Reversión química de células madre pluripotentes humanas convencionales a un estado ingenuo con potencia mejorada del Multilineage diferenciación

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Developmental Biology

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Summary

Presentamos un protocolo de reversión química rápida, eficiente y a granel de las células madre pluripotentes humanas linaje preparado convencional (hPSC) en un estado de preimplantación epiblasto como pluripotentes ingenua de epigenomically estable. Este método resulta en expresión génica disminución linaje preparado y notable mejora en la diferenciación del multilineage dirigida a través de un amplio repertorio de líneas convencionales hPSC.

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Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Naïve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency. J. Vis. Exp. (136), e57921, doi:10.3791/57921 (2018).

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Abstract

Las ingenuo (N-hPSC) células madre pluripotentes humanas con la funcionalidad mejorada puede tener un gran impacto en medicina regenerativa. El objetivo de este protocolo es volver eficaz pluripotent humana convencional, preparado por el linaje de células (hPSC) mantenidas en condiciones libre de alimentador o feeder-dependiente a una pluripotencia ingenua-como con la funcionalidad mejorada. Este método de reversión química ingenuo emplea el factor inhibidor de leucemia clásica (LIF), GSK3β y MEK/ERK inhibición cóctel (LIF-2i), complementado con un inhibidor de tankirasa XAV939 (LIF-3i). LIF-3i vuelve hPSC convencional a un estado pluripotente estable adoptando transcripcional, bioquímicos y características epigenéticas del epiblasto antes de la implantación humana. Este método de LIF-3i requiere manipulación de la cultura de célula mínima y es altamente reproducible en un amplio repertorio de células madre embrionarias humanas (hESC) y líneas de células madre (hiPSC) libre de transgén de humanas pluripotentes inducidas. El método LIF-3i no requiere un paso re cebado antes de la diferenciación; N-hPSC pueden diferenciarse directamente con eficacias extremadamente altas y mantener karyotypic y epigenómica estabilidades (incluso de loci impresos). Para aumentar la universalidad del método, en el cóctel de LIF-3i complementado con dos pequeñas moléculas adicionales que potencian la proteína quinasa (Forskolina) y erizo sónico (sHH) (purmorphamine) señalización (LIF-5i) se cultivan primero hPSC convencional. Esta breve etapa de adaptación de LIF-5i significativamente mejora la inicial expansión clonal de hPSC convencional y permite que posteriormente volvieron a ingenuos con LIF-3i solo en grandes cantidades, así evitando la necesidad de picking/subcloning raro N-hPSC colonias más adelante. HPSCs LIF-5i-estabilizado se mantienen posteriormente en LIF-3i solos sin necesidad de moléculas anti-apoptóticas. Lo más importante, reversión de LIF-3i mejora notablemente la pluripotencia funcional de un amplio repertorio de hPSC convencional disminuyendo su expresión de gen de cebada de linaje y borrando la variabilidad interlineal de diferenciación dirigida comúnmente observado entre líneas hPSC independiente. Caracterizaciones representativas de LIF-3i-revertir N-hPSC son estrategias proporcionadas y experimentales para comparaciones funcionales de hPSC isogénicas en linaje cebada vs. ingenua-como Estados se contornean.

Introduction

El sistema de cultivo 2i (inhibidor de la MEK/ERK y GSK3β) fue desarrollado originalmente para refinar las culturas de las células madre embrionarias (mESC) heterogéneos basados en suero del ratón a un estado uniforme de pluripotencialidad similar al epiblasto preimplantacional de ratón1. Sin embargo, 2i no es compatible con el mantenimiento estable de humanas pluripotentes células madre (hPSC) líneas2. Los distintos compleja molécula pequeña, suplementada con factor de crecimiento y enfoques transgénicos se han divulgado recientemente para capturar supuestamente similar ingenua-como pluripotent humana molecular Estados2. Sin embargo, muchos de los Estados "ingenua-como" creados con estos métodos también exhibieron inestabilidad cariotípica, epigenómica defectos (por ejemplo, pérdida global de impresión genómica parental), o con problemas potenciales de diferenciación.

En contraste, el cóctel de triple inhibición química de la GSK3β, ERK y tankirasa señalización y factor inhibidor de leucemia (LIF-3i) era suficiente para la reversión estable de ingenua-como de un amplio repertorio de hPSC convencionales líneas3. LIF-3i-vuelto ingenuo hPSC (N-hPSC) mantiene los karyotypes normales y aumentado sus expresiones de genes específicos de ingenuo humano preimplantacional epiblasto (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i reversión también conferida hPSC con una serie de características moleculares y bioquímicas únicas a pluripotencia mESC-como ingenua que incluyó mayor señalización de STAT3 fosforilados, disminución de la fosforilación de ERK, global de 5-METILCITOSINA CpG La hipometilación, desmetilación de CpG de genoma en células madre embrionarias (ESC)-promotores de genes específicos y el uso de potenciador de OCT4 distal dominante. Además, en comparación con otros ingenuos métodos de reversión que aberrantemente hypomethylated imprimieron loci genómicos, revertido por LIF-3i N-hPSC fueron sin pérdida sistemática de patrones de CpG impresos ni pérdida de expresión de ADN metiltransferasa (por ejemplo, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.

Una cultura de LIF-3i directa de una amplia gama de células de vástago embrionarias humanas convencionales (hESC) y células de madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSC) crecidas en comederos o en condiciones libres de alimentador de E8 logra reversión rápida y a granel a un ingenuo epiblasto-como estado. Sin embargo, directo LIF-3i ingenuo reversión puede ser ineficaz en algunas líneas de hPSC convencional inestable debido a las inherentes variabilidades genómicas y linaje preparado derivados de los fondos de donantes genéticamente diversas.

Así, para ampliar la utilidad del método LIF-3i, una optimización paso a paso fue desarrollada y se presenta en este documento, que permite la reversión ingenuo universal con casi cualquier hESCs convencional o libre de transgén hiPSC línea cultivados en alimentadores. Este método de reversión del ingenuo universalizado emplea un paso de la cultura inicial transitoria en hPSC convencional que complementa el cóctel de LIF-3i con dos adicionales pequeñas moléculas (LIF-5i) que potencian la proteína quinasa (Forskolina) y (sonic hedgehog (sHH) señalización de purmorphamine). Un paso inicial de hPSC convencional en LIF-5i adapta a posterior reversión de LIF-3i estable en grandes cantidades. Adaptación de LIF-5i inicial aumenta significativamente la proliferación clonal de la célula inicial de hPSC convencional en E8 o alimentadores (antes de su paso posterior estable, continuo en LIF-3i solo). Líneas convencionales hPSC adaptadas primero a un pasaje de LIF-5i toleran posterior a granel clonal pases de ingenuo revertir células en condiciones de LIF-3i, que evita la necesidad de escoger y subcloning de las colonias estables raras, o el uso rutinario de moléculas anti-apoptóticas o los inhibidores de la proteína Rho quinasa (ROCK).

El método LIF-3i ha sido empleado con éxito para ampliar estable y mantener un amplio repertorio de > 30 hPSC convencional independiente, genéticamente diversas líneas para > 10 – 30 pasos utilizando cualquiera de los dos métodos de disociación enzimática o no enzimática, y sin evidencia de inducción de cromosómicas o anomalías epigenómica, incluyendo anormalidades en lugares geométricos del gene impreso. Además, cultura de LIF-5i/LIF-3i secuencial es el método de reversión sólo ingenuo que hasta el momento se ha reportado que mejora la pluripotencia funcional de un amplio repertorio de líneas convencionales hPSC disminuyendo su expresión del linaje cebada gen y dramáticamente mejorar su potencia de diferenciación multipotentes. La borra de ingenuo reversión método de LIF-3i la inherente variabilidad de la diferenciación de líneas hPSC convencional, preparado por el linaje de la interlínea y tendrá una gran utilidad de aplicación en medicina regenerativa y terapias celulares.

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Protocol

Animales todos los procedimientos se realizaron con las pautas de cuidado de los animales y protocolos de actuación aprobados por el Johns Hopkins la escuela de medicina Instituto de cuidado de los animales y el Comité uso (IACUC).

1. preparación de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) dependiente de la alimentación convencional (medio de hESC, MEF) o revertido ingenuo (medio de LIF-3i, MEF) hPSC cultura

  1. Comprar o preparar en suministros de paso bajo de alimentadores MEF de CF1 o CF1 x embriones de ratón E13.5 DR4 híbridos siguiendo protocolos publicados4.
    1. Criopreservar las culturas del paso bajo (p1-p2) MEF previas (para almacenamiento a largo plazo) o irradiación posterior (de hasta 6 meses) y almacenar en nitrógeno líquido como describieron anteriormente4.
    2. Irradiar (5.000 rad) a granel MEF ampliado debajo de p5 con una γ - o X-ray-irradiador y preparar alícuotas de 1.5 x 106 células por vial para almacenamiento a corto plazo (menos de 6 meses) a-80 ° C en un congelador de temperatura ultrabaja.
    3. Placa de 1.2 x 106 (recién irradiado criopreservado no) y 1.5 x 106 (irradiado criopreservado) MEF por una placa de 6 pozos gelatinizada para preparar cultivos de alimentación, como se describe a continuación.
  2. Preparar gelatina-6 pozo estériles Tratado de cultivo de tejidos las placas revestidas por agregar 1,5 mL de solución de gelatina 0.1% estéril a cada pozo en un gabinete de seguridad biológica.
  3. Incube las placas recubiertas de gelatina a 37 ° C durante al menos 1 hora o toda la noche en un incubador de CO2 de laboratorio.
  4. Al día siguiente, descongelar paso bajo (por ejemplo, P2 a P4) criopreservado de DMSO e irradiado (5.000 rad) MEF según los pasos indicados a continuación.
    Nota: MEF no irradiado debe también ser descongelado, ampliado e irradiado inmediatamente antes de uso.
  5. Colocar una alícuota MEF criopreservada en un baño de agua de 37 ° C. Al descongelar, esterilizar el tubo con etanol y diluir inmediatamente el crioprotector DMSO al menos 10 veces con medio MEF (tabla 1) dentro de un gabinete de bioseguridad (p. ej. transferencia 1 mL DMSO-MEF alícuota en medio MEF de 9 mL de 15 mL estéril cónico).
  6. Centrifugar las células MEF diluidas a 200 x g durante 5 min en tubos cónicos de 15 mL estéril.
  7. En un gabinete de bioseguridad, aspirar y eliminar el sobrenadante libre de células y resuspender el precipitado de células en medio fresco de MEF 1 – 2 mL.
  8. Suavemente, deseche la solución de gelatina y añadir 2 mL de MEF resuspendida en el medio MEF en cada pocillo de una placa de 6 pozos gelatinizada, como se indicó anteriormente. Las células MEF cuenta y placa 1.2 x 106 (recién irradiado criopreservado no) o 1.5 x 106 (irradiado criopreservado) MEF por una placa de 6 pozos gelatinizada.
    Nota: Todas la célula cultura las placas que se transfieren de la incubadora de CO2 para el gabinete de seguridad de la biotecnología pueden limpiarse suavemente con papel rociado de etanol pero no deben ser directamente rociadas en con solución de etanol 70% para evitar la difusión del etanol en los pozos.
  9. Incube las placas MEF a 37 ° C durante la noche en un incubador de CO2 de laboratorio (5% CO2, atmósfera húmeda) para permitir el accesorio antes de utilizarlo.

2. a granel estabilización de culturas hPSC convencional para la posterior reversión de ingenuo con un paso de adaptación breve LIF-5i

  1. Validar todas las líneas convencionales hPSC por poseer un karyotype normal por las g-bandas, antes de la reversión del principio LIF-5i/LIF-3i.
    Nota: Reversión LIF-3i de líneas hPSC convencional alto paso (e.g., P > 40-50) debe evitarse, ya que estas culturas ya pueden abrigar las aberraciones genómicas que pueden impactar negativamente reversión de LIF-3i estable, eficiente y a granel de cebada, líneas de hPSC convencionales.
  2. Mantener y ampliar las culturas hPSC convencional con el validados cariotipos normales en un sistema de cultivo basado en el MEF (como se describe en la sección 1), o un sistema de cultivo libre de alimentador (según preferencias del investigador).
    Nota: Ambos dependiente del alimentador hPSC/MEF cocultures (p. ej., células suplementado (tabla 1) con 4-10 ng/mL bFGF) o alimentador (e.g., E8 5 o mTSER 6 los medios de comunicación (según instrucciones del fabricante en métodos las placas revestidas de vitronectina) son compatibles con reversión de ingenuo a granel usando el sistema de LIF-5i/LIF-3i/MEF (figura 1). Métodos no enzimáticos son preferibles para los pases de hPSC convencional antes de prepararlos para la reversión. Formulaciones de medios de comunicación de LIF-5i y LIF-3i no contengan antibióticos o antifúngicos. Reglas de operación estándar para la esterilidad gabinete de bioseguridad y el mantenimiento deben respetarse rigurosamente para evitar cualquier contaminación bacteriana o micótica.
  3. Para el MEF-basado en sistema de cultivo, preparar alimentadores MEF en la placa de 6 pozos gelatinizada como se describe en la sección 1 por lo menos un día antes pases de culturas hPSC convencional adaptado por LIF-5i.
  4. Después de hPSC convencional culturas llegaron al confluencia de ~ 50% (es decir, 3 a 5 días después de la galjanoplastia inicial), sustituir el medio de cultivo de células estándar con LIF-5i medio (2 mL por pozo; Tabla 1).
    Nota: Realice estos pasos en un gabinete de bioseguridad.
  5. Cultura y mantener hPSC/MEF convencional hasta 2 días en LIF-5i en la incubadora de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda). Cambiar el medio de LIF-5i diariamente para adaptarlos para su posterior paso y reversión estable en LIF-3i.
  6. Por otra parte, para las culturas libres de alimentador convencionales (por ejemplo, en E8), cultura hPSC en LIF-5i noche antes pases a la mañana siguiente.
    Nota: Las culturas LIF-5i y LIF-3i tanto se pueden mantener con atmosférico (21% O2) o fisiológica (5% O2) oxígeno niveles en la incubadora de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda).
  7. Antes de pases, coloque las placas de cultivo en un gabinete de bioseguridad lavado LIF-5i-adaptado hPSC convencional una vez con PBS y añadir 1 mL de reactivo de la disociación de células a cada pozo. Incubar por 5 min a 37 ° C en un incubador de CO2 y triturate suavemente con una pipeta en una suspensión unicelular en el gabinete de seguridad de la biotecnología.
    Nota: Buffers de disociación no enzimática pueden utilizarse alternativamente para la preparación de las células para pases.
  8. Recoger la suspensión celular en medio de hESC a tubos cónicos de 15 mL estéril (dilución al menos 2 veces) y suavemente triturate células mediante pipeteo para obtener una suspensión unicelular.
  9. Centrifugar a 300 x g durante 5 min, aspirado/descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1 – 2 mL del medio de LIF-5i en el gabinete de seguridad de la biotecnología. Contar las células usando un hemocitómetro o un contador celular automático.
  10. Lave la placa MEF pre enchapada dos veces con PBS (2 mL por pocillo, en placas de 6 pocillos) y distribuir 1 – 2 x 106 células (en medio de 2 mL LIF-5i) en la 1 de la placa de lavado PBS MEF.
  11. Ajustar y optimizar la densidad inicial de la galjanoplastia para cada línea individual hPSC que revirtió de ingenuo, como replating eficiencia puede ser muy variable. Coloque la placa en un incubador de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda).
    Nota: El uso rutinario de anti-apoptóticos reactivos no se recomienda para la mayoría de las líneas hPSC con este método. El sistema de LIF-5i ya significativamente mejora clonal eficiencia re-galjanoplastia a granel inicial de hPSC convencionales líneas. Sin embargo, un solo uso de inhibidor de la roca (5-10 μM Y-27632) puede mejorar la eficiencia inicial de la LIF-5i re-galjanoplastia clonal de culturas hPSC convencional en el primer paso para algunas líneas inestables hPSC linaje preparado con la propensión a la espontánea diferenciación.
  12. Si a partir de culturas libres de alimentación (p. ej., E8), directamente transferencia de un bien de la disociada hPSC convencional adaptado en LIF-5i en uno irradiado bien MEF-plateado (es decir, paso de 1:1).
  13. Al día siguiente, agitar suavemente la placa para levantar todas las células no adheridas, aspirar el medio (lavado PBS es opcional) y reemplazar con 2 mL de medio de LIF-5i. Realizar este paso en una bioseguridad gabinete diariamente durante 3 a 5 días o hasta que las células son confluentes de 60 – 70% (figura 1). Coloque la placa en un incubador de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda).

3. a largo plazo mantenimiento y ampliación de N-hPSC en medio de LIF-3i

  1. Tras la inicial adaptación de LIF-5i, paso posterior estable LIF-3i culturas cada 3-4 días en un gabinete de bioseguridad, o cuando las culturas se convierten en 60 – 70% confluentes (figura 1).
    Nota: LIF-3i culturas requieren mantenimiento riguroso y permitiendo cultivos N hPSC alcanzar alta confluencia/densidad celular del cultivo prolongado (por ej., > 4 días) disminuye la eficiencia re-galjanoplastia clonal posterior y promueve la espontánea diferenciación.
  2. En un gabinete de bioseguridad, deseche el medio de cultivo y lavar cada pozo de LIF-5i/LIF-3i culturas suavemente, añadir 2 mL de PBS. Descartar el PBS y añadir 1 mL de solución de separación celular. Incubar por 5 min a 37 ° C en un incubador de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda).
  3. Recoger la suspensión de células, añadir medio de hESCs (sin inhibidores o factores de crecimiento (tabla 1); dilución por lo menos 2 veces) para recuperar todas hPSC y triturate suavemente las células mediante pipeteo para obtener una suspensión unicelular. Transferir la suspensión a un tubo cónico de 15 mL estéril.
  4. Centrifugar a 300 g durante 5 min y aspirado/descartar el sobrenadante. Resuspenda el sedimento celular en medio de LIF-3i. Contar las células usando un hemocitómetro o un contador celular automático.
  5. Placa 2 x 105 células por pocillo en el MEF irradiada en la placa de 6 pozos gelatinizado para pases de rutina de las culturas de LIF-3i. Para los cultivos iniciales de LIF-5i-adaptado de la placa un inicialmente mayor densidad (4 x 105 células/pocillo) antes del primer paso en LIF-3i/MEF.
  6. Volver a la placa y distribuir hPSC LIF-5i-adaptado en fresco lavado con PBS irradiado MEF alimentador placas (preparada el día anterior como la anterior) en el medio de LIF-3i. Reemplazar el medio de LIF-3i diariamente.
  7. Paso N-hPSC para menos bulto continua 4 – 7 pasos en el LIF-3i medio antes del uso de N-hPSC en estudios funcionales o criopreservación. Registrar el número de pasos de N hPSC ya sea convencional o LIF-3i.
    Nota: Reversión de LIF-3i de paso alto (p. ej. > p40) líneas hPSC convencional, preparado de linaje no se recomienda. Debe hacer un esfuerzo para revertir las líneas hPSC convencional en el paso más bajo posible que estén disponibles. Además, el uso de hPSC LIF-3i-revertido que han sufrido más de 10 pasos de LIF-3i no se recomienda para estudios funcionales, puesto que tales culturas hPSC N pueden albergar copias karyotypically anormales debido a la selección de la cultura de célula clonal prolongada. Reversiones de LIF-5i/LIF-3i frescos de hPSC convencional paso bajo líneas deben realizarse estudios funcionales, si las reservas de N-hPSC con < 10 pasajes de LIF-3i no están disponibles.

4. crioconservación y descongelación de LIF-3i-revertir N-hPSC

  1. Ampliar N-hPSC revertida para por lo menos 5-7 pasos en LIF-3i, como se indicó anteriormente, antes de su uso en estudios funcionales o criopreservación a largo plazo. Anotar el número de pasajes en las condiciones convencionales y en condiciones de LIF-3i en cada frasco criopreservado.
    Nota: Exceso vuelto LIF-3i N-hPSC no utilizado en los análisis funcionales puede ser criopreservado en cada paso, pero congelamiento de pasajes reversión posterior inferiores (por ejemplo., < p3) puede resultar en pobre o eficiencias de recuperación post-thaw altamente variable.
  2. En un gabinete de bioseguridad, aspirar el medio de cultivo, lavar las células en PBS (2 mL por pozo), aspirar PBS y disocian hPSC colonias en las células con solución de separación celular (1 mL por pozo). Coloque la placa por 5 min a 37 ° C en un incubador de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda). Diluir la solución de la separación de la célula con el medio de LIF-3i (2), recoger hPSC en un estéril cónico de 15 mL, centrifugar las células a 200 x g durante 5 minutos y resuspender el precipitado de células en medio de LIF-3i (1 – 2 mL por pozo-equivalente). Contar el número de células usando un hemocitómetro o un contador celular automático.
  3. N-hPSC de centrífuga en el medio de LIF-3i (200 x g durante 5 min) y resuspender las células en un gabinete de seguridad de la biotecnología en la solución de congelación (tabla 2), con una densidad de al menos 1 x 106 células/mL.
  4. Transferencia de las células en los tubos criogénicos de almacenamiento a largo plazo y coloque en un recipiente de congelación lenta. Permita que las muestras se congelen durante la noche en un congelador de-80 ° C.
  5. Al día siguiente, transferir los crioviales en un congelador de nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo.
  6. Para descongelar, coloque el frasco congelado en un baño de agua de 37 ° C por 2 min esterilizar el frasco (es decir, spray de etanol), transferencia hPSC en un estéril cónico de 15 mL y diluir lentamente la células hESCs en 10 veces suplementado (tabla 1) con 5 μM de Inhibidor de quinasa (ROCK) la proteína Rho-associated Y-27632 dentro de una campana de seguridad biológica estéril gabinete.
  7. Centrifugar a 200 x g durante 5 minutos. En un gabinete de bioseguridad, descartar sobrenadante libre de células y resuspender el precipitado de células en LIF-3i suplementado (1 – 2 mL) con inhibidor de roca de 5 μM Y-27632.
    Nota: Exclusión de Y-27632 dará lugar a eficiencias de recuperación post-descongelación pobres (figura 2).
  8. La transferencia de las células descongeladas resuspendió en LIF-3i/ROCK inhibidor en los pozos de lavado PBS MEF-plateado. Criopreservar el LIF-3i culturas a una densidad de 1 x 106 células por vial. Descongelar cada uno de estos frascos en alimentadores en un pocillo de una placa de 6 pozos gelatinizado.
  9. Al día siguiente, empezar a regular LIF-3i media expansión sin inhibidor de la cinasa Rho.

5. alimentador eliminación para la recogida de muestras de N hPSC

  1. Para preparar cultivos de muestras de LIF-3i/MEF (o células/MEF convencional) (es decir, para la expresión del gen (p. ej., RT-PCR cuantitativa, microarrays) o análisis de proteínas (por ejemplo, Western blot), agotan culturas LIF-3i de alimentadores MEF usando Magnética activa célula clasificación (MACS) con el anticuerpo anti-TRA-1-81 revestido microbeads según protocolo del fabricante.
  2. También puede utilizar el siguiente método simple de la pre-galjanoplastia para agotar las culturas de los alimentadores, como se describe a continuación.
  3. En una campana de seguridad biológica estéril gabinete, descartar el sobrenadante libre de células, lavar el sedimento con PBS estéril de 2 mL por pozo. Quitar adherentes culturas LIF-3i/MEF usando celular separación solución (1 mL/pocillo). Incubar durante 5 minutos en un incubador de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda). Recoger hPSC en un estéril cónico de 15 mL. Lavado 2 veces hESCs en medio, las células de transferencia en el estéril cónico 15 mL y centrifugar a 200 x g durante 5 minutos.
  4. En un gabinete de bioseguridad, resuspender cada pocillo de las células de LIF-3i/MEF disociado en 2 mL de medio de LIF-3i y transferir directamente a un nuevo pozo de una placa de 6 pozos que ha sido recién cubierta con 0.1% de gelatina.
  5. Incube las células hPSC de LIF-3i/MEF por 1 h a 37 ° C en un incubador de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda). Recoger las células no adherentes con una pipeta en un tubo cónico nuevo. Cuidadosamente añadir 2 mL de medio de células a cada pozo y remolino para recoger las células restantes no adherente.
    Nota: La mayoría de lo MEF irradiado se fije a la placa gelatinizada en 1 h, dejando a la mayoría de la hPSC en suspensión.
  6. Combinar y centrifugar las células a 300 x g durante 5 min lavado en PBS. Rápido-congele el precipitado de células en nitrógeno líquido después de la centrifugación, o alternativamente resuspender los pellets en un tampón de lisis que es compatible con el análisis de proteína o ácido nucleico aguas abajo (figura 2B).
  7. Realizar caracterizaciones de LIF-3i hPSC líneas con un control convencional hPSC isogénicas preparado correspondiente.
    Nota: Debido a la variabilidad intrínseca entre y dentro de las culturas cebadas, controles pertinentes elaboran un punto coincidente en cultura o antes de la reversión de ingenuo. Protocolos detallados y materiales para Bioimagen inmunofluorescente descendente, flujo cytometry, Western blotting, expresión génica (análisis de RT-PCR y microarrays), estudios de metilación (blot dot, microarrays de la metilación CpG), OCT4 potenciador proximal y distal predominio reportero ensayos y ensayos de inhibidor de la señalización se proporcionan en otros lugares3.

6. post reversión de ingenuo: validación de la integridad genómica y retención de improntas parentales de LIF-3i-revertir N-hPSC antes de su uso en ensayos funcionales

  1. Pantalla las partida culturas hPSC convencional, preparado para la posesión de un cariotipo normal (por ejemplo, con análisis de tinción Giemsa banda usando métodos publicados 7) antes de iniciar la reversión de LIF-5i/LIF-3i.
    Nota: Esto es para eliminar las poblaciones de hPSC convencional que pueden albergar anormales alteraciones genómicas que pueden conducir a ventaja selectiva artefactual de la supervivencia en condiciones de LIF-3i clonales.
  2. Para obtener resultados óptimos, recién volver hPSC convencional culturas a un estado ingenuo con LIF-3i varias semanas antes de su uso en estudios funcionales o dirigida a la diferenciación.
    Nota: La rutina prolongada cultura 'mantenimiento' en condiciones de LIF-3i para más de 10 pasajes siguientes reversión de ingenuo no se recomienda. Expansión de rutina y mantenimiento de líneas de hESC y hiPSC deben realizarse utilizando sistemas de cultivo convencionales (por ejemplo, en E8 o MEF/células medianas con bFGF).
  3. Evaluar las revertidas hPSC N líneas para la retención normal karyotypes 5 – 7 pasajes después de reversión de LIF-3i (e.g., con bandas de Giemsa tinción de análisis7, o cualquier otro método de elección).
  4. Evaluar todas las líneas de N-hPSC revertidas para la retención de huellas genómicas parentales normales por un análisis de metilación de ADN de elección (por ejemplo, los protocolos para análisis de microarrays de ADN CpG de improntas parentales en N-hPSC LIF-3i-volvió en otra parte3 ) después de 5 a 10 pasos de reversión de LIF-3i.

7. post reversión de ingenuo: Diseño Experimental directrices para ensayos cuantitativos diferenciación dirigida utilizando N-hPSC LIF-3i-vuelto

  1. Utilizar directamente LIF-3i N-hPSC en protocolos de diferenciación dirigida establecido sin manipulaciones de la cultura de célula adicional.
    Nota: Volver a cebado (es decir, convertir N hPSC convencionales condiciones preparadas antes de su uso en ensayos de diferenciación dirigida) no es necesario con el método LIF-3i y no se recomienda.
  2. A para los efectos del análisis y variabilidad en las pruebas funcionales de líneas individuales hPSC de la interlínea, validación cruzada de las potencias de la diferenciación linaje-específicas empleando los protocolos de diferenciación independiente con al menos tres hPSC líneas derivadas de fondos genéticos independientes (es decir, múltiples derivados de donantes hiPSC y células).
  3. Comparaciones funcionales, establecer culturas de hermano, en el número de paso equivalente y de la misma línea de hPSC (isogénicas) en paralelo al convencional preparado de linaje y culturas hPSC LIF-3i-volvió. Mantener cultivos de cebada/ingenuo hermano hPSC isogénicas en sus respectivos medios de comunicación (por ej., E8 vs. LIF-3i) y al mismo tiempo diferenciar mediante diferenciación idénticos protocolos y materiales, para eliminar cualquier sesgo experimental (figura 4).
  4. Para isogénicas pintado vs ingenuo hPSC comparaciones, ajustar y optimizar la galjanoplastia inicial densidades para cada ensayo de diferenciación individual.
    Nota: Protocolos detallados para progenitoras neurales, endodermo definitivo y hemato-endoteliales diferenciación dirigida de LIF-3i-revertir N-hPSC reciben en otra parte 3. Revertido por LIF-3i N-hPSC tienen capacidad proliferativa y de diferenciación más robusta en los ensayos de diferenciación dirigida de hPSC convencional. N-hPSC típicamente requiere una menor concentración de placas iniciales que las hPSC convencional, y a diferencia de su convencional preparado hPSC homólogos, no requieren el uso de anti-apoptóticos reactivos para mejorar su supervivencia clonal tras enzimática digestión en los ensayos de diferenciación.

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Representative Results

Este protocolo optimiza la reversión de ingenua-como eficiente con LIF-3i en ambas culturas dependiente de alimentación y alimentador independiente linaje preparado hPSC convencional (figura 1). El protocolo detallado, aquí descrito, contornos adaptación secuencial a LIF-3i a partir de cualquier condiciones hPSC dependiente del alimentador o libre de alimentador convencional (p. ej. E8 medio).

Representante para la reversión de LIF-3i de varias células convencional y libre de transgén hiPSC líneas se presentan en las figuras 1-3. Estos resultados típicos pueden ser validados con la línea de células disponibles comercialmente H9, o con un disponible en el mercado libre de transgén, cable de línea hiPSC episomal derivadas de sangre (6.2) en el laboratorio de Zambidis8,9. Introducción de un paso de adaptación inicial de LIF-5i permite la propagación clonal subsecuente, a granel altamente eficiente de culturas hPSC convencional en LIF-3i y no requiere de agentes anti-apoptotic o roca inhibidores10 (figura 1A, B ). Múltiples placas de hPSC ingenua-como pueden ser rápidamente recolectaron muestras para posteriores análisis o multilineage indica diferenciación solamente después de 5 a 7 pasos en LIF-3i. Alternativamente, LIF-3i culturas pueden ser criopreservadas para futuras aplicaciones. Descongelar la recuperación de la célula puede ser mejorada (figura 2) mediante la inclusión de un inhibidor de la roca en criopreservación y descongelación posterior media11.

Los determinantes de la pluripotencia molecular y funcional, tanto en vitro y en el embrión fueron recientemente ha comentado2. Estos factores incluyen la genética, asociada a la cultura la adquisición de mutaciones para los genes clave de desarrollo y diferencias en células y derivación hiPSC y metodologías de cultura. Proporciona a continuación es un resumen de análisis estándar que puede ser empleado para la caracterización y validación de la fenotípica molecular y funcional pluripotencies de hPSC LIF-3i-vuelto.

Morfología de las colonias
La transición entre los sistemas de cultivo cebada, convencional y LIF-3i-revertido es acompañada por diferentes cambios físicos en la morfología de las colonias hPSC (figura 1B). HPSC convencional células proliferan como plano, colonias amplia monocapa que se expanden rápidamente de grumos de células pequeñas (en MEF o condiciones sin alimentador), pero mal como células individuales. Exposición de líneas convencionales hPSC a LIF-3i promueve el crecimiento y expansión y de la más pequeña, apretada, colonias en forma de cúpula que surgen clonally solo células. Estos cambios morfológicos son totalmente reversibles, y las colonias LIF-3i-vuelto en forma de cúpula pueden espontáneamente de la transición hacia una morfología convencional monocapa si LIF-3i se retira y células re-se cultivan en medio de hESCs convencional estándar complementado con bFGF. Además, la expansión de células LIF-3i-vuelto a altas densidades confluentes (o cultura prolongada sin pases frecuentes) en la readquisición espontánea de la morfología plana, convencional con reducida eficiencia clonal; haciendo hincapié en la necesidad de mantenimiento diligente y cuidado hPSC LIF-3i-revertido (e.g., < confluencia de 40 – 60%).

Directo tinción de inmunofluorescencia y flow cytometric análisis de marcadores de pluripotencia superficial
Evaluación de marcadores de pluripotencialidad durante la transición de convencional a un estado ingenuo siguiente cultura de LIF-3i continua puede ser monitoreados no invasiva usando anticuerpos directo tinción sin detectar ningún efecto negativo en (expansión) LIF-3i/MEF e.g., vivir-coloración conjugado con fluorocromo anticuerpos contra TRA-1-81, TRA-1-60 y SSEA4).

Retención de pluripotencialidad durante reversión de LIF-3i también puede controlarse rutinariamente por el análisis cytometric del flujo de la expresión superficial del marcador pluripotencia asociados de TRA-1 y antígenos SSEA durante solo pases (figura 1C) de la célula o inmunofluorescencia de intacto, se fijo colonias en situ (figura 3). Aunque estos marcadores no discriminan entre convencionales y LIF-3i Estados, sus niveles se correlacionan inversamente con la frecuencia de la diferenciación espontánea que puede ocurrir en hPSC cuando la transición de convencional hPSC para condiciones de LIF-3i. Antígenos de superficie adicionales que concretamente marca humana ingenua-como Estados en vitro2,12,13 también pueden ser empleados para detectar eficaz LIF-3i hPSC reversión.

Validación de pluripotencia molecular de N-hPSC
Porque el fondo genético de líneas hPSC se ha caracterizado como una fuerte variabilidad del interline, es importante evaluar rigurosamente isogénicas culturas en juego los puntos de cultura tiempo al comparar los sistemas de cultivo hPSC (figura 4). Puesto que algunos de estos sistemas ya se ha demostrado para generar poblaciones hPSC con configuraciones genómicas y epigenéticos aberrante2, cualquier método de reversión del ingenuo debe ensayarse con un número de N-hPSC de fondos genéticos independientes, de manera es suficiente para validar la reproducibilidad biológica y excluir los Estados pertinentes al no desarrollo "pseudo-pluripotentes" (es decir, con evidentes señas de identidad de pluripotencia molecular pero carecer de habilidades de diferenciación funcional). Zimmerlin et al. ampliado la validación del sistema de cultura LIF-3i incluyen la pluripotencies molecular y funcional de revertidas N-hiPSC derivado de varios métodos de reprogramación, que es otro conocido putativos de la variabilidad funcional de ensayo entre pluripotentes Estados2.

Por consiguiente, mayoría de los estudios de los sistemas de cultivo humano ingenuo se ha centrado en ensayo molecular pluripotencia de hPSC N en 1) nivel epigenético (p. ej., histona marcas por secuencia de ChIP o ChIP-PCR, la metilación del ADN global immunoblots o conjunto genómico secuenciación de bisulfito, microarrays de la metilación CpG alelo-específica, OCT4 potenciador predominante uso por sistemas de reportero, la actividad mundial en elementos reguladores por la ADNasa I hipersensibilidad y repetición elemento perfilado por secuenciación del RNA), 2) transcriptómico nivel (secuenciación del RNA, microarrays de expresión y RT-PCR cuantitativa), análisis de expresión de la proteína (e.g., FACS, microscopía de inmunofluorescencia y Western blot) y 3) mediante estudios metabólicos (por ejemplo, glicolisis, oxidación metabolismo de fosforilación y nicotinamida). Se muestran ejemplos representativos de las manchas de la inmunofluorescencia y Western blot detección de expresión para los principales marcadores de pluripotencia molecular (figura 3B, C). Por ejemplo, se muestra en la figura 3B son activada fosforilada (fosfo) y total isoformas de STAT3 y ERK1/2, que son la claves moleculares características de ratón ESC-como ingenuo pluripotencia. Estos fueron detectados con anticuerpos primarios anti-STAT3 y anti-ERK1/2. Además, pluripotencia funcional en ensayos de diferenciación de teratoma se demuestra en convencional vs. LIF-3i-revertido hPSC teratoma tejidos disecaron 10 semanas después de la inyección y fijados en formaldehído al 4% y parafina incorporado (figura 3D).

Preparación de LIF-3i/MEF o células/MEF/bFGF muestras para posterior análisis molecular debe incluir agotamiento del MEF. Dos enfoques son descritos por agotamiento del MEF que han sido empleadas con éxito en nuestro laboratorio. Pre-galjanoplastia del MEF es un simple, confiable, y eficiente método para eliminar a alimentadores de hPSC N muestras para estudios moleculares y es una alternativa preferida a FACS o MACS separación (es decir, anti-TRA-1-81 o anti-TRA-1-60 anticuerpos separación ). Además, diferenciar espontáneamente TRA-1-negativo células adherentes en culturas de LIF-5i/LIF-3i pueden ser rápidamente eliminadas del LIF-5i/LIF-3i N-hPSC culturas antes posterior LIF-3i en MEF fresco por pre-galjanoplastia enzimáticamente digerido células de 1 h en placas previamente recubierto con gelatina de 0.1% (figura 2).

Evaluación de pluripotencia funcional de hPSC N
El análisis más riguroso de pluripotencia funcional del PSC es el ensayo de quimera de inyección blastocisto, que es limitado en las pruebas de las líneas N-hPSC por razones éticas. Por otra parte, varios grupos que han reportado la generación de N-hPSC con varios otros métodos han intentado generar quimeras interespecies. Sin embargo, estos intentos han rendido muy baja o aporte de distinguidos linajes hPSC N a embriones murinos o porcinos, en comparación con la capacidad de generación de quimera de ratón estándar ESC2.

Estudios funcionales adicionales han investigado dirigida en vitro la diferenciación de supuesta N-hPSC derivado mediante varios métodos, pero han revelado la capacidad de diferenciación del multilineage parcial, defectuoso o disminuida, con la concomitante abrigar de anomalías epigenéticasde2,13. Similares aberraciones epigenómica, especialmente en lugares geométricos impresos, se han detectado en ratón ESC después de la exposición prolongada a la LIF-2i cóctel14. Curiosamente, algunos sistemas de cultivo reversión han divulgado mejoras globales en atributos específicos de pluripotencia funcional del PSC como mejorar la capacidad para en vivo trophectoderm contribución2,15 .

Utilizando una amplia colección de hPSC de LIF-3i-revertido derivado independientemente, Zimmerlin et al. emplea la diferenciación del multilineage ensayos para demostrar que el sistema de LIF-3i mejora dramáticamente la pluripotencia funcional de líneas convencionales hPSC 3. Esto permite análisis sistemático de convencionales vs LIF-3i hPSC líneas isogénicas para eliminar las variaciones dependientes del interline (figura 4). LIF-3i-revertido hPSC líneas no requieren un paso re cebado antes de la diferenciación de EB. Sin embargo, LIF-3i hPSC proliferan en tasas significativamente mayores de clonales de células isogénicas ampliaron en E8, y por lo tanto, inicial menores densidades de placas requieren ajuste para permitir que cada cultura llegar a la confluencia en un punto similar.

Los investigadores deben utilizar rutinariamente múltiples ensayos para demostrar la funcionalidad mejorada de hPSC LIF-3i-revertido que incluye no sólo en vivo teratoma ensayos sino en vitro dirigido ensayos de diferenciación a nervios, definitiva endodermo y hematovascular linajes3 usando múltiples análisis (p. ej., 2D APEL3,16 y cuerpo de embryoid 3D17,18 sistemas). Para controlar para la reproducibilidad del ensayo-dependientes, deben realizarse al menos dos métodos diferentes de diferenciación en repetición para cada par isogénicas de cebada/LIF-3i hPSC culturas (por ejemplo, figura 4, APEL, embryoid cuerpo protocolos de diferenciación). El diseño experimental debe incluir un número sólido (p. ej., > 3 – 5) líneas de cebada/LIF-3i isogénicas de hPSC de múltiples donantes independientes contextos genéticos portadores (figura 4).

Figure 1
Figura 1: Una gradual transición de culturas hPSC convencional, preparado por el linaje a condiciones similares a la ingenua con el método LIF-3i. (A) esquema de protocolos para la reversión gradual de LIF-3i. (Esquema superior) Un método general para la transición de cebada, hPSC convencional a culturas de LIF-3i. (Esquema inferior) Dos estrategias resumidas para LIF-3i ingenuo reversión de convencional (cebada) hPSC cultivada en alimentador (es decir, pintado/MEF a LIF-3i/MEF), o en condiciones libres de alimentación (es decir, pintado/E8 a LIF-3i/MEF). (B) morfologías de PSC humana. Se muestran microfotografías representativas de hPSC durante reversión de LIF-3i usando una línea de iPSC episomal humana disponible comercialmente (6.2). Muestra las transiciones observadas entre colonias de monocapa plana convencional inicial, y las colonias de clonogenic posterior en forma de cúpula que surgen tras paso intermedio LIF-5i y estables condiciones de cultivo de LIF-3i. Barras de escala = 200 μm (C) flujo representativo cytometric análisis de marcadores de superficie de pluripotencia. Se muestran TRA-1-81 y SSEA-4 superficie expresiones en línea convencional hPSC 6.2 (p40) ampliadas en E8, el paso inicial en la LIF-5i/MEF y siguientes pasos 1 a 9 (P1-P9) en condiciones de LIF-3i. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Criopreservación de N hPSC y preparación de muestras por la pre-galjanoplastia del MEF. (A) ejemplo de un ciclo de congelación/descongelación de culturas LIF-3i/MEF. La línea de derivados de sangre, no integrado, libre de transgén humano iPSC de cable convencional E5C3 fue derivado y ampliado en alimentadores MEF en células suplementado con bFGF de 4ng/mL para los 18 pasos. E5C3 convencional, preparado de linaje se adaptaron en LIF-5i (izquierda) y la transición en medio de LIF-3i para 3 pasajes (centro). Las células E5C3 LIF-3i que se muestra en el panel central cryopreserved con medio crioprotector basado en DMSO (tabla 2, 1 x 106 células por vial) y almacenados en nitrógeno líquido). Un frasco fue descongelado un mes más tarde y E5C3 células se transfirieron en un alimentador revestido de una placa de 6 pozos (derecha). Recuperación de la célula puede mejorarse complementando el medio LIF-3i con 5 μm Y-27632 de deshielo después de sólo un día. Barras de escala = 200 μm. (B) eliminación de MEF (y también adherente de TRA-negativo diferenciado de células) en las culturas de hPSC LIF-3i/MEF por el método de la galjanoplastia. Se muestran flujo cytometric análisis antes y después de pre-galjanoplastia de conjugado con PE anti-TRA-1-81 y TRA-1-60 de anticuerpos, conjugado con APC SSEA-4 anticuerpos y anticuerpos de SSEA-1/CD15 demostrando el agotamiento de los TRA-1 antígeno negativo y las células MEF mediante el método de la galjanoplastia de una hora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Caracterización de pluripotencia en LIF-3i/MEF N-hPSC culturas. (A) marcadores de pluripotencia superficial y nuclear. Expresión de pluripotencia factor NANOG en el mismo (isogénicas) TRA-1-81+SSEA4+ convencional, línea hiPSC derivadas de sangre de cordón E5C3 de cebada (p39) ampliado en cebada (E8), o ingenuo LIF-3i (+ p8 en LIF-3i/MEF) condiciones. Manchas inmunofluorescentes de hPSC representativas culturas en diapositivas de la cámara revelaron la expresión uniforme, nuclear de los factores de pluripotencia núcleo NANOG en SSEA-4+TRA-1-81+ hPSC cultivada en cebada, convencional (E8 medio) o LIF-3i/MEF condiciones. Barra de escala = 100 μm. (B) análisis de Western blot. STAT3 (izquierda), ERK (centro) y expresión de la proteína de control beta-actina para una representante hPSC (línea células H9) en condiciones de LIF-3i/MEF (3i) o convencional (E8 medio). (C) expresión ingenua pluripotencia asociados factores de transcripción. Se muestran STELLA/DPPA3, NR5A2 y TFCP2L1 por inmunofluorescencia en una cultura representativa de LIF-3i/MEF (cable línea hiPSC derivadas de sangre E5C3 p33 (hESCs/MEF) + p8 (LIF-3i/MEF). Barra de escala = 100 μm. Teratoma (D) los análisis de hPSC convencional y LIF-3i-vuelto. Validación de pluripotencia funcional en una línea hiPSC representante isogénicas (E32C6 derivadas de sangre de la cuerda) cultivadas en cualquiera de los dos E8 (p9) o LIF-3i/MEF (+ p12) por análisis de teratoma. 10 x 106 células isogénicas vs convencional, cebada cultivada URL LIF-3i-revertido hPSC fueron inyectadas por vía subcutánea en las extremidades de ratones inmunodeficientes NSG. Hematoxilina y eosina manchas de teratoma microsections revelaron robusta diferenciación en las tres capas del germen con ectodermo bien estructurado (roseta neural: NR, epitheliam pigmentado retiniano: RPE), mesodermo (condroblastos: Ch) y endodermo (glandular tejido: GI) linajes. Barras de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Comparación de pluripotencia funcional entre Estados isogénicas de cebada e ingenuos. (A) esquemática de la estrategia para la evaluación funcional pluripotencia de pluripotent distintos Estados isogénicas convencional vs hPSC LIF-3i cultivadas en protocolos de diferenciación independiente. Demostrado son dos progenitoras hemato-vascular diferenciación sistemas (monocapa APEL y sistemas del cuerpo embryoid 3D (EB)) que previamente fueron empleados para evaluar la potencia de la diferenciación de convencional vs LIF-3i-vuelto en la misma línea de hPSC (isogénicas) cultivadas en paralelo post reversión de LIF-3i con los mismos números de paso. HPSC LIF-3i-revertir líneas no requieren un paso re cebado antes de la diferenciación de EB y se someten directamente al Protocolo de diferenciación. (B) sistema de diferenciación EB vasculares progenitoras (VP). El sistema de diferenciación 3D EB empleado para este estudio fue previamente descrito17,18. Se muestran los resultados representativos en el día 10 de diferenciación de EB (paneles de la izquierda) para las culturas isogénicas de la misma sangre (CB)-derivados E5C3 hPSC línea9, cultivadas en cualquiera células/MEF convencional (pintado / MEF) condiciones o ingenuo de LIF-3i/MEF condiciones. Análisis de citometría de flujo de estas células EB muestran aumentos espectaculares de CD31+CD146+ VP siguiendo LIF-3i reversión de la línea de E5C3 antes de la diferenciación de las poblaciones. El histograma muestra la media ±SD de CD31+CD146+ VP porcentajes recuperados en el día 10 en este sistema de EB con tres isogénicas de líneas hPSC independiente (es decir, dos CB-hiPSC y un adulto derivan del fibroblasto la célula hiPSC, línea punteada conecta isogénicas). Resultados demuestran una mejoría significativa de las eficiencias de la diferenciación de VP en el sistema EB a través de fondos genéticos de varias líneas de hPSC. (C) APEL monocapa progenitoras vasculares diferenciación sistema. Convencional (cebada E8) y LIF-3i-revertido hPSC pueden ser directamente diferenciado utilizando las mismas condiciones de cultivo, factores de crecimiento, citoquinas y moléculas pequeñas de la gradual diferenciación endotelial APEL protocolo 3, 16. se muestran independientes APEL diferenciación los experimentos usando la línea de hiPSC derivadas de sangre de cordón de E5C3 y el porcentaje de CD31+CD146+ las poblaciones progenitoras vasculares en el día 7 de la diferenciación de APEL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El sistema de LIF-3i aplica una versión modificada del clásico 2i murino ingenuo reversión cóctel1 a células madre pluripotentes humanas. La auto renovación de hPSC (que no se puede expandir en 2i solo) se estabiliza en LIF-2i por complementar este cocktail con el inhibidor de tankirasa XAV939. LIF-3i cultura permite a granel y eficiente reversión de la hPSC convencional a un estado pluripotente que se asemeja el epiblasto preimplantacional humana3. Aunque los mecanismos de acción de XAV939 en hPSC probable complejo y sinérgico con 2i, probablemente incluyen a un mínimo, un importante estabilización y aumento de hPSC auto renovación vía WNT de señalización de vías3.

Las culturas hPSC convencionales normalmente adoptan un espectro de Estados pluripotenciales con expresiones muy variable linaje cebada gen y marcas epigenéticas epiblasto tras el implante que puedan resultar en inconsistente o disminución funcional pluripotencia2 . Este oscurecimiento de linaje inherente de culturas hPSC convencional también puede interferir con la exitosa reversión de LIF-3i de algunos hPSC líneas2. Sin embargo, la inclusión del paso inicial de adaptación LIF-5i (tabla 1) en el método LIF-3i universal amplía la eficacia de la reversión de la LIF-3i entre una multitud de líneas hPSC y promueve la reversión de ingenuo a granel de hPSC convencionales líneas de manera evita la tediosa recogida y subcloning de colonias ingenuo vuelto raras, o la necesidad de uso de rutina anti-apoptotic moléculas para estabilizar su viabilidad.

El método de reversión del ingenuo de LIF-5i/LIF-3i es reproducible en una amplia variedad de líneas de hESC y hiPSC. Requiere una formación mínima con habilidad de cultura básica de la célula. Zimmerlin et al empleado con éxito esta estrategia secuencial para volver > 30 células independiente y libre de transgén hiPSC líneas de una amplia gama de donantes 3. Un solo paso en LIF-5i (figura 1) es suficiente para la mayoría de las líneas de hPSC ingenuo eficiente reversión en culturas de hPSC a granel, y avanzar su posterior mantenimiento estable y expansión de LIF-3i solo.

Además, el sistema de LIF-3i/MEF compatible con eficiencias de expansión clonal de sólidos a granel a lo largo de todos los pasos entre la cultura hPSC convencional preparado linaje hasta la reversión completa hPSC ingenua-como (es decir., adaptación, transición y expansión de 7 – 10 pasos en LIF-3i/MEF solo). Aunque la formulación actual de este sistema de cultivo requiere soporte de alimentador, un método simple y económico al agotar los comederos por la técnica de la galjanoplastia para el análisis de las culturas de LIF-3i se presenta (figura 2).

Varios otros cultura sistemas también se han divulgado para promover hPSC convencional a similares pluripotentes ingenua-como indica2. Aunque estos sistemas de cultivo hPSC también han dependido de la utilización de las condiciones de 2i de ingenuo ratón clásico, en la mayoría de los casos estos métodos passaging unicelular también requieren modulación química adicional para estabilizar un inherentemente inestable / Estado metaestable ingenuos humanos. Lo importante, la mayoría de estos métodos demostraron deterioro funcional pluripotencia tras diferenciación o adquirido epigenómica anormal improntas karyotypes2. Aunque la aparición de cariotipos anormales dentro de las culturas hPSC preparado convencional está ya bien documentado19, prolongado, unicelular pases métodos enzimáticos que se emplean habitualmente en métodos de reversión más ingenuo. Esto también se ha demostrado que potencian la generación de configuraciones cromosómicas anormales20,21; las técnicas más sensibles (por ejemplo, variaciones número de copia, polimorfismo de nucleótido simple) pueden revelar alteraciones adicionales22,23.

En cambio, un amplio repertorio de líneas hPSC LIF-3i-revertido confirmaron a poseen cariotipos normales en pasajes de bajo-medio (por ejemplo, p5-p15) y también en los números de paso alto (por ej., > p30) siguiendo LIF-3i cultura3. Además, epigenómica impresiones en LIF-3i-revertido hPSC fueron encontradas reproductivo normal e intacto puesto pasajes de 5 – 10 LIF-3i reversión2. Uso de la plataforma de matriz sensible específico de alelo metilación comercial, previamente se demostró que marcas de metilación CpG en los loci impresos de un amplio repertorio de líneas de hPSC LIF-3i-revertido (siguientes pasos 4-7 en LIF-3i) fueron encontradas para ser grueso normal en la estructura1. Puesto que los cariotipos y anormales huellas genómicas en última instancia pueden afectar la capacidad funcional de hPSC, requisitos directrices fueron descritas en este protocolo que alienta a los investigadores para validar hPSC culturas antes y después de la reversión del ingenuo, el uso de este método, así como a otros.

El método LIF-3i mejorado pluripotencia funcional a través de capas germinales en un repertorio grande de células y no-transgénicas hiPSC líneas (figura 3). A diferencia de otros protocolos de reversión de ingenua, hace el método LIF-3i no requieren un paso re cebado para la posterior diferenciación de hPSC N (es decir, convertir N hPSC convencionales condiciones preparadas antes de su uso en dirigido ensayos de diferenciación). Revertido por LIF-3i N-hPSC Mostrar capacidades de diferenciación significativamente más eficientes que sus contrapartes isogénicas hPSC convencionales en ambos ensayos de teratoma (figura 3D) y dirigido protocolos de diferenciación de los linajes de todo tres capas germinales2. Debido análisis dependiente y variaciones en pruebas funcionales de hPSC convencional de la interlínea, la diferenciación linaje-específicas debe ser evaluada mediante protocolos de diferenciación dirigida independiente y hPSC derivado de múltiples fondos genéticos. Mediante el cuidadoso diseño experimental, puede esperarse una amplia gama de líneas de hPSC para mejorar significativamente su eficiencia del multilineage diferenciación en comparación con sus isogénicas convencionales después de 4 – 10 pasos en condiciones de LIF-3i.

En Resumen, este método clonalmente y rápidamente expande el número de humanos PSC, mejora su eficacia de diferenciación río abajo, aumenta el número de células progenitoras linaje comprometido tras la diferenciación, y disminuye la variabilidad de la interlínea entre líneas de hPSC convencional, preparado por el linaje. Estos hPSC N con la funcionalidad mejorada adicional puede tener un gran impacto por su potencial para contribuir tejidos funcionales a un embrión en desarrollo. Por ejemplo, N-células estables pueden ser empleados para el desarrollo de los órganos humanos transplantables y células madre adultas en el desarrollo de animales quimeras, o para la generación de modelos animales dirigidos por gene humanizados de la enfermedad. La optimización adicional de este método de LIF-3i utilizando inhibidor de tankirasa en definido libre de alimentador GMP-compatible con las condiciones de cultivo facilitará la generación eficiente clínicamente útil de una amplia gama de tipos de células funcionales y engraftable para uso terapéutico.

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Disclosures

Bajo un acuerdo de licencia entre Life Technologies y la Universidad Johns Hopkins (JHU), Dr. Zambidis tiene derecho a una cuota de regalías recibidas por la Universidad para la concesión de licencias de las células madre. Los términos de este arreglo son gestionados por JHU conforme a sus políticas de conflicto de intereses. Esto no altera la adhesión de los autores a las políticas de diario en el intercambio de datos y materiales.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por becas del NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein innovación, el fondo de investigación de la célula de vástago Maryland (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk ciencia Foro premio y la Fundación de Moseley.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated BD Biosciences 561716 use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibody Sigma Aldrich HPA029708 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibody Abcam ab6276 use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated  BD Biosciences 550315 use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugated eBioscience 17-0319-42 use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kit Miltenyi Biotec 130-091-935
anti-NANOG antibody Abcam ab109250 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibody Sigma Aldrich HPA005455 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody Cell Signaling 4695 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody Cell Signaling 4370 use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody Cell Signaling 9145 use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated Agilent E0432 use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated  R&D System FAB1435A use 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated R&D System NLLC1435G use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibody Cell Signaling 9139 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibody Millipore MAB4388 use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated  R&D System NLLC4770R use at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0068 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0069 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560193 use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560161 use 10µL per assay (FACS)
APEL2-Li StemCell Technologies 5271
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3311
CellAdhere dilution buffer StemCell Technologies 7183 dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouse Charles river 023
CHIR99021 R&D System L5283 reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope system Zeiss LSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC line Thermo Fisher Scientific A18945 also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates Corning 3506
Countess  cell counting chamber slide Thermo Fisher Scientific C10228
Countess automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)  Thermo Fisher Scientific 11995-065
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific 11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D2650
DR4 mouse The Jackson Laboratory 3208
Essential 8 (E8) medium StemCell Technologies 5940
Fetal bovin serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30071.03
Forskolin Stemgent 04-0025 reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G1890-100G resuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
mTeSR1 medium StemCell Technologies 85850
Nalgene cryogenic vials Thermo Fisher Scientific 5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System Fisher Scientific 154534
Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS USB Corporation  19943
PD0325901 Sigma Aldrich PZ0162 reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
Purmorphamine Stemgent 04-0009 reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin A Peprotech AF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 Peprotech 120-05ET resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF) Peprotech 100-18B resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human LIF Peprotech 300-05 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
SB431542  Stemgent 04-0010-05 reconstitute at 100mM in DMSO
Stemolecule Y27632 in Solution Stemgent 04-0012-02 ROCK inhibitor in solution (10mM)
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific A11105-01
Streptavidin-Cy3 conjugate Sigma Aldrich S6402 use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 Peprotech 100-21 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
Vitronectin XF matrix StemCell Technologies 7180 dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer
XAV939 Sigma Aldrich X3004 reconstitute at 100mM in DMSO
β-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023 light sensitive

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References

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