Reversão química de células-tronco pluripotentes humanas convencionais para um estado de ingenuidade com potência melhorada Multilineage diferenciação

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Developmental Biology

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Summary

Apresentamos um protocolo para a reversão química, em massa, rápida e eficiente de células-tronco pluripotentes de humana linhagem-aprontadas convencional (hPSC) em um estado de pré-implantação epiblasto como pluripotentes epigenomically-stable ingênuo. Esse método resulta em diminuição da expressao linhagem-aprontadas e melhora acentuada na diferenciação de multilineage direcionada através de um amplo repertório de linhas hPSC convencional.

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Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Naïve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency. J. Vis. Exp. (136), e57921, doi:10.3791/57921 (2018).

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Abstract

Células-tronco pluripotentes humanas ingênuo (N-hPSC) com funcionalidade aprimorada pode ter um impacto grande em medicina regenerativa. O objetivo do presente protocolo é eficientemente reverter células-tronco pluripotentes humanas linhagem-aprontadas, convencional (hPSC) mantidas em condições alimentador-livre ou dependente do alimentador para uma ingênuo como pluripotência com funcionalidade aprimorada. Este método de reversão química ingênuo emprega o fator de inibição clássica leucemia (LIF), GSK3β e MEK/ERK inibição cocktail (LIF-2i), suplementado com apenas um inibidor de tankyrase XAV939 (LIF-3i). LIF-3i reverte hPSC convencional para um estado estável pluripotentes adotando transcriptional, bioquímicos e epigenéticas características do humano pré-implantação epiblasto. Este método de LIF-3i requer manipulação de cultura celular mínima e é altamente reprodutível em um amplo repertório de células-tronco embrionárias humanas (hESC) e linhas de células-tronco (hiPSC) isento de transgene humano pluripotentes induzidas. O método de LIF-3i não requer uma etapa re-escorvamento antes a diferenciação; N-hPSC podem ser diferenciados diretamente com altíssima eficiência e manter espectofotômetro e estabilidades de epigenomic (incluindo em loci imprinted). Para aumentar a universalidade do método, hPSC convencional primeiro são cultivadas no coquetel de LIF-3i suplementado com duas pequenas moléculas adicionais que potenciam a proteína quinase A (forskolina) e sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) sinalização (LIF-5i). Nesta etapa de adaptação LIF-5i breve significativamente aumenta a expansão clonal inicial do hPSC convencional e permite que eles sejam posteriormente ingênuo-revertido com LIF-3i sozinho em grandes quantidades, assim obviating a necessidade para colheita/subcloning raro N-hPSC colónias mais tarde. LIF-5i-estabilizado hPSCs são mantidos posteriormente no LIF-3i sozinhos sem a necessidade de moléculas anti-apoptotic. O mais importante, LIF-3i reversão marcadamente melhora a pluripotência funcional de um amplo repertório de hPSC convencional diminuindo sua expressão de gene linhagem-aprontadas e apagando a interlinha variabilidade de diferenciação dirigida comumente observada entre linhas hPSC independente. Caracterizações representativas de LIF-3i-revertido N-hPSC são estratégias fornecidas e experimentais para comparações funcionais do hPSC isogénicas na linhagem-aprontadas vs. ingênuo, como Estados são descritos.

Introduction

O sistema de cultura 2i (inibidor de MEK/ERK e GSK3β) foi originalmente desenvolvido para refinar a culturas de células-tronco embrionárias (mESC) heterogêneo baseado em soro mouse a um estado de solo uniforme de pluripotência parecido com o rato epiblasto pré-implantatório1. No entanto, 2i não oferece suporte a manutenção estável de pluripotentes humanas de linhas de células-tronco (hPSC)2. Os vários pequena molécula complexa, fator de crescimento-completada e abordagens transgênicas recentemente têm sido relatados para capturar presumidamente semelhante humano ingênuo como pluripotentes molecular afirma2. No entanto, muitos dos Estados "ingênua, como" criados com estes métodos também exibiram espectofotômetro instabilidade, epigenomic defeitos (por exemplo, global perda do imprinting genômico parental), ou com deficiências potenciais de diferenciação.

Em contraste, o coquetel de triplo inibição química da GSK3β, ERK e tankyrase sinalização e fator inibitório de leucemia (LIF-3i) foi suficiente para a reversão de ingênuo, como estável de um amplo repertório de hPSC convencional linhas3. LIF-3i-revertido ingênuo hPSC (N-hPSC) mantido cariótipos normais e aumentou suas expressões de genes específicos ingênuo humano pré-implantação epiblasto (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i hPSC de reversão também conferido com uma matriz de características moleculares e bioquímicas únicas de pluripotência mESC-como ingênua que incluiu sinalização aumento de STAT3 fosforilada, diminuição da fosforilação de ERK, global 5-metilcitosina CpG hypomethylation, desmetilação de CpG todo o genoma em células-tronco embrionárias (ESC)-promotores de genes específicos e dominante uso de intensificador de OCT4 distal. Além disso, em comparação com outro ingénuo métodos de reversão que resultaram em aberrantly hypomethylated impresso loci genômicos, N-hPSC LIF-3i-revertido fosse desprovido de perda sistemática de padrões impressos de CpG ou perda de expressão de DNA metiltransferase (por exemplo, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.

Uma cultura de LIF-3i directa de um vasto leque de convencionais células estaminais embrionárias humanas (hESC) e células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSC) cultivadas em alimentadores ou E8 alimentador-free condições alcançado reversão rápida e do volume para um estado de epiblasto ingênuo. No entanto, direto LIF-3i ingênuo reversão pode ser ineficiente em algumas linhas hPSC convencional instável devido as inerentes variabilities genômicas e linhagem-aprontadas decorrentes as origens de doador geneticamente diversas.

Assim, para ampliar a utilidade do método LIF-3i, uma otimização gradual foi desenvolvida e é apresentada neste documento, que permite reversão ingênuo universal com quase qualquer hESC convencional ou hiPSC transgene-free linha cultivadas em alimentadores. Este método de reversão ingênuo universalizada emprega uma etapa transitória cultura inicial no hPSC convencional que complementa o coquetel LIF-3i com dois adicionais pequenas moléculas (LIF-5i) que potenciam a proteína quinase A (forskolina) e sonic hedgehog (sHH) ( sinalização de purmorphamine). Uma passagem inicial do hPSC convencional no LIF-5i adapta-los para posterior reversão de LIF-3i estável em grandes quantidades. Adaptação de LIF-5i inicial aumenta significativamente a proliferação clonal inicial única célula do hPSC convencional cultivada em E8 ou alimentadores (antes da sua passagem estável, contínua subsequente no LIF-3i sozinho). Linhas hPSC convencional adaptadas primeiro para uma passagem no LIF-5i toleram granel subsequente clonal passagem de células ingênuo-revertido em condições de LIF-3i, que elimina a necessidade de escolher e subcloning de raras colônias estáveis, ou o uso rotineiro de anti-apoptotic moléculas ou inibidores de Rho-associada a proteína quinase (ROCK).

O método de LIF-3i tem sido empregado com sucesso estàvel expandir e manter um amplo repertório de > 30 linhas independentes, geneticamente diversa hPSC convencional para > passagens de 10 a 30 usando qualquer um dos métodos enzimáticos ou não enzimáticos dissociação, e sem evidência de indução de cromossômica ou anormalidades epigenomic, incluindo anormalidades em loci imprinted gene. Além disso, sequencial cultura LIF-5i/LIF-3i é o ingênuo única reversão método que até agora tem sido relatado que melhora a pluripotência funcional de um amplo repertório de linhas convencionais hPSC, diminuindo sua expressão de gene linhagem-preparado e melhorar drasticamente a sua potência de diferenciação multipotentes. O LIF-3i ingênuo reversão método supressão inerente interline variabilidade de diferenciação das linhas hPSC linhagem-aprontadas, convencional e terá uma grande utilidade de aplicação na medicina regenerativa e terapias celulares.

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Protocol

Todos os animais procedimentos foram realizados em conformidade com as orientações de cuidados com animais e protocolos aprovados pela Johns Hopkins School de medicina Instituto do Comité de uso (IACUC) de animais.

1. preparação de fibroblastos embrionários de Mouse (MEF) para dependentes do alimentador convencional (hESC médio/MEF) ou ingênuo-revertida (LIF-3i médio/MEF) hPSC cultura

  1. Comprar ou preparar suprimentos de baixo-passagem internos dos alimentadores MEF da CF1 ou CF1 x embriões do rato E13.5 do híbrido DR4 seguindo protocolos publicados4.
    1. Cryopreserve culturas MEF baixa passagem (p1-p2) pre-(para armazenamento a longo prazo) ou pós-irradiação (por até 6 meses) e armazenamento em nitrogênio líquido conforme descreveram anteriormente4.
    2. A irradiação (5.000 rad) MEF expandida sob p5 usando um γ - ou X-ray-difusora a granel e preparar alíquotas de 1,5 x 106 células por frasco para armazenamento de curto prazo (menos de 6 meses) a-80 ° C em um freezer de ultra baixa temperatura.
    3. Placa entre 1,2 x 106 (recém irradiados não-criopreservadas) e 1,5 x 106 (irradiados criopreservadas) MEF por um 6-gelatinizada placa para a preparação de culturas do alimentador, conforme descrito abaixo.
  2. Prepare a gelatina-revestido estéril 6-poços placas de cultura de tecidos tratados pela adição de 1,5 mL de solução estéril de gelatina de 0,1% a cada poço em uma câmara de segurança biológica.
  3. Incubar as placas com revestimento em gelatina a 37 ° C, durante pelo menos 1 h ou durante a noite numa incubadora de CO2 de laboratório.
  4. No dia seguinte, descongele baixa passagem (e.g., P2 para P4) DMSO-criopreservado e irradiada (5.000 rad) MEF, de acordo com os passos indicados abaixo.
    Nota: Não irradiados MEF deve também ser descongelado, expandido e irradiado imediatamente antes do uso.
  5. Coloque uma alíquota MEF criopreservada em banho maria a 37 ° C. Após o descongelamento, esterilizar o tubo com etanol e imediatamente diluir o crioprotetor DMSO pelo menos 10 vezes, com média MEF (tabela 1) dentro de uma armário de biossegurança (por exemplo, transferência 1ml DMSO-MEF alíquota em 9 mL de meio de MEF em uma estéril 15 mL cônica).
  6. Centrifugar as células MEF diluídas em 200 x g durante 5 min em tubos cónicos estéril 15 mL.
  7. Em uma armário de biossegurança, aspirar e desprezar o sobrenadante sem célula e resuspenda o pellet celular em 1 a 2 mL de meio de MEF fresco.
  8. Delicadamente, descartar a solução de gelatina e adicione 2 mL do MEF re-suspendido no meio de MEF para cada poço de uma placa de 6 efeitos colaterais, como indicado acima. Células de contagem MEF e placa 1,2 x 106 (recém irradiados não-criopreservadas) ou 1,5 x 106 (irradiados criopreservadas) MEF por uma placa gelatinizada 6.
    Nota: Todas as placas de cultura de células que são transferidas da incubadora de CO2 para a biossegurança do armário podem ser limpadas cuidadosamente com papel de etanol-pulverizado, mas não devem ser diretamente pulverizadas sobre com solução de etanol 70% para evitar a disseminação de etanol em poços.
  9. Incube as placas MEF a 37 ° C durante a noite em uma incubadora de laboratório CO2 (5% de CO2, ambiente úmido) para permitir que a penhora, antes de utilizar.

2. estabilização das culturas hPSC convencional para posterior reversão ingênua com uma etapa de adaptação breve LIF-5i a granel

  1. Valide todas as linhas convencionais hPSC por possuir um cariótipo normal por G-borda, antes da reversão de início LIF-5i/LIF-3i.
    Nota: Reversão de LIF-3i das linhas de alta-passagem convencional hPSC (EG., P > 40-50) deve ser evitado, uma vez que estas culturas já podem abrigar aberrações genômicas que podem afetar negativamente estável, eficiente e granel LIF-3i reversão do preparado, convetional hPSC linhas.
  2. Manter e expandir culturas hPSC convencional com cariótipos normais validados em um sistema de cultura baseado no MEF (conforme descrito na seção 1), ou um sistema de cultura livre de alimentador (de acordo com preferência do investigador).
    Nota: Cocultures de hPSC/MEF ambos alimentador-dependente (por exemplo, hESC suplementado (tabela 1) com 4 a 10 ng/mL bFGF) ou alimentador-livre (EG., E8 mídia 6 5 ou mTSER (de acordo com as instruções do fabricante na métodos de placas revestidas vitronectina) são compatíveis com reversão de ingênuo em massa usando o sistema LIF-5i/LIF-3i/MEF (Figura 1). Métodos não-enzimáticos são preferidos para a passagem de convencional hPSC antes de prepará-los para reversão. LIF-5i e LIF-3i formulações de mídia não contém antibióticos ou agentes antifúngicos. Regras de operação padrão para a esterilidade do armário de biossegurança e manutenção deverão ser rigorosamente observados para evitar qualquer contaminação bacteriana ou fúngica.
  3. O MEF-com base em sistema de cultura, prepare alimentadores MEF na placa de 6 efeitos colaterais conforme descrito na seção 1 pelo menos um dia antes da passagem das culturas hPSC convencional LIF-5i-adaptado.
  4. Depois de culturas convencionais hPSC chegaram a confluência de ~ 50% (ou seja, 3-5 dias após o chapeamento inicial), substituir o meio de cultura padrão hESC com LIF-5i médio (2 mL por bem; A tabela 1).
    Nota: Execute estas etapas em uma armário de biossegurança.
  5. Cultura e manter hPSC/MEF convencional por até 2 dias no LIF-5i a incubadora de CO2 (5% de CO2, ambiente úmido). Altere o meio de LIF-5i diariamente para adaptá-los para sua passagem subsequente e reversão estável no LIF-3i.
  6. Como alternativa, para as culturas convencionais alimentador-livre (por exemplo, em E8), cultura hPSC no LIF-5i apenas durante a noite antes de passagem na manhã seguinte.
    Nota: Culturas LIF-5i e LIF-3i podem tanto ser mantidas com atmosférico (21% O2) ou fisiológica (5% O2) oxigênio níveis a incubadora de CO2 (5% de CO2, ambiente úmido).
  7. Antes da passagem, colocar as placas de cultura em um gabinete de segurança biológica, lavar LIF-5i-adaptado hPSC convencional uma vez com PBS e adicionar 1 mL do reagente de dissociação de célula para cada poço. Incubar durante 5 min a 37 ° C numa incubadora de CO2 e triture levemente com uma pipeta em uma suspensão de célula única no armário a biossegurança.
    Nota: Não enzimáticos buffers de dissociação alternativamente podem ser utilizados para a preparação de células únicas para passagem.
  8. Recolher a suspensão de células em meio de hESC (pelo menos 2 vezes diluição) em um tubos cónicos estéril 15 mL e triture suavemente células pipetando para obter uma suspensão de célula única.
  9. Centrifugar a 300 x g por 5 min, aspirado/descartar o sobrenadante e ressuspender o celular em 1 a 2 mL do meio de LIF-5i no armário a biossegurança. Conte as células usando um hemocytometer ou um contador automático de células.
  10. Lavar a placa MEF pre-chapeada duas vezes com PBS (2 mL por bem em placas de 6-poços) e distribuir 1 – 2 x 106 células (em média 2 mL LIF-5i) para 1 bem da placa MEF PBS-lavado.
  11. Ajustar e otimizar o chapeamento inicial densidades para cada linha de hPSC individual ser ingênuo-revertido, replating eficiências pode ser altamente variável. Coloca a placa numa incubadora de CO2 (5% de CO2, ambiente úmido).
    Nota: O uso rotineiro de reagentes anti-apoptotic não é recomendado para a maioria das linhas hPSC com este método. O sistema de LIF-5i já significativamente melhora eficiências de re-chapeamento clonal em massa inicial do hPSC convencional linhas. No entanto, uma única utilização de inibidor ROCK (5 – 10 μM Y-27632) podem melhorar ainda mais a inicial LIF-5i clonal eficiência re-chapeamento de culturas convencionais hPSC na primeira passagem para algumas linhas instável hPSC linhagem-preparado com a propensão para espontânea diferenciação.
  12. Se a partir do alimentador-livre (por exemplo, E8), culturas diretamente transferir um bem do dissociada hPSC convencional adaptado no LIF-5i em um irradiados bem MEF-chapeado (ou seja, passagem de 1:1).
  13. No dia seguinte, agite suavemente a placa para levantar todas as células não-inscritos, Aspire o meio (lavagem PBS é opcional) e substitua por 2 mL do meio de LIF-5i. Execute esta etapa em uma armário diariamente por 3 – 5 dias ou até que as células são confluente de 60-70% (Figura 1) de biossegurança. Coloca a placa numa incubadora de CO2 (5% de CO2, ambiente úmido).

3. a longo prazo manutenção e expansão de N-hPSC LIF-3i médio

  1. Após a adaptação inicial LIF-5i, passagem estável subsequentes LIF-3i culturas a cada 3-4 dias em uma armário de biossegurança, ou quando as culturas se tornam confluente de 60-70% (Figura 1).
    Nota: LIF-3i culturas exigem manutenção rigorosa e permitindo N-hPSC culturas alcançar a densidade alta confluência/célula de cultura prolongada (ex., > 4 dias) diminui a eficiência de re-chapeamento clonal subsequente e promove espontânea diferenciação.
  2. Em uma armário de biossegurança, descarte o meio de cultura e lavar cada um bem das culturas de LIF-5i/LIF-3i, suavemente, adicionando 2 mL de PBS. Descartar o PBS e adicionar 1 mL de solução de desprendimento de células. Incube durante 5 min a 37 ° C numa incubadora de CO2 (5% de CO2, ambiente úmido).
  3. Recolher a suspensão de células, adicionar hESC médio (sem inibidores ou fatores de crescimento (tabela 1); pelo menos 2 vezes diluição) para recuperar todos os hPSC e triture suavemente células pipetando para obter uma suspensão de célula única. Transferi a suspensão para um tubo cônico estéril 15 mL.
  4. Centrifugar a 300 g por 5 min e aspirado/descartar o sobrenadante. Ressuspender o centrifugado no meio de LIF-3i. Conte as células usando um hemocytometer ou um contador automático de células.
  5. Placa ~ 2 x 105 células por poço sobre o MEF irradiado na placa de 6 gelatinizado para passagem de rotina das culturas LIF-3i. Para as culturas de LIF-5i-adaptado iniciais, placa uma inicialmente maior densidade (4 x 105 células/poço) antes da primeira passagem em LIF-3i/MEF.
  6. Re-plate e distribuir hPSC LIF-5i-adaptado em fresco PBS-lavado irradiados MEF alimentador placas (preparado no dia anterior como acima) no meio de LIF-3i. Substitua o meio de LIF-3i diariamente.
  7. N-hPSC de passagem para menos em massa contínua de 4 – 7 passagens no LIF-3i médio antes do uso de N-hPSC em estudos funcionais ou criopreservação. Registrar o número de passagens de N-hPSC em qualquer convencional ou mídia LIF-3i.
    Nota: Reversão de LIF-3i alta-passagem (por exemplo, > p40) linhas hPSC linhagem-aprontadas, convencional não é recomendada. Deve ser feito um esforço para reverter linhas hPSC convencional para a passagem mais baixo possível que eles estão disponíveis. Além disso, o uso do hPSC LIF-3i-revertido que sofreram maior que 10 passagens LIF-3i não é recomendado para estudos funcionais, desde que tais culturas N-hPSC podem abrigar anormal dos clones devido à seleção de cultura celular clonal prolongada. Reversões de LIF-5i/LIF-3i frescos das linhas de baixo-passagem convencional hPSC devem ser conduzidas para estudos funcionais, se as existências de N-hPSC com < 10 passagens no LIF-3i não estão disponíveis.

4. criopreservação e descongelamento de LIF-3i-revertido N-hPSC

  1. Expanda o N-hPSC revertido para passagens de pelo menos 5-7 em LIF-3i, como indicado acima, antes da sua utilização em estudos funcionais ou criopreservação a longo prazo. Registre o número de passagens em condições convencionais e em condições de LIF-3i em cada frasco criopreservado.
    Nota: Excesso LIF-3i-revertido N-hPSC não utilizado em ensaios funcionais pode ser criopreservado em cada passagem, mas o congelamento das passagens de pós reversão menores (ex.., < p3) pode resultar em pobres, ou eficiência de recuperação pós-degelo altamente variáveis.
  2. Em uma armário de biossegurança, Aspire o meio de cultura, lavar as células em PBS (2 mL por bem), PBS, Aspire e dissociar hPSC colônias em células únicas usando solução de desprendimento de célula (1 mL por bem). Coloque a placa por 5 min a 37 ° C numa incubadora de CO2 (5% de CO2, ambiente úmido). Diluir a solução de desprendimento de célula com o meio de LIF-3i (2 dobras), recolher hPSC em uma estéril 15ml cónico, centrifugue células a 200 x g por 5 min e resuspenda o pellet de células num meio de LIF-3i (1 a 2 mL por bem-equivalente). Conte o número de células usando um hemocytometer ou um contador automático de células.
  3. N-hPSC de centrifugação a LIF-3i médio (200 x g por 5 min) e ressuspender as células em um gabinete de biossegurança na solução de congelação (tabela 2), com uma densidade de pelo menos 1 x 106 células/mL.
  4. Células de transferência para os tubos criogênicos de armazenamento a longo prazo e coloque em um recipiente de congelamento lento. Permitir que as amostras congelar durante a noite em um freezer-80 ° C.
  5. No dia seguinte, transferi o cryovials em um congelador de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
  6. Para descongelar, coloque o frasco congelado em um banho de água de 37 ° C ~ 2 min.. esterilize o frasco (ou seja, spray de etanol), transferir hPSC em uma estéril 15ml cónico e diluir lentamente o meio de 10 vezes hESC em células (tabela 1) suplementado com 5 μM de Rho-associada a proteína quinase (ROCK) inibidor da Y-27632 dentro de uma capa de segurança biológica estéril do armário.
  7. Centrifugar a 200 x g por 5 min. Em uma armário de biossegurança, descartar o sobrenadante sem célula e resuspenda o pellet de células em meio de LIF-3i (1-2 mL) suplementado com inibidor ROCK 5 μM Y-27632.
    Nota: A exclusão de Y-27632 irá resultar em eficiências de recuperação pós-descongelamento pobre (Figura 2).
  8. Transferi as células descongeladas resuspended no LIF-3i/ROCK inibidor para os poços de MEF-chapeado PBS-lavado. Cryopreserve LIF-3i culturas em uma densidade de 1 x 106 células por frasco. Descongele a cada um destes frascos de alimentadores em um poço de uma placa de 6 efeitos colaterais.
  9. No dia seguinte, começa a regular LIF-3i expansão médio sem inibidor de quinase de Rho.

5. alimentador remoção para a coleta de amostras de N-hPSC

  1. Para preparar as culturas de amostras de LIF-3i/MEF (ou hESC/MEF convencional) (ou seja, para a expressão do gene (por exemplo, RT-PCR quantitativo, microarrays) ou análises de proteínas (por exemplo, borrão ocidental), empobrecem LIF-3i culturas de alimentadores MEF usando Magnético ativado celular classificação (MACS) com anticorpo anti-TRA-1-81 revestido microbeads de acordo com o protocolo do fabricante.
  2. Como alternativa, utilize o seguinte método de pre-chapeamento simples para esgotar as culturas dos alimentadores, conforme descrito abaixo.
  3. Em uma capa de segurança biológica estéril do armário, desprezar o sobrenadante sem célula, lave a pelota com 2 mL de PBS estéril por bem. Desanexe aderentes LIF-3i/MEF as culturas usando solução de desprendimento de célula (1 mL/poço). Incube durante 5 min numa incubadora de CO2 (5% de CO2, ambiente úmido). Recolha o hPSC em uma estéril 15ml cónico. Lavar 2 vezes em hESC médio, células de transferência para o estéril 15ml cónico e centrifugar 200 x g por 5 min.
  4. Em uma armário de biossegurança, Ressuspender cada poço de células LIF-3i/MEF dissociado em 2 mL do meio de LIF-3i e transferir diretamente para um novo poço de uma placa de 6 que foi recentemente revestida com 0.1% de gelatina.
  5. Incube as pilhas do hPSC LIF-3i/MEF para 1 h a 37 ° C numa incubadora de CO2 (5% de CO2, ambiente úmido). Colete as células não-aderentes com uma pipeta em um novo tubo cónico. Delicadamente, adicione 2 mL do meio de hESC a cada poço e redemoinho para coletar as restantes células não-aderentes.
    Nota: A maioria do MEF irradiado irá anexar a placa gelatinizado em 1 h, deixando a maioria do hPSC em suspensão.
  6. Combinar e centrifugar as células a 300 x g durante 5 min. lavagem em PBS. Snap-congelar o centrifugado em nitrogênio líquido após a centrifugação, ou alternativamente, re-suspender pelotas em um lysing buffer que é compatível com a análise a jusante de proteínas ou ácidos nucleicos (Figura 2B).
  7. Realize caracterizações de LIF-3i hPSC linhas com um controle convencional aprontada isogénicas hPSC correspondente.
    Nota: Devido à variabilidade intrínseca entre e dentro de culturas aprontadas, controles relevantes são preparados em um Commit correspondente na cultura ou antes da reversão de ingênuo. Protocolos detalhados e materiais para jusante bioimaging imunofluorescência, flow cytometry mancha ocidental, expressão gênica (microarrays e ensaios de RT-PCR), estudos de metilação (borrão de ponto, CpG metilação microarray), potenciador de OCT4 proximal e distal ensaios de repórter de predominância e sinalização inibidor de ensaios são fornecidos em outro lugar3.

6. pós reversão ingênua: validação de integridade genômica e de retenção de impressões Parental de LIF-3i-revertido N-hPSC antes da sua utilização em ensaios funcionais

  1. Tela as culturas convencionais, aprontada hPSC partida pela posse de um cariótipo normal (por exemplo, com análise de coloração de Giemsa-banda usando métodos publicados 7) antes de iniciar a reversão LIF-5i/LIF-3i.
    Nota: Este é para eliminar as populações hPSC convencionais que podem abrigar alterações genômicas anormais que podem conduzir a vantagem artefactual seletiva de sobrevivência em condições de LIF-3i clonais.
  2. Para obter melhores resultados, recentemente reverter convencional hPSC culturas para um estado de ingenuidade com LIF-3i várias semanas antes de sua utilização em estudos funcionais ou dirigido a diferenciação.
    Nota: Rotina prolongada cultura 'manutenção' em condições de LIF-3i para mais de 10 passagens seguintes ingênuo de reversão não é recomendado. Expansão de rotina e manutenção das linhas hESC e hiPSC devem ser realizadas utilizando sistemas de cultura convencional (por exemplo, em E8, ou MEF/hESC médio com bFGF).
  3. Avaliar linhas de N-hPSC pós-revertidas para a retenção do normal karyotypes 5 – 7 passagens após reversão de LIF-3i (EG., com de análise coloração Giemsa-banda7, ou qualquer outro método de escolha).
  4. Avaliar todas as linhas de N-hPSC revertidas para retenção de impressões de genómicas parentais normais através de uma análise de metilação do DNA de escolha (por exemplo, protocolos para análise de microarray de DNA de CpG de impressões parentais nos LIF-3i-revertido N-hPSC são fornecidos em outro lugar3 ) após 5 – 10 passagens de reversão de LIF-3i.

7. post ingênuo reversão: Delineamento Experimental diretrizes para ensaios quantitativos diferenciação dirigido usando LIF-3i-revertido N-hPSC

  1. Utilize diretamente o LIF-3i N-hPSC em protocolos de diferenciação dirigida estabelecidos sem manipulações de cultura de células adicionais.
    Nota: Re-escorvamento (i.e., conversão de N-hPSC volta para condições aprontadas convencionais antes da sua utilização em ensaios de diferenciação dirigido) não é necessário com o método de LIF-3i e não é recomendado.
  2. Para controlar para os impactos do ensaio e interline variabilidade no teste funcional de linhas individuais hPSC, Cruz-validar as potências de diferenciação da linhagem-específicos empregando protocolos de diferenciação independente pelo menos três hPSC linhas derivado de origens genéticas independentes (ou seja, vários doadores-derivado hiPSC e hESC).
  3. Para comparações funcionais, configure irmão culturas, em número equivalente de passagem e da mesma linha hPSC (isogénicas) em paralelo com a linhagem-preparado convencional e culturas hPSC LIF-3i-revertida. Manter as culturas hPSC isogénicas de aprontado/ingênuo irmão em seus respectivos meios (por exemplo., E8 vs. LIF-3i) e simultaneamente diferenciar usando protocolos idênticos diferenciação e materiais, para eliminar qualquer viés experimental (Figura 4).
  4. Para isogénicas aprontado vs ingênuo hPSC comparações, ajustar e otimizar o chapeamento inicial densidades para cada ensaio de diferenciação individual.
    Nota: Protocolos detalhados para progenitoras neurais, endoderme definitivo e hemato-endotelial diferenciação dirigida de LIF-3i-revertido N-hPSC são fornecidos em outro lugar 3. LIF-3i-revertido N-hPSC têm mais robusta capacidade proliferativa e diferenciação nos ensaios de diferenciação dirigido do que hPSC convencional. N-hPSC, normalmente, requer uma concentração de chapeamento inicial menor do que o convencional hPSC, e ao contrário de seu hPSC aprontada convencional homólogos, não requer o uso de anti-apoptotic reagentes para melhorar sua sobrevivência clonal seguindo enzimática digestão em ensaios de diferenciação.

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Representative Results

Este protocolo otimiza a reversão de ingênuo, como eficiente com LIF-3i em ambas as culturas do alimentador-dependente e independente de alimentador linhagem-aprontadas convencional hPSC (Figura 1). O protocolo detalhado, descritos, adaptação sequencial de contornos LIF-3i, a partir de qualquer condições hPSC dependente de alimentador ou alimentador-free convencionais (por exemplo, E8 médio).

Representante de resultados para a reversão de LIF-3i de vários hESC convencional e transgene-free hiPSC linhas são apresentadas nas figuras 1 a 3. Estes resultados típicos podem ser validados com a linha disponível comercialmente hESC H9, ou com um disponível comercialmente livre de transgene, cordão hemoderivados epissomal hiPSC linha (6.2) derivada do Zambidis laboratório8,9. Introdução de uma etapa inicial de adaptação LIF-5i permita altamente eficiente propagação clonal subsequente, maioria das culturas convencionais hPSC no LIF-3i e não requer agentes anti-apoptotic ou ROCK inibidores10 (Figura 1A, B ). Várias placas de hPSC ingênuos, como podem ser rapidamente coletadas amostras para análises a jusante ou multilineage dirigido diferenciação somente após 5-7 passagens no LIF-3i. Alternativamente, LIF-3i culturas podem ser criopreservadas para aplicações futuras. Pós-descongelamento recuperação da célula pode ser melhorado (Figura 2) através da inclusão de um inibidor ROCK na mídia de criopreservação e pós-descongelamento11.

Os determinantes de pluripotência molecular e funcional, tanto em vitro e no embrião foram recentemente revistos2. Esses fatores incluem o fundo genético, aquisição de cultura associada de mutações de genes de desenvolvimento chaves e diferenças em hESC e derivação de hiPSC e metodologias de cultura. Fornecidas abaixo está um resumo dos ensaios padrão que podem ser empregados para caracterização e validação da fenotípica, molecular e funcional pluripotencies do hPSC LIF-3i-revertida.

Morfologia de colônia
A transição entre os sistemas de cultura aprontado, convencionais e LIF-3i-revertido é acompanhada por mudanças físicas distintas na morfologia de colônia do hPSC (Figura 1B). HPSC convencionais células proliferam como plana, colônias de monocamada ampla que expandir-se rapidamente de aglomerados de pequenas células (na MEF ou condições alimentador-livre), mas mal como células únicas. Exposição de linhas convencionais hPSC LIF-3i promove o crescimento e expansão e de menores, hermeticamente embalados, colônias em forma de cúpula que decorrem de uma relação clonal único células. Estas mudanças morfológicas são completamente reversíveis, e LIF-3i-revertido colônias em forma de cúpula podem espontaneamente a transição volta para uma morfologia convencionais monocamada se LIF-3i é retirado e as células são re-cultivadas médio padrão hESC convencional suplementado com bFGF. Além disso, expansão de células LIF-3i-revertido em altas densidades confluentes (ou cultura prolongada sem passagem frequente) resulta na reaquisição espontânea da morfologia plana, convencional, com redução da eficiência clonal; enfatizando a necessidade de diligente manutenção e cuidados hPSC LIF-3i-revertido (EG., < confluência de 40 – 60%).

Viver a mancha da imunofluorescência e fluxo cytometric análise de marcadores de superfície pluripotência
Avaliação de marcadores de pluripotência durante a transição do convencional para um estado de ingênuo contínua seguir LIF-3i cultura pode ser monitorado não invasiva usando anticorpo ao vivo manchando sem detectar quaisquer efeitos negativos no LIF-3i/MEF expansão ( ex., viver-coloração anticorpos conjugados a fluorocromo contra TRA-1-81, TRA-1-60 e SSEA4).

Retenção de pluripotência durante reversão LIF-3i também pode ser monitorizada rotineiramente por análise de fluxo cytometric de expressão associada a pluripotência marcador de superfície de TRA-1 e antígenos SSEA durante uma única célula de passagem (Figura 1C) ou imunofluorescência de intacto, fixo colônias em situ (Figura 3). Embora estes marcadores não discriminar entre convencional e LIF-3i Estados, seus níveis correlacionam inversamente com a frequência de diferenciação espontânea que pode ocorrer no hPSC ao fazer a transição do hPSC convencional para condições de LIF-3i. Antígenos de superfície adicionais que mais especificamente marca humana ingênua, como Estados em vitro2,12,13 de maio também podem ser empregados para detectar eficaz LIF-3i hPSC reversão.

Validação de pluripotência molecular do N-hPSC
Porque o fundo genético de linhas hPSC tem sido caracterizado como um forte contribuinte para a variabilidade de interline, é importante avaliar com rigor isogénicas culturas em momentos de cultura de correspondência ao comparar sistemas de cultura hPSC (Figura 4). Uma vez que alguns desses sistemas já foram mostrados para gerar hPSC populações com configurações de genômica e epigenéticas aberrante2, qualquer método de reversão ingênuo deve ser analisado com um número de N-hPSC de origens genéticas independentes, de forma Isso é suficiente para validar a reprodutibilidade biológica e excluir Estados relevantes não-desenvolvente "pseudo-pluripotentes" (ou seja, com características aparentes de pluripotência molecular, mas faltam habilidades de diferenciação funcional). Zimmerlin et al. alargado a validação do sistema de cultura de LIF-3i para incluir a pluripotencies molecular e funcional de revertido N-hiPSC derivado de vários métodos de reprogramação, que é outro conhecido contribuinte putativo de variabilidade funcional de análise do entre pluripotentes afirma2.

Nesse sentido, a maioria dos estudos dos sistemas de cultura humana ingênua centraram-se na análise do pluripotência molecular do N-hPSC em 1) o nível epigenético (por exemplo, histona marcas por sequenciamento de ChIP ou ChIP-PCR, metilação de DNA global por immunoblots ou toda genômica sequenciamento de bissulfito, alelo-específico CpG metilação microarrays, OCT4 potenciador predominante a utilização de sistemas de repórter, atividade global em elementos reguladores por DNAse eu hipersensibilidade e repetição do elemento de criação de perfil por sequenciação do ARN), 2) transcriptomic nível (RNA-sequenciamento, expressão microarrays e RT-PCR quantitativo), análise de expressão de proteínas (ex., FACS, microscopia de imunofluorescência e mancha ocidental) e 3) através de estudos metabólicos (por exemplo, glicólise, oxidativo metabolismo de fosforilação e nicotinamida). Exemplos representativos de manchas de imunofluorescência e Western blot detecção de expressão para chaves marcadores de pluripotência molecular são mostrados (Figura 3B, C). Por exemplo, mostrado na Figura 3B são registrado fosforilado (phospho) e totais isoformas de STAT3 e ERK1/2, que são características moleculares chaves de rato ESC-como ingênua pluripotência. Estas foram detectadas usando anticorpos primários anti-STAT3 e anti-ERK1/2. Além disso, funcional pluripotência em ensaios de diferenciação de teratoma é demonstrada no convencional vs. LIF-3i-revertido hPSC teratoma tecidos dissecados 10 semanas depois da injeção e fixada em formol 4% e parafina incorporado (Figura 3D).

Preparação de LIF-3i/MEF ou hESC/MEF/bFGF amostras para análise molecular a jusante deve incluir a depleção do MEF. Duas abordagens são descritas acima para esgotamento de MEF que têm sido empregadas com sucesso em nosso laboratório. Pré-chapeamento MEF é um simples, confiável, e custo-eficiente método para eliminar alimentadores de N-hPSC amostras para estudos moleculares e é uma alternativa preferencial para FACS ou MACS separação (ou seja, anti-TRA-1-81 ou anti-TRA-1-60 baseados em anticorpos ). Além disso, espontaneamente-diferenciando as células aderentes TRA-1-negativo em culturas de LIF-5i/LIF-3i podem ser rapidamente eliminadas da LIF-5i/LIF-3i N-hPSC culturas antes da passagem de LIF-3i subsequente no MEF fresco por pré-chapeamento digerido enzimaticamente células únicas por 1h em placas pré-revestido com 0.1% de gelatina (Figura 2).

Avaliação de pluripotência funcional de N-hPSC
O ensaio mais rigoroso de pluripotência funcional do PSC é o ensaio de Quimera de injeção de blastocisto, que é limitado no teste da N-hPSC linhas por razões éticas. Como alternativa, vários grupos que relataram a geração de N-hPSC com vários outros métodos têm tentado gerar interespécies quimeras. No entanto, estas tentativas produziram uma contribuição extremamente baixa ou mal sucedida de linhagens de N-hPSC diferenciadas aos embriões de suínos ou murino, em comparação com a capacidade de gerar Quimera de mouse padrão ESC2.

Estudos funcionais adicionais têm investigado dirigido em vitro diferenciação de putativo N-hPSC derivada através de vários métodos, mas revelaram capacidade de diferenciação de multilineage tendenciosa, defeituoso ou diminuída, com concomitante abrigando de anormalidades epigenéticas2,13. Semelhantes aberrações epigenomic, especialmente em loci impressa, foram detectadas no mouse ESC após a exposição prolongada a LIF-2i cocktail14. Curiosamente, alguns sistemas de cultura de reversão relataram melhorias globais em atributos específicos de pluripotência funcional da PSC, tais como a capacidade melhorada para contribuição na vivo trofectoderma2,15 .

Usando uma ampla coleção de derivado de forma independente hPSC LIF-3i-revertido, Zimmerlin et al empregado multilineage diferenciação ensaios para mostrar que o sistema de LIF-3i melhora drasticamente a pluripotência funcional das linhas convencionais hPSC 3. isto permite a análise sistemática de convencionais vs LIF-3i hPSC linhas em pares isogénicas para eliminar variações interline-dependente (Figura 4). LIF-3i-revertido hPSC linhas não requerem uma etapa re-escorvamento antes da diferenciação de EB. No entanto, LIF-3i hPSC proliferar a preços significativamente maior clonal que células isogénicas expandido em E8, e assim, inicial baixas densidades de chapeamento requerem ajuste para permitir que cada cultura alcançar a confluência em um Commit semelhante.

Os investigadores rotineiramente devem utilizar vários ensaios para demonstrar a funcionalidade aprimorada de LIF-3i-revertido hPSC que inclui não só na vivo teratoma ensaios, mas também em vitro dirigido ensaios de diferenciação para neural, definitivo endoderme e hematovascular linhagens3 usando vários ensaios (por exemplo, 2D APEL3,16 e sistemas de17,18 do corpo do embryoid 3D). Para controlar para reprodutibilidade do ensaio-dependente, pelo menos dois métodos diferentes de diferenciação devem ser realizados em replicar para cada par isogénicas de culturas hPSC aprontado/LIF-3i (por exemplo, a Figura 4, APEL, do embryoid corpo protocolos de diferenciação). O delineamento experimental deve incluir um número robusto (p. ex., > 3 – 5) aprontado/LIF-3i pares isogénicas de hPSC linhas origens múltiplas, independente dos doadores genéticos (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Uma gradual transição das culturas hPSC convencional, linhagem-preparado para condições de ingênuo, como com o método de LIF-3i. (A) esquema de protocolos para reversão gradual do LIF-3i. (Top esquemático) Um método geral para a transição de ferrado, hPSC convencional para culturas LIF-3i. (Esquemas de fundo) Duas estratégias resumidas para reversão de ingênuo LIF-3i do convencional (preparado) hPSC cultivada no alimentador (i.e., Primed/MEF para LIF-3i/MEF), ou livre de alimentador de condições (ou seja, Primed/E8 a LIF-3i/MEF). (B) morfologias de PSC humana. São mostrados fotomicrografias representativas do hPSC durante reversão LIF-3i, usando uma linha de iPSC epissomal humano disponível comercialmente (6.2). Mostradas são as transições observadas entre colônias iniciais convencionais monocamada plana, e as colônias clonogenic subsequentes em forma de cúpula que surgem após passagem no LIF-5i intermédios e condições estáveis de cultura LIF-3i. Escala de barras = 200 µm. (C) representativo fluxo cytometric análises de marcadores de superfície de pluripotência. São mostrados TRA-1-81 e SSEA-4 superfície expressões em linha convencional hPSC 6.2 (p40) expandidas em E8, a passagem inicial no LIF-5i/MEF e passagens seguintes de 1 a 9 (P1-P9) em condições de LIF-3i. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Criopreservação de N-hPSC e preparação da amostra por pre-chapeamento MEF. (A) exemplo de um ciclo de congelamento/descongelamento das culturas LIF-3i/MEF. A linha de derivados de sangue, não integrados, livre de transgene humano iPSC cabo convencional E5C3 foi derivado e ampliado em alimentadores MEF em hESC suplementado com bFGF 4ng/mL para 18 passagens. E5C3 convencional, linhagem-aprontadas foram adaptados de LIF-5i (à esquerda) e tornou-se meio de LIF-3i para 3 passagens (centro). As células E5C3 LIF-3i exibidas no painel do centro foram criopreservadas usando baseado em DMSO crioprotetoras médio (tabela 2; 1 x 106 células por frasco) e armazenados em nitrogênio líquido). Um frasco foi descongelado um mês mais tarde e E5C3 células foram transferidas em um alimentador-revestido bem de uma placa de 6 (à direita). Recuperação da célula pode ser reforçada, completando o meio de LIF-3i com 5 µM Y-27632 para post-degelo de apenas um dia. Escala de barras = 200 µm. (B) eliminação de MEF (e também células aderentes de TRA-negativo diferenciada) em culturas de hPSC LIF-3i/MEF pelo método pré-chapeamento. É mostrados fluxo cytometric análises antes e depois do Pré-chapeamento de PE-conjugado anti-TRA-1-81 e anticorpos TRA-1-60, anticorpos conjugados a APC SSEA-4 e anticorpos SSEA-1/CD15, demonstrando o esgotamento dos TRA-1 antígeno negativo e células MEF usando o método de pre-chapeamento de uma hora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Caracterização de pluripotência em culturas de LIF-3i/MEF N-hPSC. (A) marcadores de superfície e nuclear pluripotência. Expressão do fator de pluripotência NANOG no mesmo (isogénicas) TRA-1-81+SSEA4+ convencional, aprontado cabo hemoderivados hiPSC linha E5C3 (p39) expandiu em aprontada (E8) ou em condições de LIF-3i (+ p8 no LIF-3i/MEF) ingênuo. Imunofluorescência manchas de culturas hPSC representativa em slides câmara revelaram a expressão uniforme, nuclear do fator pluripotência núcleo NANOG em SSEA-4+TRA-1-81+ hPSC cultivada no preparado, convencionais (E8 médio) ou LIF-3i/MEF condições. Barra de escala = 100 µm. (B) ocidental do borrão análise. Stat3 (à esquerda), ERK (centro) e expressão de proteínas beta-ACTINA controle para uma representante hPSC (linha hESC H9) em condições de LIF-3i/MEF (3i) ou convencional (E8 médio). (C) expressão ingênua pluripotência-associado de factores de transcrição. São mostrados STELLA/DPPA3, NR5A2 e TFCP2L1 por imunofluorescência em uma cultura representativa de LIF-3i/MEF (cordão hemoderivados hiPSC linha E5C3 no p33 (hESC/MEF) + p8 (LIF-3i/MEF). Barra de escala = 100 µm. Teratoma (D) os ensaios de hPSC convencional e LIF-3i-revertida. Validação de pluripotência funcional em uma linha de hiPSC representante isogénicas (E32C6 derivados de sangue de cordão) cultivados em qualquer E8 (p9) ou LIF-3i/MEF (+ p12), por meio de ensaio de teratoma. 10 x 106 células de isogénicas vs convencional, aprontada paralelo-cultivadas LIF-3i-revertido hPSC foram injetadas por via subcutânea dos membros de ratos NSG imunodeficientes. Hematoxilina e eosina manchas de teratoma microsections revelaram robusta diferenciação em todas as três camadas germinativas com ectoderme bem estruturado (Roseta neural: NR, epitheliam pigmentada da retina: RPE), mesoderma (condroblastos: Ch) e a endoderme (glandular tecido: GI) linhagens. Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Comparação de pluripotência funcional entre Estados isogénicas de aprontado e ingênuo. (A) esquemático da estratégia para a avaliação funcional pluripotência de Estados distintos pluripotentes isogénicas convencional vs hPSC LIF-3i cultivadas em protocolos de diferenciação independente. São mostradas duas progenitoras hemato-vascular diferenciação sistemas (monocamada APEL e sistemas do corpo do embryoid 3D (EB)) que anteriormente foram empregados para avaliar a potência de diferenciação de convencional vs LIF-3i-revertido na mesma linha (isogénicas) hPSC cultivadas em paralelo post LIF-3i reversão com mesmos números de passagem. LIF-3i-revertido hPSC linhas não requerem uma etapa re-escorvamento antes da diferenciação do EB e são submetidas a protocolo de diferenciação diretamente. Sistema de diferenciação vascular progenitor (VP) EB (B) . O sistema de diferenciação 3D EB utilizado para este estudo foi descrito anteriormente17,18. Mostrados são os resultados representativos no dia 10 de diferenciação EB (painéis esquerdos) para culturas isogénicas do mesmo sangue do cordão umbilical (CB)-derivado E5C3 hPSC linha9, cultivadas em qualquer hESC convencional/MEF (Primed / MEF) condições ou LIF-3i/MEF ingênuo condições. Análise de citometria de fluxo dessas células EB mostram um aumento dramático de CD31+CD146+ VP populações após reversão de LIF-3i da linha E5C3 antes da diferenciação. O histograma exibe o ±SD média de CD31+CD146+ VP percentagens recuperadas no dia 10 neste sistema EB usando três pares isogénicas de linhas hPSC independentes (ou seja, dois CB-hiPSC e um adulto fibroblasto-derivado de células hiPSC, linhas pontilhadas conectar isogénicas pares). Resultados demonstraram melhora significativa da eficiência de diferenciação de VP no sistema EB em origens genéticas de várias linhas de hPSC. Sistema de diferenciação do progenitor vascular de monocamada APEL (C) . Convencionais (escorvado E8) e LIF-3i-revertido hPSC podem ser diretamente diferenciadas usando as mesmas condições de cultura, fatores de crescimento, citocinas e pequenas moléculas da gradual diferenciação endotelial APEL protocolo 3, 16. são mostrados experimentos de diferenciação APEL independentes usando a linha de derivados de sangue hiPSC de cabo E5C3 e a porcentagem de CD31+CD146+ populações de progenitor vascular no dia 7 de diferenciação de APEL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O sistema de LIF-3i aplica-se uma versão modificada do clássico 2i murino ingênuo reversão cocktail1 a células estaminais pluripotentes humanas. A auto-renovação do hPSC (que não pode expandir em 2i sozinho) é estabilizada no LIF-2i, completando este cocktail com o inibidor de tankyrase XAV939. LIF-3i cultura permite a granel e reversão eficiente do hPSC convencional para um estado de pluripotentes, lembrando o epiblasto pré-implantatório humano3. Embora os mecanismos de ação do XAV939 no hPSC são provável complexo e sinérgica com 2i, eles provavelmente incluem no mínimo, uma estabilização importante e aumento de auto-renovação hPSC via WNT, sinalização de caminhos3.

As culturas convencionais hPSC normalmente adotam um espectro de Estados de pluripotentes com expressões altamente variável gene linhagem-aprontadas e epiblasto pós-implantação marcas epigenéticas que podem resultar em inconsistente ou diminuição funcional pluripotência2 . Este escorva de linhagem inerente das culturas convencionais hPSC pode também interferir com a bem sucedida LIF-3i reversão de algumas linhas de hPSC2. No entanto, a inclusão da inicial LIF-5i adaptação etapa (tabela 1) o método de LIF-3i universalmente amplia a eficiência da reversão de LIF-3i, entre uma infinidade de linhas hPSC e promove a reversão de ingênuo em massa das linhas convencionais hPSC de forma que contorna o tedioso picking e subcloning de raras colônias ingênuo-revertido, ou a necessidade de utilização de moléculas de rotina anti-apoptotic para estabilizar a sua viabilidade.

O método de reversão de ingênuo LIF-5i/LIF-3i é reproduzível em uma ampla variedade de linhas hESC e hiPSC. Requer treinamento mínimo com habilidade de cultura de célula básica. Zimmerlin et al . empregado com sucesso essa estratégia sequencial para reverter > 30 hESC independente e livre de transgene hiPSC linhas de uma ampla gama de doadores 3. Uma única passagem no LIF-5i (Figura 1) é suficiente para a maioria das linhas hPSC sofrer reversão ingênuo eficiente em culturas de hPSC em massa e ainda mais antecipadamente a sua subsequente manutenção estável e expansão no LIF-3i sozinho.

Além disso, o sistema LIF-3i/MEF suporta eficiências de expansão clonal robusto em massa ao longo de todas as etapas entre cultura de linhagem-aprontadas hPSC convencional até a reversão concluído hPSC ingênuos, como (i. e., adaptação, transição e expansão de 7 – 10 passagens no LIF-3i/MEF sozinho). Embora a formulação actual deste sistema de cultura requer suporte alimentador, um método simples e acessível para esgotar alimentadores pela técnica de pré-chapeamento para análise de culturas de LIF-3i é apresentado (Figura 2).

Vários outra cultura sistemas também têm sido relatados para promover hPSC convencional para semelhante pluripotentes ingênuo, como afirma2. Embora estes sistemas de cultura hPSC também têm contado com a utilização das condições 2i ingênuo rato clássico, na maioria dos casos estes métodos de passaging de célula única também necessárias, modulação química adicional para estabilizar uma inerentemente instável / Estado metaestável ingenuidade humana. Importante, a maioria destes outros métodos demonstrado prejudicada pluripotência funcional após a diferenciação e/ou impressões adquirida epigenomic anormal ou cariótipos2. Embora o surgimento de cariótipos anormais dentro de culturas convencionais hPSC Escorvado já é bem documentado19, prolongada, enzimáticos célula única passagem métodos que são empregados rotineiramente na maioria dos métodos de reversão de ingênuo. Isso também foi mostrado para potencializar a geração de configurações cromossômica anormal20,21; técnicas mais sensíveis (por exemplo, copiar números variações, polimorfismo de nucleotídeo único) podem revelar alterações adicionais22,23.

Em contraste, um amplo repertório de LIF-3i-revertido hPSC linhas foram confirmados possuir cariótipos normais em passagens de baixa e média (por exemplo, p5-p15) e também em números de passagem alta (ex., > p30) LIF-3i cultura3a seguir. Além disso, epigenomic impressões nos LIF-3i-revertido hPSC foram encontrados reproducibly normal e intacto no posto de passagens de 5 – 10 LIF-3i reversão2. Usando a plataforma de matriz de metilação de comercial sensível alelo-específico, foi previamente demonstrado que foram encontradas marcas de metilação CpG em loci impressa de um amplo repertório de linhas hPSC LIF-3i-revertido (seguintes 4 – 7 passagens no LIF-3i) ser grosseiramente normal na estrutura1. Desde cariótipos e impressões de genômicas anormais em última análise, podem prejudicar a capacidade funcional do hPSC, pré-requisito diretrizes foram descritas neste protocolo que incentiva os pesquisadores para validar hPSC culturas antes e após a reversão de ingênuo, usando este método, bem como os outros.

O método de LIF-3i melhorou funcional pluripotência em camadas germinativas em um grande repertório de hESC e linhas de hiPSC não-transgênicos (Figura 3). Ao contrário de outros protocolos de reversão de ingênuo, o método de LIF-3i faz não requerer um re-escorvamento passo subsequente diferenciação de N-hPSC (i.e., conversão de N-hPSC volta para condições aprontadas convencionais antes da sua utilização na direção ensaios de diferenciação). LIF-3i-revertido N-hPSC exibir as capacidades de diferenciação significativamente mais eficientes do que suas contrapartes isogénicas hPSC convencional em ambos os ensaios de teratoma (Figura 3-D) e dirigido a protocolos de diferenciação das linhagens de todos três camadas germinativas2. Devido a dependente de ensaio e interline variações em testes funcionais de hPSC convencional, diferenciação de linhagem específica deve ser avaliada usando protocolos de diferenciação dirigido independente e hPSC derivado de várias origens genéticas. Usando o cuidado desenho experimental, uma ampla gama de linhas hPSC pode ser esperada para melhorar significativamente a sua eficiência de diferenciação multilineage comparada a suas contrapartes convencionais isogénicas 4 – 10 passagens no LIF-3i condições a seguir.

Em resumo, este método rapidamente e uma relação clonal expande o número de humanos PSC, melhora sua eficiência de diferenciação a jusante, aumenta o número de células progenitoras confirmada linhagem seguindo a diferenciação, e diminui interline variabilidade entre linhas hPSC convencional, linhagem-preparado. Estes N-hPSC com funcionalidade aprimorada ainda mais pode ter um impacto grande para seu potencial de contribuir tecidos funcionais de um embrião em desenvolvimento. Por exemplo, N-hESC estável pode ser empregada para o desenvolvimento de órgãos humanos para transplante e células-tronco adultas no desenvolvimento de quimeras animais, ou para a geração de gene-alvo humanizados modelos animais da doença. A otimização mais desse tankyrase inibidor-utilizando método LIF-3i em definida livre de alimentador GMP-compatível com as condições de cultura facilitará eficiente geração clinicamente útil de uma ampla gama de tipos de células engraftable e funcional para uso terapêutico.

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Disclosures

Sob um acordo de licenciamento entre tecnologias da vida e da Johns Hopkins University (JHU), Dr. Zambidis tem direito a uma parte dos royalties recebidos pela Universidade para o licenciamento de células-tronco. Os termos desse acordo são gerenciados pelo JHU em conformidade com suas políticas de conflito de interesses. Isto não altera a adesão dos autores a políticas de jornal sobre a partilha de dados e materiais.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por concessões do NIH/NEI (R01EY023962), NIH/FORMULADORES (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, o fundo de pesquisa de células-tronco de Maryland (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk prêmio Fórum de ciência e a Fundação de Moseley.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated BD Biosciences 561716 use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibody Sigma Aldrich HPA029708 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibody Abcam ab6276 use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated  BD Biosciences 550315 use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugated eBioscience 17-0319-42 use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kit Miltenyi Biotec 130-091-935
anti-NANOG antibody Abcam ab109250 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibody Sigma Aldrich HPA005455 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody Cell Signaling 4695 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody Cell Signaling 4370 use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody Cell Signaling 9145 use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated Agilent E0432 use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated  R&D System FAB1435A use 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated R&D System NLLC1435G use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibody Cell Signaling 9139 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibody Millipore MAB4388 use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated  R&D System NLLC4770R use at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0068 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0069 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560193 use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560161 use 10µL per assay (FACS)
APEL2-Li StemCell Technologies 5271
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3311
CellAdhere dilution buffer StemCell Technologies 7183 dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouse Charles river 023
CHIR99021 R&D System L5283 reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope system Zeiss LSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC line Thermo Fisher Scientific A18945 also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates Corning 3506
Countess  cell counting chamber slide Thermo Fisher Scientific C10228
Countess automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)  Thermo Fisher Scientific 11995-065
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific 11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D2650
DR4 mouse The Jackson Laboratory 3208
Essential 8 (E8) medium StemCell Technologies 5940
Fetal bovin serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30071.03
Forskolin Stemgent 04-0025 reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G1890-100G resuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
mTeSR1 medium StemCell Technologies 85850
Nalgene cryogenic vials Thermo Fisher Scientific 5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System Fisher Scientific 154534
Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS USB Corporation  19943
PD0325901 Sigma Aldrich PZ0162 reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
Purmorphamine Stemgent 04-0009 reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin A Peprotech AF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 Peprotech 120-05ET resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF) Peprotech 100-18B resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human LIF Peprotech 300-05 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
SB431542  Stemgent 04-0010-05 reconstitute at 100mM in DMSO
Stemolecule Y27632 in Solution Stemgent 04-0012-02 ROCK inhibitor in solution (10mM)
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific A11105-01
Streptavidin-Cy3 conjugate Sigma Aldrich S6402 use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 Peprotech 100-21 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
Vitronectin XF matrix StemCell Technologies 7180 dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer
XAV939 Sigma Aldrich X3004 reconstitute at 100mM in DMSO
β-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023 light sensitive

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References

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