膜蛋白質の構造解析および経験的モデリング中性子小角散乱実験でコントラストに一致する洗剤

Biochemistry

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Summary

このプロトコルは、低解像度第一原理計算モデルと洗剤のコントラストが一致する中性子小角散乱法を用いたソリューションの洗剤可溶化膜蛋白質の構造の詳細を取得する方法を示します。

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Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss, K. L., Pingali, S. V., Lieberman, R. L., Urban, V. S. Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling. J. Vis. Exp. (140), e57901, doi:10.3791/57901 (2018).

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Abstract

高流束同位体リアクターのオークリッジ国立研究所で生物学的中性子小角散乱装置、生体材料ナノからをカバー、バイオ燃料の処理、生物学的材料の調査に捧げられてマイクロメータ スケール。膜タンパク質の物性 (すなわちサイズと形状) を調査するためにここで提示されたメソッド (ここで MmIAP、 Methanoculleus marisnigriから膜アスパルチル プロテアーゼ) ミセル形成のソリューションで洗剤とりわけこの中性子小角散乱装置に適しています。他の生物物理学的解析技術がタンパク質洗剤複雑な構造で洗剤の貢献に対処する彼らの無力によって妨げられます。さらに、バイオ重水素化研究室へのアクセスは、大規模な耕作を準備し、タンパク質強化による散乱信号の重水素標識蛋白質を表現するためのユニークな機能を提供します。この技術は、高分解能で構造の詳細を提供しない、膜蛋白質の構造の知識のギャップには近く原子分解能を必要とせず研究の多くのアドレス指定可能な分野が含まれています。たとえば、これらの区域は、摂動、および折りたたみ/展開イベント オリゴマー状態、複雑な形成、構造変化の測定を含みます。これらの調査は、このメソッドのアプリケーションを容易に実現できます。

Introduction

膜タンパク質は、すべての遺伝子1の推定 30% がエンコードされ、現代の医薬品のターゲットの大多数を表します。2これらの蛋白質は、彼らの豊かさと重要性にもかかわらず重要な細胞機能を3の広い配列を行うなど、研究利用に供構造バイオインフォマティクス (RCSB) 蛋白質のための総構造の約 1% にすぎませんデータ ・ バンク。4彼らの部分的に疎水性性質のため膜結合蛋白質の構造決定が極めて挑戦でされています。5,6,7

生物物理技法の多くは、測定溶液中における同一径粒子を必要と、ネイティブ膜から膜タンパク質を分離し、生体膜の可溶性模倣これらのタンパク質の安定化は最近の研究の活発な領域をされています。数十年。8,9,これらの調査は、nanodiscs11,12,13膜,14,15 等の膜タンパク質の可溶化多くの新規両親媒性アセンブリの開発につながっている10と amphipols。16,17ただし、洗剤のミセルの使用特定の蛋白質の容解性の要件を満たすための最も一般的で簡単な方法の 1 つは。18,19,20,21,22,23,24,25残念ながら、単一の洗剤や洗剤の魔法混合現在存在満たすすべての膜蛋白質。したがって、これらの条件は経験的蛋白質ごとの固有の要件にスクリーニングする必要があります。26,27

洗剤は、ミセルと呼ばれる集合構造を形成するソリューション、臨界ミセル濃度以上で自己組み立てます。ミセルは、疎水性のアルキル鎖ミセル コアおよび水溶媒に直面してミセル シェル層に配置される親水性のヘッド グループを形成 (通常は 20 から 200 まで) 多くの洗剤モノマーの構成されます。洗剤のミセル形成挙動は古典的な疎水性効果28およびサイズでチャールズ タンフォードによって記述され、膜タンパク質研究で一般的に使用される洗剤のミセルの形状をしています。小角散乱法を用いた特徴付けられます。29,30洗剤組織膜タンパク質についても研究されていると、きちんと洗剤のような配置でタンパク質を取り巻く洗剤の分子蛋白質界面活性剤複合体 (Pdc) の形成を期待ミセル。31

1 つは、洗剤を使用する利点は他の洗剤を組み込むことによって生じるミセル プロパティを操作できることを追加しました。多くの洗剤を示す理想的な混合と混合ミセルの選択プロパティはコンポーネントとの混合比率からも予想されます。22ただし、洗剤の存在できますまだ課題が生物物理特性の信号全体に貢献することであります。たとえば、x 線と光散乱技術、PDC の洗剤からの信号はタンパク質と実質的に区別できます。32単一粒子の低温電子顕微鏡 (Cryoem) 調査は通常トラップ (冷凍) 粒子に依存してください。蛋白質の構造の詳細は、特定の洗剤や洗剤を背景に追加する高濃度によってまだ隠されています。33 (洗剤を含む) 完全な PDC 構造の解釈への別のアプローチは、指定された膜タンパク質の周り洗剤を再構築しようとする計算方法で行われています。34

中性子散乱の場合は、洗剤のミセルでコア-シェル アレンジ観測散乱に寄与するフォーム ファクターが生成されます。幸いなことに、彼らは net の観測された散乱に寄与しないことなどは、ソリューション コンポーネントを変更できます。この「コントラスト マッチング」のプロセスと一致する (バッファー) の背景の散乱長密度を達成するために水素の重水素を置き換えることによって達成されます。(利用できる重水素化対応) と洗剤の賢明な選択と混合の比率を考慮しなければなりません。洗剤のミセル、洗剤を用いた重水素置換アルキル鎖 (d-尾 h 尾ではなく) を持っているが、同じヘッド グループこの置換を実行できます。洗剤は十分に混合されたので、35の集計でお越しの加重モル分率は、散乱長密度 (h 尾と尾 d) の 2 つのコンポーネントの平均。この平均コントラストが頭のグループの一貫性のある、均一の凝集構造と観測された散乱へのすべてを削除する完全に照合できます。

重水素標識アルキル鎖と化学的に同一の洗剤の分子を組み込むことによって洗剤のミセルの中性子コントラストを操作するためのプロトコルをご紹介します。19,36,37ミセル コアとシェルは、中性子散乱のユニークな機能は、一致する完全な対比ができます。35,38により大幅に洗練されたこの詳細レベルには、コントラストのマッチングを実現できます膜蛋白質の構造のそれ以外の場合不可能研究。さらに、このコントラスト マッチング方法は高分子交換反応39と油水分散剤、40または膜、41なども他の可溶化剤などの洗剤を含む他のシステムに拡張することnanodiscs、42またはブロック共重合体。この原稿が、アルキル鎖および/または頭の部分重水素置換の単一洗剤種を用いたアウトラインとして43 A 同様のアプローチは最近出版されました。置換および 2 段階用の洗剤の利用できる位置の限られた数、ここで紹介した方法と比較して37これが水素と重水素洗剤中のランダムな分布の改善に期待できます。合成洗剤は、ポーズの追加の課題を検討に必要な。

多くの場合下記のプロトコルの手順 1 と 2 が重なる品質提案を提出する最初の実験計画を行う必要がありますので。ただし、提案書の提出であるここでは中性子実験の前にこのプロセスを開始することを強調する最初のステップとして。また、提案によって示される必要があります、前提条件の手順が生化学的および物理的な特性 (安定性、純度など) 中性子研究の必要性をサポートするサンプルを持つことをする必要があります。小角中性子散乱 (SAN) の一般的な議論はこの記事の範囲を超えています。簡単なしかし徹底的な導入はカウフマン、44と包括的な教科書に焦点を当てた生物小角ソリューション散乱による材料特性評価を公開されている最近の参照作業で利用可能です。45さらにおすすめの読書は、ディスカッション セクションで与えられます。小角散乱は、散乱過程を説明する中央の量として、いわゆる散乱ベクトル Q を使用します。この資料を使用して、広く受け入れられている定義 Q = 4 π 罪 (θ)/θ が受信および散乱ビームと λ の半分の角度、λ は、オングストロームの中性子放射の波長。使用別のなどの記号、その他の定義が存在する ' の散乱ベクトルは要因 2 π かナノメートル オングストロームの代わりを使用して異なる場合があります (図 10の議論を参照してください)。

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Protocol

1. 準備し、中性子施設はり時間と計測器の提案を提出

  1. 一般的なユーザー中性子ビームの時間アクセス、オークリッジ国立研究所 (ORNL) などを提供する中性子散乱施設を特定するためのオンライン リソースを参照してください。中性子設備、中性子研究世界についての情報の地図はオンラインできません。46これらの施設が通常提案; 通常の呼び出しであることを注意これは次回のビームが利用できる時を決定します。中性子は、さまざまなアプリケーションに使用されます。中性子小角散乱 (SAN) 楽器、特に、生物学的サンプルの機能を検索します。
  2. 中性子ビームの時間提案提出プロセスをナビゲートするために中性子設備によって提供されるリソースを使用します。あなたが適用されます楽器に関連付けられている中性子散乱科学者 (NSS) とを参照してください。中性子施設の公募、期限、および送信のための助言に関する現在の情報を確認します。オークリッジこれは利用可能なオンラインです。47は、送信が成功したのすべてのガイドラインに従うビーム時間の提案を提出します。
  3. 重水素化蛋白質が必要 (2.2 を参照) の場合、中性子散乱施設多い所と重水素化材料の生産に特化の専門知識によってサポートされます。オークリッジ国立研究所でバイオ重水素化ラボ (BDL) へのアクセスを要求するには、提案システムで 2 番目の楽器として BDL を選択します。SAN 提案の可能性および科学的審査委員会による審査は、BDL 要求は可能性のみ上映します。BDL 実現可能性検討のため提出完了した情報要求フォーム48推定収量および蛋白質の表現のプロトコルを記述する (利用可能なオンライン)。
  4. ビームの時間の提案の成功したピア レビュー後、実験前にビームに受賞の日付を確認します。適切なレビューのための提案のすべての数式とサンプルとバッファーの詳細が正しく一覧されることを確認します。サンプルとバッファーの組成の変化を含む実験計画案への変更、施設の届出が必要です。
    注:変更は、割り当て済みの NSS とできるだけ早く議論されるべき。

2. タンパク質測定のため中性子コントラスト マッチ ポイントと必要なコントラストを決定します。

  1. (仕入先の製品情報、オンライン データベース、公開された値など)から情報を収集原子組成とコントラスト-一致する洗剤システム コンポーネントのボリュームに関連します。ソリューションでは、SAN のコンテキストで関心の膜タンパク質のデータと構造情報の品質を得るために重要である中性子散乱長密度 (Sld) を決定し、従ってマッチ ポイント (Cmp) は対照的にこの情報を使用します。PDC。膜タンパク質の生物物理学的研究でよく使用される洗剤の物理特性とコントラスト マッチ ポイントは集計表 (表 1) が含まれています。
  2. Web アプリケーションのマルチを使用して中性子 Sld を決定: モジュールのためのコントラスト変化データ解析49 (利用できるオンライン50の無料)。ユーザー マニュアルへのリンクをホーム ページにあります。サイトにアクセスし、添付ドキュメントを読みます。図 1図 2 2 つの関連例コントラスト モジュール入力と出力の概要を提供します。
    注:Sld を計算する他のウェブサイトが利用可能、中性子研究の国立研究所の標準とテクノロジ (NIST) センターで整備されたものなど。51
    1. コントラスト モジュールを開くには、左側のナビゲーション ペインにある「コントラスト」をクリックします。プロジェクトのタイトルのテキストを指定し、として (例えば、洗剤のヘッド グループおよび尾) の 2 つのコンポーネントの下の詳細を入力 'サブユニット 1' と' 2' サブユニット。
    2. 「式」テキスト ボックス内の各コンポーネントの分子式を入力します。
      : ラジオボタンだ '分子式を入力する' 物質型 ' の下で選択する必要があります。また、数式の文字 'X' を使用して、容易に交換可能な水素原子を示します。場合、タンパク質や RNA、DNA シーケンスを入力ことができます対応する 'P'、'R'、またはいた ' ラジオボタンが選択されて。サブユニット内にコンポーネントの複数のコピーが存在する、'Nmolecules' の値はそれに応じて変更できます。実用的な例をここでは片側 2 に等しい Nmolecules で入力する式を許可する 2 つの同一の尾を含んでいる脂質のような洗剤に関連します。
    3. 'ボリューム (Å3)' 下のボックス内の各コンポーネントの立方オングストロームのボリュームを入力します。長さn、 Vテールのアルキル鎖のタンフォードの数式28を使用して = 27.4 + n * 26.9、おおよそ尾翼容積を計算したり、製品情報から分子容積を取得するまたは値を公開文学。
    4. バッファーのコンポーネントの詳細を入力します。'番号溶解溶媒種' を変更するドロップ ダウン メニューを使用して追加またはバッファーの各コンポーネントの行を削除します。ミセル形成の場合洗剤、洗剤の臨界ミセル濃度 (CMC) のコンポーネントを別々 のバッファーとして無料洗剤モノマーが含まれます。
    5. 中性子コントラスト計算を実行し、D2O での任意の特定の割合でこれらのパラメーターを決定するための式と同様に、散乱長密度とコントラスト マッチ ポイントの表を提供しています結果ページを生成するには、[送信] をクリックします。バッファー。コンポーネント Cmp に留意して散乱パラメーターを確認します。マッチ ポイント (10% D2O) の内で類似していると無料ミセル濃度が低いし、CMP がすることができます平均洗剤貢献コントラスト一致に使用されます。ほとんどのケースで洗剤頭グループと尾の CMP よりも 10-15% だけでタンパク質から散乱信号の直接のコレクションを難読化する SAN データでコア-シェル フォーム ファクターを生産異なります。
  3. 洗剤のヘッド グループと尾の間のコントラストを評価します。洗剤頭グループとアルキル鎖尾 Cmp が似合い、可用性と重水素置換洗剤定款を操作する成分の選択の長さ密度を散乱許可できます。ほとんどの場合、これは重水素置換アルキル鎖と同じ洗剤を組み込むことによって混合ミセルを形成が必要です。重水素の添加は、アルキル鎖尾によって形成されたコアの散乱長密度を発生させます。目的のエンドポイントはこの場合、頭グループ シェル CMP とアルキル鎖コア CMP があるほぼ等しい値です。
    1. H 尾と頭のグループと一致する完全なコントラストを実現する d ツインテールの混合の適切な比率を決定することにより頭グループのシェルの CMP に相当する洗剤のミセル コアの CMP を上げます。この決定の前提条件は、重水素置換アルキル鎖尾 CMP の知識です。N-β-D-maltoside (DDM) に市販の相手はすべてアルキル鎖水素重水素 (d25 DDM) に置き換えられます。いた尻尾の手順 2.1 に示したコントラスト計算を繰り返す '' h 尾 ' の代わりに。
    2. CMP の頭のグループとのコントラスト マッチングに必要な d 尾 h 尾のモル比を計算します。次の数式は、この決定に役立ちます。
      CMPCMPh 尾を = * χh 尾+ CMPd 尾* χd 尾
      CMP が散乱長密度と χ 洗剤頭 h 尾、または d 尾コンポーネントの体積です。DDM のバッファリングされたソリューションは、定款重水素置換アルキル鎖 d25 DDM として合計洗剤の重量 (ほくろ 43%) の 44% 48.5% D2O の頭と尾のコンポーネントで 1 つの CMP が生成されます。
  4. 膜タンパク質の重水素置換度を検討してください。タンパク質から十分な散乱信号を測定するには、蛋白質の CMP は少なくとも 15% D2O 洗剤 CMP からソリューションで、測定条件をする必要があります。この % 差の正方形と増加する信号。ラベルのないタンパク質の CMP は 〜 42% D2O (CMP の多くの洗剤頭グループに似ています) のソリューションで通常発生するので蛋白質の重水素標識がほとんど常に必要です。52

3. エクスプレスし、興味の膜蛋白質を浄化します。

  1. LB (ホストゲノム スープ) 培地を準備し、大腸菌の成長 (エシェリヒア属大腸菌)細胞のターゲット蛋白質シーケンスの誘引可能な表現のベクトル。
    1. 最小媒体を準備します。H2O または D2O、溶解 7.0 g/L (NH4)24、5.25 g/L の Na2HPO4、1.6 g/L KH2PO4、0.50 g/L のクエン酸水素アンモニウム、グリセリン 5.0 g/L、1.0 mL/L 20 %w/v MgSO4·7H2O と 1.0 mL/L ホルメ微量金属 (0.50 g/L CaCl2·2H2O、0.098 g/L CoCl2、0.102 g/L CuSO4、16.7 g/L した FeCl3·6H2O、0.114 グラム/L の MnSO4·H2O、22.3 グラム/L の Na2EDTA·2H2O および 0.112 g/L ZnSO4·H2O)。53,54
    2. H2O または D2o. を使用して適切な抗生の貯蔵液を準備します。
    3. H2O または D2o. を使用してイソプロピル-β-D-1-thiogalactopyranoside 原液を準備します。
    4. 無菌フィルターにすべてのソリューション乾燥、ボトル上部の真空を使用して滅菌容器とシリンジ フィルター孔径 0.22 ミクロンの。
  2. 重水素化タンパク質の発現をスケール アップ中前の重水素標識にエシェリヒア属大腸菌のセルを適応します。
    1. ホストゲノム スープ (LB) 寒天板から隔離されたコロニーまたは冷凍のグリセロール ストックから細胞を LB 培地 3 mL に接種します。250 回転で振動のインキュベーターで 37 ° C で細胞の成長または一晩インキュベート時文化の増殖を避けるために 30 ° C 以下の温度を下げます。
      注:適応手順を変えることができます。55,56,57
    2. 600 の光学濃度に LB 文化が成長していたら nm (外径600) 〜 1、1:20 H2O 最小培地 3 mL に希釈し、~ 1 の外径600に成長します。1:20 を繰り返して 50、75、100% D2O (または) を含む D2O パーセンテージまで最小限の媒体を使用して希釈。
      : としての D2O 量が増加、成長率が低下します。タンパク質成長メディアおよび重水素置換で D2O の割合の関係は文献で報告されています。58,59,60
    3. 重水素化細胞塊 (図 3) の収穫を増加するバイオリアクターで培養を拡張し続けます。
      注:バイオリアクター操作の詳細な手順は、他の場所で検討されています。61,62,63,64
  3. 収穫し、大腸菌の細胞膜抽出および蛋白質の浄化のための溶解
    1. 30 ~ 45 〜 6,000 × g で遠心分離によって細胞をペレット 4 ° C で分
    2. ~ 30 分間氷の上のバッファーに浸すことによって細胞のペレットを柔らかきます。その後、優しく再懸濁します細胞ペレット バッファーで軽くピペッティング血清ピペットまたは穏やかな ~ 1 g 湿電池質量/10 mL のバッファーの最終濃度に、2 D のロッカーの揺動によって。
      : 例バッファーは 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸)、pH 7.5、200 mM の NaCl 添加プロテアーゼ阻害剤タブレット。
    3. 流出を低温中 3 10,000 psi の高圧ホモジナイザーを通過で再懸濁細胞を溶解させます。
      注:必要なスケールによって、他の換散方法は使用される (例えば、フランス語を押すまたは超音波処理によって) にあります。
    4. 4 ° C で 15 分間 4,000 〜 5,000 × g で遠心分離によって細胞の残骸をペレット上清が明らかになるまでこの手順を繰り返します。
    5. 超遠心機 (30-45 分 ~ 150,000 x g)、水溶性を含む前のステップと膜の一部分から上澄み。遠心後のペレットには、膜画分が含まれています。
    6. 大 Dounce ホモジナイザーで膜ペレットを再懸濁し、遠心 (ステップ 3.3.5) によって再び膜画分を分離します。ゆるく縛られた蛋白質を削除するには、この手順を少なくとも 1 回を繰り返します。
    7. 浄化に適した洗剤を含むバッファーの 4 ° C で 30 分程度の穏やかな揺動によって膜可溶化します。可溶化は、懸濁液が透明に変わったら曇りから明らかです。超遠心法 (30-45 分 ~ 150,000 x g) で不溶性物質を削除します。
      注:例バッファーは、50 mM HEPES、pH 7.5、500 mM の NaCl、20 mM のイミダゾールと 4% (w/v) DDM Ni2 +親和性クロマトグラフィーによる浄化のためです。
  4. 次のフォームのプロトン化以前に開発されたプロトコルの蛋白質を浄化します。
    注:タグ付き hexahistidine M. marisnigri JR1膜アスパルチル プロテアーゼ (d MmIAP) の例の浄化のプロトコルのためのナインを参照してください。65最終的な収量であった 〜 1 mg の重水素重水素化 5 L 細胞培養成長、すべてが使用されたから SAN 実験 (図 4)。
  5. コントラストが一致する「最終的な交換バッファー」に浄化された蛋白質を交換します。
    1. 準備、例えば、20 mM HEPES、pH 7.5 に一致するコントラストの正しい混合物を含む「最終交換バッファー」の 200 mL、250 の mM の NaCl、の 0.05 %%2 49 D2o. で DDM (0.028% DDM と 0.022 %ddm d25) の合計
    2. サイズ排除カラムの平衡 > 2 列内のボリューム (CV)「最終交換バッファー」の 3.5.1 高速蛋白質液体クロマトグラフィー (FPLC) システムを使用しています。
    3. サンプルを注射した後、列を実行し、興味の蛋白質に相当する画分を分離します。
    4. 望ましい最終的な集中 (2-5 mg/mL) に蛋白質を集中します。
      注:〜 300 μ L のボリュームは、SAN の使用 1 mm 円筒形の石英キュベットに合わせて必要です。
    5. 背景差分 SAN の整合バッファーの因数をぜひご予約ください。
      注:準備されたバッファーから直接または理想的に FPLC 実行の終わりにきれいな溶出画分から、因数を取ることができます。

4. ビーム時間と SANS のデータ収集のための最終的な準備を作る

  1. 採択されて、サイトへのアクセスが承認された後は、割り当てられた時間の前にすべての必要なトレーニングを完了します。これは、prearrival、web ベースの敷地内の放射線検査と計測器固有のトレーニングだけでなく、トレーニングが含まれています。
    注:トレーニング要件と、初めてのユーザーのための事前到着が指示できます。詳細については、オンライン利用可能です。66
  2. サンプルおよびデータ コレクションに対するバッファーをロードします。
    注:生物の小角中性子散乱の概要 (バイオ-SAN) 楽器サンプル環境領域は図 5に示します。
    1. サンプルとバッファーを石英セルに読み込みます。楽器の科学者や施設からは、石英セルがあります。ほとんどのサンプル細胞の狭い開口部にアクセスするのにゲル ロード ヒントを使用します。
    2. ビーム シャッターが閉じていることを確認、サンプル環境エリアに接近し、検体チェンジャーで石英セルを配置します。サンプルの各セルのサンプル チェンジャー位置を記録します。
    3. エリアをチェックしビーム光路が閉塞から無料を確認し、サンプル環境領域を残すし、ビーム シャッターを開きます。
      注:慎重にすべての施設の規則および規制に従う、すべての投稿に従うし、楽器の科学者のアドバイスに耳を傾けます。サンプルのビームから削除、次の特別な注意なしビームへの露出の後の操作はありません。これらの手順の前に放射線管理技術者 (RCT) を参照してください。
  3. データ収集の自動化についてはテーブル スキャンを実行します。
    1. カスタム コントロール LabVIEW ベースのソフトウェア分光計測器制御環境 (スパイス) を通って測定器を動作します。中性子散乱科学者によって提供される操作の指示に従います。図 6にテーブル スキャン操作ウィンドウの概要があります。
    2. 適切な分野で必要な情報を入力した後テーブル スキャンを実行し、自動化されたデータ収集プロセスが開始されます。テーブル スキャン ステータス タブを介して進行状況の監視。

5. 1 D のプロットの 2次元画像からの SAN データ削減します。

  1. 記録されたスキャン数から各サンプルとバッファーのデータ ファイルを識別します。各測定には、一意のスキャン数が割り当てられます。この情報は、各対応するサンプルとバッファーのペアを識別するデータ削減の時に便利です。
  2. MantidPlot ソフトウェアと Python スクリプトを使用して、削減のため
    1. 中性子散乱ユーザーは、リモート解析クラスター上のデータにアクセスするためのアカウントの詳細を提供しています。67リモート解析クラスターにログインし、コマンドラインから"MantidPlot"を実行します。図 7および図 8は、これらの手順を支援するために提供されます。
    2. (これは通常実験中に発生します) 中性子散乱科学; からユーザー削減スクリプトを取得します。このスクリプトは、Python ベースは、すべての必要な校正と I(Q) 散乱角の関数として散乱光強度の 1 D のプロットに 2次元散乱画像を縮小するスケーリングの調整が含まれます。
    3. MantidPlot で提供されているユーザー削減スクリプトを開き、適切なリストに対応するスキャン番号またはサンプルとバッファーのペアのための識別を配置します。
    4. 4 段組みテキスト ファイルとして減らされたデータを生成するスクリプトを実行する (列の順序が Q、I(Q)、I(Q) エラーは、Q エラー) 指定した場所に。MantidPlot で適切なワークスペースを右クリックし、「プロット エラー...」散乱プロファイルの初期審査を選択します。

6. 散乱粒子の構造パラメーターのデータを分析します。

  1. セキュリティで保護された FTP ファイル転送を使用してローカル コンピューターに分析サーバーから減らされたデータ ファイルを転送します。これは、CyberDuck FileZilla などのソフトウェアを使って実行できます。追加手順と分析サーバーのファイル システムに接続するための詳細については、analysis.sns.gov ログイン ページで提供されます。
  2. ATSAS ソフトウェア スイート65,68 (全体 ATSAS スイート) をダウンロードします。69個々 のプログラム70も承りますオンラインすなわち構造パラメーターと第一原理計算のモデルを決定する SAN データを分析するため。
    注:多くのオプションは、SANS の生体高分子のデータ解析に使用できます。45
  3. データのプロットに PRIMUS71を使用、バッファー スケーリングし減算と Guinier 分析。
    1. ATSAS 'SAS データ分析' を起動アプリケーションと負荷低減データ ファイルのサンプルとバッファーのペアに対応します。
      1. バッファーを適切に拡大縮小する高 Q でデータ範囲を選択 (Q > 0.5 Å-1) 両方のプロファイルが似ており、フラット、'操作' の下にある 'Scale' ボタンをクリックしてタブします。スケール ファクターは、これら 2 つのフラット領域が重複するようにバッファーに適用されます。注意: バッファー強度サンプルを一致するようにスケーリングを正当化する説得力のある物理的な理由があるはず。ずれが大きい場合は、バック グラウンド減算への有効なアプローチを楽器の科学者を参照してください。44,45,72
      2. すべてのポイントを表示するデータ範囲を増やします。この操作を実行する ' 削除' をクリックします。凡例内のバッファー減算データファイルを右クリックし、その後の分析のためこのファイルを保存します。図 9では、'操作' タブの使用について説明します。
    2. 'SAS データ分析' アプリケーション '分析'] タブを使ってバッファー減算サンプル データの Guinier 解析を実行します。
      1. 一覧で適切なファイルを選択し、' 旋回半径 ' をクリックします。自動でフィット Guinier を実行しようとした場合は、'Autorg' ボタンをクリックして提供されます。
      2. 低 Q データのすべてを含めるし、尿まで高 Q ポイントを奪うことによってデータ範囲を縮小を開始に使用するデータの範囲を拡大 * Rg制限が 1.3 以下。残差のプロットを使用して、データが適合範囲で線形であることを確認します。フィット Guinier では、おおよその Rgと散乱粒子の0が得られます。
      3. フィットの領域を少しずつ調整し、フィットで使用されるデータの範囲にこれらの値の感度を監視します。図 10 aは、「旋回半径 ' ツール使用を示します。
  4. 確率分布関数 (GNOM の P(r))。73ここで生成された出力ファイルは、入力として、第一原理計算モデルの作成プロセスに使用されます。
    1. データによいフィットを取得 '分析' タブ内の距離配布ウィザードを開始品質モデルの取得に不可欠です。正確なフィットを取得に関する詳しい情報は、パットナムによるレビュー74を参照してください。
      :「GNOM プログラム距離配布ウィザードを超えてフィットに関する追加情報を提供します。図10Bに '距離分布' ツールの適切な使用と図 11に発生する一般的なエラーのいくつかを示します。
    2. Dmax、分子内最大原子間の距離を決定します。
      1. Rmax を強制するチェック ボックスをオフして Dmax の値を見積もる = 0 および Dmax に大きな値を入力 (150 Å、たとえば)。P(r) のプロットの最初の x 切片の値には、この推定値が得られます。
      2. この Dmax 値と使用するデータの範囲またはフィット データと結果 P(r) 曲線に合わせて GNOM を最適化するために使用されるポイント数を増分変更します。
    3. 続行 GNOM フィットを改良しモデリング手順以降第一原理計算の良いフィット パラメーターに GNOM 出力ファイルを保存します。
  5. SANS の CRYSON プログラムを使用して高解像度 PDB モデルからプロファイルをシミュレートします。75
    1. プログラムを開き、'0' のオプションを選択します。ポップアップのファイル ブラウザーに PDB ファイルの名前を選択します。適切なコントラストのパラメーターを達成するために溶剤でチェーン重水素化画分と D2O の分数を指定することを除いて、既定の設定を受け入れる enter キーを押します。
    2. 'Y' を入力しポップアップ ファイル ブラウザーでデータ ファイルを選択実験のデータ セットにモデルに適合します。残りの既定値を受け入れるし、出力ファイルが PDB ファイルの場所に書き込まれます。'.Fit' ファイルには、高解像度の 3 D モデルから予測される散乱プロファイルの情報が含まれています。

7.第一原理からモデルを作成する、データの SANS。

: DAMMIF7677 ATSAS ソフトウェア スイート内の DAMMIN を使用して出力、P(r) データや確率についての情報を含む GNOM から焼鈍処理のシミュレーションを使用してダミー原子モデル (ダム) を再構築するか散乱粒子内の原子間距離の頻度。これらのプログラムは、バッチ モードと ATSAS オンラインの web サーバーで実行可能性があります。

  1. 'SAS データ分析' の '分析' タブで 'Dammif' ボタンからプリムス形状ウィザードを起動し、パラメーターの手動選択を使用します。ウィザードの入力は、図 12に示されています。
    1. フィット (ステップ 6.3.2) から Guinier 範囲を定義し、ナビゲーション ボタンを使用して次の手順に進みます。P(r) プロット (ステップ 6.4) からフィットの値を定義し、次の手順に進みます。
    2. 第一原理計算モデルの作成プロセスのパラメーターを提供します。モデル出力ファイル名 (例: SANSEnvelope) のプレフィックスを入力する、いずれかの '高速' または 'ゆっくり' モード モデルを選択、モデル (統計的な有意性をお勧めします 17) 数の値を入力、粒子の対称性の利用可能なオプションから選択anisometry と角度スケール (既知の場合)。ボックス平均モデル DAMAVER にチェックされます、DAMMIN と最終的なモデルを絞り込むことを確認します。
    3. 'Commit' ボタンを使用して、プロセスを開始します。プロセスが完了すると、表示および作業ディレクトリに保存します。
      : 1 つの一般的なモデリング プロセス、小さなタンパク質にかかることが一般的なパソコンでは数時間。ファイルは、保存されるまで一時ディレクトリに格納されます。
  2. オーバーレイし、決勝をスーパーイン ポーズ内 ATSAS SUPCOMB を使用して関連する高解像度モデルのエンベロープ SAN。作業ディレクトリで SAN 封筒に合わせて高解像度の PDB のモデルのコピーを配置します。コマンドラインから SUPCOMB を実行最初に表示されるテンプレートの構造を持つ 2 つの引数として PDB ファイル名を使用して: $ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    注:テンプレート構造の重ね合わせの終わりと新しい座標に追加"r"で新しいファイルとして記載されている 2 番目のファイル名が書き換えられます。
  3. ソフトフェア (pymol.org)、分子の 3 D グラフィックス表示プログラムを使用して経験的モデル結果を可視化します。図 13は、ソフトフェアの操作の概要を提供します。
    注:溶液中の生体分子から小角散乱データの構造化のための文書ガイドラインがあります。78
    1. ソフトフェア アプリケーションを起動し、表示する SANS の封筒と SUPCOMB 揃えの高分解能構造 3 D に対応する .pdb ファイルを開きます。
    2. サーフェスとしてこのモデルを表すことによって SAN 封筒を視覚化します。クリックして s 'モデルと選択] の横にあるボタン' を表示: として: 表面 '。
    3. 漫画としてこのモデルを表現することによって高解像度のタンパク質の骨格構造を視覚化します。選択 s 'このモデルの横にあるボタンをクリックし、選択' を表示: として: 漫画 '。'C' ボタンを選択することによって虹 N ・ C 末端のようにチェーンを表示と ' によってチェーン: Chainbows'。
    4. わかりやすくするため表面の表現の透明度を変更します。「設定」メニュー ・ バーから選択 ' 透明» 表面» 40% '。
    5. 背景白と非不透明。'Display' のメニューバーから選択 ' 背景»' '不透明' このオプションと '白' の背景にこの色をマークするをオフにするを選択します。
      : 追加の操作、ソフトフェアの使用方法は、PyMolWiki.org で見つけることができます。

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Representative Results

ビームの時間と計測器の提案は、提案する実験の有効な評価を行うことができますので、審査委員会に必要なすべての情報を明確に伝える必要があります。NSS との通信は非常に経験の浅いユーザーの示唆されました。NSS は、初期の可能性と可能性、安全性、効果の高い科学の可能性を強調するガイド提案提出を評価できます。提案で提供される情報は、背景情報と、研究の意義のコンテキストを含める必要があります。知識を獲得することになっている、これは科学の分野で現在の理解に及ぼす影響について作業、サンプル、メソッド、および採用される手順の説明該当する場合は、関連する出版物や結果をはじめとして、施設でのチームの前の生産性。中性子科学ユーザー ポータル (neutrons.ornl.gov/users) 経由でユーザーに提案書テンプレートや、提案を準備するためのヒントなどの有用な資源があります。

実験計画がしばしば提案書の提出の最初の段階の間に始まる実験直前まで完全に構想がない動的なプロセスです。ただし、(バッファー条件またはサンプル構成への変更を含む) 提案の説明から大幅に逸脱している変化を実験の開始前に施設によって承認されなければならないことを覚えておいてください。

このプロトコルでは、表現して洗剤のミセル溶液中に興味の膜蛋白質の浄化の方法が正常に実証されていることを前提としています。この場合、興味の膜蛋白質は、確立された浄化のプロトコルを水溶性と DDM ミセルを含むバッファー中に以前決定されました膜アスパルチル プロテアーゼ (IAP) です。

ここ、根おおいを使用した中性子コントラスト計算に示す: コントラスト モジュール コントラスト マッチの IAP 蛋白質の解決を混合 DDM/d25 DDM ミセル。本戦略は、最初ミセルの完全なコントラストの一致を達成するために必要な二つの洗剤と混合の程度を決定するためだった。最終結果は、各コンポーネントの背景 (H2外径2O 比) コントラスト マッチ洗剤から散乱をタンパク質散乱のみを遵守するために必要な相対的なコントラストを決定するは。

図 1マルチ コントラスト モジュールの適切な入力と DDM 洗剤頭グループと尾のコントラスト計算結果の出力として示しますサブユニット 1 と 2、それぞれ。頭のグループで使用される数式は、C12H14X7O11 348 Å の3、およびアルキル鎖尾式の C12として与えられる H25 3Å 350 のボリュームのボリュームです。

DDM ヘッド グループと尾がある異なる散乱長密度と 2 つのコンポーネント間のコントラストを観察するためコントラスト モジュールの出力から明らかです。Ddm™ のヘッド グループがある、CMP 49% D2O のアルキル鎖尾が、CMP 2% D2O、その平均の CMP 22% D2o. で発生するいるとしたがって、次のステップの目的を頭グループの CMP に合わせて洗剤のツインテールの平均 CMP を増加する重水素置換アルキル鎖を組み込んだ混合ミセルを設計すること。置換用洗剤、同様にグループの頭と尾の間に対照的結果完全に重水素化尾 (d25 DDM)、DDM のコントラスト計算を繰り返した。しかし、h 尾の値を対照的し、d ツインテールが大幅に異なる。洗剤混合22ブレンドのこれら h と d-尾ミセル コアが頭の平均 SLD 平等を生成する必要したがってソリューションで十分に混合されたミセルの生成に知られているグループ シェル、1 つの CMP とミセルの降伏を思い出して。先頭集団は DDM と d25 DDM の両方に共通なので、戦略は頭グループのコントラストに一致する混合のツインテールから平均コントラスト値を生成するこれらの洗剤の混合物を見つけることです。

洗剤の尾のターゲット平均 CMP は、maltoside ヘッド グループ、または 49% D2o.H 尾と尾 d 各部の平均の CMP を混合の比率を推定するには、必要がある知られています。これらの値の表 1に規定するいくつかの一般的な洗剤や市販の重水素ラベル対応。これらの CMP 値を使用すると、DDM と d25 DDM、h 尾と手順 2.2 で方程式を満たす d ツインテールのモル分率は χd ツインテール= 0.43。

図 2は、最終的な混合ミセル コントラスト条件を確認し、重水素化蛋白質の必要性を判断するために使用できるマルチ コントラスト モジュールへのより高度な入力を示します。ここでは、サブユニット 2 は、そのアミノ酸配列によって与えられたM. marisnigri JR1膜アスパルチル プロテアーゼ (MmIAP) 一方、サブユニット 1 は 2 のコンポーネント、DDM d25-DDM とコントラストをマッチさせた混合ミセルを指します。~ 92% D2o. を含むバッファーにタンパク質の CMP をもたらすための重水素化成長媒体の式で蛋白質の SLD を高めた92% D2O で蛋白質のマッチ ポイントと測定条件 (48.5% D2O) 間の分離度を提案する蛋白質から十分な散乱信号を取得します。

ロゼッタ 2大腸菌細胞の pET22b MmIAP ベクトルと d MmIAP の生産を行った。90% D2O でラベルのグリセロールと最小媒体は、成長培地として選ばれました。90% D2O 最小媒体に順応した後、文化のボリュームは 400 mL をスケールおよび 5.5 L バイオリアクター容器で新鮮な 90% D2O 最小媒体の 3.6 L に接種します。

図 3は、フェッド バッチ培養中にプロセス値のトレースを提供します。接種の時に、ポイントを設定温度は 30 ° C、溶存酸素 (DO) セット ポイントは 100%、撹拌のセット ポイントが 200 rpm 圧縮空気の流量は 4 リットル/分。PH は、水酸化ナトリウムの 10 %w/v ソリューションを使用して 90% D2o. 6.9 のセット ポイント上記開催されました一度はスパイクは、シグナル状態に栽培を続けたが、餌 (30% の w/v グリセロール、90 %d2o で 0.2% MgSO4 )、グリセリン、初期 5 g/L の枯渇が開始されました。供給の約 7 時間後、培養温度は 18 ° C に減少したし、イソプロピル-β-D-1-thiogalactopyranoside を最終濃度 1 mM を追加しました。遠心分離 (6,000 x g 45 分) 経由で収集された約細胞ペーストの湿重量の 145 g、稲刈り時に

酵素収量が低く, 最終的な純度が標準よりやや低いことを除いて、d MmIAP の精製はプロトン化酵素としては進んだ。5 L 〜 20 g からウェット膜の分離は、すべての浄化の DDM で可溶化され、最初の Ni2 +親和性列に読み込まれます。精製収率を最大限に通過割合は希釈し、Ni2 +アフィニ ティー ・ カラムで再を再度実行します。手順は、サイズ排除クロマトグラフィー (図 4) によって集中 d MmIAP サンプルを研磨する前に 3 回を繰り返されました。

図 5は、石英サンプル セルとその関連するサンプル チェンジャー セットアップを示しています。サンプル環境は生物によって管理される-運用チームと NSS SAN。さまざまな異なる環境は、温度制御、湿度制御、機械タンブリング、高温などの持続的な圧力と測定を行う手配できます。

図 6に示しますバイオ-なき操作や自動テーブルの実行をスキャンします。テーブル スキャンは、直感的で、わかりやすいように構成されます。(負荷サンプル) 最初のタブには、検体チェンジャーと検体チェンジャー、セルの厚み、およびサンプル タイプ (オープン梁、サンプル、背景、) の各位置でサンプルの同定などのセットアップに関する情報を提供します。追加のメタデータ タグは、ここで適用することができます。[次] タブ (実験計画) の楽器構成と (温度制御) など関連するパラメーターが定義されます。この手順は、実験の開始時に NSS によって配置されます。ユーザー各サンプルの計測時間を秒単位で入力する必要があります。(実行スキャン) 最後のタブはテーブル スキャン データの概要を提供し、自動スキャンを実行することができます。

2次元散乱画像が記録された後は、Q - 散乱角の関数と強度の 1 D のプロットにこのデータを軽減しなければなりません。データ還元画素感度マスクなど暗い背景差分画像補正も適用されます。生生物の解釈には、MantidPlot ソフトウェア-計測器データの SANS。NSS は軽減し、実験の終わりに最終的なデータを取得する一般的に役立ちます。

図 7は、MantidPlot とデータ削減のために使用されるスクリプト ウィンドウにリモート解析クラスター アクセスの概要を説明します。Raw データは、UCAMS/XCAMS ユーザー認証経由でリモート解析クラスター (analysis.sns.gov) にアクセスできます。リモート デスクトップにログインした後は、単に任意のパスの下で 'MantidPlot' を実行することで、ターミナル ・ ウィンドウから MantidPlot ソフトウェアを起動できます。MantidPlot でスクリプト ウィンドウを開き、NSS の指示に従って、ユーザー削減スクリプトを編集します。このスクリプトを実行すると、セキュリティで保護された FTP を使用して分析のためのローカル コンピューターに転送することができます減少データファイルが生成されます。

図 8は、プロットおよび [ワークスペース] ウィンドウに表示されますユーザー低減スクリプト データの実行後にデータを表示するを示します。既定では、追加サフィックス _f にお越しは、最終的なマージされたデータ。右クリックはエラーを選択すると、表示するデータのスペクトルのプロットになります。表示設定をアクセスするには、「ビュー」メニュー バーから設定を選択します。軸をダブルクリックして軸の書式と印刷範囲を簡単にアクセス可能です。大きなサイズの散乱粒子を含まないバッファーの散乱プロファイルが (一定強度) 比較的平らな線として表示されます。サンプルは、フラット支離滅裂な背景に指数関数的減衰で、低い散乱角度 (Q) に強度を観察すべき。

図 9は、次のデータ削減 SAS データ分析 (または primusqt) ソフトウェア パッケージを使用して適切なバッファー減算の概要を示します。かなり頻繁に支離滅裂な背景 (高 q 強度) はバッファーとサンプルの間少し不一致です。適切な引き算の場合この地域のデータが重複する必要があります。スケール補正強度尺度を重複しているデータの結果をデータに適用して減算を実行することができます。尺度結果バッファー データ ポイントがサンプルに対応するポイントより大きい強度のこれらのポイントは負の値とログ プロットのないレンダリングされたなります。バッファー減算ファイルの負の値が多い場合軽微な削減は、バッファーの尺度と再び減算を実行します。

図 10は、Primus Guinier および距離配布ウィザードの「使用例を提供します。Guinier 分析は、低角度散乱データから二次粒子半径の予備の見積もりを提供します。データが 0 に近づくと線形領域がデータ内に存在する必要があります。この地域でラインのフィッティングでは、斜面と私から決定される Rg 0 Q = 0 で強度のインターセプトから外挿することをことができます。データの傾向 Q がゼロに近づくとは、下落傾向は通常粒子間反発力を示すサンプルでは、集計を示します。これらの傾向は、残差の分布が非確率的最も明白です。球状粒子に適した Guinier の上限値に拘束されて Q * Rg < 1.3 ('s' ATSAS ソフトウェアで Q の代わりに使用されて)。

この Guinier フィットから d MmIAP は 15.4 ± 1.1 Å と推定決定 Rg0 0.580 ± 0.001 として与えられます。

距離ディストリビューション ウィザードでは、合わせて P(r) のパラメーターに行われる体系的な変更をことができます。P(r) 曲線は、実験データに近似曲線の間接フーリエ変換です。したがって、左側のパネルでフィットが正確に実験データを反映していることを確認してくださいに不可欠です。この例では、46 の Dmax に示すフィット Å が得られました。

図 11は、Dmax 選択の一般的なエラーを示しています。しばしば意図的に大きな Dmax P(r) 値 P(r) 関数は x 軸振動、マイナスになってしまいますが発生します。Rmax への急激な移行が切り捨てられた P(r) 曲線リードは人工的に小さい Dmax = 0。

図形のプライマスのウィザードの最初のステップは、Guinier および距離ディストリビューション ウィザードと同じです。実験的データによいフィットを取得するこの情報が提供されている一度アブイニシオモデル設定が構成されています。

図 12は、図形のプライマスのウィザードの適切な入力を示しています。ここでは、実験データ、IAP の SAN オングストロームの尺度で提供され、"SANSEnvelope"の予想されるファイルのプレフィックスが与えられました。17 の初期のダミー原子モデルのセットは、適用ないの対称性 (P1) を「高速」モデル ・ モードと選択なしの anisometry を使用して生成される要求されました。17 モデルのセットが配置、平均と DAMAVER、および DAMMIN を使用して洗練された平均モデルでフィルター処理します。プレフィックスの検査-damsel.log テキスト ドキュメントが選択基準とセットから破棄される任意のモデルの概要を示します。最終的な洗練されたモデルは、SANSEnvelope 1.pdb として書かれました。

SUPCOMB を使用して SAN 封筒の重ね合わせが実行プログラムは、入力として 2 つの PDB 構造ファイルのみで高解像度のモデルでは、モデルします。既定では、"r"は、向きを変えるとスーパーイン ポーズのファイル名に追加されます。

一度 SAN 封筒と高分解能の構造が重ねて表示されて、任意の分子グラフィック プログラムを表示を使用してこれらのモデルを可視化することができます。ソフトフェアから結果は印刷品質の画像に適した、構造調査に係る生物物理の結果を強調する使用ことができます。ここでは、いくつか基本的なソフトフェア操作 3 D 表現と結果の重ね合わせ構造のビューを提供するために使用を示します。

図 13は、ソフトフェア可視化プロセスの概要を示します。PDB ファイルの構造は、ソフトフェアで開かれている、モデルは表示のソフトフェア ビューアー ウィンドウでをする必要があります。次のコードを使用して、各モデルの表現を変更 s ' 各ファイル名の横にあるボタン。SAN のエンベロープと高解像度モデルから蛋白質のバックボーンの漫画表現の表面の表現を使用します。'C' ボタンの下に使用可能なオプションから適切なカラースキームを選択します。蛋白質の鎖、"chainbow"着色色のグラデーションから N-を C 末端の解釈を支援するために用意されています。透明度は、エンベロープに含まれる蛋白質の構造のより良い視覚化を許可する曲面の表現に適用されます。文書画像の白い背景の使用をお勧めします。これらの可視化キューを適用すると、3 D 構造を調べることができます。クリックし、構造をドラッグして視点と分子回転/翻訳の操作を実行できます。

Figure 1
図 1。コントラスト ドデシル maltoside (DDM) のコンポーネントのパラメーターを決定するマルチ コントラスト モジュールを使用します。入力値は、右側に後続の出力と左上の画面に表示されます。コントラスト モジュールの入力ページに「コントラスト」(緑の円) をクリックしてして各画面左側にあるナビゲーション メニューからアクセス。プロジェクトのタイトル、バッファー コンポーネント、およびサブユニット 1 と 2 の入力領域のようなラベルです。出力ページは、重要な粒子情報とコントラスト プロパティは、記述されたシステムを含みます。関連するテーブルと計算されたマッチ ポイントはわかりやすくするためのオレンジ色のボックス化されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2。膜蛋白質界面活性剤複合体の構成要素のコントラストのパラメーターを決定するマルチ コントラスト モジュールを使用します。このインスタンスで、入力をバッファリングされているソリューションの全体的な PDC システムを記述するため与えられています。サブユニット 1 には、コントラストをマッチさせた混合ミセル d25 DDM としてモルで 43% で DDM の構成について説明します。サブユニット 2 MmIAP 入力、数式としてのアミノ酸配列と、膜タンパク質をについて説明します。重水素化レベル (緑色の円) は重水素置換蛋白質の度をについて説明し、SLD とタンパク質の推定する計算のマッチ ポイントに直接影響を与えます。混合洗剤は 48.5% D2O、なります ~ 90% D2o. でタンパク質のマッチ ポイントが発生したときの結果 (オレンジ色のボックス) が、マッチ ポイントを示すこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3。サンプル準備-バイオリアクター トレース。表示されるプロセス値が温度セット ポイント (オレンジ ライン)、溶存酸素量 (DO) セット ポイント (青線)、撹拌セット ポイント (赤い線)、および圧縮空気流量 (ピンクの線)。ポンプ 1 (グリーン ライン) は、pH コントロールの使用でした。18:40 にはスパイクは初期のグリセロールの枯渇を通知され、グリセロール溶液ポンプ 2 (黒線) 経由での給餌を開始する使用されました。X 軸は時間を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4。試料調製-サンプルの FPLC、SDS ページの特性。 Dの最終的なサイズ排除クロマト グラム - MmIAP 20 mm HEPES、pH 7.5、250 mM の NaCl、平衡 48.5% D2O の 0.05% の合計の 44% (w/v) が尾重水素 d25 DDM DDM。クマシー染色とはめ込み: SDS-PAGE 分析。プールされた分数ラベル A、B、および C. 地域"B"が使用された実験では SAN。注釈付きの分子量マーカーは、kDa です。ナインから許可を得て再現画像65この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

Figure 5
図 5。データ コレクション-石英バンジョー サンプル セルとオートサンプラーのセットアップです。(A)オートサンプラー ブロックに休んでバンジョー、空の石英のセルが表示されます。細胞はサンプルでいっぱい、15 利用可能な位置の 1 つに挿入します。(B)サンプル ブロック ビーム管エクステンダーとシリコン検出器タンクへの入り口のウィンドウ (表示されていません) 絞りセレクターの後ろにマウントされます。恒温水浴、サンプル ブロック全体でチャンネルに接続するホースは、サンプルの位置で温度調節を提供します。矢印は、中性子ビームの方向を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6。データ コレクション-スパイス操作とテーブル スキャンの概要です。テーブル スキャン操作、スパイス計測器制御ソフトウェアの左端メニューのテーブル スキャン] ボタンからアクセスできます。緑の矢印が画面の上部にアクティブなタブを示すため、オレンジ色のボックスは、アクティブなユーザー入力のテーブルの領域を強調表示します。(A)テーブル スキャンの最初のタブは検体チェンジャーとサンプル セル位置についての情報を提供するために使用されます。検体チェンジャーで使用される各位置のラベル、サンプル厚み、およびサンプルの型を提供します。' スキャンを行う」にチェック、テーブル スキャン キューに対応する行が追加されます。(B)の 2 番目のタブ (単位は秒) の各サンプルに対して、測定器の構成と測定の時間の詳細が記録されます。楽器構成は中性子散乱の科学者によって事前に構成されてあり、ビームの時間と計測器の提案の提供の詳細に基づいてユーザーに提供します。温度セット ポイントを定義し、時間測定キュー全体を保持する機能など、計測器制御にパラメーターを追加することができます。(C)最後のタブは、テーブルの行ごとに行われる測定の概要を示します。変更が必要ない場合は、'' をスキャン実行ボタンをクリックして自動スキャンが開始されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7。データ削減-削減スクリプトと MantidPlot 操作の概要です。MantidPlot ソフトウェアは、任意のアクティブなディレクトリ (たとえば、黄色の円と矢印を強調のため追加) のターミナル コマンド プロンプトで「mantidplot」を入力して解析クラスター上でアクセス可能。ソフトウェアが開いたら、(緑のボタンで切り替え) スクリプト ウィンドウにアクセスし、中性子散乱の科学者によって提供されるスクリプトを開きます。サンプルおよびバッファーごとにスキャン番号減算のため空のセルおよび空ビーム伝送およびビームの番号をスキャンし同様、自動還元のリストで入力する必要がありますのみ、スクリプト内の指示に従いますセンターの決定。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 8
図 8。データ分析-MantidPlot を使用してデータのプロット。データが MantidPlot で 'ワークスペース' として参照されます。ワークスペース領域はファイル名とユーザー削減スクリプトによって生成されます。ワークスペースを右クリックし、「エラー... スペクトルのプロット」を選択することによってデータ セットの 1 D ワークスペース データをプロットできます。 されます追加のデータは、ドラッグ アンド ドロップのワークスペースで現在のプロットに追加できます。プロット ウィンドウ (両対数プロットなど) の書式は、'ビュー' のメニュー バーの '設定' を選択するか、軸ラベルをダブルクリックすると実行できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 9
図 9。ATSAS ソフトウェア ・ データ解析: 基本操作、バッファー減算。Primusqt アプリケーション (SAS データ解析) は、適切な背景 (バッファー) 差分の可視化を提供します。バッファー ファイル必要がありますスケール減算の高 Q でデータがオーバー ラップするような (散乱は支離滅裂な背景から残りの信号の結果としてフラット)。この高 q 値の範囲のデータを選択すると、スケール操作はスケール係数を定義された領域の重複を生成するテーブルの下のデータ ファイルに適用されます。スケーリング後粒子の純散乱プロファイルを生成するためバッファー ファイルを減算できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 10
図 10。データ分析-Guinier および P(r) (距離分布) 決定。(A) 0 Rg私の初期推定値を提供して Guinier 分析を実行するプリムス Guinier ウィザードを使用します。粒子の種類やデータの範囲に合わせて、フィットを定義する使用されます。Guinier 条件ながら左にフィットと対応する残差のプロットが表示されます (私0と Rg)、Q * Rg制限、および線形フィットの品質は、オレンジ色のボックスでマークされたエリアで出力として提供されています。(B) 、プリムス距離ディストリビューション ウィザードを使用する距離分布解析を実行散乱粒子内の原子間距離の確率を定義し、dmax 関数または最大を含んでいる P(r) 曲線を提供すること原子間の距離。オレンジ色のボックスによって示されるパラメーターは、適切な距離の分布を決定する体系的に調べることができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 11
図 11。距離分布解析から不適切な結果。適切に選択された Dmax は、ゼロに徐々 に崩壊とピーク P(r) 曲線になるはずです。Dmax の値が大きすぎる可能性 P(r) の負の値を生成、または人工的に小さいが多い r. Dmax 値の高い値で x 軸に近い振動 P(r) 曲線の上限値が切り捨てられて表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 12
図 12。モデリング-プリムス図形のウィザードを使用してモデル セットアップ第一原理計算します経験的モデル パラメーターは、単一の入力ウィンドウに提供されます。利用可能な処理のための他のオプションと出力ファイル名のプレフィックス納入します。アニーリングは、高速 (高速冷却と大きなビーズ) または低速 (遅い冷却と小さいビーズ) にすることができます。繰り返しの数は、モデルの機能の再現性を確認するために十分なサイズのする必要があります。粒子の対称性と anisometry は提供されることがわかっている場合。角度スケールは測定データの単位に対応する必要があります。DAMAVER 平均配置しすべてのダミー原子モデルの平均、外れ値モデルを除外する選択基準を適用します。平均モデルから固定の原子の中心はさらになります。 このオプションを選択した場合、DAMMIN を使用して洗練されました。この洗練されたモデルは、プロファイル SAN 実験 3 D 低解像度エンベロープを表す必要があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 13
図 13。可視化実験 SAN 封筒、ソフトフェアを用いた高解像度モデルによるオーバーレイ。ソフトフェアの PDB 構造ファイルを開くと、ソフトフェア ビューアーでモデルが表示されます。アクティブなモデルは、モデルとその表現を処理する使用できますアクション ボタンと一緒に、右側にテーブルに表示されます。基本的な操作は、識別される SAN 封筒と高解像度契約 (または不一致) 構造体の領域を許可するこれらのモデルを可視化するため提供しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

テーブル 1。膜蛋白質の調査で一般的に使用される界面活性剤の物性このファイルをダウンロードするここをクリックしてください

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Discussion

構造生物学研究では、溶液散乱溶液中生体分子から (全体のサイズや形) など生化学的および構造の詳細を取得するような相補的な構造技術を活用します。SAN は、膜蛋白質の低分解能構造、現代構造生物学と生化学のコア焦点を決定するための特に魅力的な手法です。SAN に匹敵する結晶構造試験 (1 mg/サンプル) の浄化された蛋白質の量が必要です。高純度重水素化洗剤膜タンパク質研究に関連する、最近拡大の商業的利用にアクセス可能なこの水素/重水素実験膜蛋白質界面活性剤複合体のサンセリフのコンテンツを操作するための手段蛋白質信号を直接記録することができます。成功した場合、わずか数時間にわたって収集されたデータから経験的モデル分子エンベロープを計算できます。したがって、膜蛋白質の生化学者、とらわれる、および構造生物学者容易に活用できます SAN ソリューションの膜蛋白質、パートナーまたは基板、および得られたモデルを結合との複合体構造の切望された最初の 3 D モデルを取得するのSAN では、回折データを段階的に使用できます。膜蛋白質を特徴付けるための SAN のルーチン使用膜タンパク質の生化学分野の変革と創薬と開発に基本的な構造機能からの波及効果を持ちます。タンパク質間、タンパク質-DNA、または水素/重水素内容に容易に操作することができますその他生体分子複合体を研究のための貴重な技術 SAN 中性子コントラスト重水素置換とのマッチングの利点になります。

小角散乱装置の設計や理論に関する詳細は、以下のレビューをお勧めします: バイオ-計測器、高フラックス同位体リアクターのオークリッジ国立研究所、SAN の79小角散乱構造生物学-落とし穴、72と溶液中生体高分子の小角散乱法による研究を避けながら、フロンティアを拡大しています。80現在の計測器の構成、与えられたシステムの最適パラメーターの中性子散乱科学者は話し合うことができるも。例えば、低い Q (散乱角度と中性子波長の関数である) でデータが大規模なシステム一般に求められます。バイオで最も一般的な楽器構成-SAN-1 Å 0.003 の Qを提供し、最大数百 kDa の大きなタンパク質複合体に適しています。〜 3 mg mL-1 30 kDa (単量体) コントラスト マッチ ミセル 48.5% D2O 溶液中でのおおよそのサイズの膜タンパク質を含むソリューション サンプル、バッファー、および空のセル (24 の代表的な測定時間約 8 時間が必要です。時間 = 1 日の総)。計測器測定時与えられたコントラスト条件は、散乱粒子の分子量および濃度の製品によると約スケールできます。しかし、サンプルの濃度で実質的な上限は、任意の非特異的タンパク質凝集を含む、非相互作用の条件下で散乱粒子を測定する必要があります。時間の測定はある特定の蛋白質の安定性に制限を配置します。幸いなことに、SANS の測定することができる日常的にタンパク質の寿命を改善するために冷蔵温と低エネルギー中性子ビームの採用は、計測中に放射線損傷を発生しません。

このプロセスの概要と洗剤のコントラスト マッチ ポイントで測定された試料からの中性子散乱の成功記録に向かって多くの要因の決定は、本稿で提示されます。洗剤のヘッド グループとアルキル鎖コンポーネント間制服中性子コントラストと洗剤の混合物を設計することにより集計の洗剤の完全な一致を取得に向けての重要なステップが含まれます。この洗剤の試合一点で測定を提供散乱プロファイル興味の膜蛋白質のみに起因する経験的エンベロープを表すデータから再構築する膜タンパク質を許可します。データ分析と第一原理計算プロトコルのモデル化も全体的な構造、構造変化、他の中のオリゴマーの状態に対処する目的がそのような調査から得られる潜在的な情報を示しています。1 つの制限は、までには非常にいくつかの洗剤重水素置換で市販されていることです。19

目的は、蛋白質を達成するためにこの場合する必要があります perdeuteration は必要ではないかもしれないが、> 65% の重水素標識タンパク質。また、グループの頭と尾があり洗剤選択的重水素、洗剤のミセルの CMP が 100% D2O、近く発生して、重水素標識を必要とせず、タンパク質から十分なコントラストを実現できます。洗剤のコントラスト マッチ ポイントで測定したとき十分な散乱を達成するために蛋白質の適切な重水素化レベルを決定します。膜タンパク質の発現と精製、この記事の範囲を超えて残る81に関連付けられている多くの課題があります。残念ながら、重水素化の高レベルは現在 (まだ) 不可能な真核生物用です。我々 は、これはいくつかの真核生物のタンパク質の制限を実現する一方、ほとんどの膜タンパク質はこのメソッドが適切な細菌の嗅覚あります。

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Disclosures

フォルカー s. 都市、サイ ヴェンカテシュ Pingali、ケビン ・ l ・ ワイス、C. ライアンオリバー著者が中性子科学ユーザー プログラムとバイオ サポートする米国 DOE と UT バテルを通じて契約されています-オークリッジ国立研究所のこの記事で使用される楽器の SANS。

この原稿がされてポーセリンペインティングの UT-バテル、LLC は、デ-AC05-00OR22725 米国エネルギー省 (DOE) との契約の下。米国政府を保持し、パブリッシャー、パブリケーションのアーティクルを受け入れることで米国政府が発行またはこの原稿の発行済みのフォームを再現したりする非独占的、払込、取消不能、世界的なライセンスを保持することを認める他の人は、米国政府の目的のために。DOE は、DOE のパブリック アクセスの計画に従って連邦政府委託研究のこれらの結果へのパブリック アクセスを提供します。 82

Acknowledgments

構造分子生物学 (CSMB) とバイオのオークリッジ国立研究所のセンターで研究をサポート オフィスの生物と環境の研究-科学的なユーザー施設課の基本的なエネルギー科学のオフィス、米国部門でサポートされている機能を使用して SANエネルギー。リーバーマン ラボでの膜タンパク質の構造的な仕事は、NIH (DK091357、GM095638) によってサポートされている、NSF (0845445)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component

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