心去除不溶性材料 (约 15万 x g 30-45 分钟)。
      注意:示例缓冲区为 50 mm HEPES、pH 7.5、500 mM 氯化钠、20 mM 咪唑和 4% (w/v) DDM, 用于通过 Ni2 +亲和层析进行纯化。
  4. 按照以前为质子化表单开发的协议纯化蛋白质。
    注意:有关 hexahistidine 标记m. marisnigri JR1 intramembrane aspartyl 蛋白酶 (d-MmIAP) 的示例纯化协议, 请参阅 Naing65从 5 L 氘代细胞培养生长中, 氘代的最终产量为1毫克, 全部用于无实验 (图 4)。
  5. 将纯化的蛋白质交换到 "最终交换缓冲区" 进行对比匹配。
    1. 准备200毫升的 "最终交换缓冲液" 包含正确的混合物的对比度匹配,例如,20 毫米 HEPES, pH 7.5, 250 毫米氯化钠和0.05% 总 ddm (0.028% ddm 和 0.022% d25-DDM) 在 49% D2O。
    2. 平衡采用快速蛋白质液相色谱 (FPLC) 系统, 在3.5.1 中使用 "最终交换缓冲器" 的 > 2 列卷 (CV) 的大小排除列。
    3. 注射样品后, 运行该列并分离与所感兴趣的蛋白质相对应的分数。
    4. 将蛋白质浓缩到所需的最终浓度 (2-5 毫克/毫升)。
      注意:需要300微升的体积来填充用于 san 的 1 mm 圆柱形石英试管。
    5. 为无背景减法保留匹配缓冲区的等分。
      注意:等分可直接从准备好的缓冲液中取出, 也可以从 FPLC 运行结束时的清洁洗脱分数中理想地进行。

4. 为光束时间进行最后准备并收集 san 数据

  1. 在接受建议并批准网站访问后, 请在指定的光束时间之前完成所有必需的培训。这包括 prearrival、基于网络的培训以及现场辐射、实验室和仪器特定的培训。
    注意:培训要求可能决定首次用户的提前到达。更多信息可在线获取。66
  2. 为数据收集加载示例和缓冲区。
    注意:生物小角中子散射 (生物 san) 仪器样品环境区域概述如图 5所示。
    1. 将样品和缓冲器加载到石英电池中。石英电池可从仪器的科学家或设施。使用凝胶加载提示来访问大多数样品细胞的狭窄开口。
    2. 确保光束快门闭合, 然后接近样品环境区域并将石英电池放置在样品更换器中。记录每个样品单元的样品更换器位置。
    3. 检查区域并确保光束路径无障碍物, 然后离开样品环境区域并打开光束快门。
      注意:仔细遵守所有设施的规章制度, 服从所有的张贴, 并听从仪器科学家的建议。样品不得从光束中移除并在接触光束后进行操作, 而无需遵循特殊的预防措施。在这些程序之前, 请咨询放射控制技术员 (RCT)。
  3. 执行表扫描以实现自动数据收集
    1. 通过自定义控制 LabVIEW 软件、光谱仪仪表控制环境 (香料) 操作仪器。按照中子散射科学家提供的仪器操作说明进行。图 6提供了表扫描操作窗口的概述。
    2. 在输入适当区域所需的信息后, 执行表扫描, 并将开始自动数据收集过程。通过 "表扫描状态" 选项卡监视进度。

5. 将 san 数据从2D 图像减少到1D 图

  1. 从记录的扫描编号中识别每个样本和缓冲区数据文件。每个测量值将被分配一个唯一的扫描编号。此信息在减少数据时非常有用, 以识别每个对应的采样和缓冲区对。
  2. 使用 MantidPlot 软件和 Python 脚本减少
    1. 中子散射用户提供帐户详细信息, 以访问远程分析群集上的数据。67登录到远程分析群集并从命令行执行 "MantidPlot"。图 7图 8提供了帮助这些步骤。
    2. 从中子散射科学家那里获得用户减少脚本 (这通常会在实验过程中发生);此脚本是基于 Python 的, 将包含所有必要的校准和缩放调整, 以将2D 散射图像减小为散射角的函数 (Q) 的1D 散度图。
    3. 在 MantidPlot 中打开提供的用户减少脚本, 并在相应列表中放置相应的扫描编号或示例和缓冲区对的标识。
    4. 执行脚本以四列文本文件生成减少的数据 (列顺序是 q、i (q)、i (q) 错误、q 错误) 在指定的位置。右键单击 MantidPlot 中适当的工作区, 然后选择 "图解与错误...", 以便对散射剖面进行初步检查。

6. 分析散射粒子结构参数的数据

  1. 使用安全 FTP 文件传输将减少的数据文件从分析服务器传输到本地计算机。可以使用 FileZilla 或 CyberDuck 等软件执行此操作。analysis.sns.gov 登录页上提供了有关连接到分析服务器文件系统的其他说明和详细信息。
  2. 下载 ATSAS 软件套件65,68 (整个 ATSAS 套件)。69个单独的程序70也可联机用于分析 san 数据, 即确定结构参数和从头模型。
    注意:许多选项可用于生物大分子的 san 数据分析。45
  3. 使用71用于数据绘制、缓冲区缩放和减法以及吉尼尔分析。
    1. 启动 ATSAS "SAS 数据分析" 应用程序, 并加载与示例和缓冲区对相对应的减少的数据文件。
      1. 要正确缩放缓冲区, 请在高 q (q > 0.5-1) 中选择一个数据区域, 其中两个配置文件都相似且平坦, 然后单击位于 "操作" 选项卡下的 "缩放" 按钮。比例因子将应用到缓冲区, 以便这两个平面区域应重叠。谨慎使用: 应该有一个合理的物理原因来调整缓冲强度以匹配样本。如果差异很大, 请咨询仪器科学家以获得有效的背景减法方法。44,45,72
      2. 增加数据范围以查看所有点。单击 "减法" 执行此操作。右键单击图例中的缓冲减去的文件, 然后保存此文档以进行后续分析。图 9概述了 "操作" 选项卡的使用情况。
    2. 使用 "SAS 数据分析" 应用程序的 "分析" 选项卡对缓冲区减去的示例数据执行吉尼尔分析。
      1. 确保在列表中选择了正确的文件, 然后单击 "回转的半径"。单击 "Autorg" 按钮将提供自动执行吉尼尔拟合的尝试。
      2. 扩展用于包括所有低 q 数据的数据范围, 并通过带走高 q 点来开始缩小数据范围, 直到 Qmaxg限制低于1.3。使用残差图来验证数据在拟合范围内是否为线性。吉尼尔适合产生散射粒子的近似 Rg和 I0
      3. 对拟合区域进行小调整, 并监视这些值对拟合中使用的数据范围的敏感性。图 10A展示了 "回转半径" 工具的使用。
  4. 获取 GNOM 中的概率分布函数 (P (r))。73此处生成的输出文件将用作从头建模过程的输入。
    1. 在 "分析" 选项卡中启动距离分布向导. 获得良好的数据符合性对于获得质量模型至关重要。有关获得准确匹配的更多信息, 请参阅74的评论,等等
      注意: GNOM 程序提供了有关超出距离分布向导的配合的其他信息。图 10B展示了 "距离分布" 工具的正确使用,图 11说明了遇到的一些常见错误。
    2. 确定 Dmax, 分子内最大原子间距离。
      1. 通过取消选中该框以强制 Rmax=0 并为 Dmax (例如 150 Dmax) 输入较大值来估计的值。P (r) 图中的第一个 x 截距产生此估计值。
      2. 对此 Dmax 值和所使用的数据范围或拟合中使用的点数进行增量更改, 以优化 GNOM 适合于数据和生成的 P (r) 曲线。
    3. 继续细化 GNOM 拟合, 并保存具有良好拟合参数的 GNOM 输出文件, 以用于后续的从头建模步骤。
  5. 使用程序 CRYSON 模拟来自高分辨率 PDB 模型的 san 配置文件。75
    1. 打开程序并选择选项 "0"。在弹出式文件浏览器中选择 PDB 文件名称。按 enter 接受默认设置, 除非指定链氘化分数和溶剂中 D2O 的分数, 以达到适当的对比度参数。
    2. 通过输入 "Y" 并在弹出式文件浏览器中选择数据文件, 将模型拟合到实验数据集。接受剩余的默认值, 输出文件将写入 PDB 文件位置。". fit" 文件包含来自高分辨率3D 模型的预测散射剖面信息。

7. 从 san 数据创建从头模型。

: DAMMIF76和 DAMMIN77在 ATSAS 软件套件中用于重建虚拟原子模型 (水坝) 使用模拟退火过程从 GNOM 输出, 其中包含 P (r) 数据, 或有关概率的信息或散射粒子内原子间距离的频率。这些程序可以在批处理模式或 ATSAS 联机 web 服务器上运行。

  1. 从 "SAS 数据分析" 的 "分析" 选项卡上的 "Dammif" 按钮启动 "博智形状向导", 并使用手动选择参数。向导的输入如图 12所示。
    1. 从 fit (步骤 6.3.2) 定义吉尼尔范围, 然后使用导航按钮继续执行下一步。从 P (r) 图中定义拟合值 (步骤 6.4), 然后继续执行下一步骤。
    2. 从头建模过程提供参数。输入模型输出文件名的前缀 (例如, SANSEnvelope), 选择 "快速" 或 "慢" 模式建模, 输入模型数量的值 (17 推荐用于统计意义), 从可用的粒子对称选项中进行选择,anisometry 和角度刻度 (如果已知)。确保将复选框检查为具有 DAMAVER 的平均模型, 并使用 DAMMIN 优化最终模型。
    3. 使用 "提交" 按钮启动进程。完成该过程后, 查看并保存工作目录。
      注意: 一个单一的小蛋白质的典型的建模过程可能需要几个小时与典型个人计算机。文件存储在临时目录中, 直到保存。
  2. 使用 ATSAS 内的 SUPCOMB 叠加并叠加最终的无封套与相关的高分辨率模型。将高分辨率 PDB 模型的副本放入工作目录中的 san 信封。使用 PDB 文件名作为包含第一个模板结构的两个参数的命令行执行 SUPCOMB: $ SUPCOMB 雇用. pdb SANSEnvelope. pdb
    注意:列出的第二个文件名将被重写为一个新文件, 其中 "r" 追加到末尾, 并在模板结构上具有叠加的新坐标。
  3. 使用 PyMOL (pymol.org) (3D 分子图形查看程序) 可视化从头模型结果。图 13提供了 PyMOL 操作的概述。
    注意:有关于生物分子在溶液中的小角散射数据的结构建模的出版指南。78
    1. 启动 PyMOL 应用程序并打开与 3D san 信封对应的. pdb 文件和要查看的 SUPCOMB 对齐的高分辨率结构。
    2. 通过将此模型表示为曲面来可视化 san 信封。单击模型旁边的 "S" 按钮, 然后选择 "显示: 为: 曲面"。
    3. 通过将此模型表示为卡通, 可视化高分辨率蛋白质主干结构。选择此模型旁边的 "S" 按钮, 然后选择 "显示: 为: 卡通"。通过选择 "C" 按钮和 "按链: Chainbows", 将链显示为从 N 到 C 终点的彩虹。
    4. 修改曲面表示的透明度以实现清晰度。从 "设置" 菜单栏中, 选择 "透明度»表面» 40%"。
    5. 使背景为白色和不透明。从 "显示" 菜单栏中, 选择 "背景»", 然后选择 "不透明" 以取消选中此选项和 "白色" 标记背景颜色。
      : PyMOL 的其他操作和用途可在 PyMolWiki.org 中找到。

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Representative Results

光束时间和仪器建议应清楚地将所需的所有资料传达给审查委员会, 以便对所提议的试验进行有效的评估。对于经验不足的用户, 强烈建议与 NSS 进行通信。NSS 可以评估初步可行性并指导提案提交, 以强调可行性、安全性和高影响科学的潜力。建议中提供的资料应包括背景资料和背景, 以说明研究的重要性;预计将获得的知识, 以及这对相关科学领域目前的理解有何影响;将使用的工作、样本、方法和程序的描述;和 (如果适用) 该设施的团队以前的生产力, 包括相关的出版物和结果。可通过中子科学用户门户 (中子. ornl) 向用户提供有用的资源, 如建议模板和准备建议的提示。

实验计划是一个动态过程, 通常在建议提交的初始阶段开始, 但在实验之前可能无法完全构思。但是, 请记住, 在实验开始前, 该设施必须批准与建议中的描述 (包括对缓冲条件或样品合成的更改) 显著偏离的任何更改。

本协议假设成功地证明了溶液中洗涤剂胶束中膜蛋白的表达和纯化方法。在这种情况下, 膜蛋白的兴趣是一个 intramembrane aspartyl 蛋白酶 (IAP), 它有一个既定的纯化协议, 并已被确定为可溶性和活性在包含 DDM 胶束的缓冲区。

在这里, 我们演示使用覆盖物的中子对比度计算: 对比度模块, 用于比较匹配的混合 DDM/d25-DDM 胶束中的 IAP 蛋白溶液。本文所述的策略是首先确定两种洗涤剂之间的混合程度, 以实现胶束的完全对比度匹配。最终的结果是确定每个组件和背景的相对对比度 (H2o/D2o 比率) 所需的对比-匹配从洗涤剂的散射, 以仅观察蛋白质散射。

图 1展示了覆盖对比度模块的正确输入, 以及对 DDM 洗涤剂头组和尾部作为亚基1和2的对比度计算结果的输出。用于头组的公式为 c12H14X7O11 , 体积为348埃3, 烷基链尾公式为 c12H25 , 体积为350埃3

从对比模块输出可以看出, DDM 头组和尾部具有不同的散射长度密度, 因此两个分量之间的对比度将被观察到。对于 DDM, 头组的 cmp 在 49% d2o, 而烷基链尾有 cmp 在 2% D2o, 其平均 CMP 发生在 22% D2o。因此, 下一步的目的是设计一个混合胶束, 结合氘取代烷基链, 以增加洗涤剂尾巴的平均 cmp, 以匹配的 cmp 的头组。对比计算被重复的替代洗涤剂, DDM 与一个完全氘代尾巴 (d25-DDM), 这同样导致头部组和尾巴之间的对比。但是, h 尾和 d 尾的对比度值明显不同。记得洗涤剂混合物是已知的在溶液中产生良好的混合胶束,22因此, 这些 h 和 d-尾在胶束核心的混合应产生平均 SLD 等于头组壳, 形成一个胶束与单一 CMP。由于头组是 DDM 和 d25-DDM 的共同之处, 该策略是找到这些洗涤剂的混合物, 产生从混合尾的平均对比度值与头组的对比度。

洗涤剂尾部的目标平均 CMP 是麦芽糖苷头组, 或 49% D2O。要估计每个 h 尾和 d 尾分量的平均 CMP 率, 必须知道。表 1提供了一些常用洗涤剂和商业上可用的氘标签对应的值。对 DDM 和 d25-DDM 使用这些 CMP 值, 满足步骤2.2 中提供的等式的 h 尾和 d 尾的摩尔分数为χd 尾= 0.43。

图 2展示了覆盖对比度模块的更高级输入, 可用于确认最终的混合胶束对比度匹配条件, 并确定蛋白质所需的氘化程度。在这里, 亚基1是指与2组分, DDM 和 d25-DDM 的对比匹配的混合胶束, 而亚基2是指m marisnigri JR1 intramembrane aspartyl 蛋白酶 (MmIAP) 给出的氨基酸序列。在氘代生长培养基中, 该蛋白的 SLD 被提升, 以产生含有约 92% D2O 的缓冲液中的蛋白质 CMP。92% d2o 中蛋白质匹配点与测量条件 (48.5% D2o) 之间的分离程度表明, 将从蛋白质中获得足够的散射信号。

用罗塞塔 2大肠杆菌细胞窝藏 pET22b-MmIAP 载体, 进行 d-MmIAP 的生产。选择 90% D2O 中未标记甘油的最小培养基作为生长培养基。在适应 90% D2O 最小培养基后, 培养体积被扩展到400毫升, 用于在 90% l 生物反应器容器中接种 3.6 l 的新鲜 2 D5.5O 最小培养基。

图 3提供了在分批种植期间的过程值的跟踪。接种时, 温度设定点为30摄氏度, 溶解氧 (做) 设定点为 100%, 搅拌设置点为 200 rpm, 压缩空气流速为4升/分。pH 值高于设定点 6.9, 使用 90% D2O 中的氢氧化钠的10% 瓦/v 溶液。一旦做穗状信号耗尽初始的5克/升甘油, 喂食 (30% 瓦特/v 甘油, 0.2% MgSO4在 90% D2O) 开始, 这继续在整个种植。经过大约7小时的喂食, 培养温度降至18摄氏度, isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside 被添加到最终浓度 1 mM。在收获的文化, 大约145克湿重的细胞膏通过离心收集 (6000 x g 45 分钟)

纯化 d-MmIAP 进行质子化酶, 除了酶产量显著降低, 最终纯度略低于典型。从 5 L, 约20克湿膜被隔离, 所有这些都是溶解在 DDM 纯化和加载到第一 Ni2 +亲和柱。为了最大限度地提高纯化率, 在 Ni2 +亲和性柱上稀释并重新运行了流过馏分。在用尺寸排除色谱法抛光浓缩 d-MmIAP 样品之前, 第三次重复该过程 (图 4)。

图 5描述了石英样品电池及其相关的样品更换器设置。示例环境由生物 san 运营团队和 NSS 管理。可以安排各种不同的环境来进行温度控制、湿度控制、机械翻滚、高温和持续压力等测量。

图 6演示了生物 san 操作和自动表扫描的执行。表扫描配置为直观且用户友好。在第一个选项卡 (负载样本) 中, 提供有关样品更换器和设置的信息, 例如样品更换装置中每个位置的样品识别、细胞厚度和样品类型 (开梁、样品、背景)。还可以在此处应用其他元数据标记。在下一个选项卡 (计划实验) 中, 定义仪器配置和任何相关参数 (如温度控制)。此步骤由 NSS 在实验开始时安排。用户必须简单地输入每个样本的测量时间 (以秒为单位)。最终选项卡 (执行扫描) 提供表扫描数据的摘要, 并允许执行自动扫描。

在对2D 散射图像进行记录后, 必须将此数据减至1D 图的强度与 Q-散射角函数。在减少数据的过程中, 还会应用像素敏感度掩码和深色背景增减等图像校正。MantidPlot 软件旨在解释原始的无生物仪器数据。在实验结束时, NSS 通常会帮助减少和检索最终数据。

图 7提供了对 MantidPlot 的远程分析群集访问和用于减少数据的脚本窗口的概述。通过 UCAMS/XCAMS 用户身份验证, 可在远程分析群集 (analysis.sns.gov) 中访问原始数据。登录到远程桌面后, 只需在任何路径下执行 "MantidPlot", 即可从终端窗口启动 MantidPlot 软件。在 MantidPlot 中打开 "脚本" 窗口, 并按照 NSS 的指示编辑用户缩减脚本。执行此脚本将生成减少的数据文件, 然后可以将其传输到本地计算机, 以便使用安全 FTP 进行分析。

图 8演示了在执行用户缩减脚本后绘制和查看数据. 减少的数据将显示在 "工作区" 窗口中。默认情况下, 最终合并的数据将追加后缀 _f。右键单击将允许选择错误的打印频谱和要绘制的数据。通过从 "视图" 菜单栏中选择首选项, 可以访问显示首选项。通过双击轴可轻松访问轴和绘图范围的格式。缓冲区的散射剖面 (不包含显著尺寸的散射粒子) 应显示为相对平坦的线 (恒定强度)。对于样品, 应在低散射角 (Q) 下观察强度, 并将指数衰减到平坦的非相干背景。

图 9提供了在数据缩减后使用 SAS 数据分析 (或 primusqt) 软件包进行适当缓冲减法的概述。通常情况下, 非相干背景 (高 Q 强度) 在样本和缓冲器之间稍有不匹配。对于适当的减法, 此区域中的数据应重叠。刻度校正将强度比例因子应用于导致数据重叠的数据, 并且可以执行减法运算。如果比例因子导致缓冲区数据点的强度大于示例中的相应点, 则这些点将为负数, 而不会在日志图解中呈现。如果缓冲区减去文件中的负值是丰富的, 则在缓冲区比例因子中进行较小的缩减并再次执行减法。

图 10提供了吉尼尔和距离分布向导的示例用法。吉尼尔分析提供了从低角度散射数据中回转粒子半径的初步估计。当数据方法为零时, 数据中应存在线性区域。此区域中的线的拟合允许从斜率中确定 Rg , 并从 Q=0 的强度截距推断 I0 。当 Q 接近零时, 数据的向上趋势表示样本中的聚合, 而向下的趋势通常预示着颗粒间斥力。当残差分布非随机时, 这些趋势最为明显。吉尼尔适合球形粒子的上限由 Q * Rg < 1.3 (' ' 在 ATSAS 软件中用于 q 的位置) 限制。

Rg确定的 d-MmIAP 从这个吉尼尔适合是15.4 ±1.1 埃与估计 I0给定为0.580 ±0.001。

距离分布向导允许对 P (r) 拟合的参数进行系统更改。P (r) 曲线是曲线拟合到实验数据的间接傅立叶变换。因此, 必须验证左侧面板中的拟合是否准确地反映了实验数据。对于本例中所示的拟合, 获得了 46 Dmax。

图 11说明了 Dmax 选择中的常见错误。人为大的 Dmax 通常导致 p (r) 值变为负值, 因为 p (r) 函数围绕 x 轴振荡。人为小的 Dmax 导致截断的 P (r) 曲线与突然过渡到 Rmax=0。

"博智形状向导" 中的第一步与吉尼尔和距离分布向导相同。一旦提供此信息以获得与实验数据的良好匹配,从头开始模型设置配置。

图 12说明了 "博智形状向导" 的正确输入。在这里, 在埃中提供了用于 IAP 的实验 san 数据, 并给出了 "SANSEnvelope" 的预期文件前缀。一组17初始的虚拟原子模型被要求生成使用 "快速" 模型模式没有对称 (P1) 应用和没有 anisometry 选择。17个模型集将与 DAMAVER 对齐、平均和过滤, 使用 DAMMIN 优化的平均模型。对前缀damsel.log 文本文档的检查提供了选择标准和从集合中丢弃的任何模型的摘要。最后的精炼模型被写为 SANSEnvelope-1. pdb。

程序 SUPCOMB 用于执行 san 信封模型与高分辨率模型的叠加, 只有两个 PDB 结构文件作为输入。默认情况下, "r" 追加到重新定向和叠加的文件名。

一旦无封套和高分辨率结构叠加, 这些模型可以使用任何分子图形查看程序进行可视化。PyMOL 的结果适用于出版物质量图像, 可用于强调与结构调查有关的生物物理结果。在这里, 我们演示了一些基本的 PyMOL 操作, 用于提供3D 表示和生成的叠加结构的视图。

图 13提供了 PyMOL 可视化过程的概述。在 PyMOL 中打开 PDB 结构文件后, 模型应在 PyMOL 查看器窗口中可见。使用每个文件名旁边的 "S" 按钮更改每个模型的表示形式。使用无封套的表面表示形式和高分辨率模型中蛋白质主干的卡通表示。从 "C" 按钮下的可用选项中选择合适的配色方案。对于蛋白质链, "chainbow" 着色提供从 N 到 c-终点的颜色梯度, 以帮助解释。透明度应用于表面表征, 以便更好地可视化信封内的蛋白质结构。对于发布图像, 建议使用白色背景。一旦应用了这些可视化队列, 就可以检查3D 结构。可以通过单击和拖动结构来执行透视和分子旋转/平移的操作。

Figure 1
图1。使用覆盖对比度模块来确定麦芽糖苷 (DDM) 组件的对比度参数.输入值显示在左侧的屏幕上, 右侧的后续输出。通过单击每个屏幕左侧的导航菜单中的 "对比度" (绿色圆圈), 可访问对比模块输入页面。项目标题、缓冲区组件和子单元1和2的输入区域被标记为这样。输出页面包含所述系统的重要粒子信息和对比度属性。相关表格和计算出的匹配点以橙色装箱, 以实现清晰度。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 2
图2。使用覆盖对比度模块来确定膜蛋白洗涤剂复合物组分的对比度参数.在此实例中, 给出了在缓冲解决方案中描述整体 PDC 系统的输入。亚基1描述了与43% 由摩尔作为 d25-DDM 的 DDM 组成的对比匹配混合胶束。亚基2描述膜蛋白, 以氨基酸序列为 MmIAP 输入作为公式。氘化水平 (绿色圆圈) 描述了氘替代的蛋白质的程度, 并直接影响的 SLD 和计算的匹配点, 将估计的蛋白质。结果 (橙色框) 表明混合洗涤剂的匹配点将发生在 48.5% D2o, 而蛋白质的匹配点发生在 ~ 90% D2O.请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 3
图3。样品制备-生物反应器跟踪。显示的过程值为温度设定点 (橙色线)、溶解氧 (做) 设定点 (蓝线)、搅拌设置点 (红线) 和压缩空气流速 (粉红色线)。泵 1 (绿线) 用于 pH 控制。在18:40 的初始甘油的执行峰值, 并被用来启动通过泵 2 (黑线) 的甘油溶液的喂养。X 轴表示小时。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 4
图4。样品制备–样品的 FPLC 和 SDS 页面表征。MmIAP 平衡的最终尺寸排除色谱图为 20 mM HEPES、pH 7.5、250 mM 氯化钠、48.5% d2O 和0.05% 总 DDM, 其中 44% (w/v) 为尾氘代 d25-DDM。插页: SDS-页面分析与考马斯染色。在 san 实验中使用了共用分数标记为 A、b 和 c 区域 "b"。注释分子量标记在 kDa。通过 Naing许可复制的图像。65请点击这里查看这个数字的更大版本. 

Figure 5
图5。数据采集-石英班卓琴样品单元和自动进样装置。(A)一个空的石英班卓琴单元显示在自动进样块的静止。单元格填充样本并插入到15个可用位置之一。(B)样品块安装在探头水箱入口处的光束管延长器和硅窗口之间的孔径选择 (未显示) 后面。连接到温度控制的水浴和整个样品块中的通道的软管可在样品位置提供温度调节。箭头指示中子光束的方向。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 6
图6。数据收集–香料操作和表扫描概述。表扫描操作可从香料仪表控制软件的最左侧菜单上的 "表扫描" 按钮访问。绿色箭头表示屏幕顶部的活动选项卡, 橙色框突出显示活动用户输入表中的区域。(A)表扫描的第一个选项卡用于提供有关样品更换器和样品单元位置的信息。为样品更换器中使用的每个位置提供标签、样品厚度和样品类型。选中 "执行扫描" 框会将相应的行添加到表扫描队列中。(B)在第二个选项卡上, 记录每个样品的仪器配置和测量时间的详细信息 (以秒为单位)。仪器配置由中子散射科学家预先配置, 并根据光束时间和仪器方案中提供的细节提供给用户。可以将其他参数添加到仪表控制中, 例如在整个测量队列中定义温度设定值和保持时间的能力。(C) "最终" 选项卡提供对表中每一行进行的测量的概述。如果不需要更改, 则通过单击 "执行扫描" 按钮启动自动扫描。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 7
图7。数据缩减-减少脚本和 MantidPlot 操作概述。MantidPlot 软件可在分析群集上访问, 方法是在任何活动目录的终端命令提示符处键入 "MantidPlot" (将黄色圆圈和箭头添加为重点)。软件打开后, 访问脚本窗口 (按绿色标记的按钮切换) 并打开中子散射科学家提供的脚本。按照脚本中提供的说明操作, 这只需要在列表中输入每个样本和缓冲区的扫描编号, 以便自动还原, 以及用于传输和光束的减法和空光束的扫描编号中心确定。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 8
图8。数据分析–使用 MantidPlot 绘制数据。数据在 MantidPlot 中被引用为 "工作区"。将使用用户减少脚本生成的文件名填充工作区区域。1D 数据集的工作空间数据可以通过右键单击工作区并选择 "打印有错误的频谱图" 来绘制。通过简单地拖放工作区, 可以将其他数据添加到当前图中。可以通过从 "视图" 菜单栏中选择 "首选项" 或双击坐标轴标签来执行打印窗口的格式设置 (例如日志日志图)。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 9
图9。数据分析– ATSAS 软件: 基本操作和缓冲减法。primusqt 应用程序 (SAS 数据分析) 提供了适当的背景 (缓冲区) 减法的可视化。缓冲区文件应缩放为减法, 这样, 数据重叠在高 Q (其中散射是平坦的结果从非相干背景的剩余信号)。选择此高 Q 范围的数据时, 缩放操作将对表中的较低数据文件应用比例因子, 从而在定义的区域中产生重叠。缩放后, 可以减去缓冲区文件以产生粒子的净散射剖面。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 10
图10。数据分析–吉尼尔和 P (r) (距离分布) 确定。(A)吉尼尔向导用于执行吉尼尔分析, 提供 I0和 Rg的初始估计值。粒子类型和要拟合的数据范围用于定义拟合。在左侧显示拟合和相应残差的图解, 而吉尼尔术语 (I0和 rg)、Q * Rg限制和线性拟合质量在橙色框标记的区域中作为输出提供。(B) "博远距离分布向导" 用于执行距离分布分析, 提供用于定义散射粒子内原子间距离概率的 P (r) 曲线, 包括 Dmax 或最大原子间距离。可以系统地研究橙色方框所指示的参数, 以确定合适的距离分布函数。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 11
图11。距离分布分析结果不正确.正确选择的 Dmax 应生成 P (r) 曲线, 其峰值逐渐衰减为零。Dmax 值太大将可能产生负 P (r) 值或在 x 轴附近的振荡, 在高值的 r. Dmax 值是人为小通常导致 P (r) 曲线中的上限出现截断。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 12
图12。建模–使用 "博智形状向导"从头模型设置.从头建模参数在单个输入窗口中提供。为输出文件名提供前缀, 其他选项用于处理可用。退火过程可以是快速的 (更大的珠与更快的冷却) 或慢 (较小的微珠, 冷却较慢)。重复次数应足够大, 以检查模型特征的重现性。如果已知, 可以提供粒子对称性和 anisometry。角度刻度应与测量数据的单位相对应。DAMAVER 平均将对齐和平均所有虚原子模型, 然后应用选择条件排除任何异常值模型。如果选择了此选项, 则将使用 DAMMIN 进一步细化来自平均模型的固定原子的核心。此优化模型应表示实验 san 配置文件的3D 低分辨率信封。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 13
图13。可视化-使用 PyMOL 的高分辨率模型的实验无封套和叠加.在 PyMOL 中打开 PDB 结构文件后, 模型将出现在 PyMOL 查看器中。活动模型在右侧的表中列出, 以及可用于操作模型及其表示形式的操作按钮。为了可视化这些模型, 提供了基本操作, 使 san 信封和高分辨率结构之间的协议区域 (或不匹配) 得以识别。请点击这里查看这个数字的更大版本.

表1。膜蛋白研究中常用洗涤剂的物理特性.请点击这里下载此文件.

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Discussion

结构生物学研究人员利用互补的结构技术, 如溶液散射, 获得生物化学和结构细节 (如整体大小和形状) 从生物分子在溶液中。san 是一种特别吸引人的技术, 用于确定膜蛋白的低分辨率结构, 这是现代结构生物学和生物化学的核心重点。san 需要与晶体试验 (1 毫克/样品) 相媲美的纯化蛋白数量。最近扩大的商业可用性与膜蛋白研究相关的高纯度氘代洗涤剂使可获取的手段来操纵这种氢/氘含量的无膜蛋白洗涤剂复合物实验,允许直接记录蛋白信号。当成功时, 从头模型分子包络可以计算从收集的数据在短短几个小时。因此, 膜蛋白生物化学家、生物和结构生物学家可以很容易地利用 san 获得令人垂涎的初始3D 模型的膜蛋白在溶液中, 结构在复杂的结合合作伙伴或基板, 并获得模型通过 san 可用于相位衍射数据。常规使用 san 来表征膜蛋白对膜蛋白质生物化学领域具有革命性的影响, 从基本结构功能到药物发现和开发都有连锁反应。与氘置换相匹配的中子对比度的增加优势使 san 成为研究蛋白质 - 蛋白质、蛋白质 - DNA 或其他生物分子复合物的宝贵技术 , 这些化合物可以在氢 / 氘含量中轻易地纵。

有关小角度散射仪设计和理论的其他详细信息, 建议使用以下评论: 橡树岭国家实验室高通量同位素反应器生物无仪器,79小角散射结构生物学–扩大边界, 同时避免陷阱,72和小角度散射研究生物大分子在溶液中。80中子散射科学家还可以讨论当前仪器配置和给定系统的最佳参数。例如, 在较小的 Q (这是散射角和中子波长的函数) 的数据通常需要较大的系统。生物 san 中最常见的仪器配置提供了 Qmin 0.003 埃-1 , 适用于更大的蛋白质复合物, 高达数以百计的 kDa。溶液中含有约3毫克 mL-1的膜蛋白, 其近似大小为 30 kDa (单体), 在液相匹配胶束中, 48.5% D2O, 需要一个典型的测量时间, 每个样本、缓冲液和空单元的约8小时 (24小时 = 1day 共计)。在给定的对比条件下, 仪器测量时间可以根据散射粒子的分子质量和浓度的乘积进行近似缩放。然而, 散射粒子必须在非相互作用条件下测量, 包括任何非特异蛋白聚集, 这对样品的浓度有实际的上限。小时长的测量限制了某些蛋白质的稳定性。幸运的是, 无测量可以在冷藏温度下例行进行, 以提高蛋白质寿命, 而低能量中子的使用光束在测量过程中不会造成任何辐射损伤。

本文概述了这一过程, 并确定了许多关键因素, 以成功记录的中子散射从样品在对比剂比较匹配点测量在本手稿。这包括在洗涤剂头组和烷基链组件之间设计一种具有均匀中子对比度的洗涤剂混合物, 从而获得完全匹配的总洗涤剂的关键步骤。在这个单一的洗涤剂匹配点的测量提供了一个散射剖面归因于仅膜蛋白的兴趣和允许从头包络代表膜蛋白从数据重建。数据分析和从头建模协议还展示了从这些调查中获得的潜在信息, 这些资料可能旨在解决总体结构、构象变化、寡聚状态等问题。一个限制是, 迄今为止只有极少的洗涤剂在商业上可用氘替代品。19

虽然 perdeuteration 可能不是必要的, 在这种情况下的目的应该是实现蛋白质与 > 65% 氘标签在蛋白质。或者, 如果有选择性氘代头组和尾部的洗涤剂, 并且洗涤剂胶束的 CMP 发生在接近 100% D2O, 那么可以实现与蛋白质的充分对比, 无需氘标记。确定适当的氘化水平的蛋白质, 以达到足够的散射, 当测量在对比剂匹配点。有许多挑战与膜蛋白表达和纯化相关,81这仍然超出了本文的范围。不幸的是, 真核系统目前还没有可能有高水平的氘化。虽然我们认识到这是一些真核蛋白的局限性, 但大多数膜蛋白都有细菌基因, 这种方法适用。

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Disclosures

作者福尔克·海因斯贝格 s 城市, 西文卡特斯赫 Pingali, 凯文 l. 维斯和瑞安 c. 奥利弗通过 UT-巴特尔与美国能源部签约, 以支持在这篇文章中使用的橡树岭国家实验室中子科学用户计划和生物无仪器。

这份手稿是由巴特尔, LLC, 在合同 DE-AC05-00OR22725 与美国能源部 (DOE) 共同创作的。美国政府保留, 出版商接受这篇文章发表, 承认美国政府保留了一个非排他性的, 有偿的, 不可撤销的, 世界各地的许可证出版或复制本手稿的出版形式, 或允许其他人这样做, 为美国政府的目的。能源部将根据能源部的公共准入计划, 向公众提供联邦资助的研究结果。 82

Acknowledgments

生物和环境研究办公室支持 ORNL 的结构分子生物学 (CSMB) 和生物 san 中心的研究, 使用由美国能源部基础能源科学办公室科学用户设施部支持的设施。的能量。在利伯曼实验室的膜蛋白结构工作已得到 NIH (DK091357, GM095638) 和 NSF (0845445) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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