Orbital schütteln Kultur von Säugerzellen in O-förmigen Schiffe, einheitliche Aggregate zu produzieren

Bioengineering
 

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von O-förmigen Schiffe, spezialisiert für Suspensionskulturen zellulären Aggregate mit orbital schütteln. Die HEK293 Zellen gewachsen in diese Tasche zu bilden mehr homogene Aggregate als die in herkömmlichen Kulturgefäße angebaut.

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Horiguchi, I., Suzuki, I., Morimura, T., Sakai, Y. An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates. J. Vis. Exp. (143), e57922, doi:10.3791/57922 (2019).

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Abstract

Suspensionskulturen Säugerzelle Aggregate sind für verschiedene Anwendungen im medizinischen und biotechnologischen Bereich erforderlich. Die Einweg-Beutel-basierte Methode ist eine der einfachsten Techniken für die Massenproduktion von zellulären Aggregate, aber es schützt nicht die Kulturen gegen übermäßige Anhäufung, die auftritt, wenn sie in der unteren Mitte Kulturgefäß zu sammeln. Um dieses Problem zu lösen, entwickelten wir eine O-förmige Schale und eine O-förmigen Tasche, von die keine zentrale Region enthält. Aggregate in beiden O-förmigen Kulturgefäß angebaut wurden deutlich gleichmäßiger Größe als Aggregate in konventionellen Schiffen gewachsen. Histologische Analysen zeigten, dass die Aggregate, die in herkömmlichen Kultur Gerichte enthalten nekrotische Kerne sehr wahrscheinlich verursacht durch eine schlechte Sauerstoffversorgung. Im Gegensatz dazu zeigte Aggregate, die in der O-förmigen Tasche, auch solche mit ähnlichen Durchmessern bis Aggregate in herkömmlichen Kultur Gerichte angebaut wurden nicht nekrotische Kerne. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die O-förmigen Tasche ausreichend Sauerstoff zu den Aggregaten durch die Sauerstoff-Durchlässigkeit des Materials Tasche bietet. Wir schlagen daher vor, dass diese neuartige gasdurchlässigen O-förmigen Kultur-Tasche für die Massenproduktion von einheitlicher Aggregate geeignet ist, die in verschiedenen biotechnologischen Felder notwendig sind.

Introduction

Zelle Suspensionskultur spielt eine wichtige Rolle in der Zellproduktion für regenerative Medizin1 und rekombinanter Protein Produktion2 , weil es einfach zu skalieren und zu erreichen hohen Zelldichten, manchmal bis zu mehr als 107 Zellen / mL-5. Chinesische Hamster Eierstock (CHO) Zellen3 und menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) sind vor kurzem in Kultur Federungssysteme für gewachsen und menschliche embryonale Nieren-Zellen 293 (HEK293)4 Suspensionskultur gewachsen worden regenerative Therapien,1,6,7. Die Verwendung von Suspensionskulturen wird voraussichtlich in der Zukunft erhöhen.

In Suspensionskultur einigen Zelllinien nicht als Einzelzellen wachsen und müssen daher Aggregate bilden. Zum Beispiel können hPSCs in Suspension Bedingungen nicht überleben ohne Aggregate zu bilden. Allerdings stellt diese Anforderung für aggregierte Wachstum Schwierigkeiten für homogene Suspensionskulturen. Eine Schwierigkeit ist die Bildung der einheitlichen Aggregate in der Frühzeit der Kultur, die die Effizienz der Aussetzung Kultur8bestimmt. Eine weitere Schwierigkeit ist der Stoffaustausch von Nährstoffen zu Aggregaten. Insbesondere die Versorgung mit Sauerstoff beschränkt die maximale Größe der Aggregate, und eine schlechte Sauerstoffversorgung bewirkt Nekrose in der Mitte der Aggregate9. Suspensionskulturen Zelle Aggregate sind daher schwieriger zu erreichen als herkömmliche Suspensionskulturen. Suspensionskulturen sind jedoch entscheidend für die Biomedizin und Biotechnologieanwendungen.

Orbital schütteln Schiffe sind eines der einfachsten Federungssysteme für Kultur, die Kulturmedium Mischungen ohne Laufrad Erregung zu erreichen. Scherspannung des Laufrades und der dynamischen Medium-Fluss ist das Hauptproblem der Suspensionskultur, weil es Zellschäden und Differenzierung verursacht. Um Agitation mit einer geringeren Scherbeanspruchung zu erreichen, entwickelten Forscher und Industrie eine Vielzahl von orbital schütteln Schiff Systeme2,10.

Konventionelle Kulturgefäße eignen sich jedoch nicht für Orbital schütteln Kulturen. In Orbital schütteln Schiffe Zellen angezogen die Mitte-unten der Gefäße durch eine Art von Medium-Fluss bekannt als die "Einsteins Tea leaf Paradox"11, wodurch die inhomogene Aggregation von Zellen. Die kreisförmige Strömung, verursacht durch eine Fliehkraft und eine Reibung zwischen dem Kulturmedium und ein Schiff fegt Zellen in der Mitte11,12. Darüber hinaus sind konventionelle Kultur Taschen für Massenkultur quadratische, die ist nicht geeignet für orbital schütteln.

In dieser Studie haben wir eine neue Kultur-Tasche geeignet für Orbital schütteln Kulturen entwickelt. Die Neuheit dieser Tasche ist die O-Form, die nicht über ein Zentrum-Gebiet, so dass Raffung an der unteren Mittelbereich Zellen verhindert werden. Wir haben auch den Umgang mit dieser Schiffe mit einer HEK293 Kultur zu zeigen, die Möglichkeit, diese Taschen für biotechnologische Anwendungen gezeigt.

Protocol

1. Vorbereitung der Zellen und Materialien

  1. Pflegen Sie HEK293 Zellen in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium mit einem 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren. Den pH-Wert des Kulturmediums auf 6,8-7,6 einstellen.
  2. Nach der Kultivierung für 5 bis 7 d, die Zellen mit 0,25 % Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure-Lösung (Trypsin-EDTA) distanzieren und reseed Zellen bei 5.000-10.000 Zellen/cm2.

(2) Aussaat die Zellen in einer O-förmigen Tasche

  1. Trennen Sie die Zellen zu, wie unter Punkt 1.2 beschrieben und aufzuwirbeln sie in 2-5 mL Kulturmedium.
  2. Filtern Sie die Zellsuspension durch eine Zelle Sieb (40 µm), eine einzelne Zelle Aussetzung zu sammeln.
  3. Die Anzahl der Zellen durch Trypan blau einfärben und automatische Zelle Zähler, und bereiten dann 20 mL Zellsuspension (2,0 x 105 Zellen/mL).
  4. Verbinden Sie den Einlass der O-förmigen Tasche (Abbildung 1a) mit eingespannten 50 mL Spritze ohne einen Kolben.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Bilder und Fotos von O-förmigen Schiffe. (a1) Dies ist eine schematische Bild einer O-förmigen Tasche. (a2) Dies ist ein Bild von einem O-förmigen Tasche. (b1) Dies ist eine schematische Bild einer O-förmige Schale. (b2) Dies ist ein Bild von einem O-förmige Schale. Die äußere und innere Durchmesser der O-förmigen Tasche sind jeweils 90 mm und 20 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Pipette die präparierten Zellsuspension in den O-förmigen Beutel durch die eingespannten Spritze.
  2. Ersetzen Sie die ersten eingespannte Spritze durch eine saubere Spritze. Fügen Sie 55 mL saubere Luft durch die saubere Spritze, die Tasche komplett zu erweitern.
  3. Klemmen Sie den Schlauch und schließen Sie dann den Einlass. Schließlich entfernen Sie die Klammer aus der Tube.
  4. Inkubieren Sie die Zellen in der O-förmigen Tasche durch Schütteln sie bei 45 u/min bei 37 ° C und 5 % CO2.

3. mittlere Änderung (optional)

  1. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 mL Röhrchen durch den Einlass.
  2. Für 2 min bei 200 X g bei Raumtemperatur Zentrifugieren Sie und aspirieren Sie überstand.
  3. 20 mL Kulturmedium und Aufschwemmen der Zellen.
  4. Fügen Sie die resuspendierte Zellen um die O-förmigen Tasche, um folgende Schritte 2,4-2,7.
  5. Inkubieren Sie die Zellen in der O-förmigen Tasche durch Schütteln sie bei 45 u/min bei 37 ° C und 5 % CO2.

4. sammeln die Zellen aus dem Beutel

  1. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 mL Röhrchen durch den Einlass.
  2. Waschen Sie die Innenseite der Tasche mit 20 mL Kalzium/Magnesium-freies Phosphat gepufferte Kochsalzlösung [PBS(-), pH = 7,4-7,6] und dann abtropfen lassen den Inhalt in ein Rohr, die verbleibenden Zellen aus dem Beutel zu sammeln.
  3. Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellsuspension für 3 min bei 200 X g bei Raumtemperatur und aspirieren Sie überstand.
  4. Fügen Sie 10 mL PBS(-) und waschen Sie der Aggregate.
  5. Für 3 min bei 200 X g bei Raumtemperatur Zentrifugieren Sie und aspirieren Sie überstand die Aggregate zu sammeln.
  6. 4 mL PBS und 1 mL Trypsin und inkubieren sie mit die Aggregate für 10 min bei 37 ° C, um die Zellen für die Zählung (optional) zu distanzieren.

5. Vorbereitung eines O-förmige Schale (optional)

Hinweis: Siehe Abbildung 1 b für eine schematische Bild der O-förmige Schale.

  1. Am Ende ein Gericht mit 60 mm oder 35 mm mit einem heißen Messer geschnitten Sie aus und nutzen Sie es als eine innere Schale.
  2. Setzen Sie die 60 Millimeter-Teller kopfüber in der Mitte eines Tellers 100 mm.
    Hinweis: Ein Leitfaden Blatt kann helfen, die Position von 60 Millimeter-Teller entscheiden.
  3. Bei Bedarf setzen Sie Viskosität eingestellt Cyclohexanon auf der Kommissur aus dem Inneren des 60 Millimeter-Teller.
  4. Trocknen Sie die O-förmige Schale für ein paar Tage und sterilisieren Sie es von Gamma Ray oder Ethylen Oxid-Gas.

Representative Results

Nach unseren Messungen hatte Aggregate in der herkömmlichen Petrischale gezüchtet nach 5D orbital schütteln Durchmesser variiert. Aggregate in O-förmigen Schiffe für 5D angebaut hatte dagegen viel mehr einheitlichen Durchmesser. Die konventionellen Gericht Kultur zeigte kleine Aggregate (50-200 µm), während die Kulturen in den O-förmigen Gefäßen keine kleine Aggregate (Abbildung 2a) enthielten. Laut der bildbasierten Größenmessung zeigte die konventionellen Gericht Kultur zwei verschiedene Gipfel (Abbildung 2 b 1), eine große Abweichung der aggregierten Größe angibt. Dieses Ergebnis impliziert, dass Aggregate in der konventionellen Schale unter zwei verschiedenen Bedingungen in der gleichen Kultur, wuchsen die heterogenen Zelle Qualität führen könnten. Auf der anderen Seite Aggregate in O-förmigen Gefäßen zeigte eine einzelne Spitze und weniger Abweichung im Durchmesser als die in der konventionellen Schale (Abbildung 2 b2 und 2b3), darauf hindeutet, dass solche Aggregate von mehr einheitliche Qualität sein können.

Figure 2
Abbildung 2: Morphologien und Durchmessern von Aggregaten in verschiedenen Behältern gewachsen. Diese Tafeln zeigen (ein) Hellfeld-Bilder und (b) die Histogramme der Aggregate in entweder (a1 und b1) angebaut, eine konventionelle Gericht (a2 und b2) ein O-förmige Schale, oder (a3 und b3) eine O-förmigen Tasche. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Hämatoxylin und Eosin Färbung des aggregierten Querschnitte zeigten, dass Aggregate in der herkömmlichen Petrischale gezüchtet einige denucleated Zellen und nekrotischen Kerne (Abbildung 3a hatten). Aggregate in O-förmigen Schiffe gewachsen zeigen nekrotischen Kerne (Abb. 3 b und 3 c) jedoch nicht. Insbesondere Aggregate in der O-förmigen Tasche gewachsen waren so groß wie die in der konventionellen Schale noch haben keine nekrotischen Kerne (Abb. 3 c). Diese Ergebnisse vorgeschlagen, dass die gasdurchlässigen Tasche genügend Sauerstoff, um die Kultur geliefert.

Figure 3
Abbildung 3: Querschnitte von Aggregaten in verschiedenen Gefäßen. Die Querschnitte sind 12 µm dick und bereiteten aus gefrorenen Proben. Die Abschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin visualisieren die Zellen gefärbt. (ein) die Zelle Aggregate in einer konventionellen Suspensionskultur gewachsen zeigte nekrotische Kerne. Zelle Aggregate in beiden (b) angebaut, eine O-förmige Schale oder (c) eine O-förmigen Tasche zeigte sehr wenig Nekrose in ihren Kernen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zellzahlen zeigte, dass mehr als 85 % der Zellen für 5D Suspensionskultur in jedes Schiff (Abbildung 4a) überlebt. Die endgültige Zelldichte war ca. 1,5-2,0 x 106 Zellen/mL. Zwar gab es keinen signifikanten Unterschied, war das Wachstum-Verhältnis in der O-förmigen Tasche höher als in anderen Schiffen (Abbildung 4 b). Die spezifischen Wachstumsraten der Zellen in der konventionellen Gericht, die O-förmige Schale und den O-förmigen Beutel zwischen Tag 2 und 5 waren 0,018 und 0,025 0,020 h-1, beziehungsweise.

Figure 4
Abbildung 4: Zelle, Rentabilität und Wachstum. Diese Tafeln zeigen die (eine) Lebensfähigkeit und (b) Zelle Zelldichte HEK293 Zellen in verschiedenen Kulturgefäße nach 2 d Kultur (Tag 2) und 5 d Kultur (Tag 5). Die dargestellten Werte repräsentieren den Mittelwert der Ergebnisse aus 3 unabhängigen Experimenten. Die Werte für jedes Experiment wurden aus Trypan blau gefärbten Zellen gezählt mit einem automatischen Zelle Zähler berechnet. Die Fehlerbalken zeigen Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Abbildung1: Verteilung in 2 verschiedenen Gericht Formate in verschiedenen schütteln Bedingungen Bead. Dieses Fenster zeigt die Wulst bei verschiedenen schütteln (30, 40 und 45 u/min) in einer konventionellen und O-förmige Schale. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Discussion

In dieser Studie entwickelt O-förmigen Schiffe und ein HEK293 Suspensionskultur in ihnen für einen einheitlichen Aggregate Bildung und Erweiterung durchgeführt. In der konventionellen Kulturschale produziert Orbital schütteln Kultur zwei unterschiedliche Durchmessern der Aggregate, während wir einheitliche Aggregate in den O-förmigen Gefäßen (Abbildung 1) beobachtet. Nach der Beobachtung der Verteilung von bunten Perlen in den orbitalen schütteln Bedingungen sammeln Perlen in der Mitte-unten von einer konventionellen Kulturschale. Diese Versammlung verursacht vermutlich die Dichteunterschiede Zelle führt zu verschiedenen Größen der Aggregate. Alternativ wurden Perlen in der O-förmige Schale verteilt, die nicht über die Mitte-unten-Region (ergänzende Abbildung1). Diese Verteilung verursacht wahrscheinlich die gleichmäßig große Aggregate in O-förmigen Schiffe. Eine weitere – weit verbreitete – Ansatz zur Herstellung einheitlicher Aggregate ist die Kultivierung in Mikrovertiefungen, aber dieser Ansatz hat einige Probleme, wie z. B. bei der Versorgung von einem Nährmedium ohne Aggregate der Ausstieg aus der Mikrovertiefungen13. Bei O-förmigen Schiffen können einheitliche Aggregate in einem einfachen Suspensionskultur hergestellt werden.

Die Orbital schütteln Kultur ist ein Popkultur-System für Säugerzellen eingesetzt. Es gibt verschiedene Kulturmethoden für die Massenproduktion von Säugerzellen, wie z. B. die Rührbehälters Bioreaktor14, Welle winkte Taschen15, und drehen der Flaschen. Orbitale schüttelnde Kulturen beinhalten keine innere Laufrad für das Rühren des Mediums, im Gegensatz zu den Rührbehälters Bioreaktor tut. Diese Funktion ist ähnlich wie die Welle winkte Taschen und rotierenden Flaschen. Diese Laufrad-freie Kultur-Systeme vermeiden Zellschädigung aus der Querkraft, die rund um die Laufräder und geringe Schubbeanspruchung in Suspensionskultur zu realisieren. Insbesondere sind orbital schütteln Kultur Systeme wegen ihrer hohen Skalierbarkeit und geringen Schubspannung effektiv für die Massenproduktion von lichtempfindlichen Zellen wie Säugetierzellen.

O-förmigen Schiffe können das verbleibende Problem der orbital schütteln Kultur in der Bildung von Aggregaten verbessern. Im Orbital schütteln Kultur-Systeme Wandern Einzelfeldern zum Zentrum und Boden des Gefässes, bekannt als die "Einsteins Tea leaf Paradox"11. Diese Migration verursacht die inhomogene Aggregation und ungleichmäßige aggregierte Produktion in konventionellen Orbital schütteln Schiffe. In dieser Studie verhindert O-förmigen Schiffe die Konzentration der Zellen in der Mitte unten der Gefäße, die zum Grund des einheitlichen Aggregation im orbital schütteln O-förmigen Schiffe spekuliert wird.

Histologische Analysen ergaben, dass die Aggregate in der konventionellen Schale denucleated Zellen (Abbildung 2a) enthalten. Im Gegensatz dazu erschien denucleated Zellen nicht in den Aggregaten aus O-förmigen Gefäßen (Abb. 2 b und 2 c). Es ist möglich, dass diese denucleated Zellen durch einen Mangel an Substraten wie Glukose, Glutamin und Sauerstoff9verursacht wurden. Entsprechend der Größenmessung hatte Aggregate in den Gefäßen O-förmigen homogene Durchmesser weniger als 400 µm. Im Gegensatz dazu in einem konventionellen Gericht einige Aggregate hatte einen Durchmesser größer als 400 µm, und diese Aggregate enthalten denucleated Zellen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Schaffung homogener Größe Aggregate in O-förmigen Schiffe wirksam bei der Kontrolle der Qualität der Aggregate. Darüber hinaus wird es auch spekuliert, dass die Sauerstoffversorgung durch die gasdurchlässigen Polyethylenfolie das Auftreten von denucleated Zellen in der O-förmigen Tasche verhindert.

Diese Experimente zeigten die Möglichkeit dieser O-förmigen Schiffe als ein einfaches System für die Herstellung einheitlicher Aggregate. Obwohl andere Kultur-Taschen für Suspensionskultur entwickelten15gewesen sein, sind diese Kultur Taschen Quadrat-geformte, die verhindert, dass der Kulturkreis effektiv in orbital schütteln gemischt. Die Tasche in dieser Studie hat einen Runde Form geeignet für orbital schütteln um Aggregate mit einer homogenen Größe produzieren Roman. Diese Eigenschaft der Schiffe ist wichtig für die Steuerung, die Bedingungen und die hohe Reproduzierbarkeit der Zellen in der Massenproduktion. Die mögliche Anwendung des O-förmigen Schiffes ist weit verbreitet. Es kann verwendet werden bei der Produktion von rekombinanten Proteinen aus Zellen und für die regenerative Medizin, beim Umgang mit Stammzellen.

Zusammenfassend haben wir einen Roman O-förmigen Tasche geeignet für die Herstellung von einheitlichen Zelle Aggregate mit einem orbital schütteln Kultur entwickelt. Die Tasche zeigt Möglichkeiten für verschiedene biomedizinische Anwendungen wie z. B. in der regenerativen Medizin.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

Diese Forschung wird durch eine Zusammenarbeit mit Allgemeines, CO., Ltd. Takao Yoshida von Allgemeines, CO., Ltd. lieferte die Idee der O-förmigen Kultur Tasche unterstützt. Takamasa Sato von Allgemeines, CO., Ltd. unterstützt diese Forschung im Hinblick auf eine Computersimulation für die Entwicklung der O-förmigen Kultur-Tasche. Wir würden gerne aktuelle Zugehörigkeit des entsprechenden Autors, Osaka University, für die Erlaubnis zur Veröffentlichung arbeiten zu schätzen wissen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293 RIKEN Bio resorce centre RCB1637
DMEM, high glucose, pyruvate GIBCO 11995040
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions GIBCO 10437-028
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X GIBCO 11140050
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red GIBCO 25200056
Dulbecco's PBS (–) Cell Science & Technology Institute 1102P05
Cell Strainer 40µm CORNING 352340
50 mL Syringe TERUMO SS-50ESZ
Shaker AS ONE 2-1987-02
Centrifuge Tube 50 mL AS ONE 1-3500-02
Automated cell counter BioRad TC20

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References

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