Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu iletişim kuralı bir protein nükleer translocation ısı stres altında bir yeşil floresans protein (GFP) füzyon proteini bir işaretleyici olarak ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanarak izlemek gösterilmiştir boyama. İletişim kuralı boyama DAPI hızlı ve GFP ve protein hücre altı yerelleştirme sinyalleri korur.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Liang, J., De Castro, A., Flores, L. Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (137), e57914, doi:10.3791/57914 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bu iletişim kuralı, bir yeşil floresans protein (GFP) füzyon protein ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) boyama protein hücre altı yerelleştirme değişiklikleri; izlemek için kullanılır Özellikle, bir ısı altında nükleer translocation stres durumu. Proteinler buna bağlı olarak dış ve iç sinyalleri tepki. Onun hücre altı yerelleştirme değiştirmek için ortak bir mekanizmadır. Bu makalede bir antikor, radyoaktif etiketleme veya confocal mikroskop gerektirmez protein yerelleştirme izlemek için bir iletişim kuralı. Bu makalede, GFP memeli CLIC4 de dahil olmak üzere klorür hücre içi kanal proteinleri (CLICs) ailesinin C. elegans, üye EXL-1 hedef protein etiketlemek için kullanılır. Bir entegre translasyonel exl-1::gfp transgenik satır (bir organizatörü ve tam gen sıralaması) dönüştürme ve γ-radyasyon tarafından oluşturulmuş ve stabil gfpve gen ifade eder. Son araştırma ısı stres, değil oksidatif stres, EXL-1::GFP çekirdeğinde biriken gösterdi. GFP sinyal çekirdek yapısı ve DAPI ile örtüşen sinyalleri stres altında EXL-1 hücre altı yerelleştirme değişiklikleri onaylar. Bu iletişim kuralı DAPI boyama için iki farklı fiksasyon yöntemi sunar: etanol fiksasyon ve aseton fiksasyon. Bu makalede sunulan DAPI boyama iletişim kuralı hızlı ve verimli ve GFP sinyal hem protein hücre altı yerelleştirme değişiklikleri korur. Bu yöntem yalnızca Nomarski, FITC filtre ve DAPI filtre ile floresan mikroskop gerektirir. Bir küçük laboratuvar ayarı, lisans öğrencisi araştırma, lise öğrenci araştırma ve biyoteknoloji derslik için uygundur.

Introduction

Protein hücre altı yerelleştirme değişikliği yanıt olarak dahili veya harici sinyaller ısı stres, açlık, oksidatif stres, apoptozis, protein fosforilasyon ve diğerleri gibi ortak bir mekanizmadır. Örneğin, ısı stres FOXO üye DAF-16 nükleer translocation1,2ve3,4sinyal alıcı ölümü üzerine mitokondri için teklif translocates pro-apoptotik BCL-2 protein neden olmaktadır. Çeşitli teknikler bu değişiklikleri algılamak kullanılabilir. Western blot ve biyokimyasal olarak izole hücre altı yapıları (Örneğin, mitokondri veya çekirdek) bir arada de hedef3elde edebiliriz. Ancak, spesifik bir antikor protein ilgi karşı gerektirir. Böylece, köklü bir antikor başarı için anahtar olur. Farklı hücre altı yapıları veya organelleri yeşil floresans protein (GFP), kırmızı floresans protein (RFP), sarı floresans protein (YFP) ve mCherry gibi çeşitli işaretçileri olan etiket ve bu arada protein etiket için alternatif bir yaklaşımdır ilgi diğer işaretleri ile. O zaman, onları hedef5,6yerelleştirmek için confocal mikroskop altında gözlemlemek. Radyoaktif izotoplar hedef proteinler etiketleme ve onların hücre altı yerelleştirme7algılama için alternatif bir seçimdir. Ancak, bu yöntem uygun eğitim ve radyoaktif atıkların işlenmesi gerekir. Spesifik bir antikor eksikliği, uygun bir işaretleyici yokluğu veya ekipman confocal mikroskop gibi scarceness gibi bu şartlar altında başka bir yaklaşım dikkate alınması gerekiyor. Protein nükleer translocation tanımlamak için sadece bir işaretleyici ile hedef proteinler etiketlemek için ve çekirdeklerin Kimyasal reaktif 4', 6-diamidino-2-phenylindole (Bu sadece normal floresan mikroskop gerektirdiğinden DAPI) ile leke için çekici.

Immunolabeling C. elegans antikorlar ile yumurta kabuğu veya hayvan çevreleyen kolajen kütikül düşük geçirgenliği nedeniyle meydan okuyor. Bu arada, C. elegans proteinler--dan onların omurgalı orthologs önemli ölçüde farklı olduğu için birkaç ticari şirketler ile belirli ürünler C. elegans sağlar. C. elegans antikorlar kendileri için üretmek küçük bir laboratuvar için zordur. Araştırmacılar toplumda sık sık tagged proteinler protein yerelleştirme veya gen ifade göstermek için imleyicileri kullanın. Bu makale EXL-1::GFP bir protein nükleer translocation ısı stres8altında izlemek için örnek olarak kullanılmıştır. Bir entegre translasyonel exl-1::gfp içine hayvan genom stabil gen gfp füzyon ile ifade etmek için kullanılır. Araştırma exl-1 bağırsak, vücut duvar kas ve diğer hücre altı yapıları8ifade edilir gösterdi. Bu iletişim kuralı, solucanlar dördüncü larva (L4) sahneye eşleştirir, ısı stres deney ve davranış DAPI boyama, etanol fiksasyonu, aseton fiksasyon ve görüntüleme düzenli floresan mikroskop altında gerçekleştirmek gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. çözümler

  1. NGM plakaları
    1. Bir 2 L Erlenmeyer şişesi, NaCl, 3 g, agar 17 g, pepton 2.5 g ve dH2O. kapak alüminyum folyo ile balonun ağzı 975 mL ekleyin. Otoklav şişesi 50 dk. 20-30 dakika sakin ol.
    2. Sonra steril çözümleri ekleyin: 1 mL 1 M CaCl2, 5 mg/mL kolesterol etanol içinde 1 mL, 1 M MgSO41 mL ve 1 M KPO4 (pH 6.0) arabelleği 25 mL. Onları iyice karıştırın çözümleri girdap.
    3. Sıvı Sabunluk kullanarak, 60 mm Petri plakaları NGM çözümü dağıtmak. Ağar kaplamalar 2/3 tam dolgusuna. Onları ileride kullanmak üzere 4 ° C'de hava geçirmez bir kap içinde saklayın.
  2. 1 M KPO4 arabellek (pH 6.0)
    1. KH2PO4 10.83 g ve 3.56 g K2HPO4 ' te dH2O çalışma geçiyoruz, o zaman 100 ml toplam ses seviyesini. Basınçlı kap 15dk için çözüm.
  3. M9
    1. 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO dağıtılması4ve 5 gram NaCl dH2O, 1 M MgSO41 mL ekleyin ve 1 m'ye toplam ses seviyesini
  4. 10 µg/mL DAPI
    1. 10 mg/ml DAPI dH2O. 999 µL içine 1 µL Ekle
  5. % 95 alkol (v/v)
    1. 95 mL %100 alkol ölçmek ve ses seviyesini 100 ml distile su ekleyin.
  6. % 30 aseton (v/v)
    1. 30 mL aseton dH2için O ekleyin ve toplam ses seviyesini 100 ml.

2. ısı stres

  1. Hedef genlerin9,10translasyonel bir yapı ile bir extrachromosomal dizi satırı oluşturmak. Alternatif olarak, bu satırları üzerinden Caenorhabditis genetik Merkezi ( C. elegans araştırma için bir kamu kaynağı olan CGC), veya daha önce yayımlanmış araştırma laboratuvarı alabilirsiniz.
  2. Extrachromosomal satırları solucanlar 3.800 Rad γ-radyasyon9açarak genom entegre. Sonra her hayvan bir işaretleyici protein GFP veya silindir gibi ifade eder stabil ifade çizgileri seçin.
  3. Radyasyon sırasında oluşturulan mutasyonlar kaldırmak için çizgiler en az 2 outcross x. Protein ifade deseni değişiklikleri stres altında transgenik bu cümleyi.
  4. NGM solucan plakaları 1.1. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın. Bir OP50 klon çizgi ve sıvı LB suyu bakterilerde gecede kültür. Solucanlar için bir besin kaynağı olarak bir bakteri çim büyümeye sıvı OP50 NGM pilakalar kültür ve 37 ° C kuluçka plakaları kuluçkaya tohum gecede. Plakalar için kullanmadan önce en az 30 dakika oda sıcaklığında sakin.
  5. 20 ° C ısı stres tahlil öncesinde en az 2 nesiller için açlık olmadan transgenik satırında büyümek.
  6. 8-10 genç gravid yetişkin (rahim yumurta ile dolu) bir yeni solucan plaka, sonra onları yumurtlamak için yaklaşık 3-5 h let için almak ve tüm yetişkin plakalar kaldırın.
  7. Solucanlar eşitlemek için yumurta yumurtadan ve larvaları yaklaşık 48 saat için dördüncü larva (L4) sahne alanı'na büyümeye izin. L4 sahne (Şekil 1, ok)11tanımlamak için onların vulva yapısı (yarım ay yapısı) inceleyin.
  8. Isı stres ulaşmak 2-5 h için 35 ° C kuluçka L4 larvaları ile solucan tabak koyun. Bir termometre doğru ısısını ölçmek için kuluçka makinesine koyun.

3. DAPI boyama

  1. Etanol fiksasyon
    1. 10 µL M9 arabelleği bir cam slayt ortasına ekleyin.
    2. Isı şok solucanlar adım 2.8 toplar ve onları koyardım M9 arabelleğine cam slayt üzerinde.
      1. Alternatif olarak, M9 ile plaka uzakta yıkama, 1000 x g oda sıcaklığında 1 dk. için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atmak. Solucanlar için cam slayt ekleyin.
    3. Herhangi bir aşırı sıvı boşaltmak için yumuşak bir doku kullanın. Diseksiyon mikroskop altında bu adıma dikkat et.
    4. 10 µL % 95 alkol solucanlar üzerine eklemek ve onları kurutma. Diseksiyon mikroskop altında süreci izlemek ve çok kuru olsun hayvan izin vermeyin. Sonra hemen etanol hayvanlardan buharlaşıp vardır, sonraki adıma geçin.
      Not: Etanol çok hızlı buharlaşır.
    5. Adımı yineleyin 3.1.4 iki kez böylece solucanlar sabit.
      Not: Bu hayvanlar için karanlık ve çarpık bakmak normaldir.
    6. DAPI 10 µL ekleyin (10 µg/mL) solucanlar için. Hemen onları bir coverslip ile karşılamak ve şeffaf oje jel içeren slaydı mühür.
    7. Floresan mikroskop üzerinde yaklaşık 10 dakika sonra hayvanlar görüntüleyin.
  2. Aseton fiksasyon (alternatif bir yaklaşım)
    1. Adım 2.8 M9 ile ısı şok plaka uzakta yıkama, 1000 x g oda sıcaklığında 1 dk. için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atmak. Pelet dH2O 1 mL ile yıkayın, Pelet toplamak ve süpernatant atın.
    2. 1000 x g için oda sıcaklığında 1 dk 400 µL % 30 aseton 15 dk. santrifüj ekleyin ve süpernatant atın. Hayvanlar 2 yıkamak için dH2O 500 µL kullanın x. Süpernatant atmak.
    3. DAPI 200 µL ekleyin (10 µg/mL), veya 4 x tüp 15 dakika içinde toplam solucanlar birim miktarı.
    4. 1000 x g 1 dk. için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Pelet 2 yıkama x 500 µL dH2O. ile solucanlar cam slaytlarda yer, onları coverslips ile karşılamak, şeffaf oje jel içeren slaydı mühür ve floresan mikroskop altında hayvanlar gözlemlemek.

4. mikroskobik görüntüleme

  1. UV ışık kaynağı ve floresan mikroskop açın. Mikroskop için bağlı olduğu bilgisayarda açın.
  2. Floresan mikroskop slaytta yükleyin. Solucanlar bulmak, 400 X büyütme gücünü arttırın ve numune üzerinde odaklanmak için bir düşük güç objektif lens (10 X) kullanın.
  3. Mikroskop ile sağlanan yazılımını açın. "Alma" menüsünde'ı tıklatın; "Kamera" tıklayın ve mikroskop için bağlı kamera seçin; Bu yazılım ile iletişim kurmak seçili kamera sağlar.
    Not: Farklı mikroskoplar işleminde değişiklik gösterebilir.
  4. Altında aynı "alma", "Çok boyutlu edinme"'ı tıklatın. Bu yeni bir "Çok boyutlu edinme" gezinti penceresi açar. "Çok kanallı" düğmesini ve tüm kanallar görüntülenir.
  5. Mavi, yeşil ve numune gözlemlemek için DIC (diferansiyel girişim kontrast) seçin. "Çok boyutlu edinme" Gezinti penceresinde "Mavi-DAPI", "Yeşil-GFP" ve "Gri-DIC", "Nomarski" kanallarda bırakın; "Kırmızı-rodamine" ve "beyaz parlak alan", gibi diğer kanallar sağ tıklayın onları kapatın.
  6. İlk olarak, pozlama süresi her kanal için tedbir:
    1. Seçin ve sonra otomatik çekim hızı ile DAPI kanalın altında canlı bir görüntü çekmek için "Ölçü" tıklayın "Mavi-DAPI" kanal sol tıklatın. Canlı bir görüntü ile yeni bir pencere açılacaktır.
    2. Canlı görüntü penceresinin sol tarafında el ile istediğiniz gibi resim yapmak gerekirse çekim hızı ayarlayın.
    3. Son olarak "Tamam tıklayın" canlı görüntü penceresinde. Bu çekim hızı DAPI kanalın altında ayarlar.
  7. Diğer kanallar, "Yeşil-GFP" ve "Gri-pozlama süreleri bu kanallar için ayarlamak için DIC", "Nomarski" için 4,6 arasındaki adımları yineleyin.
  8. "Çok boyutlu edinme" Gezinti penceresinde otomatik olarak 3 resim sipariş (bkz. yukarıda) belirtildiği gibi belirli pozlama süreleri ile 3 farklı kanalların altında toplamak için "Başlat" tıklayın.
  9. Kurtarmak belgili tanımlık eğe için ana menüye gidin, "Dosya" ve sonra "Kaydet"'i tıklatın. Dosya adını ve klasör adını girin. İleride detaylı görüntüleme bilgileri korumak için varsayılan dosya biçimi olarak kaydedin.
  10. Diğer biçimlerde dosyasını dışa aktarmak için:
    1. Gitgidmek "Eğe" ve tıkırtı üstünde "ihracat yapmak". Bu bir dışa aktarma ayarı pencere açılacaktır.
    2. Dosya adı ve klasör ayarlayın. "Bir proje klasörü için daha iyi oluşturmak" verileri düzenlemek kontrol edin. Yazılım aynı zamanda 4 diğer seçenekleri belirtmek kullanıcı sağlar: "Generate birleştirilmiş görüntüler"kanal görüntülerde renk kullanın",", "Kanal adları kullan" ve "Yalnızca birleştirilmiş resim".
    3. Açılan menüden "TIF", "BMP", "PSD", veya "JPG" ve diğer türleri gibi istediğiniz dosya türünü seçin. O zaman tıkırtı üstünde "ihracat Başlat".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Klorür hücre içi kanal proteinler (klik) türler12arasında son derece korunmuş çok fonksiyonlu proteinlerdir. CLICs hücresel stres, autophagy, apoptozis, karsinojenezis, anjiogenez ve makrofaj doğuştan gelen bağışıklık yanıtı memeli sistem13,14,15,16 düzenleyen çok araştırma gösterir ,17. C. elegansiçinde iki CLIC homologs vardır: exl-1 ve hariç-4. Bizim yeni çalışma exl-1 hayvan stres yönetimi8düzenleyen gösterdi. Biz bir translasyonel exl-1::gfp yapı bir hayvan genom entegre ve stabil bir GFP ile gen exl-1 (Şekil 2A ve 2B) bir işareti olarak ifade transgenik satırlarının oluşturulduğu. Güçlü GFP sinyal çekirdek yapısı ile (2 C - anlaE) ile çakışıyor bu yana ısı stres altında EXL-1::GFP çekirdeği bağırsak bölgesinde birikir. Hücre altı yerelleştirme onaylamak için DAPI boyama bir yaklaşım çekirdeklerin leke için kullanıldı. Etanol fiksasyon DAPI boyama gösterir açık çekirdeği hayvan vücuttaki (Şekil 3B) için kullanma. Aseton fiksasyon da benzer sonuçlar (Şekil 3E) elde. Üst üste gelen GFP ve DAPI sinyalleri EXL-1::GFP gerçekten çekirdek (Şekil 3 c, F) bağırsak bölgesinde birikmiş onaylayın.

Figure 1
Resim 1: Bir dördüncü larva (L4) görüntülerini C. elegans farklı büyütme güçleri altında sahne. (A) 63 X, (B) 115 X ve (C) 400 X büyütme gücü. Oklar L4 solucan vulva işaret; yarım ay yapısı unutmayın. Ölçek çubuğu tüm görüntülerde 100 µm =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: ısı stres altında EXL-1::GFP bağırsak çekirdekleri içinde birikir. Isı şok önce bir bağırsak bölgesinin (A) Normaski görüntü. (B) güçlü bir GFP sinyal instestinal bölgesinde Isı şok önce gözlendi. (C) Normaski görüntü Isı şok (çekirdeklerin okları gelin bağırsak bölgesinin) sonra bağırsak bölgesinin. (D) güçlü bir GFP sinyal ısı şoktan sonra birikir. (E) görüntü GFP ve Normaski denk geliyor. Tüm fotoğraflar 400 X büyütme gücü ile çekilmiştir. Ölçek çubuğu tüm görüntülerde 50 µm =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: EXL-1::GFP nükleer translocation olduğunu doğruladı tarafından DAPI boyama. (A-C) Etanol fiksasyon DAPI boyama için kullanma. (D-F) Aseton fiksasyon DAPI boyama için kullanma. A ve Dyeşil renk GFP sinyal bağırsak bölgesinde gösterir. B ve E, mavi renk DAPI boyama tarafından çekirdek gösterir. C ve F GFP, DAPI ve Normaski üst üste gelen görüntülerini göster. Ölçek çubuğu tüm görüntülerde 50 µm =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek şekil: Numune aseton fiksasyon korur ve 60 gün sonra aseton fiksasyon, GFP ve DAPI hala observable sinyaller. (A) için GFP yeşildir. (B) mavi için DAPI sinyaldir. (C) görüntü GFP, DAPI ve DIC denk geliyor. Tüm resimler altında 400 X büyütme güç alınır. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu makale için çekirdek sitoplazma protein hücre altı değişiklikleri doğrulamak için hızlı ve etkili bir yöntem mevcuttur. Çekirdek yapı (Şekil 3) boyama DAPI tarafından doğrulandı ise protein ifade GFP füzyon tarafından gösterildi. İmmunostaining C. elegans proteinler zor olduğundan, çoğu C. elegans protein hücre altı yerelleştirmeler GFP, Laz, mCherry ve diğerleri gibi işaret proteinler ile etiketleyerek karakterizedir18,19 , 20 , 21. Bu makalede, gfp hedef gen exl-1 etiketlemek için onun protein hücrede yerleşimi göstermek için kullanılmıştır. Nükleer yerelleştirme onaylamak için DAPI boyama kullanıldı. İki farklı yöntemi sunuldu DAPI boyama için. Her ikisi de etkin bir şekilde iyi bir çalışma zaman çerçevesinde (az 1 h) solucanlar güçlü çekirdek gösterdi. Etanol fiksasyon (50'den az solucanlar toplama) bir kalite gözlem gibi bir küçük örnek koleksiyon için uygundur. Solucanlar tamamen kurumasını önlemek için anahtardır. Bir kez solucanlar % 95 alkol buharlaşır, hemen bir sonraki adıma geçin. Aseton fiksasyon (50'den fazla hayvan toplama) kantitatif analiz gibi büyük ölçekli örnek koleksiyonu için uygundur. Ancak, örnek yıkama birden çok adımı nedeniyle, bazı örnek kaybolacak. Böylece, dikkatle süpernatant kaldırmak ve mümkün olduğu kadar çok solucanlar korumak için önerilir. Bir kez onlar mühürlü, aseton fiksasyon kaynaklanan slaytlar 4 ° C'de bir hafta boyunca saklanabilir

Bu iletişim kuralı diğer proteinler hücre altı yerelleştirme değişiklikleri izlemek için faiz için ayarlanabilir. Burada sunulan ısı stres yanı sıra, diğer stres deneyleri, oksidatif stres, ağır metal stres, diyet kısıtlamaları ve diğerleri gibi tabi. Protein hücre altı yerelleştirme değişikliği de ilgi proteinin genetik arka plan değişikliği tarafından muayene. Örneğin, böylece roman genetik etkileşim tespit transgenik satır farklı bir mutantın arka plana geçti. RNA müdahale (RNAi) da belirli genler vurmak ve elde edilen protein hücre altı yerelleştirme değişiklik araştırmak için uygulanabilir. Bu uygulamalarını yeni düzenleyici bileşenleri tanımlamak için yüksek ilgi vardır. Bilinmeyen bir protein için çeşitli deneysel koşullar, test reaktif konsantrasyonları gibi stres süreyi ve solucanların belirli gelişim aşamalarında test edilmelidir. Bizim çalışmada, farklı süreler, 5 h ve farklı ısı stres sıcaklıklar 30 dk dan denedik. 35 ° c 3 h için bir ısı şok bir protein nükleer translocation açıkça göstermektedir.

DAPI boyama ek uygulamalar arasında mayoz ve mitoz işleminin incelenmesi germline hücreleri22,23,24,25, özellikle de solucan ve bir sayısı içinde çekirdek sayısı bir genetik mutantın arka plan20,26,27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar bildirmek için bir şey yok.

Acknowledgements

Bu çalışmada kullanılan C. elegans suşları Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından - Office of araştırma altyapı programları (P40 OD010440) desteklenen Caenorhabditis genetik Merkezi'nden elde edilmiştir. Bu eser NIH tarafından desteklenmiştir: 1R03AG048578-01 Jun Liang, Jun Liang ve PSC CUNY-CCRG 1501-CUNY 66184-00 44 ve 67248-00 45 Jun Liang için. Cathy Savage-Dunn nazikçe onu laboratuvar alanı paylaşımı için teşekkür ederiz. Tüm floresans görüntüleri Queens Koleji çekirdek tesisinde toplanmıştır. William J. Rice el yazması üzerine onun yorum için teşekkür.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI Biotium 40043 both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well
OP50 CGC OP50 https://cgc.umn.edu/
Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
Kim Wipe Kimberly-Clark Corporation soft tissue
Zeiss  AX10 Zeiss fluorescence microscope
Axiovision Rel 4.8 Zeiss microscope software
AxioCam MR Rev3 Zeiss digital camera
Incubator 
Micro centrifuge
Transparent nail polish gel
60 mm petri dishes
Glass slides
Glass coverslips
1-20 µL pipettor
20-200 µL pipettor
200-1000 µL pipettor
1-200 µL pipet tips
200-1000 µL pipet tips
1.5 mL microcentrifuge tubes
Platinum wire worm pick

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Essers, M. A., et al. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK. The EMBO Journal. 23, (24), 4802-4812 (2004).
  2. Oh, S. W., et al. JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, (12), 4494-4499 (2005).
  3. Gross, A., et al. Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death. The Journal of Biological Chemistry. 274, (2), 1156-1163 (1999).
  4. Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. BH3-only proteins: a 20-year stock-take. The FEBS Journal. 282, (6), 1006-1016 (2015).
  5. Mayorova, T. D., et al. Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses. PLoS One. 13, (1), e0190905 (2018).
  6. Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death. Methods in Molecular Biology. 97-105 (2018).
  7. Pedrazzini, E., Vitale, A. Protein biosynthesis and maturation in the ER. Methods in Molecular Biology. 179-189 (2018).
  8. Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12, (9), e0184308 (2017).
  9. Evans, T. C. Transformation and microinjection. Wormbook. edited by The C. elegans Research Community (2006).
  10. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  11. Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. Wormbook. edited by The C. elegans Research Community (2006).
  12. Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator. The Journal of Biological Chemistry. 276, (5), 3319-3323 (2001).
  13. Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections. Molecular Carcinogenesis. 46, (8), 599-604 (2007).
  14. Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. 22, (3), 541-548 (2009).
  15. Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts. The American Journal of Pathology. 161, (2), 471-480 (2002).
  16. He, G., et al. Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide. European Journal of Immunology. 41, (5), 1221-1230 (2011).
  17. Zhong, J., et al. Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation. PLoS One. 7, (6), e39378 (2012).
  18. Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, (26), 6453-6464 (2003).
  19. Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (20), E2667-E2676 (2015).
  20. Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9, (7), e101929 (2014).
  21. Matus, D. Q., et al. Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression. Developmental Cell. 35, (2), 162-174 (2015).
  22. Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination. Cell. 118, (4), 439-452 (2004).
  23. Ames, K., et al. A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development. Current Biology. 27, (6), 905-913 (2017).
  24. Pekar, O., et al. Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche. Development. 144, (16), 2896-2906 (2017).
  25. Schvarzstein, M., et al. DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis. Genetics. 198, (1), 193-207 (2014).
  26. Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (10), 5285-5290 (2000).
  27. Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans. Genes to Cells. 9, (1), 39-47 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics