Détection de protéines localisation subcellulaire par Green Fluorescence marquage de protéines et 4', 6-Diamidino-2-phénylindole coloration chez Caenorhabditis elegans

Biology

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Summary

Ce protocole montre comment suivre une translocation nucléaire de protéines sous la contrainte thermique à l’aide d’une protéine de fusion de protéine (GFP) par fluorescence verte comme un marqueur et 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration. Le DAPI souillant le protocole est rapide et préserve les signaux de localisation sous-cellulaire GFP et de protéines.

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Liang, J., De Castro, A., Flores, L. Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (137), e57914, doi:10.3791/57914 (2018).

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Abstract

Dans ce protocole, une protéine de fusion de protéine (GFP) fluorescence verte et 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration sont utilisés pour suivre les changements de localisation subcellulaire de protéine ; en particulier, une translocation nucléaire sous une chaleur stress condition. Les protéines réagissent signaux proportionnellement aux internes et externes. Un mécanisme commun est de changer sa localisation subcellulaire. Cet article décrit un protocole afin de suivre la localisation des protéines qui ne nécessite pas un anticorps, marquage radioactif ou un microscope confocal. Dans cet article, GFP est utilisé pour marquer la protéine cible EXL-1 chez c. elegans, un membre de la famille de protéines (CLICs) intracellulaire canal chlorure, y compris les mammifères CLIC4. Une lignée transgénique intégré translationnelle exl-1::gfp (avec un promoteur et une séquence de gène complet) a été créée par la transformation et le rayonnement γ et stablement exprime le gène et la gfp. Des recherches récentes ont montré que, lors de stress thermique, stress oxydatif pas, EXL-1::GFP s’accumule dans le noyau. Chevauchement avec la structure des noyaux et le DAPI, le signal de GFP signaux confirme les changements de localisation sous-cellulaire EXL-1 sous contrainte. Ce protocole présente deux méthodes différentes de fixation pour la coloration DAPI : fixation de l’éthanol et la fixation de l’acétone. Le protocole de coloration DAPI présenté dans cet article est rapide et efficace et préserve aussi bien le signal de la GFP et les changements de localisation sous-cellulaire des protéines. Cette méthode nécessite seulement un microscope à fluorescence avec Nomarski, un filtre FITC et un filtre DAPI. Il est adapté pour le petit laboratoire, étudiant en Master recherche, recherche étudiant de lycée et classes de biotechnologie.

Introduction

Un changement de localisation subcellulaire des protéines est un mécanisme commun en réponse aux signaux internes ou externes, tels que le stress thermique, famine, stress oxydatif, l’apoptose, la phosphorylation des protéines et d’autres. Par exemple, un stress thermique induit un membre FOXO DAF-16 translocation nucléaire1,2et la protéine BCL-2 pro-apoptotiques que BID translocation vers les mitochondries à mort récepteur signalisation3,4. Il existe plusieurs techniques détecter ces changements. Une combinaison de western blot et biochimiquement isoler des structures subcellulaires (p. ex., les mitochondries ou les noyaux) pourrait bien atteindre l’objectif3. Cependant, elle nécessite un anticorps spécifique contre la protéine d’intérêt. Ainsi, un anticorps bien établi devient la clé de la réussite. Une autre approche consiste à étiqueter les différentes structures subcellulaires ou organites avec des marqueurs différents tels que la protéine de fluorescence verte (GFP), protéine de fluorescence rouge (DP), protéine de fluorescence jaune (YFP) et mCherry et l’étiquette dans le même temps la protéine de intérêt avec les autres marqueurs. Ensuite, les observer sous un microscope confocal de localiser les cibles5,6. Isotopes radioactifs sont une alternative de choix pour l’étiquetage des protéines cibles et détection puis leur localisation subcellulaire7. Toutefois, cette méthode requiert une formation adéquate et la gestion des déchets radioactifs. Dans des circonstances telles que l’absence d’un anticorps spécifique, l’absence d’un bon marqueur, ou le manque d’équipement, comme un microscope confocal, une autre approche doit être examinée. Pour identifier une translocation nucléaire de protéine, il est attirant pour marquer uniquement les protéines cibles avec un marqueur et pour colorer les noyaux avec le réactif chimique 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) puisqu’il suffit d’un microscope à fluorescence ordinaire.

Immunomarquage c. elegans avec des anticorps est un défi en raison de la faible perméabilité de la cuticule de collagène qui entourent l’animal ou la coquille de l’oeuf. Pendant ce temps, étant donné que les protéines de c. elegans sont significativement différentes des leurs orthologues vertébrés, quelques sociétés commerciales fournissent c. elegans avec des produits spécifiques. Il est difficile pour un petit laboratoire à produire des anticorps de c. elegans pour eux-mêmes. Chercheurs dans la communauté utilisent souvent les protéines étiquetées comme marqueurs pour démontrer une expression de localisation ou de gène de protéine. Cet article utilise EXL-1::GFP par exemple pour suivre une translocation nucléaire de protéines sous stress de chaleur8. Une translation intégré exl-1::gfp dans le génome de l’animal sert à stablement expriment le gène de fusion de gfp . Recherche a montré que exl-1 est exprimé dans l’intestin, muscle de la paroi corporelle et autres structures subcellulaires8. Ce protocole montre comment synchroniser vers le quatrième stade larvaire (L4), effectuer une chaleur stress experiment et conduite coloration DAPI, éthanol de fixation, fixation de l’acétone et l’imagerie sous un microscope à fluorescence ordinaire.

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Protocol

1. les solutions

  1. Plaques NGM
    1. Dans une fiole d’Erlenmeyer de 2 L, ajouter 3 g de NaCl, 17 g de gélose, 2,5 g de Peptone et 975 mL de dH2O. la couverture de l’embouchure de la fiole avec du papier aluminium. Autoclave le flacon pour 50 min. refroidir pendant 20 à 30 min.
    2. Ajouter ensuite des solutions stérilisées : 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de cholestérol 5 mg/mL dans de l’éthanol, 1 mL de 1 M MgSO4et 25 mL de tampon de4 (pH 6.0) KPO 1 M. Agiter les solutions pour bien les mélanger.
    3. En utilisant un distributeur de liquide, ajouter la solution NGM pour plats de Pétri de 60 mm. Remplissage des plaques de 2/3 plein d’agar. Entreposez-les dans un contenant hermétique à 4 ° C pour une utilisation future.
  2. Tampon de4 M 1 KPO (pH 6.0)
    1. Dissoudre 10,83 KH2PO4 et 3,56 g K2HPO4 dH2O, puis ajustez le volume total à 100 mL. Autoclave la solution pendant 15 minutes.
  3. M9
    1. Dissoudre 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl dans dH2O, ajouter 1 mL de 1 M MgSO4et ajuster le volume total de 1 L.
  4. 10 µg/mL DAPI
    1. Ajouter 1 µL de 10 mg/mL DAPI dans 999 µL de dH2O.
  5. alcool à 95 % (v/v)
    1. Mesurer 95 mL d’alcool à 100 % et ajouter de l’eau distillée pour régler le volume à 100 mL.
  6. acétone 30 % (v/v)
    1. Ajouter 30 mL d’acétone à dH2O et ajuster le volume à 100 mL.

2. Stress thermique

  1. Générer une ligne de tableau extrachromosomique dont une construction translationnelle des gènes de cible9,10. Également obtenir ces lignes de la centre de génétique de Caenorhabditis (CCG), qui est une ressource publique pour la recherche de c. elegans , ou d’un laboratoire de recherche déjà publiés.
  2. Intégrer les lignes extrachromosomiques dans le génome en exposant les vers à 3 800 rayonnement γ Rad9. Ensuite, sélectionnez les lignes stablement expresses afin que chaque animal exprime une protéine marqueur tel qu’un GFP ou rouleau.
  3. Pour supprimer les mutations générées pendant le rayonnement, croiser les lignes au moins 2 x. Cette lignée transgénique permet de détecter les changements de modèle expression protéiques sous contrainte.
  4. Préparer les plaques ver NGM comme indiqué au point 1.1. Ensemencer un clone OP50 et culture de la bactérie dans un bouillon LB liquide du jour au lendemain. Graines les plaques NGM avec liquide OP50 culture et incuber les boîtes dans un incubateur à 37 ° C durant la nuit à cultiver une pelouse de bactéries comme source de nourriture pour les vers. Refroidir les plaques à température ambiante pendant au moins 30 min avant utilisation.
  5. Cultiver la lignée transgénique à 20 ° C sans faim au moins 2 générations avant le test de stress de chaleur.
  6. Choisissez 8 à 10 jeunes adultes gravides (utérus rempli d’oeufs) pour une nouvelle plaque de ver, puis laissez les pondent des œufs pendant environ 3 à 5 h et retirer les plaques de tous les adultes.
  7. Pour synchroniser les vers, laissez les œufs éclosent et poussent les larves pendant environ 48 h au quatrième stade larvaire (L4). Examiner leur structure de la vulve (une structure de demi-lune) afin d’identifier le L4 stade (Figure 1, flèche)11.
  8. Placer les plaques de ver avec la larve L4 dans une étuve à 35 ° C pendant 2 à 5 h atteindre le stress thermique. Placez un thermomètre dans la couveuse pour mesurer avec précision la température.

3. la coloration DAPI

  1. Fixation de l’éthanol
    1. Ajouter 10 µL de tampon M9 dans le centre d’une lame de verre.
    2. Choisir les vers un choc thermique de l’étape 2.8 et placez-les dans le tampon de M9 sur la lame de verre.
      1. Vous pouvez également laver la plaque avec le M9, il centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min à température ambiante et éliminer le surnageant. Ajouter les vers à la lame de verre.
    3. Utiliser un linge doux pour vider tout le liquide en excès. Regarder cette étape sous un microscope à dissection.
    4. Ajouter 10 µL d’alcool à 95 % sur les vers et les laisser sécher à l’air. Regarder le processus sous un microscope à dissection et ne laissez pas les animaux deviennent trop secs. Immédiatement après que l’éthanol est évaporé des animaux, passez à l’étape suivante.
      Remarque : L’éthanol s’évapore très rapidement.
    5. Répétez l’étape 3.1.4 deux fois afin que les vers sont fixes.
      Remarque : Il est normal que les animaux semblent plus sombres et déformée.
    6. Ajouter 10 µL de DAPI (10 µg/mL) à la worms. Immédiatement, recouvrir d’un lamelle couvre-objet et sceller la diapositive avec gel vernis à ongles transparent.
    7. Découvre les animaux après environ 10 min sur un microscope à fluorescence.
  2. Fixation de l’acétone (une autre approche)
    1. Laver la plaque de choc thermique de l’étape 2.8 avec M9, il centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min à température ambiante et éliminer le surnageant. Laver le culot avec 1 mL de dH2O, percevoir le culot et éliminer le surnageant.
    2. Ajouter 400 µL d’acétone 30 % pendant 15 min. Centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min à température ambiante et éliminer le surnageant. Permet de laver les animaux 2 500 µL de dH2O x. Jeter le surnageant.
    3. Ajouter 200 µL de DAPI (10 µg/mL), ou 4 fois le montant du volume du ver total, dans le tube pendant 15 min.
    4. Centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min et éliminer le surnageant. Laver le culot 2 x avec 500 µL de dH2O. Placer les vers sur lames de verre, couvrez-les avec lamelles couvre-objet, sceller la diapositive avec le vernis à ongles transparent gel et observer les animaux sous un microscope à fluorescence.

4. microscopique imagerie

  1. Allumez la source de lumière UV et un microscope à fluorescence. Allumez l’ordinateur connecté au microscope.
  2. Chargez la lame sur le microscope à fluorescence. Un objectif de faible puissance (10 X) permet de localiser les vers, augmenter la puissance de grossissement 400 X et se concentrer sur le spécimen.
  3. Ouvrez le logiciel fourni avec le microscope. Cliquez sur « Acquisition » dans le menu ; Cliquez sur « Appareil photo » et sélectionnez la caméra connectée au microscope ; Cela permet à la caméra sélectionnée communiquer avec le logiciel.
    Remarque : Les différents microscopes peuvent varier dans l’opération.
  4. Sous la même « Acquisition », cliquez sur « Acquisition multidimensionnelle ». Cela ouvre une nouvelle fenêtre de navigation « Acquisition multidimensionnelle ». Cliquez sur le bouton « Multicanal », et tous les canaux disponibles apparaîtra.
  5. Choisissez le bleu, le vert et DIC (contraste interférentiel différentiel) pour observer l’échantillon. Dans la fenêtre de navigation « Acquisition multidimensionnelle », laissez le « Blue-DAPI », « Vert-GFP » et « Gris-DIC », « Nomarski » canaux Faites un clic droit sur d’autres chaînes, telles que « Red-rhodamine » et « champ blanc brillant », pour les fermer.
  6. Tout d’abord, mesurer le temps d’exposition pour chaque canal :
    1. Cliquez sur le canal « Bleu-DAPI » pour le sélectionner puis cliquez sur « Mesure » afin de prendre une image en direct sous la manche DAPI avec la durée d’exposition automatique. Une nouvelle fenêtre avec une image en direct apparaîtra.
    2. Sur le côté gauche de la fenêtre de l’image en direct, ajuster manuellement la durée d’exposition si nécessaire pour rendre l’image comme vous le souhaitez.
    3. Enfin, cliquez sur " "OK » dans la fenêtre de l’image en direct. Ceci définit le temps d’exposition sous le canal DAPI.
  7. Répétez l’étape 4.6 pour les autres chaînes, « Green-GFP » et « Gris-DIC », « Nomarski », de mettre en place les temps d’exposition pour ces chaînes.
  8. Dans la fenêtre de navigation « Acquisition multidimensionnelle », cliquez sur « Démarrer » pour recueillir automatiquement des 3 images sous les 3 différents canaux dans l’ordre (voir ci-dessus) avec des durées d’exposition spécifiques énoncés.
  9. Pour enregistrer le fichier, allez dans le menu principal, cliquez sur « Fichier » puis sur « Enregistrer sous ». Nom du fichier d’entrée et le nom du dossier. Enregistrez le fichier sous le format de fichier par défaut pour conserver les informations détaillées d’imagerie pour référence ultérieure.
  10. Pour exporter le fichier dans d’autres formats :
    1. Allez dans « Fichier » et cliquez sur « Export ». Cela va ouvrir une fenêtre de réglage d’exportation.
    2. Définissez le nom de fichier et de dossier. Cochez « Créer un dossier de projet » afin de mieux organise les données. Le logiciel permet également l’utilisateur de spécifier 4 autres options : « Generate fusionnée images », « Utiliser la couleur pour les images de canal », « Utiliser des noms de canal » et « L’image fusionnée seulement ».
    3. Choisissez un type de fichier souhaité dans le menu déroulant, comme « TIF », « BMP », « PSD », ou « JPG » et d’autres types. Cliquez ensuite sur « Start » pour l’exportation.

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Representative Results

Les protéines intracellulaires canal chlorure (CLIC) sont des protéines multifonctionnelles qui sont hautement conservées entre espèces12. Beaucoup de recherches montre que les CLICs régulent le stress cellulaire, autophagie, apoptose, carcinogenèse, l’angiogenèse et la réponse immunitaire innée de macrophages dans le système des mammifères13,14,15,16 ,,17. Il y a deux homologues de CLIC chez c. elegans: exl-1 et exc-4. Notre étude récente a montré que exl-1 régule stress animal gestion8. Nous avons intégré une construction translationnelle exl-1::gfp dans un génome animal et créé des lignées transgéniques, qui expriment stablement gène exl-1 avec un GFP comme marqueur (Figure 2 a et 2 b). Sous la contrainte thermique, EXL-1::GFP s’accumule dans le noyau de la région intestinale puisque le signal fort de la GFP chevauche la structure du noyau (Figure 2-C -E). Pour confirmer la localisation subcellulaire, coloration DAPI a été utilisée comme une approche pour colorer les noyaux. À l’aide de la fixation de l’éthanol pour les spectacles coloration DAPI claires noyaux dans le corps animal (Figure 3 b). Fixation de l’acétone réalise également des résultats semblables (Figure 3E). Les signaux qui se chevauchent de GFP et DAPI confirment que EXL-1::GFP a en effet accumulé dans les noyaux dans la région intestinale (Figure 3, F).

Figure 1
Figure 1 : Images d’un quatrième larvaire (L4) stade c. elegans en vertu des pouvoirs différents grossissement. (A) 63 X, (C) et (B) 115 X 400 X puissance de grossissement. Flèches pointent vers la vulve d’un ver de L4 ; Notez la structure de la demi-lune. Echelle = 100 µm dans toutes les images. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : sous la contrainte thermique, EXL-1::GFP s’accumule dans le noyau de l’intestin. (A) Normaski image d’une région intestinale avant un choc thermique. (B) un signal fort de la GFP a été observé dans la région d’instestinal avant un choc thermique. (C) Normaski image de la région intestinale après un choc thermique (point de flèches pour les noyaux de la région intestinale). (D) un signal fort de la GFP s’accumule après un choc thermique. (E) chevauchement image de GFP et Normaski. Toutes les photos sont prises avec la puissance de grossissement X 400. Echelle = 50 µm dans toutes les images. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : EXL-1::GFP translocation nucléaire est confirmée par la coloration DAPI. (A-C) À l’aide de la fixation de l’éthanol pour coloration DAPI. (D-F) À l’aide de la fixation de l’acétone pour la coloration DAPI. Dans A et D, couleur verte montre signal GFP dans la région intestinale. B et E, couleur bleue indique les noyaux par coloration au DAPI. C et F montrent des images qui se chevauchent de GFP, DAPI et Normaski. Echelle = 50 µm dans toutes les images. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire : Fixation acétone préserve le spécimen et 60 jours après la fixation de l’acétone, GFP et DAPI signaux sont encore observables. (A) vert est pour GFP. (B) le bleu est pour signal DAPI. (C) qui se chevauchent l’image de GFP, DAPI et DIC. Toutes les images sont prises moins de 400 puissance de grossissement de X. Echelle = 50 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Cet article présente une méthode rapide et efficace pour vérifier les modifications subcellulaire protéique du cytoplasme au noyau. L’expression de la protéine a été montrée par une fusion de GFP, tandis que la structure du noyau a été vérifiée par DAPI coloration (Figure 3). Immunomarquage c. elegans protéines étant difficile, la plupart localisations subcellulaires de la protéine c. elegans sont caractérisées par leur marquage avec des protéines de marqueurs tels que GFP, Laz, mCherry et autres,du1819 , 20 , 21. dans cet article, gfp a été utilisée pour baliser le gène cible exl-1 afin de démontrer sa localisation cellulaire de la protéine. Pour confirmer la localisation nucléaire, coloration DAPI a été utilisée. Deux méthodes possibles ont été présentés pour la coloration DAPI. Les deux noyaux fort efficacement a montré chez les vers dans un laps de temps de travail décent (moins de 1 h). La fixation de l’éthanol est adaptée pour une collection de petit échantillon comme une observation de qualité (moins de 50 vers de perception). Empêchant les vers de dessécher complètement est la clé. Une fois que l’alcool à 95 % s’évapore vers, procéder immédiatement à l’étape suivante. La fixation de l’acétone est idéal pour un prélèvement à grande échelle comme une analyse quantitative (plus de 50 animaux de perception). Toutefois, en raison des multiples étapes de laver l’échantillon, certains spécimens seront perdues. Ainsi, il est fortement recommandé de soigneusement retirer le surnageant et conserver les vers autant que possible. Une fois qu’elles sont scellées, diapositives résultant de la fixation de l’acétone peuvent être stockés pendant une semaine à 4 ° C.

Ce protocole peut être ajusté aux autres protéines d’intérêt à suivre l’évolution de la localisation subcellulaire. En plus de la contrainte thermique présentée ici, autres tests de stress pourraient être évaluées, telles que le stress oxydatif, stress de métaux lourds, des restrictions alimentaires et autres. Changement de localisation subcellulaire de protéines pourrait également être examiné en changeant le bagage génétique de la protéine d’intérêt. Par exemple, la lignée transgénique peut être traversée en fond d’un mutant différent, afin que la nouvelle interaction génétique puisse être identifiée. L’interférence ARN (ARNi) pourrait également être appliquée pour abattre les gènes spécifiques et enquêter sur le changement de localisation subcellulaire de protéine qui en résulte. Ces applications sont d’un grand intérêt pour identifier de nouvelles composantes réglementaires. Pour une protéine inconnue, diverses conditions expérimentales doivent être testées, tels que les concentrations de réactif test, la durée de la contrainte de temps et les stades de développement spécifiques vers. Dans notre étude, nous avons essayé différentes durées, de 30 min à 5 h et les températures de stress de chaleur différents. Un choc thermique à 35 ° C pendant 3 h démontre clairement une translocation nucléaire de protéine.

Des applications supplémentaires de coloration DAPI comprennent l’examen du processus de la méiose et la mitose en vers, surtout dans les cellules germinales cellules22,23,24,25et le nombre de noyaux dans un fond20,26,27. de mutant génétique

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

Acknowledgements

Les souches de c. elegans utilisées dans cette étude ont été obtenues depuis le centre de génétique de Caenorhabditis, qui est soutenu par le National Institutes of Health - programmes d’Infrastructure du Bureau de la recherche (P40 OD010440). Ce travail a été soutenu par les NIH : 1R03AG048578-01 Jun Liang, CUNY-groupe 1501 à Jun Liang et CFP-CUNY 66184-00 44 et 45/67248-00 Jun Liang. Cathy Savage-Dunn nous remercions de bien vouloir partager son espace de laboratoire. Toutes les images de fluorescence ont été perçus au Queens College Core Facility. Nous remercions William J. Rice pour ses commentaires sur le manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Biotium 40043 both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well
OP50 CGC OP50 https://cgc.umn.edu/
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
Kim Wipe Kimberly-Clark Corporation soft tissue
Zeiss  AX10 Zeiss fluorescence microscope
Axiovision Rel 4.8 Zeiss microscope software
AxioCam MR Rev3 Zeiss digital camera
Incubator 
Micro centrifuge
Transparent nail polish gel
60 mm petri dishes
Glass slides
Glass coverslips
1-20 µL pipettor
20-200 µL pipettor
200-1000 µL pipettor
1-200 µL pipet tips
200-1000 µL pipet tips
1.5 mL microcentrifuge tubes
Platinum wire worm pick

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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