Kemiske Reversion af konventionelle humane pluripotente stamceller til en naiv-lignende tilstand med forbedret Multilineage differentiering potens

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi præsenterer en protokol for effektiv, bulk og hurtige kemiske reversion af konventionelle afstamning-pulverlak humane pluripotente stamceller (hPSC) ind i en epigenomically-stabil naive præimplantations epiblast-lignende pluripotente tilstand. Denne metode resulterer i nedsat afstamning-pulverlak genekspression og markant forbedring i styret multilineage differentiering på tværs af et bredt repertoire af konventionelle hPSC linjer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Naïve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency. J. Vis. Exp. (136), e57921, doi:10.3791/57921 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Naive humane pluripotente stamceller (N-hPSC) med forbedret funktionalitet kan have en bred effekt i regenerativ medicin. Målet med denne protokol er effektivt tilbage afstamning-pulverlak, konventionelle humane pluripotente stamceller (hPSC) vedligeholdes på enten feeder-fri eller feeder-afhængige forhold til en naiv-lignende pluripotency med forbedret funktionalitet. Denne kemiske naive reversion metode beskæftiger klassisk leukæmi hæmmende faktor (LIF), GSK3β, og MEK/ERK hæmning cocktail (LIF-2i), suppleret med kun en tankyrase hæmmer XAV939 (LIF-3i). LIF-3i vender konventionel hPSC til en stabil pluripotente stat vedtage biokemiske, transcriptional og epigenetiske funktioner i den menneskelige præ-implantation epiblast. LIF-3i metoden kræver minimal celle kultur manipulation og reproducerbare meget i et bredt repertoire af humane embryonale stamceller (menneskelige stamceller) og transgen-fri menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) linjer. LIF-3i metode kræver ikke en ny grunding skridt før differentiering; N-hPSC kan differentieres direkte med meget høj effektivitet og vedligeholde karyotypic og epigenomiske stabilitet (herunder på påtrykt loci). For at øge universelle i metoden, konventionelle hPSC er først kulturperler i LIF-3i cocktail suppleres med to yderligere små molekyler, at forstærke protein kinase en (forskolin) og sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) signalering (LIF-5i). Denne korte LIF-5i tilpasning trin betydeligt forbedrer den oprindelige klonal ekspansion af konventionelle hPSC og tillader dem at være efterfølgende naive gendannes med LIF-3i alene i bulk mængder og dermed længere er behov for pluk/subcloning sjældne Nielsen-hPSC kolonier senere. LIF-5i-stabiliseret hPSCs vedligeholdes efterfølgende i LIF-3i alene uden brug af anti-apoptotiske molekyler. Vigtigst, forbedrer LIF-3i reversion markant den funktionelle pluripotency af et bredt repertoire af konventionelle hPSC ved faldende deres slægt-pulverlak genekspression og sletning af interline variabiliteten af styret differentiering almindeligt observeret blandt uafhængige hPSC linjer. Repræsentative beskrivelser af LIF-3i-vendt N-hPSC er forudsat, og eksperimenterende strategier til funktionel sammenligninger af isogene hPSC i slægt-pulverlak vs. naiv-lignende stater er skitseret.

Introduction

2i (MEK/ERK og GSK3β hæmmer) kultur-systemet blev oprindeligt udviklet for at forfine heterogene serum-baserede mus embryonale stamceller (mESC) kulturer til en ensartet grundtilstand for pluripotency beslægtet med musen præimplantations epiblast1. 2i understøtter dog ikke stabil vedligeholdelse af humane pluripotente stamceller (hPSC) linjer2. De forskellige komplekse lille molekyle, vækstfaktor-suppleret, og transgene tilgange er for nylig blevet rapporteret at fange derfor lignende menneskelige naiv-lignende pluripotente molekylære hedder2. Men mange af de "naiv-lignende" stater lavet med disse metoder også udstillet karyotypic ustabilitet, epigenomiske defekter (fx globale tab af forældrenes genomisk prægning), eller forringet differentiering potentielle.

I kontrast, Cocktailen af tredobbelt kemiske hæmning af GSK3β, ERK og tankyrase signalering og leukæmi hæmmende faktor (LIF-3i) var tilstrækkelig for et bredt repertoire af konventionelle hPSC linjer3stabile naiv-lignende tilbagevenden. LIF-3i-vendt naiv hPSC (N-hPSC) opretholdes normal karyotypes og øget deres udtryk for naiv-specifikke menneskelige præimplantations epiblast gener (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i reversion også tillægges hPSC med et array af molekylære og biokemiske egenskaber enestående til mESC-lignende naive pluripotency, der omfattede øget fosforyleres STAT3 signalering, faldt ERK fosforylering, globale 5-methylcytosine CpG hypomethylation, genome-wide CpG demetylering på embryonale stamceller (ESC)-specifikt gen initiativtagere og dominerende distale OCT4 forstærker skik. Desuden, i forhold til andre naive reversion metoder, som resulterede i en anderledes hypomethylated præget genomisk loci, LIF-3i-vendt N-hPSC var blottet for systematisk påtrykt CpG mønstre eller tab af DNA methyltransferase udtryk (f.eks. DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.

En direkte LIF-3i kultur i en bred vifte af konventionelle humane embryonale stamceller (menneskelige stamceller) og menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) dyrkes på enten foderautomater eller E8 feeder-fri betingelser opnået hurtige og bulk tilbagevenden til en naiv epiblast-lignende tilstand. Direkte LIF-3i naive reversion kan dog være ineffektiv i nogle ustabile konventionel hPSC linjer på grund af de iboende genomisk og afstamning-pulverlak variabilitet som følge af genetisk forskellige donor baggrunde.

Således, for at udvide nytten af metoden LIF-3i, en trinvis optimering blev udviklet og præsenteres heri, der giver universel naive reversion med næsten alle konventionelle menneskelige stamceller eller transgen-fri hiPSC linje kulturperler på foderautomater. Denne universalized naive reversion metode beskæftiger et forbigående oprindelige kultur skridt i konventionelle hPSC, der supplerer LIF-3i cocktailen med to ekstra små molekyler (LIF-5i) at forstærke protein kinase en (forskolin) og sonic hedgehog (sHH) ( purmorphamine) signalering. En indledende passage af konventionelle hPSC i LIF-5i tilpasser dem til efterfølgende stabil LIF-3i reversion som bulkvarer. Indledende LIF-5i tilpasning øger betydeligt indledende enkelt celle klonede spredning af konventionelle hPSC dyrkes på E8 eller foderautomater (før deres efterfølgende stabil og kontinuerlig passage i LIF-3i alene). Konventionelle hPSC linjer tilpasset først tolerere en passage i LIF-5i efterfølgende bulk klonede passaging naive gendannes celler i LIF-3i betingelser, som overflødiggør behovet for pluk- og subcloning af de sjældne stabile kolonier eller den rutinemæssige anvendelse af anti-apoptotiske molekyler eller Rho-forbundet protein kinase (ROCK) hæmmere.

LIF-3i metode er blevet med held ansat til stabilt udvide og opretholde et bredt repertoire af > 30 uafhængige, genetisk forskellige konventionelle hPSC linjer for > 10 – 30 passager ved hjælp af enten ikke-enzymatiske eller enzymatisk dissociation metoder, og uden beviser af induktion af kromosomale eller epigenomiske abnormiteter, herunder abnormaliteter på påtrykt gen loci. Derudover sekventielle LIF-5i/LIF-3i kultur er den eneste naive reversion metode der hidtil er blevet rapporteret at forbedrer den funktionelle pluripotency af et bredt repertoire af konventionelle hPSC linjer ved at reducere deres slægt-pulverlak genekspression og dramatisk forbedre deres Multipotente differentiering potens. LIF-3i naive reversion metoden sletter den iboende interline variation af differentiering af afstamning-pulverlak, konventionelle hPSC linjer, og vil have en stor nytte af ansøgning i regenerativ medicin og cellulære behandlingsformer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr procedurer blev udført i overensstemmelse med dyrs pleje retningslinjer og protokoller godkendes af det Johns Hopkins School af medicin Institut for dyrs pleje og brug udvalg (IACUC).

1. forberedelse af mus embryonale fibroblaster (MEF) for Feeder-afhængige konventionel (menneskelige stamceller medium/MEF) eller naive gendannes (LIF-3i medium/MEF) hPSC kultur

  1. Køb eller forberede in-house lav-passage forsyninger af MEF foderautomater fra CF1 eller CF1 x DR4 hybrid E13.5 mus embryoner efter publicerede protokoller4.
    1. Cryopreserve lav passage (p1-p2) MEF kulturer før (til langtidsopbevaring) eller efter (for op til 6 måneder) bestråling og opbevares i flydende nitrogen som tidligere beskrevet4.
    2. Bestråle (5.000 rad) bulk udvidet MEF under p5 ved hjælp af en γ - eller X-stråle-irradiator og forberede delprøver på 1,5 x 106 celler pr. hætteglas til kortvarig oplagring (mindre end 6 måneder) ved-80 ° C i en ultra-lav temperatur fryser.
    3. Pladen mellem 1,2 x 106 (frisk bestrålet ikke-befrugtede) og 1.5 x 106 (bestrålet befrugtede) MEF pr. én 6-godt forklistres plade for at forberede feeder kulturer, som beskrevet nedenfor.
  2. Forbered gelatine-belagt 6-godt sterile vævskultur-behandlede plader ved at tilføje 1,5 mL sterilt 0,1% gelatine løsning til hver brønd i en biologisk sikkerhed kabinet.
  3. Inkuber gelatine-belagte plader ved 37 ° C i mindst 1 time eller natten over i et laboratorium CO2 inkubator.
  4. Den næste dag, tø lav passage (fx P2 til P4) DMSO-befrugtede og bestrålet (5.000 rad) MEF efter trinene anført nedenfor.
    Bemærk: Ikke bestrålet MEF bør også være optøet, udvidet og bestrålet umiddelbart før brug.
  5. Anbringes en befrugtede MEF alikvot i et 37 ° C vandbad. Efter optøning, sterilisere tube med ethanol og straks fortyndes DMSO kryoprotektant mindst 10-fold med MEF medium (tabel 1) inden for en biosikkerhed kabinet (f.eks. overdragelse 1 mL DMSO-MEF delprøve til 9 mL MEF medie i en steril 15 mL konisk).
  6. Der centrifugeres de fortyndede MEF celler på 200 x g i 5 min i sterile 15 mL konisk rør.
  7. Opsug i en biosikkerhed kabinet, supernatanten celle-fri, og celle resuspenderes i 1-2 mL frisk MEF medium.
  8. Forsigtigt kassere gelatine løsning og der tilsættes 2 mL af MEF re suspenderet i MEF medium til hver brønd med en gelatinized 6-godt plade, som anført ovenfor. Grev MEF celler og plade 1,2 x 106 (frisk bestrålet ikke-befrugtede) eller 1,5 x 106 (bestrålet befrugtede) MEF pr. én 6-godt forklistres plade.
    Bemærk: Alle celle kultur plader, der er overført fra CO2 inkubator til biosikkerhed kabinet kan tørres forsigtigt af med ethanol-sprøjtede papir men direkte sprøjtes ikke på med 70% ethanol løsning til at undgå ethanol formidling i brøndene.
  9. Inkuber MEF plader ved 37 ° C natten over i et laboratorium CO2 inkubator (5% CO2, fugtigt atmosfære) for at tillade vedhæftede filer, før anvendelsen.

2. bulk stabilisering af konventionelle hPSC kulturer for efterfølgende naive Reversion med en kort LIF-5i tilpasning trin

  1. Validere alle konventionelle hPSC linjer for besidder en normal karyotype af G-banding, før begyndelsen LIF-5i/LIF-3i reversion.
    Bemærk: LIF-3i reversion af høj-passage konventionelle hPSC linjer (fx., P > 40 – 50) bør undgås, da disse kulturer kan allerede havn genomiske afvigelser, der kan have en negativ effekt stabile, effektive og bulk LIF-3i reversion af primet, convetional hPSC linjer.
  2. Vedligeholde og udvide konventionelle hPSC kulturer med validerede normale karyotypes i et MEF-baserede kultur system (som beskrevet i afsnit 1), eller en feeder-fri kultur system (ifølge investigators præference).
    Bemærk: Begge feeder-afhængige hPSC/MEF cocultures (fx menneskelige stamceller medium (tabel 1) suppleret med 4-10 ng/mL bFGF) eller feeder-fri (fx., E8 5 eller mTSER 6 medier (ifølge producentens anvisninger på vitronectin-belagte plader) metoder er kompatibel med bulk naive reversion ved hjælp af LIF-5i/LIF-3i/MEF system (figur 1). Ikke-enzymatiske metoder er at foretrække for passaging af konventionelle hPSC før forberede reversion. LIF-5i og LIF-3i media formuleringer indeholder ikke antibiotika eller svampemidler agenter. Standarddrift regler for Biosikkerhed kabinet sterilitet og vedligeholdelse forventes at overholdes nøje for at undgå kontaminering bakterie- eller svampeinfektion.
  3. MEF-baseret kultur system, forberede MEF foderautomater i gelatinized 6-godt plade som beskrevet i afsnit 1 mindst én dag før passaging af LIF-5i-tilpasset konventionelle hPSC kulturer.
  4. Efter konventionelle hPSC kulturer har nået ~ 50% confluency (dvs. 3-5 dage efter første plating), erstatte standard menneskelige stamceller næringssubstratet med LIF-5i medium (2 mL pr. brønd; Tabel 1).
    Bemærk: Udføre disse trin i en biosikkerhed kabinet.
  5. Kultur og vedligeholde konventionelle hPSC/MEF for op til 2 dage i LIF-5i i CO2 inkubator (5% CO2, fugtigt atmosfære). Ændre LIF-5i medium dagligt for at tilpasse dem til deres efterfølgende passage og stabil reversion i LIF-3i.
  6. Alternativt, for feeder-fri konventionelle kulturer (f.eks.i E8), kultur hPSC i LIF-5i kun natten før passaging næste morgen.
    Bemærk: LIF-5i og LIF-3i kulturer kan både vedligeholdes med enten atmosfæriske (21% O2) eller fysiologisk (5% O2) ilt niveauer i CO2 inkubator (5% CO2, fugtigt atmosfære).
  7. Før passaging, placere kultur plader i en biosikkerhed fryser, vaske LIF-5i-tilpasset konventionelle hPSC gang med PBS og tilsættes 1 mL af celle dissociation reagens til hver brønd. Inkuber i 5 minutter ved 37 ° C i en CO2 inkubator, og forsigtigt hakkede med en pipette til en enkelt cellesuspension tilbage i biosikkerhed kabinet.
    Bemærk: Ikke-enzymatiske dissociation buffere kan alternativt anvendes for at forberede enkelt celler til passaging.
  8. Indsamle cellesuspension i menneskelige stamceller medium (mindst 2-fold fortynding) i en steril 15 mL konisk rør, og forsigtigt hakkede celler af pipettering for at få en enkelt cellesuspension.
  9. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min, aspirat/Fjern supernatanten, og celle resuspenderes i 1-2 mL af LIF-5i medium i biosikkerhed kabinet. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer eller en automatisk celle counter.
  10. Vaske den forhånd belagte MEF plade to gange med PBS (2 mL pr. brønd i 6-godt plader) og distribuere 1 – 2 x 106 celler (i 2 mL LIF-5i medium) på 1 godt af PBS-vasket MEF plade.
  11. Justere og optimere indledende plating tætheder for hver enkelte hPSC linje at være naive gendannes, da replating effektivitet kan være meget varierende. Pladen anbringes i en CO2 inkubator (5% CO2, fugtigt atmosfære).
    Bemærk: Den rutinemæssige anvendelse af anti-apoptotiske reagenser er ikke anbefalet til de fleste hPSC linjer med denne metode. LIF-5i system allerede betydeligt forbedrer indledende bulk klonede re forkromning effektivitetsgevinster af konventionelle hPSC linjer. Dog en engangs-brug af ROCK inhibitor (5-10 μM Y-27632) yderligere kan forbedre den indledende LIF-5i klonede re forkromning effektiviteten af konventionelle hPSC kulturer i den første passage for nogle ustabile afstamning-pulverlak hPSC linjer med tilbøjelighed til spontan differentiering.
  12. Hvis start fra feeder-fri kulturer (fxE8), direkte overføre et godt af de dissocierede konventionelle hPSC tilpasset i LIF-5i i bestrålet en MEF forgyldt brønd (dvs., 1:1 passage).
  13. Den næste dag, forsigtigt swirl plade til at løfte alle løsgængere celler, Aspirér medium (PBS vask er valgfri) og erstatte med 2 mL af LIF-5i medium. Udføre dette trin i en biosikkerhed kabinet dagligt i 3-5 dage eller indtil celler er 60-70% sammenflydende (figur 1). Pladen anbringes i en CO2 inkubator (5% CO2, fugtigt atmosfære).

3. langsigtede vedligeholdelse og udvidelse af N-hPSC i LIF-3i Medium

  1. Efter indledende LIF-5i tilpasning, passage efterfølgende stabil LIF-3i kulturer hver 3-4 dage i et kabinet biosikkerhed, eller når kulturer bliver 60-70% sammenflydende (figur 1).
    Bemærk: LIF-3i kulturer kræver grundig vedligeholdelse og giver N-hPSC kulturer at nå høje confluency/celle tæthed fra langvarig kultur (fx., > 4 dage) falder efterfølgende klonede re forkromning effektivitet og fremmer spontane differentiering.
  2. I en biosikkerhed kabinet, kassere næringssubstratet og vaske hver godt af LIF-5i/LIF-3i kulturer ved forsigtigt tilsætning 2 mL PBS. Kassér PBS og tilsættes 1 mL celle detachement. Inkuber i 5 minutter ved 37 ° C i en CO2 inkubator (5% CO2, fugtigt atmosfære).
  3. Indsamle cellesuspension, tilføje menneskelige stamceller medium (uden hæmmere eller vækstfaktorer (tabel 1) mindst 2-fold fortynding) at gendanne alle hPSC og forsigtigt hakkede celler af pipettering for at få en enkelt cellesuspension. Overføre suspension til en steril 15 mL konisk slange.
  4. Der centrifugeres ved 300 g til 5 min og aspirat/Fjern supernatanten. Genopslæmmes celle pellet i LIF-3i medium. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer eller en automatisk celle counter.
  5. Plade ~ 2 x 105 celler pr. brønd på den bestrålede MEF i gelatinized 6-godt pladen for rutinemæssig passaging af LIF-3i kulturer. For de første LIF-5i-tilpasset kulturer, plade en i første omgang højere tæthed (4 x 105 celler/brønd) før den første passage ind LIF-3i/MEF.
  6. Re plade og distribuere LIF-5i-tilpasset hPSC på frisk PBS-vasket bestrålede MEF feeder plader (forberedt den foregående dag som ovenfor) i LIF-3i medium. Erstatte LIF-3i medium dagligt.
  7. Passage N-hPSC for mindst 4 – 7 kontinuerlig bulk passager i LIF-3i medium forud for brug af N-hPSC i funktionelle undersøgelser eller kryopræservering. Registrere antallet af passager af N-hPSC i enten konventionel eller LIF-3i medier.
    Bemærk: LIF-3i reversion af høj-passage (f.eks. > p40) slægt-pulverlak, konventionelle hPSC linjer anbefales ikke. Bør gøres en indsats hen til hjemfalde til konventionelle hPSC linjer på den lavest mulige passage, at de er tilgængelige. Desuden er brug af LIF-3i-vendt hPSC, som har undergået større end 10 LIF-3i passager ikke anbefalet til funktionelle studier, da sådanne N-hPSC kulturer kan havnen karyotypically unormal kloner på grund af langvarig klonede celle kultur valg. Frisk LIF-5i/LIF-3i reversions af lav-passage konventionelle hPSC linjer bør gennemføres for funktionelle studier, hvis lagre af N-hPSC med < 10 passager i LIF-3i er ikke tilgængelige.

4. kryopræservering og optøning af LIF-3i-vendt Nielsen-hPSC

  1. Udvid hjemfalde N-hPSC for mindst 5-7 passager i LIF-3i, som anført ovenfor, inden det anvendes i funktionelle undersøgelser eller langsigtede kryopræservering. Registrere antallet af passager i konventionelle betingelser og i LIF-3i betingelser på hvert befrugtede hætteglas.
    Bemærk: Overskydende LIF-3i-vendt N-hPSC ikke bruges i funktionelle assays kan være befrugtede på hver passage, men indefrysning af lavere efter reversion passager (fx., < p3) kan resultere i dårlig eller meget varierende efter optøning nyttiggørelse effektivitet.
  2. I en biosikkerhed kabinet, Aspirér næringssubstratet, vaske cellerne i PBS (2 mL pr. brønd), Aspirér PBS og adskille hPSC kolonier i enkelte celler ved hjælp af celle detachement løsning (1 mL pr. brønd). Læg pladen i 5 min ved 37 ° C i en CO2 inkubator (5% CO2, fugtigt atmosfære). Fortynd celle detachement løsning med LIF-3i medium (2-fold), indsamle hPSC i en steril 15 mL konisk, centrifugeres celler på 200 x g i 5 min og resuspenderes celle i LIF-3i medium (1-2 mL pr. brønd-ækvivalent). Tæl antallet af celler ved hjælp af en hemocytometer eller en automatisk celle counter.
  3. Der centrifugeres N-hPSC i LIF-3i medium (x 200 g for 5 min) og resuspend celler i en biosikkerhed kabinet i den frysende løsning (tabel 2), med en tæthed på mindst 1 x 106 celler/mL.
  4. Overfør celler til de langsigtede oplagring kryogene rør og placere i en langsom-frysning container. Tillad prøver at fryse natten over i et-80 ° C fryser.
  5. Den næste dag, overføre cryovials ind i en flydende kvælstof fryser til langtidsopbevaring.
  6. Til optøning, læg den frosne hætteglas i et 37 ° C vandbad til ~ 2 min. Sterilize hætteglas (dvs. ethanol spray), overføre hPSC i en steril 15 mL konisk og langsomt fortyndes celler 10-fold i menneskelige stamceller medium (tabel 1) suppleret med 5 μM af Rho-forbundet protein kinase (ROCK) hæmmer Y-27632 i en steril biologiske sikkerhed hood kabinet.
  7. Der centrifugeres ved 200 x g i 5 min. I en biosikkerhed kabinet, kassere celle-fri supernatanten og resuspenderes celle i LIF-3i medium (1-2 mL) suppleret med 5 μM ROCK hæmmer Y-27632.
    Bemærk: Udelukkelse af Y-27632 vil resultere i dårlig efter optøningen nyttiggørelse effektivitet (figur 2).
  8. Overføre de optøede celler genopslemmes i LIF-3i/ROCK Inhibitor på PBS-vasket MEF-belagte brønde. Cryopreserve LIF-3i kulturer med en tæthed på 1 x 106 celler pr. hætteglas. Tø hver af disse hætteglas på foderautomater i et godt af en gelatinized 6-godt plade.
  9. Den næste dag, start regelmæssig LIF-3i medium ekspansion uden Rho kinase inhibitor.

5. feeder fjernelse for indsamling af N-hPSC prøver

  1. At forberede prøver fra LIF-3i/MEF (eller menneskelige stamceller/MEF konventionelle) kulturer (dvs.for genekspression (f.eks. kvantitativ RT-PCR, microarrays) eller protein (f.eks., vestlige skamplet) analyser, nedbryder LIF-3i kulturer fra MEF foderautomater ved hjælp af Magnetisk aktiveret celle sortering (MLA) med anti-TRA-1-81 antistof coated microbeads efter producentens protokol.
  2. Alternativt kan du udnytte følgende simple før plating metode for at nedbryder kulturer af foderautomater, som beskrevet nedenfor.
  3. I en steril biologiske sikkerhed hood kabinet, supernatanten celle-fri, vaske pellet med 2 mL steril PBS pr. brønd. Frigøre vedhængende LIF-3i/MEF kulturer ved hjælp af celle detachement løsning (1 mL/hul). Inkuber i 5 min i en CO2 inkubator (5% CO2, fugtigt atmosfære). Saml hPSC i en steril 15 mL konisk. Vask 2-fold i menneskelige stamceller medium, overførsel celler ind i sterile 15 mL konisk og centrifugeres ved 200 x g i 5 min.
  4. I en biosikkerhed kabinet, genopslæmmes hver brønd af LIF-3i/MEF dissocieres celler til 2 mL af LIF-3i medium, og direkte overføre til et nyt godt af en 6-godt plade, der er blevet frisk belagt med 0,1% gelatine.
  5. Inkuber LIF-3i/MEF hPSC celler i 1 timer ved 37 ° C i en CO2 inkubator (5% CO2, fugtigt atmosfære). Indsamle ikke-tilhænger celler med en pipette i en ny koniske rør. Forsigtigt tilføje 2 mL af menneskelige stamceller medium til hver brønd og slyng for at indsamle de resterende ikke-tilhænger celler.
    Bemærk: Fleste af de bestrålede MEF vil lægge til den gelatinized plade i 1 h, forlader fleste af hPSC i suspension.
  6. Kombinere og centrifugeres celler på 300 x g i 5 min. Skyl i PBS. Snap-freeze celle pellet i flydende kvælstof efter centrifugering, eller alternativt genopslæmmes pellets i en lysing buffer, der er kompatible med downstream protein eller nukleinsyre analyse (figur 2B).
  7. Udføre beskrivelser af LIF-3i hPSC linjer med en tilsvarende konventionelle PRIMES isogene hPSC kontrol.
    Bemærk: På grund af iboende variabilitet mellem og inden for PRIMES kulturer, relevante Kontroller tilberedes på en matchende tidspunkt i kultur eller før naive reversion. Detaljerede protokoller og materialer til downstream immunfluorescent bioimaging, flow flowcytometri, Western blotting, Gen-ekspression (RT-PCR assays og microarrays), methylering undersøgelser (dot skamplet, CpG methylering microarray), OCT4 proksimale og distale forstærker overvægt reporter assays og signalering hæmmer assays er fastsat andetsteds3.

6. post naive reversion: validering af genomisk integritet og fastholdelse af forældrenes sikkerhedsmærker af LIF-3i-vendt N-hPSC før brug i funktionelle Assays

  1. Skærmen start primet, konventionelle hPSC kulturer for besiddelse af en normal karyotype (f.eks.med Giemsa-bånd farvning analyse ved hjælp af offentliggjorte metoder 7) før indlede LIF-5i/LIF-3i reversion.
    Bemærk: Dette er hen til eliminere konventionel hPSC populationer, der kan havnen unormal genomisk ændringer, som kan drive artefactual selektive overlevelsesfordel i klonede LIF-3i betingelser.
  2. For optimale resultater, frisk hjemfalde konventionelle hPSC kulturer til en naiv-lignende tilstand med LIF-3i flere uger forud for deres anvendelse i funktionelle undersøgelser eller instrueret differentiering.
    Bemærk: Rutine langvarig 'vedligeholdelse' kultur i LIF-3i betingelser for mere end 10 passager følgende naive reversion ikke anbefales. Rutinemæssig udbygning og vedligeholdelse af menneskelige stamceller og hiPSC linjer bør udføres ved hjælp af konventionelle kultur systemer (f.eks. i E8 eller MEF/menneskelige stamceller medium med bFGF).
  3. Vurdere post hjemfalde N-hPSC linjer for opbevaring af normale karyotypes 5-7 passager efter LIF-3i reversion (fx., med Giemsa-bånd farvning analyse7, eller enhver anden metode valg).
  4. Vurdere alle hjemfalde N-hPSC linjer for opbevaring af normale forældrenes genomisk aftryk af et DNA methylering analyse af valg (fxprotokoller for CpG DNA microarray analyse af forældrenes aftryk i LIF-3i-vendt N-hPSC er nævnt andre steder3 ) efter 5-10 passager af LIF-3i reversion.

7. post naive Reversion: Eksperimenterende Design retningslinjer for kvantitative styret differentiering Assays ved hjælp af LIF-3i-vendt Nielsen-hPSC

  1. Direkte anvende LIF-3i N-hPSC i etablerede styret differentiering protokoller uden yderligere celle kultur manipulationer.
    Bemærk: Igen grunding (dvs. konvertering af N-hPSC tilbage til konventionelle PRIMES betingelser forud for deres anvendelse i styret differentiering assays) er ikke nødvendigt med metoden LIF-3i og anbefales ikke.
  2. At kontrollere for virkningerne af analysen og interline variabilitet i funktionskontrol af individuelle hPSC linjer, cross-validere afstamning-specifikke differentiering potenseringsniveau ved at ansætte uafhængige differentiering protokoller med mindst tre hPSC linjer stammer fra uafhængige genetiske baggrunde (dvs. flere donor-stammer hiPSC og menneskelige stamceller).
  3. Til funktionelt sammenligninger, oprette søskende kulturer, som tilsvarende passage nummer og fra linjen samme (isogene) hPSC parallelt med den konventionelle afstamning-pulverlak og LIF-3i-vendt hPSC kulturer. Vedligeholde primet/naive søskende isogene hPSC kulturer i deres respektive medier (fx., E8 vs. LIF-3i), og samtidig differentiere bruger identiske differentiering protokoller og materialer, for at fjerne enhver eksperimentelle bias (figur 4).
  4. For isogene primet vs naiv hPSC sammenligninger, justere og optimere indledende plating tætheder for hver enkelte differentiering assay.
    Bemærk: Detaljerede protokoller for neurale stamfader, endelige endoderm og hemato-endotel styret differentiering af LIF-3i-vendt N-hPSC er fastsat andetsteds 3. LIF-3i-vendt N-hPSC har mere robust proliferativ og differentiering kapacitet i styret differentiering assays end konventionelle hPSC. N-hPSC typisk kræver indledende plating lavere koncentration end den konventionelle hPSC, og i modsætning til deres konventionelle PRIMES hPSC kolleger, kræver ikke brug af anti-apoptotiske reagenser til at forbedre deres klonede overlevelse efter enzymatisk fordøjelsen i differentiering assays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol optimerer effektiv naiv-lignende reversion med LIF-3i i begge feeder-afhængige og feeder-uafhængig afstamning-primet konventionelle hPSC kulturer (figur 1). Den detaljerede protokollen, beskrevet heri konturer fortløbende tilpasning til LIF-3i starter fra enten feeder-afhængige eller feeder-fri konventionelle hPSC betingelser (fx E8 medium).

Repræsentative resultater af LIF-3i reversion af flere konventionelle menneskelige stamceller og transgen-fri hiPSC linjer er præsenteret i figur 1-3. Disse typiske resultater kan bekræftes med kommercielt tilgængelige menneskelige stamceller linje H9, eller med en kommercielt tilgængelig transgen-fri, ledning blod-afledt episomal hiPSC linje (6.2) stammer i Zambidis laboratorium8,9. Indførelsen af et indledende skridt i LIF-5i tilpasning tillader højeffektive efterfølgende, bulk klonede spredning af konventionelle hPSC kulturer i LIF-3i, og kræver ikke anti-apoptotiske agenter eller ROCK hæmmere10 (figur 1A, B ). Flere plader af naive-lignende hPSC prøver kan afhentes hurtigt for downstream analyser eller multilineage instrueret differentiering først efter 5-7 passager i LIF-3i. Alternativt, LIF-3i kulturer kan være cryopreserved for fremtidige ansøgninger. Efter optøning celle opsving kan være forbedret (figur 2) via optagelse af en ROCK hæmmer i kryopræservering og efter optøning medier11.

Determinanter for molekylær og funktionelle pluripotency, både in vitro- og i embryo blev for nylig gennemgået2. Disse faktorer omfatter den genetiske baggrund, kultur-associerede erhvervelse af mutationer til vigtige udviklingsmæssige gener, og forskelle i menneskelige stamceller og hiPSC afledning og kultur metoder. Fastsat nedenfor er en oversigt over standard assays, som kan anvendes til karakterisering og validering af de fænotypiske, molekylære og funktionelle pluripotencies af LIF-3i-vendt hPSC.

Koloni morfologi
Overgangen mellem primet, konventionelle og LIF-3i-vendt kultur systemer er ledsaget af forskellige fysiske ændringer i hPSC koloni morfologi (figur 1B). Konventionelle hPSC celler formere så flad, bred éncellelag kolonier, at ekspandere hurtigt fra småcellet klumper (på MEF eller feeder-fri betingelser), men dårligt som enkelt celler. Eksponering af konventionelle hPSC linjer til LIF-3i fremmer vækst og ekspansion og af mindre, tæt-pakket, kuppelformede kolonier, der opstår alsidighed fra enkelt celler. Disse morfologiske ændringer er fuldstændig reversibel, og LIF-3i-vendt kuppelformede kolonier kan spontant overgang tilbage til en konventionel éncellelag morfologi, hvis LIF-3i er trukket tilbage og celler er igen kulturperler i standard konventionelle menneskelige stamceller medium suppleret med bFGF. Desuden udvidelse af LIF-3i-vendt celler på høj sammenflydende tætheder (eller langvarig kultur uden hyppig passaging) resultater i den spontane genanskaffelse af den flade, konventionelle morfologi med reduceret klonede effektivitet; understreger behovet for omhyggelig vedligeholdelse og pleje af LIF-3i-vendt hPSC (fx., < 40 – 60% sammenløbet).

Live immunofluorescens farvning og flow cytometric analyse af overflade pluripotency markører
Evaluering af pluripotency markører under overgangen fra konventionelle til en naiv-lignende tilstand følgende løbende LIF-3i kultur kan være overvåges ikke-invasivt ved hjælp af live antistof farvning uden at afsløre nogen negative virkninger på LIF-3i/MEF ekspansion ( fx., live-farvning fluorokrom-konjugerede antistoffer mod TRA-1-81, TRA-1-60 og SSEA4).

Fastholdelse af pluripotency under LIF-3i reversion kan også overvåges rutinemæssigt flow cytometric analyse af pluripotency-associerede overflade markør udtryk for TRA-1 og SSEA antigener under single cell passaging (figur 1C) eller immunfluorescens af intakt, fast kolonier i situ (figur 3). Selv om disse markører ikke diskriminerer mellem konventionelle og LIF-3i stater, deres niveauer omvendt korrelerer med hyppigheden af spontane differentiering, der måtte opstå i hPSC ved overgang fra konventionel hPSC til LIF-3i betingelser. Yderligere overflade antigener, der kan mere specifikt mark menneskelige naiv-lignende stater in vitro-2,12,13 kan også anvendes til at påvise effektive LIF-3i hPSC tilbagevenden.

Validering af molekylære pluripotency af N-hPSC
Fordi den genetiske baggrund for hPSC linjer har været karakteriseret som en stærk bidragsyder til interline variabilitet, er det vigtigt at nøje vurdere isogene kulturer på matchende kultur timepoints, når man sammenligner hPSC kultur systemer (figur 4). Da nogle af disse systemer har allerede vist sig at generere hPSC befolkninger med afvigende genomisk og epigenetiske konfigurationer2, bør enhver naiv reversion metode analyseres med en række af N-hPSC af uafhængige genetiske baggrunde, på en måde der er tilstrækkelig til at validere biologiske reproducerbarhed og udelukke ikke-udviklingshæmmede relevante "pseudo-pluripotente" stater (dvs, med tydeligt præg af molekylære pluripotency men mangler funktionelle differentiering evner). Zimmerlin mfl. yderligere udvidet validering af LIF-3i kultur systemet til at inkluderer aflæst den molekylære og funktionelle pluripotencies af hjemfalde N-hiPSC stammer fra forskellige omprogrammering metoder, som er en anden kendt formodede bidragyder af funktionelle variabilitet mellem pluripotente hedder2.

Derfor, de fleste undersøgelser af menneskelige naive kultur systemer har fokuseret på boltpistoler molekylære pluripotency af N-hPSC på 1) den epigenetiske niveau (fx Histon mærker af ChIP sekvensering eller ChIP-PCR, globale DNA methylering af immunoblots eller hele genomisk bisulfite sekventering, allel-specifik CpG methylering microarrays, OCT4 forstærker fremherskende brug af reporter systemer, global aktivitet på regulerende elementer af DNAse jeg overfølsomhed, og Gentag element profilering af RNA-sekventering), 2) transkriptom niveau (RNA-sekventering, udtryk microarrays og kvantitativ RT-PCR), protein udtryk analyse (fx., FACS, immunfluorescent mikroskopi og Western blotting) og 3) via metaboliske undersøgelser (fx glykolyse, oxidativ fosforylering og nicotinamid stofskifte). Repræsentative eksempler på immunofluorescens pletter og vestlige skamplet påvisning af udtryk for centrale markører for Molekylær pluripotency er vist (figur 3B, C). For eksempel, er vist i figur 3B aktiveret fosforyleres (phospho) og total isoformer STAT3 og ERK1/2, som er centrale molekylære kendetegnende for musen ESC-lignende naive pluripotency. Disse blev fundet ved hjælp af anti-STAT3 og anti-ERK1/2 primære antistoffer. Derudover er funktionelle pluripotency i teratom differentiering assays demonstreret i konventionelle vs. LIF-3i-vendt hPSC teratom væv dissekeret 10 uger efter injektion og fast i 4% formaldehyd og paraffin indlejrede (figur 3D).

Forberedelse af LIF-3i/MEF eller MEF-menneskelige stamceller-bFGF prøver for downstream Molekylær analyse bør omfatte MEF udtynding. To tilgange er beskrevet ovenfor for MEF udtynding, der har været med succes ansat i vores laboratorium. MEF før plating er en enkel, pålidelig og omkostningseffektiv metode til at fjerne foderautomater fra N-hPSC prøver for molekylære undersøgelser og er en foretrukne alternativ til FACS eller MACS adskillelse (dvs. anti-TRA-1-81 eller anti-TRA-1-60 antistof-baseret adskillelse ). Derudover kan spontant differentiere TRA-1-negative vedhængende celler i LIF-5i/LIF-3i kulturer hurtigt fjernes fra LIF-5i/LIF-3i N-hPSC kulturer før efterfølgende LIF-3i passage på frisk MEF ved pre plating enzymatisk fordøjet enkelt celler i 1 time på plader overfladebelagt med 0,1% gelatine (figur 2).

Evaluering af funktionelle pluripotency af N-hPSC
Den mest stringent analyse af funktionelle pluripotency af PSC er blastocyst injektion chimera assay, som er begrænset til afprøvning af N-hPSC linjer af etiske grunde. Alternativt, adskillige grupper, der har rapporteret generation af N-hPSC med forskellige andre metoder har forsøgt at generere interspecies kimærer. Men disse forsøg har givet yderst lav eller mislykket bidrag af differentierede N-hPSC lineages murine eller svin embryoner, i forhold til standard mus ESC2chimera-genererende kapacitet.

Yderligere funktionelle studier har undersøgt styret i vitro differentiering af formodede N-hPSC afledt via forskellige metoder, men har afsløret forudindtaget, defekte eller formindsket multilineage differentiering kapacitet, med samtidig husly epigenetiske abnormaliteter2,13. Lignende epigenomiske afvigelser, især på påtrykt loci, der er konstateret i mus ESC efter langvarig udsættelse for LIF-2i cocktail14. Interessant nok, nogle reversion kultur systemer har rapporteret globale forbedringer i specifikke attributter af funktionelle pluripotency af PSC såsom øget kapacitet til i vivo trophectoderm bidrag2,15 .

Ved hjælp af en bred samling af selvstændigt afledt LIF-3i-vendt hPSC, ansat Zimmerlin et al. multilineage differentiering assays til at vise, at LIF-3i system dramatisk forbedrer den funktionelle pluripotency af konventionelle hPSC linjer 3. Dette tillader systematisk analyse af konventionelle vs LIF-3i hPSC linjer isogene parvis at fjerne interline-afhængige variationer (figur 4). LIF-3i-vendt hPSC linjer kræver ikke en ny grunding skridt før EB differentiering. Dog LIF-3i hPSC formere til betydeligt højere klonede priser end isogene celler udvidet i E8, og dermed, indledende lavere plating tætheder kræver justering for at tillade hver kultur at nå sammenløbet på en lignende tidspunkt.

Efterforskere bør rutinemæssigt udnytte flere assays for at demonstrere den forbedrede funktionalitet af LIF-3i-vendt hPSC, der omfatter ikke blot i vivo teratom assays, men også in vitro- instrueret differentiering assays til neurale, endelige endoderm og hematovascular lineages3 bruger flere assays (fx, 2D APEL3,16 og 3D embryoid krop17,18 systemer). For at kontrollere for assay-afhængige reproducerbarhed, bør mindst to forskellige differentiering metoder udføres i replikat for hvert isogene par primet/LIF-3i hPSC kulturer (fx, figur 4, APEL, embryoid krop differentiering protokoller). Den eksperimentelle design bør omfatte en robust nummer (f.eks., > 3-5) primet/LIF-3i isogene par hPSC linjer fra flere, uafhængige donor genetiske baggrunde (figur 4).

Figure 1
Figur 1: En trinvis overgang af konventionelle, slægt-pulverlak hPSC kulturer til naive-lignende forhold med metoden LIF-3i. (A) skema af protokoller for trinvis LIF-3i reversion. (Top skematisk) En generel metode for overgang af primet, konventionelle hPSC til LIF-3i kulturer. (Bunden skemaer) To opsummerede strategier for LIF-3i naive reversion af konventionelle (primes) hPSC kulturperler på feeder (dvs. Primed/MEF til LIF-3i/MEF), eller feeder-fri betingelser (dvs, Primed/E8 til LIF-3i/MEF). (B) menneskelige PSC morfologier. Vist er repræsentative mikrofotografier af hPSC under LIF-3i reversion ved hjælp af en kommercielt tilgængelige menneskelige episomal iPSC linje (6.2). Vist er overgangene observeret mellem indledende konventionelle flat éncellelag kolonier, og de efterfølgende kuppelformet clonogenic kolonier, der opstår efter passage i mellemliggende LIF-5i og stabil LIF-3i kultur betingelser. Skalere barer = 200 µm. (C) repræsentative flow cytometric analyser af pluripotency overflade markører. Vist er TRA-1-81 og SSEA-4 overflade udtryk i konventionelle hPSC linje 6.2 (p40) udvidet i E8, den første passage i LIF-5i/MEF og følgende 1 til 9 passager (P1-P9) i LIF-3i betingelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Kryopræservering af N-hPSC og forberedelse af prøver af MEF før plating. (A) eksempel på en fryse/tø cyklus af LIF-3i/MEF kulturer. Konventionelle ledningen blod-afledte, ikke-integrerede, transgen-fri menneskelige iPSC linje E5C3 blev afledt og udvidet på MEF foderautomater i menneskelige stamceller medium suppleret med 4ng/mL bFGF til 18 passager. Konventionelle, slægt-pulverlak E5C3 blev tilpasset i LIF-5i (venstre) og skiftet ind LIF-3i medium for 3 passager (center). E5C3 LIF-3i cellerne vises i panelet center blev befrugtede bruge DMSO-baserede kryoprotektant medium (tabel 2, 1 x 106 celler pr. hætteglas) og gemt i flydende kvælstof). Ét hætteglas blev optøet en måned senere og E5C3 celler blev overført i en feeder-belagt godt af en 6-godt plade (til højre). Celle opsving kan forbedres ved at supplere LIF-3i mediet med 5 µM Y-27632 for kun én dag efter optøning. Skalere barer = 200 µm. (B) afskaffelse af MEF (og også vedhængende TRA-negative differentierede celler) i LIF-3i/MEF hPSC kulturer af metoden før plating. Vist er flow cytometric analyser, før og efter før plating af PE-konjugerede anti-TRA-1-81 og TRA-1-60 antistoffer, APC-konjugeret SSEA-4 antistoffer og SSEA-1/CD15 antistoffer demonstrerer udtømning af TRA-1 antigen negative og MEF celler ved hjælp af den en time før plating metode. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Karakterisering af pluripotency i LIF-3i/MEF N-hPSC kulturer. (A) overflade og nukleare pluripotency markører. Udtryk pluripotency faktor NANOG i den samme (isogene) TRA-1-81+SSEA4+ konventionelle, primet ledningen blod-afledte hiPSC linje E5C3 (p39) udvidet primes (E8) eller naive LIF-3i (+ p8 i LIF-3i/MEF) betingelser. Immunfluorescent pletter af repræsentative hPSC kulturer på kammer dias afslørede den ensartet, nukleare udtryk for core pluripotency faktor NANOG i SSEA-4+TRA-1-81+ hPSC kulturperler i primet, konventionel (E8 medium) eller LIF-3i/MEF betingelser. Skalalinjen = 100 µm. (B) Western blot analyse. STAT3 (venstre), ERK (center) og kontrol beta-ACTIN protein udtryk for et repræsentativt hPSC linje (menneskelige stamceller linje H9) i konventionelle (E8 medium) eller LIF-3i/MEF betingelser (3i). (C) udtryk for naiv pluripotency-associerede transkriptionsfaktorer. Vist er STELLA/DPPA3, NR5A2 og TFCP2L1 ved immunfluorescens i en repræsentativ LIF-3i/MEF kultur (ledning blod-afledte hiPSC linje E5C3 på p33 (menneskelige stamceller/MEF) + p8 (LIF-3i/MEF). Skalalinjen = 100 µm. (D) teratom assays af konventionelle og LIF-3i-vendt hPSC. Validering af funktionelle pluripotency på isogene repræsentative hiPSC linie (ledning blod-afledte E32C6) kulturperler i enten E8 (p9) eller LIF-3i/MEF (+ p12) af teratom assay. 10 x 106 celler af isogene parallel-kulturperler konventionelle, PRIMES vs LIF-3i-vendt hPSC blev injiceret subkutant ind i lemmer af immundefekte NSG mus. Hæmatoxylin og eosin pletter af teratom microsections afsløret robust differentiering i alle tre Kim lag med velstruktureret ectoderm (neurale roset: NN, retinal pigmenteret epitheliam: ÅV), mesoderm (chondroblasts: Ch), og endoderm (glandulær væv: GI) lineages. Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Sammenligning af funktionelle pluripotency mellem isogene primet og naive stater. (A) skematisk af strategi for vurdering af funktionelle pluripotency fra forskellige pluripotente stater i isogene konventionelle vs LIF-3i kulturperler hPSC i uafhængige differentiering protokoller. Vist er to hemato-kar stamfader differentiering systemer (APEL éncellelag og 3D embryoid organ (EB) systemer), der var tidligere beskæftiget at vurdere differentiering potens af konventionelle vs LIF-3i-vendt i den samme (isogene) hPSC linje kulturperler i parallel stilling LIF-3i reversion med samme passage numre. LIF-3i-vendt hPSC linjer kræver ikke en ny grunding skridt før EB differentiering og udsættes for differentiering protokol direkte. (B) EB vaskulære stamfader (VP) differentiering system. EB 3D differentiering systemet ansat til denne undersøgelse var tidligere beskrevet17,18. Vist er de repræsentative resultater på dag 10 i EB differentiering (venstre paneler) for isogene kulturer af den samme navlestrengsblod (CB)-afledt E5C3 hPSC linje9, kulturperler i enten konventionel menneskelige stamceller/MEF (Primed / MEF) betingelser eller LIF-3i/MEF naive betingelser. Flow flowcytometri analyse af disse EB celler vis dramatisk øger af CD31+CD146+ VP populationer efter LIF-3i reversion af E5C3 linjen inden differentiering. Histogrammet viser den gennemsnitlige ±SD af CD31+CD146+ VP celle procenter inddrives ved dag 10 i EB systemet ved hjælp af tre isogene par af uafhængige hPSC linjer (dvs. to CB-hiPSC og en voksen fibroblast-afledte hiPSC, punkterede linjer forbinde isogene par). Resultaterne viser betydelig forbedring af VP differentiering effektivitetsgevinster i EB system på tværs af genetiske baggrund med flere hPSC linjer. (C) APEL éncellelag vaskulære stamfader differentiering system. Konventionel (primes E8) og LIF-3i-vendt hPSC kan være direkte differentieret ved hjælp af den samme dyrkningsbetingelser, vækstfaktorer, cytokiner og små molekyler af trinvis APEL endotel differentiering protokol 3, 16. vist er uafhængige APEL differentiering eksperimenter ved hjælp af E5C3 ledningen blod-afledte hiPSC linje, og procentdelen af CD31+CD146+ vaskulære stamfader befolkninger på dag 7 af APEL differentiering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LIF-3i system gælder en modificeret version af den klassiske murine 2i naive reversion cocktail1 humane pluripotente stamceller. Self-fornyelse af hPSC (som ikke kan ekspandere i 2i alene) er stabiliseret i LIF-2i ved at supplere denne cocktail med tankyrase hæmmer XAV939. LIF-3i kultur tillader bulk og effektiv reversion af den konventionelle hPSC til en pluripotente tilstand ligner den menneskelige præimplantations epiblast3. Selvom virkningsmekanisme af XAV939 i hPSC er sandsynligvis kompleks og synergistisk med 2i, de sandsynligvis omfatte på et minimum, en vigtig stabilisering og forstærkning af hPSC selvfornyelse via WNT signalering veje3.

Konventionelle hPSC kulturer vedtage normalt et spektrum af pluripotente stater med meget varierende afstamning-pulverlak gen udtryk og efter implantation epiblast epigenetiske mærker, der kan medføre inkonsekvente eller formindsket funktionelle pluripotency2 . Denne iboende lineage priming af konventionelle hPSC kulturer kan også interferere med den succesfulde LIF-3i tilbagevenden af nogle hPSC linjer2. Men optagelse af den indledende LIF-5i tilpasning trin (tabel 1) i metoden LIF-3i universelt udvider effektiviteten af LIF-3i reversion blandt et væld af hPSC linjer og fremmer bulk naive reversion af konventionelle hPSC linjer på en måde der omgår kedelig picking og subcloning af sjældne naive gendannes kolonier, eller behovet for anvendelse af rutinemæssig anti-apoptotiske molekyler til at stabilisere deres levedygtighed.

LIF-5i/LIF-3i naive reversion metode er reproducerbare på en bred vifte af menneskelige stamceller og hiPSC linjer. Det kræver minimal uddannelse med grundlæggende celle kultur dygtighed. Zimmerlin et al. med held ansat denne sekventielle strategi hen til hjemfalde til > 30 uafhængige menneskelige stamceller og transgen-fri hiPSC linjer fra en bred vifte af donorer 3. En enkelt passage i LIF-5i (figur 1) er tilstrækkelig for de fleste hPSC, der skal underkastes effektive naive reversion i bulk hPSC kulturer, og yderligere fremme deres efterfølgende stabil vedligeholdelse og udvidelse i LIF-3i alene.

Derudover LIF-3i/MEF systemet understøtter robust bulk klonal ekspansion effektivitetsgevinster overalt i alle trin mellem afstamning-primet konventionelle hPSC kultur hele vejen til færdige naiv-lignende hPSC tilbagevenden (dvs., tilpasning, overgang og ekspansion for 7-10 passager i LIF-3i/MEF alene). Selv om den nuværende formulering af denne kultur system kræver understøttelse af feeder, præsenteres en enkel og billig metode til at nedbryder foderautomater af før plating teknik til analyse af LIF-3i kulturer (figur 2).

Flere andre kultur systemer er også blevet rapporteret til at fremme konventionelle hPSC til lignende naiv-lignende pluripotente hedder2. Selv om disse hPSC kultur systemer har også påberåbt sig udnyttelse af klassisk mus naive 2i betingelser, disse enkelt-celle passaging metoder i de fleste tilfælde også kræves supplerende kemiske graduering for stabiliserende en iboende ustabilt / metastabile menneskelige naive stat. Vigtigere er, de fleste af disse andre metoder påvist nedsat funktionel pluripotency efter differentiering og/eller erhvervede unormal epigenomiske sikkerhedsmærker eller karyotypes2. Selv om fremkomsten af unormal karyotypes inden for konventionel PRIMES hPSC kulturer er allerede godt dokumenteret19, forlænget, enzymatisk encellede passaging metoder, der er rutinemæssigt ansat i de fleste naive reversion metoder. Det har også vist sig at forstærke generation af unormal kromosomale konfigurationer20,21; mere følsomme teknikker (f.eks. kopi nummer variationer, enkelt nukleotid polymorfisme) kan afsløre yderligere ændringer22,23.

Derimod et bredt repertoire af LIF-3i-vendt hPSC linjer blev bekræftet for at besidde normale karyotypes på lav-medium passager (fx p5-p15), og også på høje passage numre (fx., > p30) efter LIF-3i kultur3. Derudover blev epigenomiske aftryk i LIF-3i-vendt hPSC fundet reproducerbar normale og intakt på 5 – 10 passager post LIF-3i reversion2. Ved hjælp af følsomme allel-specifik kommercielle methylering array platformen, blev det tidligere påvist at CpG methylering mærker på påtrykt loci af et bredt repertoire af LIF-3i-vendt hPSC linjer (følgende 4 – 7 passager i LIF-3i) fandtes for at være groft normal i struktur1. Da unormal genomisk aftryk og karyotypes kan i sidste ende forringe den funktionelle kapacitet af hPSC, blev nødvendige retningslinjer skitseret i denne protokol, der tilskynder forskerne til at validere hPSC kulturer, før og efter naive reversion, ved hjælp af dette metode samt andre.

LIF-3i metode forbedret funktionelle pluripotency på tværs af Kim lag i et stort repertoire af menneskelige stamceller og ikke-transgene hiPSC linjer (figur 3). I modsætning til andre naive reversion protokoller, LIF-3i metode gør ikke kræver en re grunding trin for efterfølgende differentiering af N-hPSC (dvs. konvertering af N-hPSC tilbage til konventionelle PRIMES betingelser forud for deres anvendelse i instrueret differentiering assays). LIF-3i-vendt N-hPSC vise betydeligt mere effektiv differentiering kapacitet end deres isogene konventionelle hPSC kolleger i begge teratom assays (figur 3D), og instrueret differentiering protokoller af lineages af alle tre Kim lag2. På grund af assay-afhængige og interline variationer i funktionskontrol af konventionelle hPSC, slægt-specifikke differentiering bør evalueres ved hjælp af uafhængige styret differentiering protokoller og hPSC stammer fra flere genetiske baggrunde. Ved hjælp af omhyggelige eksperimentelle design, kan en bred vifte af hPSC linjer forventes at forbedre deres multilineage differentiering effektivitet i forhold til deres isogene konventionelle kolleger efter 4-10 passager i LIF-3i betingelser.

I Resumé, denne metode hurtigt og alsidighed udvider antallet af menneskelige PSC, forbedrer deres downstream differentiering effektivitet, øger afstamning-begået stamfader celle numre efter differentiering, og falder interline variabilitet blandt konventionelle, slægt-pulverlak hPSC linjer. Disse N-hPSC med forbedret funktionalitet kan yderligere har en bred virkning for deres potentiale til at bidrage funktionel væv til et embryo under udvikling. For eksempel, kan stabil N-menneskelige stamceller være ansat for at udvikle ender menneskelige organer og voksne stamceller i udviklingen af animalsk kimærer eller til at generere humaniseret gen-målrettet dyremodeller for sygdom. Yderligere optimering af denne tankyrase inhibitor-udnytte LIF-3i metode i defineret feeder-fri GMP-kompatibel kultur betingelser vil lette effektiv klinisk nyttige generation af en bred vifte af funktionelle og engraftable celletyper til terapeutisk brug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Under en licensaftale mellem liv teknologier og Johns Hopkins University (JHU), er Dr. Zambidis berettiget til en del af royalty modtaget ved universitetet for licensering af stamceller. Vilkårene i denne aftale er forvaltes af JHU i overensstemmelse med dens interessekonflikt politikker. Dette ændrer ikke ved forfatternes overholdelse af journal politikker på deling af oplysninger og materialer.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, The Maryland Stem Cell Research Fund (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award og The Moseley Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated BD Biosciences 561716 use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibody Sigma Aldrich HPA029708 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibody Abcam ab6276 use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated  BD Biosciences 550315 use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugated eBioscience 17-0319-42 use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kit Miltenyi Biotec 130-091-935
anti-NANOG antibody Abcam ab109250 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibody Sigma Aldrich HPA005455 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody Cell Signaling 4695 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody Cell Signaling 4370 use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody Cell Signaling 9145 use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated Agilent E0432 use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated  R&D System FAB1435A use 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated R&D System NLLC1435G use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibody Cell Signaling 9139 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibody Millipore MAB4388 use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated  R&D System NLLC4770R use at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0068 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0069 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560193 use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560161 use 10µL per assay (FACS)
APEL2-Li StemCell Technologies 5271
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3311
CellAdhere dilution buffer StemCell Technologies 7183 dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouse Charles river 023
CHIR99021 R&D System L5283 reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope system Zeiss LSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC line Thermo Fisher Scientific A18945 also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates Corning 3506
Countess  cell counting chamber slide Thermo Fisher Scientific C10228
Countess automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)  Thermo Fisher Scientific 11995-065
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific 11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D2650
DR4 mouse The Jackson Laboratory 3208
Essential 8 (E8) medium StemCell Technologies 5940
Fetal bovin serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30071.03
Forskolin Stemgent 04-0025 reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G1890-100G resuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
mTeSR1 medium StemCell Technologies 85850
Nalgene cryogenic vials Thermo Fisher Scientific 5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System Fisher Scientific 154534
Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS USB Corporation  19943
PD0325901 Sigma Aldrich PZ0162 reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
Purmorphamine Stemgent 04-0009 reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin A Peprotech AF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 Peprotech 120-05ET resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF) Peprotech 100-18B resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human LIF Peprotech 300-05 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
SB431542  Stemgent 04-0010-05 reconstitute at 100mM in DMSO
Stemolecule Y27632 in Solution Stemgent 04-0012-02 ROCK inhibitor in solution (10mM)
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific A11105-01
Streptavidin-Cy3 conjugate Sigma Aldrich S6402 use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 Peprotech 100-21 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
Vitronectin XF matrix StemCell Technologies 7180 dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer
XAV939 Sigma Aldrich X3004 reconstitute at 100mM in DMSO
β-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023 light sensitive

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, (7194), 519-523 (2008).
  2. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26, (16), 1141-1161 (2017).
  3. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143, (23), 4368-4380 (2016).
  4. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
  5. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8, (5), 424-429 (2011).
  6. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, (2), 185-187 (2006).
  7. Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203 (2014).
  8. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, (4), 18293 (2011).
  9. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7, (8), 42838 (2012).
  10. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, (6), 681-686 (2007).
  11. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24, (3), 580-589 (2009).
  12. Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20, (6), 874-890 (2017).
  13. Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14, (11), 1055-1062 (2017).
  14. Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548, (7666), 219-223 (2017).
  15. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169, (2), 243-257 (2017).
  16. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9, (6), 1514-1531 (2014).
  17. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83, (1), 114-126 (2013).
  18. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129, (3), 359-372 (2014).
  19. Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29, (4), 313-314 (2011).
  20. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23, (1), 19-20 (2005).
  21. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, (11), 2029-2040 (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8, (1), 106-118 (2011).
  23. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471, (7336), 58-62 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics