Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada açıklanan protokolü yeni sentezlenmiş mRNA 4-thiouracil ile etiketli Maya hücrelerinden saf genom çapında miktar temel alır. Bu yöntem mRNA decay edilişi mRNA sentezi ölçmek için sağlar ve böylece, RNA polimeraz II transkripsiyon doğru bir ölçüm sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. J. Vis. Exp. (140), e57982, doi:10.3791/57982 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

RNA polimeraz II transkripsiyon genel kusurları kararlı durum RNA analiz transcriptomic çalışmaları tarafından göz ardı edilebilir. Nitekim, mRNA sentezi genel azalma mRNA bozulması normal kararlı durum düzeyleri geri yüklemek için eşzamanlı bir düşüş telafi edilebilir olduğu gösterilmiştir. Dolayısıyla, genom çapında miktar mRNA sentezi mRNA decay, dan bağımsız olarak en iyi doğrudan RNA polimeraz II transkripsiyon etkinlik yansımasıdır. Burada, Sigara perturbing metabolik Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) içinde yeni doğmakta olan RNA'ların etiketlerine göre kullanarak bir yöntem tartışmak. Özellikle, hücreleri urasil analog, 4 thiouracil ile 6 dk kültürlü ve etiketli yeni transkripsiyonu RNA'ların saflaştırılmış ve tüm bireysel mRNA sentezi oranları belirlemek için sayılabilir. Ayrıca, kullanarak etiketli Schizosaccharomyces pombe hücreleri dahili standart farklı S. cerevisiae mRNA sentezi verir gibi suşları. Bu iletişim kuralını kullanan ve dinamik bir kinetik modeli ile veri uydurma, karşılık gelen mRNA decay oranları tespit edilebilir.

Introduction

Hücreleri endojen ve eksojen cues, dinamik değişiklik kendi gen ifade programı aracılığıyla yanıt. Son yıllarda, farklı koşullarda transcriptome değişiklikleri kesin ve kapsamlı açıklaması genom çapında metodolojileri muazzam bir gelişme sağlar. Çoğu transcriptomic çalışmalarda Mikroarray hibridizasyon veya yüksek üretilen iş sıralama toplam kararlı durum RNA kesir düzeylerinden RNA ölçmek için kullanılır. Transkripsiyon değişiklikleri belirli bir pertürbasyon altında belirli bir gen ifade değişikliklerle veya up - veya downregulated genler geniş bir yelpazede olası sonuçları geniş bir görüntüleyebilirsiniz. Gen ifadesinin ince ayarlı bir denge sonucudur — veya kararlı durum — tarafından RNA polimerazlar RNA sentezi ve RNA düzeyleri etkileyen diğer işlemler arasında. RNA polimeraz II transkripsiyon, onun üç farklı aşamada (başlatma, uzama ve sonlandırma) dahil olmak üzere mRNA işleme, sitoplazmik ihracat, çeviri ve bozulma ile son derece ve girift ilişkilidir.

Birkaç son yıllarda yapılan çalışmalarda mRNA sentezi ve çürüme eşleşmiş mekanizmalarının olduğunu gösterdi ve transkripsiyon etkileri mutasyon üzerine veya bir çekim gücü altında toplam kararlı durum RNA miktarının ne zaman göz ardı edilebilir olduğunu gösterdi. Birincisi, her zaman kararlı durum düzeyleri mRNA analizleri transkripsiyon değişimler tespiti mRNA'ların half-life üzerinde bağlıdır. Bir kez pertürbasyon tanıttı, mRNA'ların uzun yarı-ömrü olan kararlı durum düzeyleri daha az bu kısa yarı-ömrü olan mRNA'ların daha etkilenecektir. Bu nedenle, RNA sentezi değişiklikleri tespit şiddetle longer-lived mRNA türler analizini transkripsiyon hızı dinamik değişiklikler ortaya çıkarmak başarısız olabilir iken kısa ömürlü transkript lehine önyargılı olduğunu. İkinci olarak, çeşitli raporlar ve hem de Maya memeliler, transkripsiyon küresel değişimler mRNA kararlı durum düzeyde analiz ederken göz ardı, göstermiştir. Bu mRNA sentezi ve yıkımı mRNA tampon kaynaklanan bağlantı mekanizmaları nedeniyle muhtemeldir. Bu bozulma, yeni kopya etmek mRNA analizi ile gelen edilişi mRNA sentezi ölçmek için yeni protokoller geliştirme istenir. Son yıllarda, birkaç alternatif, küresel çalıştırma sıralama (GRO-seq)1ve sıralama (NET-seq)2,3yerli uzama transkript de dahil olmak üzere sunulmuştur. Burada, başlangıçta memeli hücreleri4,5,6 ' geliştirilen ve Maya7,8,9,10' auyarlanmış bir protokol bulunuyorlar, bir thiolated nükleozit veya temel analog ile etiketleme RNA dayanır, 11, 4-thiouridine (4sU) veya 4-thiouracil (4tU), anılan sıraya göre.

Bu yöntem özellikle yeni transkripsiyonu RNA hangi RNA hücrelerden arındırır darbe etiketli hücre homeostazı hemen hemen hiçbir girişim ile 4sU ile vardır. Sonra hücreleri 4sU için sunulan, bu nedenle, hızla 4sU-trifosfat için fosforile ve transkripsiyonu RNA'ların içinde dahil uptaken, moleküldür. Bir kez darbe etiketli, toplam Hücresel RNA (RNA kararlı durum düzeylere karşılık gelen) ayıklamak mümkündür ve daha sonra 4sU etiketli RNA kesir thiol-özellikle bu değişiklik, bir disülfür bağ oluşumu için biotin arasında önde gelen ve Yeni transkripsiyonu RNA4,5. Ancak, 4sU sadece insan equilibrative nükleozit ışınlama (hENT1), tomurcuklanma veya fisyon mayası hemen onun kullanımını engelleme gibi bir nükleozit taşıyıcı ifade hücreleri tarafından uptaken olabilir. Bir hENT1 S. pombe veya S. cerevisiaeifade olabilir iken, daha kolay bir yaklaşım, Maya hücreleri 4tU, ifade bir nükleozit ışınlama10, , gerek kalmadan kadar sürebilir bu yana değiştirilen temel 4tU kullanılarak elde edilebilir 11 , 12 , 13. Aslında, 4tU metabolizma enzim urasil phosphoribosyltransferase (UPRT) faaliyet gerektirir. Maya ama değil memeliler, dahil olmak üzere çeşitli organizmalarda UPRT urasil Üridin monofosfattır için geri dönüşüm pirimidin kurtarma yolu için esastır.

Transcriptomic çalışmalarda önemli bir önyargı paralel olarak analiz farklı örnekleri arasında normalleştirme tarafından tanıttı olabilir. Gerçekten de, birçok temaslara faktör transcriptome mutant ve vahşi-türü suşları karşılaştırmalı analizi etkileyebilir: hücre lizis, verimliliğini farklılıkları ayıklama ve RNA ve Mikroarray analizleri için tarayıcı kalibrasyon'deki kurtarma , diğerleri arasında. RNA polimeraz II transkripsiyon küresel etkileri beklenen yukarıda da açıklandığı gibi bu tür varyasyonları özellikle yanıltıcı olabilir. Doğru bir şekilde farklı örnekleri arasında mRNA sentezi oranlarını karşılaştırmak için zarif bir ortalama bir iç standart olarak uzaktan ilgili fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe kullanarak tasarlanmıştır. Bunun için sabit sayıda S. pombe etiketli hücreleri S. cerevisiae örnekleri, hücre lizis ve RNA ayıklama10önce vahşi-türü ya mutasyona uğramış hücreler eklenir. Daha sonra S. pombe ve S. cerevisiae kararlı durum hem yeni sentezlenmiş RNA'ların RT-qPCR veya üzerinden Mikroarray fiş ya da yüksek üretilen iş sıralama10kullanımı sayısal. Bu veriler kinetik modelleme ile birleştirerek, mRNA sentezi ve mayası çürümesi mutlak oranda ölçülebilir.

Bu makale çerçevesinde, biz nasıl RNA polimeraz II transkripsiyon tomurcuklanma coactivator kompleksleri destan ve TFIID14,15Maya için küresel bir rol ortaya çıkarmak için yeni transkripsiyonu RNA Analizi izin gösterir, 16. Önemlisi, son çalışmalar kararlı durum mRNA düzeyleri S. cerevisiae sayılabilir ve destan destan mutasyonlar kuvvetle etkilenen ama nispeten TFIID karşı olan Maya genler, sınırlı sayıda üzerinde baskın bir işlev çalış önerdi mutasyonlar17,18,19. Şaşırtıcı, destan enzimatik faaliyetleri tüm kopya etmek soykırım, RNA polimeraz II transkripsiyon Co bu harekete geçirmek için daha geniş bir rol öne hareket gösterilmiştir. Azalan RNA polimeraz II işe alım en ifade genler, destan veya TFIID, bu coactivators birlikte çoğu genleri çalışır düşündüren inactivation üzerine gözlendi. Bu nedenle, yeni kopya etmek mRNA miktar destan ve TFIID için neredeyse tüm genlerin transkripsiyonu RNA polimeraz II14,15,16tarafından gerekli olduğunu ortaya koydu. Telafi edici mekanizmaların uygulanması için hücreleri mRNA sentezi mRNA yıkımı eşzamanlı bir küresel düşüş arabelleğe alınmış genel bir azalma ile başa çıkmak bir yol olarak ortaya çıkıyor. DESTAN transkripsiyon faktörü TFIIH21,22 RNA polimeraz II transkripsiyon, RNA Pol II alt birimleri10gibi küresel bir etkisi, arabulucu coactivator karmaşık20, general sahip faktörler listesine ekler ve dolaylı olarak, öğeleri mRNA yıkımı makine9,10,23. Telafi tür olayların evrensel destan mutantlar, mRNA sentezi14küresel ve ciddi bir düşüş rağmen kararlı durum mRNA düzeylerinde mütevazı ve sınırlı değişiklikler için muhasebe gözlendi. Benzer analizler de tam bir kaybı histon H2B ubiquitination ile sonuçlanan bir BRE1 silme yük içinde gerçekleştirilmiştir. İlginçtir, bir çok daha hafif ama tutarlı küresel etkisi RNA polimeraz II transkripsiyon Maya içinde yeni transkripsiyonu RNA'ın metabolik etiketleme algılayabilir ve çok çeşitli mRNA değişiklikleri ölçmek olduğunu belirten Bre1, yokluğunda tespit edilemedi sentez oranları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hücre kültürü çalışmalarının ve Rapamycin tükenmesi bir destan alt birimi

  1. Her S. cerevisiae zorlanma ve çoğaltma için vahşi-türü dahil olmak üzere veya kontrol suşları, YPD Orta (%2 pepton, % 1 maya özü ve % 2 glikoz) 5 mL taze bir tabağa tek bir koloni aşılamak.
  2. S. cerevisiae hücreleri gecede 30 ° C'de sabit ajitasyon (150 devir/dakika) ile büyümek.
  3. 600 optik yoğunluk ölçmek nm (OD600) ve yaklaşık 100 0.1 ml YPD orta OD600 kültür sulandırmak ve OD600 0,8 kadar büyümesine izin.
  4. Buna paralel olarak, bir koloni Evet orta 50 mL taze bir tabağa S. pombe hücre aşılamak (% 0.5 maya özü; 250 mg/L adenin, histidin, urasil, lösin ve lizin; % 3 glikoz) ve gecede 32 ° C'de sabit ajitasyon (150 ile hücrelerin büyümesine devir/dakika).
  5. S. pombe gecede kültür OD600 ölçmek ve kültür yaklaşık 0,1 500 ml Evet orta OD600 sulandırmak ve OD600 yaklaşık olana kadar büyümesine izin 0.8.
  6. Her S. cerevisiae çapa koyma zorlanma ve çoğaltma için vahşi-türü dahil olmak üzere veya kontrol suşları, YPD Orta (%2 pepton, % 1 maya özü ve % 2 glikoz) 5 mL taze bir tabağa tek bir koloni aşılamak.
  7. Bir gecede 30 ° C'de sabit ajitasyon (150 devir/dakika) ile hücrelerin büyümesine.
  8. Ertesi sabah, OD600ölçmek, yaklaşık 100 0.1 ml YPD orta OD600 kültür sulandırmak ve OD600≈ 0,8 kadar büyümesine izin.
  9. Rapamycin 100 µL kültür için 1 mg/mL (son rapamycin konsantrasyonu 1 µg/ml) hisse senedi bir çözümden ekleyin ve faiz çekirdek (koşullu olarak tükenmiş protein için gereken süre için sürekli ajitasyon ile 30 ° C'de kuluçkaya hücreleri izin Genellikle, 30 dk yeterlidir). Denetim için benzer bir Maya kültür kullanın ama rapamycin eklemek yerine, dimetil sülfoksit (DMSO) eşdeğer hacmi ekleyin.

2. 4tU S. pombe ile bir Spike bileşeni (sayım) etiketleme

  1. 2 M 4-thiouracil taze çözeltisi hazırlamak. Bir kez hazırlanan, oda sıcaklığında ve ışıktan uzak tutun.
    1. Doğru 64,1 mg 4-thiouracil her S. cerevisiae kültür için tartmak ve dimethylformamide (DMF) 250 µL veya DMSO 250 µL geçiyoruz.
    2. Spike-, kullanılmak üzere S. pombe kültür için 4-thiouracil 320.5 mg tartmak ve DMSO 1,250 µL içinde çözülür.
  2. S. cerevisiae ve S. pombe kültürler 5 mM son bir konsantrasyon için 4-thiouracil çözüm eklemek ve onları 30 ° C ve 32 ° C, sürekli ajitasyon ile 6 min için sırasıyla kuluçkaya.
  3. 6 dakika sonra hücre sayımı için her kültür küçük bir aliquot kaldırın. Bir otomatik hücre sayaç veya Neubauer odası kullanarak hücreleri saymak.
  4. Santrifüjü (2500 x g) 4 ° C'de 5 dakika ile hücreleri toplamak
  5. Süpernatant atmak, hücreler (2500 x g, 4 ° C, 5 min) buz gibi 1 x PBS ve tekrar santrifüj ile yıkayın.
  6. Her birine S. cerevisiae ve S. pombe örnekleri toplam sayısını hesaplayın.
  7. 5 mL buz gibi 1 x PBS de hücrelerde resuspend ve S. cerevisiae 3:1 oranında hücrelerle S. pombe ile karıştırın.
  8. Hücreleri (2500 x g, 4 ° C, 5 min) santrifüj kapasitesi, PBS çıkarın, flash-hücreler sıvı N2' donma ve örnek-80 ° c kadar daha fazla kullanılmasını saklayın.

3. RNA çıkarma ve DNaz tedavi

  1. Buz yaklaşık 20-30 dk hücrelerdeyse çözülme.
  2. Bir maya-RNA ekstraksiyon kiti (Malzemeler tablo) ile birkaç uyarlamalar kullanarak RNA çıkarma ile devam edin.
  3. Her örnek 750 µL buz gibi zirkon boncuk kiti ile birlikte bir 1.5 mL vidalı kapak tüp içine dökün. Her tüp RNA--dan ilâ 109 hücre verimli bir şekilde elde edilebilir olduğunu göz önünde bulundurun. Bu nedenle, tüpler her örnek için gerekli sayıda hazır olun. Örneğin, 100 mL (OD600≈ 0,8) S. cerevisiae kültürünü yaklaşık 2 x 109 -3 x 109 hücre, toplam 2.7 x 10 için çıkılan işleyebilir9 4 x 109 hücre (sonra spike-in S. pombe üçte ile toplam hücreleri). Bu durumda, en çok 3-4 tepki tüpler her örnek/durum/mutant/Çoğalt başına gerekli olacaktır.
  4. Her 1 x 109 hücre başına 480 µL kit ile sağlanan lizis arabelleği, 48 µL % 10 SDS ve fenol: kloroform: izoamil alkol (25:24:1, v/v/v) 480 µL ekleyin.
  5. Bir girdap Mikser kullanarak hücreleri karıştırın ve buz gibi zirkon boncuk içeren tüpler aktarabilirsiniz.
  6. Bir girdap Mikser adaptör üzerine boruları karşılamak, girdap maksimum hızda açmak ve Maya hücreleri (4 ° C'de bir odada) koşullar için 10 dakika için yendi. Alternatif olarak, hücre lizis otomatik bir boncuk döven gerçekleştirin.
  7. 16.000 x g oda sıcaklığında 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi ve dikkatli bir şekilde taze 15 mL şahin Tüp üst aşama (aşama RNA içeren) toplamak. Genellikle, her tüp kurtarılan birim civarındadır 500 – 600 µL.
  8. Kısmen arıtılmış RNA içeren 15 mL tüpler için kit ve karışımı ile iyice sağlanan bağlama arabellek ekleyin. RNA çözüm her 100 µL, bağlama arabellek 350 µL ekleyin (sulu faz çözüm hacmi 600 µL, bağlama arabellek 2.1 mL olduğundayani, eklenebilir).
  9. Önceki karışımı için % 100 etanol ekleyin ve iyice karıştırın. RNA çözüm her 100 µL, 235 µL % 100 etanol ekleyin (sulu faz çözüm hacmi 600 µL olduğundayani, 1,41 mL etanol ekleyin).
  10. Her ikisi de kit ile sağlanan bir koleksiyon tüp içinde monte 700 µL filtre kartuşu için adım 3.9 karışımı uygulamak.
  11. Santrifüj 16.000 x g, 1 dk için. Santrifüjü süresi toplam hacim filtreden geçmek için yeterli değildi, aralıklarla 30 için yinelemeniz s.
  12. Akış-üzerinden atmak ve aynı toplama tüp yeniden kullanabilirsiniz. Filtre ve 1 dk. için tekrar 16.000 x g , santrifüj başka bir 700 µL RNA-bağlama arabellek-etanol çözüm ekleyin.
  13. Akışı aracılığıyla atın ve RNA çözüm bitmesini 3.11 ve 3.12 adımları yineleyin.
  14. Filtre 2 yıkama x 700 µL, çözüm 1 yıkama ile. Yıkama çözüm yolu ile Santrifüjü 16.000 x g 1 dk. için de toplamak ve her zaman toplama tüp.
  15. Filtre 2 yıkama x 500 µL, çözüm 2 yıkama ile. Yıkama çözüm yolu ile Santrifüjü 16.000 x g 1 dk. için de toplamak ve her zaman toplama tüp.
  16. Bir kez daha, 16.000 x g filtre tamamen kurumasını 1 dk. için tüpler santrifüj kapasitesi.
  17. Filtre kartuşu son koleksiyonu tüp (RNA uygun tüp) aktarmak ve RNA DEPC tedavi, RNase free H2O (100 ° C'ye ısıtılmış) 50 µL ile elute.
  18. Santrifüj 16.000 x g, 1 dk için.
  19. RNA tekrar (aynı tüp için) 50 µL önceden ısıtılmış DEPC tedavi, RNase free H2O. bütün toplu filtreden geçti emin olun ile elute; Aksi takdirde, uzun süre santrifüj kapasitesi.
  20. Bir tek örnek için birden fazla tüpler kullandıysanız, onları bütün bir tüp içinde havuz.
  21. Ölçmek ve uygun ekipman kullanarak örnek saflığı kontrol edin.
    Not: 4tU sadece yeni sentezlenmiş RNA içinde dahil ederken, DNA ile küçük kirlenme olasılığı yoktur. Bu nedenle, her zaman DNaz örnekleriyle tedavisi için tavsiye edilir ben. Bunun için RNA-ekstraksiyon kiti (Tablo reçetesi) üreticinin önerilerini takip sağlanan reaktifler kullanın.

4. thiol özgü Biotinylation yeni sentezlenmiş RNA'ın

  1. Bölüm 3-2 mg/ml protokolü ile elde edilen RNA konsantrasyonu ayarlayın. Toplam RNA, aliquot 200 µg 60 ° C'de 10 dakika için ısı ve hemen buz 2 min için chill.
  2. RNA aliquot için aşağıdaki sıraya göre aşağıda belirtilen reaktifler ekleyin: 600 µL DEPC tedavi, RNase free H2O, 100 µL biotinylation arabellek (100 mM Tris-HCl [pH 7,5] ve 10 mM EDTA, DEPC tedavi, RNase free H2O) ve 200 µL biotin-HPDP 1 mg/mL biotin-HPDP DMSO veya DMF stoktan.
    1. Bazı durumlarda, biotin-HPDP çözüm çökelti, büyük olasılıkla onun düşük suda nedeniyle eğilimindedir. Bu durumda, DMSO/DMF tepki birim % 40 kadar hacmini (RNA örnek için DEPC tedavi H2O, biotinylation arabelleği 100 µL ve biotin-HPDP 400 µL 400 µL 0,5 mg/mL stoktan ekleyin).
  3. Örnek oda sıcaklığında kuluçkaya ve nazik ajitasyon ile 3 h için ışık korunuyorsunuz.
  4. Kuluçka sonra tüpler için kloroform yaklaşık olarak eşit bir hacmi ekleyin ve kuvvetle karıştırın.
  5. 13.000 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek spin Bu adımı RNA biotinylate mi fazlalığı Biyotin kaldırılmasını sağlar. Alternatif olarak, faz kilidi tüpler (ağır) kullanarak bu adımı gerçekleştirin. Bunun için faz kilidi tüpler 13.000 x g, 1 dk. için aşağı spin, RNA karışımı ve kloroform, eşit miktarda onları kuvvetle karıştırın ve onları 13.000 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi ekleme
  6. Dikkatle üst aşama yeni 2 mL tüpler içine aktarın.
  7. -Onda biri 5 M NaCl hacmi ve örnek karıştırın.
  8. İsopropanol eşit bir birim eklemek, örnek iyice karıştırın ve 13.000 x g 4 ° C'de en az 30 dk için de spin
  9. Dikkatli süpernatant kaldırmak ve buz gibi % 75 etanol 1 mL ekleyin.
  10. 13.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de spin
  11. Dikkatle süpernatant, hızlı-spin Tüp, kaldırmak ve kalan etanol çözüm kaldırın. RNA Pelet değil Kuru emin olun.
  12. RNA DEPC tedavi, RNase free H2o 100 µL içinde askıya alma

5. Toplam ve etiketsiz RNA manyetik boncuklar Streptavidin kaplı kullanarak üzerinden yeni sentezlenmiş kesir saflaştırılması

  1. 65 ° C'de 10 dakika için RNA biotinylated ısı ve sonra 5 min için buz üzerinde örnekleri chill.
  2. Manyetik boncuklar streptavidin kaplı 100 µL biotinylated RNA (at 200 µL son hacmi) ekleyin. Özellikle, bu konuşmaları ile diğer laboratuvarlar, bu gibi görünüyordu sonra beri Malzemeler tablo, belirtilen boncuk daha tutarlı ve güvenilir olarak kullanmak için tavsiye edilir.
  3. Oda sıcaklığında 90 dk hafif sallayarak ile örnek kuluçkaya.
  4. Manyetik standında kiti (Malzemeler tablo) ile sağlanan sütun yerleştirin.
  5. Oda sıcaklığında çamaşır arabelleği 900 µL ekleyin (100 mM Tris-HCl [pH 7,5], 10 mM EDTA, 1 M NaCl ve %0.1 ara 20, DEPC tedavi içinde RNase free H2O) (önceden çalıştırmak ve equilibrate) sütunlar için.
  6. Boncuk/RNA karışımı (200 µL) sütunlarla.
  7. 1.5 mL tüpler aracılığıyla akış toplamak ve yine aynı manyetik sütun için geçerlidir. Etiketlenmemiş RNA kesir temsil eder gerekirse, bu akış yoluyla tutun.
  8. Sütun 5 yıkama birimleri, arabellek yıkama artan x (600, 700, 800, 900 ve 1000 µL).
  9. 200 µL 0.1 m DTT ile yeni sentezlenmiş RNA elute.
  10. Bir ikinci elüsyon, 3 dk sonra 0.1 M DTT eşit bir hacmi ile gerçekleştirin.
  11. RNA eluting sonra 3 M NaOAc (pH 5.2), buz gibi % 100 etanol 3 cilt ve 20 mg/mL glikojen (RNA-grade) 2 µL 0.1 miktarda ekleyin ve -20 ° C'de RNA acele geceleme izin
  12. Santrifüjü (13.000 x g 4 ° C'de 10 dakika) tarafından RNA yeniden elde etmek ve DEPC tedavi, RNase free H20 15 µL içinde resuspend. Etiketli toplam RNA oranı yaklaşık % 2-4 yeni sentezlenmiş RNA'ın yaklaşık 2.0 µg işleme % (genellikle daha fazla alt sonuna doğru), olacağı tahmin edilmektedir. Bu miktar Mikroarray/sıralama analizleri için de birkaç qPCR deneyler yapmak için yeterli olacaktır.

6. farklı kesirler doğrulanmasını RT-qPCR

  1. Toplam RNA'ın 2 µg veya rasgele hexamers ve transkriptaz tercih, kullanarak etiketli RNA'ın 10 µL cDNA üretici yönergelerine göre (Tablo reçetesi) sentez.
  2. CDNA standart Protokolü (Tablo reçetesi) kullanarak gerçek zamanlı qPCR tarafından yükseltmek.
    Not: Tüm örneklerini nüsha en az iki biyolojik çoğaltır ve çalıştırılması gerekir. S. pombe tübülin ifade tüm ham değerleri düzeltin.

7. Mikroarray hibridizasyon

  1. RNA örnekleri üretici yönergelerine göre tercih edilen Mikroarray fiş üzerine melezlemek (bu belirli iletişim kuralı için bkz: Malzemeler tablo). Kısaca, biotinylated 150 hedeflerden cRNA hazırlamak ng Premier RNA güçlendirme seti (Tablo malzemeler), üreticinin yönergelerine göre kullanarak RNA'ın. 16 h 45 ° C'de ve Mikroarray yongaları üzerinde 60 rpm için parçalanmış cRNAs 4 mg melezlemek.
  2. Yıkama, leke ve belirtilen İstasyonu ve tarayıcı (Tablo reçetesi) kullanıldığında cips inceden inceye gözden geçirmek. Ham veri (CEL yoğunluğu dosyalar) komut konsolu (AGCC, sürümü 4.1.2) kullanılarak taranmış görüntülerden ayıklayın.
  3. Daha fazla ifade konsol yazılım sürümü 1.4.1 sonda sinyal yoğunluklarını, varsayılan ayarları ve küresel normalleştirme yöntemi olarak ölçekleme ile istatistik tabanlı algoritmalar MAS 5.0 kullanarak ayarla hesaplamak için CEL dosyalarla işlem.
    Not: Her çip kesilmiş ortalama hedef yoğunluğunu keyfi olarak 100'e ayarlandı. Tüm deneylerin en az iki bağımsız biyolojik çoğaltır kullanarak gerçekleştirin. S. pombe sinyal için ham veri normalleştirme ve sınıflandırma toplam ve yeni sentezlenmiş RNA düzeylerinde kat değişiklikleri hesaplamak.

8. veri analizi kullanarak varolan bir R boru hattı

  1. Sentez hesaplamak ve oranları bir boru hattı ve R/Bioconductor paket halk için elde edilebilir, daha önce açıklanan8,10kullanarak çürüme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metabolik yeni transkripsiyonu RNA etiketleme işlemi sırasında çeşitli yönleri kontrol edilebilir gerekiyor: zaman ve verimlilik etiketleme, spike oranı, ayıklama Protokolü ve biotinylation etkinliği (dahil olmak üzere sinyal-gürültü oranı), diğerleri arasında. Bu koşullar yoğun ve sistemli bir şekilde başkaları tarafından7,10,11gösterilmiştir. Burada esas olarak yorumu ve örnekleri, RT-qPCR, Mikroarray veya sıralama tarafından işlenen bir kez gerçekleştirilen hemen analiz ele. DESTAN mutant gibi S. cerevisiae durumunda mRNA sentezi, sadece dramatik genel azalma tespit etmek için güç yöntem farklı mutant suşları analizleri göstermek suşları, aynı zamanda RNA polimeraz II etkinlik çok hafif bir azalma histon H2B monoubiquitination bastırılması.

Bizim analizleri destan enzimatik faaliyetleri kromatin15seviyelerinde destan mutant suşları mRNA kararlı durum analizi tarafından ortaya değil, geniş bir işe alım önerdi. RNA polimeraz II işe alım destan inactivation Engelli olduğu gibi mRNA sentezi oranları genel olarak etkilenir olup olmadığını çözümlemek karar verdik. Bu nedenle, vahşi-türü veya mutant S. cerevisiae suşları 4tU yeni transkripsiyonu RNA'ların etiketlemek için bir 6 dk süre maruz. Spike, etiketli hücreleri (S. pombe) oranı 3:1 ile karıştırma sonra toplam RNA ayıklandı ve yeni sentezlenmiş RNA biotinylated ve Şekil 1' de gösterilen chronogram olduğu gibi burada anlatılan protokolüne göre saf. Etiketli RNA'ların tümü saf ürün miktarı herhangi bir aşağı akım uygulama için yeterli olacağını sağlanması RNA'ın 200 µg arasından saf. Bir başlangıç ve sistematik önce adım herhangi bir genom geniş analizi, yeni sentezlenmiş RNA arıtma RT-qPCR tarafından doğrulandı. Genlerin ifade, yasal yollar ve farklı RNA polimeraz bağımlılığını düzeyini de dahil olmak üzere farklı parametrelere göre seçildi.

Bu iletişim kuralı özel olarak etiketlenmiş RNA arındırır onaylamak için kesirler ile ya da ezelî 4tU kültürlü vahşi tipi hücrelerden saf transkript düzeyleri sayılabilir. İhmal edilebilir arka plan düzeyde analiz RNA'ların 4tU için maruz bırakılmamalıdır hücrelerden algılandı (Şekil 2A). Yeni transkripsiyonu RNA arıtma daha fazla intron içeren ACT1 pre-mRNA (veri gösterilmez) gözlenen zenginleştirme tarafından doğrulandı. MRNA sentezi destan karmaşık derleme bozmaya bilinen SPT20, silme etkilenir olup sonra doğrulama örnekleri kalitesi test ettik. Başkaları tarafından bildirildiği gibi çoğunlukla değişmeden veya hafif düşük seviyeleri test genler (Şekil 2B) için toplam (kararlı durum) RNA spt20Δ zorlanma üzerinde gerçekleştirilen mRNA miktar saptandı. BRE1 için (Şekil 2B) silinmiş suşları için benzer sonuçlar elde edilmiştir. Buna ek olarak, spt20Δ zorlanma yeni transkripsiyonu RNA Analizi mRNA sentezi dramatik bir düşüş üç tarafından ortaya-için beş kat için tüm test genler (Şekil 2C). Bre1 kaybı okudu genler (Şekil 2C) için yeni sentezlenmiş mRNA düzeyleri daha dikkatli ama hala görünür azalmasına yol açtı. RNA polimeraz II transkripsiyon destan ve Bre1 bir rol ile iyi anlaşma içinde Spt20 veya Bre1 kaybı ifade etkilemez mi RDN25 veya snR6 genler, transkripsiyonu RNA polimeraz tarafından ben ve RNA polimeraz III, sırasıyla ( Şekil 2C).

Ancak, SPT7 veya SPT20, gibi karmaşık efsanesinin yapısal alt birimleri için silinmiş suşları gözlenen transkripsiyon değişiklikler için sorumlu olabilir şiddetli yavaş büyüme fenotipleri görüntüler. Koşullu olarak çekirdek Spt7 aküsü tükenmek üzereyken istenmeyen ikincil etkileri, hükmetmek,14,24bağlantı koyma S. cerevisiae kullanarak suşları. Rapamycin tedavisi, nabız etiketleme ile 4tU önce 60 dk üzerine (şematik Gösterim için Şekil 1 bakınız), yeni kopya etmek mRNA düzeyleri silme zorlanma (2EŞekil 2B ve gözlenen olarak benzer bir ölçüde azaltılmış ). Bu analiz, böylece, eski sonuçlarımız doğruladı ve iletişim kuralı bu indüklenebilir tükenmesi sistem için doğrulanmış. Nereye hücreler bir süre 0 ile 240 min kapsayan için rapamycin sinin, bir zaman ders analizde, azaltılmış ifade hemen ilaca maruz kalma 15 dk sonra kanıtı. Daha da ilginci, kararlı durum mRNA düzeyleri başlangıçta azaltmak olarak gördüler ama 60 dakika sonra bir telafi mekanizması yer arada (Şekil 2E) alır bir göstergesi normal seviyelere döndü.

Tamamen, etiketleme ve miktar yeni sentezlenmiş RNA'ın destan kompleks için yeni yasal rolleri ifşa izin. Açıklanan protokolü de RNA polimeraz II etkinlik orta etkileri ortaya ve başarılı bir şekilde uygulanan koşullu tükenmesi maya suşları oldu.

Arıtılmış yeni sentezlenmiş RNA aşağı akım uygulamalarda biridir Mikroarray hibridizasyon kullanarak veya (4tU-seq) sıralama tutanaklar bir genom çapında miktar. Yüksek işlem hacmi sıralama ise daha hassas nicel ve bilgilendirici Mikroarray hibridizasyon küresel mRNA düzeyleri değiştirilmiş olup olmadığını belirlemek çok yararlı olabilir. Normalleştirme önemli nerede bu bağlamda bir spike organizma analiz etmek amaçlı örnek eklendi. Özellikle, biz S. cerevisiae hücreleri S. pombe hücreleri oranı 3:1, hem de daha önce açığa 4tU için karışık. Arıtılmış, etiketli RNA'ların yüksek üretilen iş sıralama için tabi olan, herhangi bir standart kitaplığı hazırlık protokolü, ribozomal RNA tükenmesi en sık takip kullanılabilir. 4tU-seq verilerden farklı örnekleri arasında normalleştirme ekleyerek de RNA farklı türler (Yani, karıştırma S. cerevisiae ve S. pombe hücreler olarak yukarıda)22 veya içinde vitroetiketli yapılmıştır- transkripsiyonu RNA12,25,26,spike-in thiolated27. Piyasada bulunan Mikroarray cips probları tomurcuklanma ve fisyon mayası, mRNA miktar her iki organizmalar bir tek denemede sağlayan tüm transcriptome için içerir. Mikrodizi hybridizations (yaban tipi, spt20Δ ve bre1Δ) belirtildiği gibi RT-qPCR tarafından doğrulanmış toplam ve yeni sentezlenmiş RNA ile gerçekleştirilmiştir. Buna ek olarak, biz bir gerginlik, does değil çekmek histon H2B, nokta mutasyon ubiquitinable kalıntı (K123R) ile monoubiquitination dahil. S. pombe hücre kesin aynı oran kullanılmıştır çünkü farklı örnekleri ve çoğaltır, doğrusal olarak diziler yeniden Ölçeklendir mümkündür yoğunluklarda böylece toplam ve etiketli S. pombe probları var aynı ortalama yoğunlukta. Bu normalleştirme veya rescaling, Patrick Cramer laboratuvar tarafından geliştirilen bir Bioconductor paketi kullanılarak yapılır ve paralel tüm analiz örnekleri, toplam olarak kullanılır ve kesirler ve vahşi-türü ve mutant suşları8etiketli. Kısaca, bu boru hattı giriş tüm örnekleri ve kesirler için sondalar ve onların yoğunluğu (MAS5 veya RMA) içeren bir Excel dosyası vardır. Algılama aralığı dışında probları hariç sonra sinyal şiddeti, S. pombe probları yoğunluk değerleri dikkate alarak boyutlandırılan. Son olarak, spike-in için normalleştirilmiş ifade değerleri içeren bir matris ile biten tomurcuklanma ve fisyon mayası genleri, için sondalar eşleyebilirsiniz. Bu değerler daha fazla olabilir (sonraki bölümüne bakın) işlenen veya olduğu gibi kullanılabilir. Aşağıdaki örnekte, biz kat her transkript mutant ve vahşi-türü zorlanma arasındaki değişikliği tespit.

Analizler her iki kararlı durum için gerçekleştirilen yeniden veya yeni sentezlenmiş RNA düzeyde ve istatistiksel öneme karşı çizilen (p-değeri) (Şekil 3). Diğer çalışmalar sadece birkaç genleri değiştirilmiş, onların ifade vardı, toplam RNA düzeyleri analiz edildi, anlaşarak up - veya downregulated (Şekil 3A-3 C). Ancak, yeni transkripsiyonu RNA Analizi çarpıcı farklı sonuçlara yol açtı. Yeni kopya etmek mRNA düzeyleri 4000'den fazla gen tarafından en az azaltılacağını düşündüren küresel üzerinde olumlu bir etkisi destan RNA polimeraz II transkripsiyon tomurcuklanma Mayalar (Şekil 3D SPT20, silme işlemini üzerine iki kat ). Ayrıca, bre1Δ ve K123R mutantlar sonuçları daha dikkatli: çoğu genler azaltılmış onların ifade var göründü ama ölçüde downregülasyon ve önemli ölçüde etkilenen genler (≈ 300-500) sayısı gerçekten fazla oldu sınırlı (Şekil 3E ve 3F).

Daha önce bahsedilen, kararlı durum veya toplam düzeyleri mRNA sentezi ve çürüme (Şekil 4A) arasındaki sıkı denge tarafından dikte edildiği gibi. RNA polimeraz II transkripsiyon genel olarak bozulmuş olduğunda iki senaryo hayal: (i) Toplam mRNA düzeyleri azaltmak genel olarak azaltılmış sentez ama sabit çürüme yanıt olarak veya (ii) mRNA yıkımı aynı ölçüde azaltılması elde edilen çoğunlukla değişmeden kararlı durum mRNA seviyelerinde. Belgili tanımlık ikinci senaryo SAGA veya TFIID bozulma9,10,14,16,22bağlamında dahil olmak üzere çeşitli koşullar bildirilmiştir. Karşılaştırmalı dinamik transcriptome Analizi (cDTA) adlı bir yordam 4tU etiketleme üzerinde temel ve dinamik kinetik modelleme mRNA sentezi belirlemek ve çürüme oranları her transkript8,10için anlaması için bize izin verir. Bir kez daha, biz daha önce bahsedilen suşları için (vahşi-türü, spt20Δ, bre1Δ ve K123R) toplanan verileri kullandı. , SPT20, silme beklendiği gibi vahşi tipi zorlanma için karşılaştırıldığında sentezi ve yıkımı oranları mRNA eşzamanlı bir düşüş görülmektedir. Bu mutant suşu tazminat hemen hemen en uygun olan, ortalama sentez 3.8-fold azaltmak ve ortalama 4.1-fold (Şekil 4B), yalnızca sınırlı transkripsiyon değişiklikler neden olabilir corroborating ve çürüme azaltmak Toplam mRNA düzeyde (Şekil 3A) algıladı. İki diğer mutant suşları içinde (bre1Δ ve K123R), ayrıca mRNA sentezi ve çürüme eşlik eden değişiklikler gözlendi, ama çok daha küçük bir ölçekte değişiklik olduğunu ve daha fazla (Şekil 4 c ve 4 D) dağınık.

Figure 1
Resim 1 : Metabolik 4tU kullanarak RNA etiketleme, şematik Gösterim. Taze hazırlanmış 4tU kültür ortamına eklenir ve 6 dk. Labeled S. cerevisiae hücreleri etiketlenir ve S. pombe hücre oranı 3:1 karışık ve toplam RNA elde edilir. Daha sonra yeni sentezlenmiş RNA biotinylated olduğunu ve manyetik boncuklar streptavidin kaplı kullanarak saf. Son olarak, toplam (kararlı durum) RNA ve etiketli yeni sentezlenmiş RNA aşağı akım uygulamaları, dahil olmak üzere RT-qPCR ve Mikroarray hibridizasyon veya sıralama çeşitli kullanılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Transkripsiyon değişiklikleri her iki kararlı durum ve yeni tasvir analiz RT-qPCR tarafından belirlenen RNA transkripsiyonu. Beş farklı genler (A) RNA düzeyleri ya sinin vahşi tipi hücrelerden veya 4tU için değil saf etiketli RNA kesir üzerinden sayısal. Sonraki iki panel (B) toplam göstermek ve (C) yeni sentezlenmiş RNA miktar RT-qPCR tarafından vahşi-tipi (WT), spt20Δ ve bre1Δ Maya hücreleri için. Tedavi edilmezse veya 60 dk, rapamycin ile tedavi Spt7 çapa koyma suşları, 4tU ile etiketli ve (D) Toplam veya (E) yeni RNA transkripsiyonu RT-qPCR tarafından sayılabilir. (F) Bu panel değişiklikleri kararlı durum ve yeni zaman ders analizini mRNA Spt7 nükleer tükenmesi sentezlenmiş gösterir. Tüm örnekleri için mRNA düzeyleri beş RNA polimeraz II genler için RT-qPCR tarafından sayısal. RNA polimeraz ben ve RNA polimeraz III genler (RDN25 ve snR6, sırasıyla) denetimi olarak kullanılmıştır. İfade değerleri içinde çivili S. pombe için normalleştirilmiş (± SD üç bağımsız deneyler demek) sinyal ve 1 denetim örnek olarak ayarlayın. Panelleri D-F Baptista vd değiştirilme tarihi 14. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Genom çapında analizler toplam veya etiketli RNA kesirler kullanarak mRNA düzeylerinin. Bu paneller volkan arsalar gösteren kat değişiklikleri (A-C) kararlı durum mRNA düzeylerinde veya (D-F) yeni sentezlenmiş mRNA düzeyleri öneme göre göstermek (p-değeri). Kat değişiklikleri (FC) normalleştirme için (A ve D) spt20Δ S. pombe donanımdaki sinyalin sonra her gen ifade değerini oranını log2 hesaplanmıştır (B ve E) bre1Δ veya () C ve F) K123R vahşi tipi S. cerevisiaeiçinde karşı aynı gen ifade değerini süzün. 5,385 genler toplam analiz ve iki kat eşikleri değiştirmek (mavi nokta: bir iki kat fazla azaltmak; sarı nokta: bir iki kat artış daha fazla) ve 0,05 p-değerler olarak kabul. Paneller A ve D Baptista vd değiştirildi 14. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Paralel mRNA sentezi değişiklikler ve mRNA tampon mRNA decay sonuçlanır. (A) Bu panel kararlı durum RNA düzeyde şematik gösterimi, RNA sentezi pertürbasyon sonucunu gösterir. (B-D) Bu paneller mRNA sentezi ve çürüme oranları analizler toplam ve yeni sentezlenmiş RNA'ın üzerinden hesaplanması göster. Sentez ve çürüme oranları her S. cerevisiae transkript (B) spt20Δ, bre1Δ (C) ve (D) K123R için belirlenmiştir. Sentez (mutant ve vahşi-türü arasındaki oran log2 hesaplanır) yapılan değişiklikler çürüme oranları karşı çizildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Transkripsiyon değişiklikleri analiz etmek için genom çapında araçları hala gelişiyordu iken, RNA'ın kararlı durum düzeyleri miktar üzerinden transcriptome tek analizini doğru değişiklikleri RNA polimeraz II etkinliğinde yansıtmıyor. Nitekim, mRNA düzeyleri sadece RNA sentezi tarafından aynı zamanda kendi olgunlaşma ve yıkımı tarafından düzenlenmektedir. MRNA yıkımı edilişi mRNA sentezi ölçmek için farklı protokolleri Maya ve memeliler doğmakta olan transkripsiyon analizi için son yıllarda geliştirilmiştir.

Yeni doğmakta olan transkripsiyon miktar için en çok kullanılan iletişim kurallarından birini GRO-seq1' dir. GRO-seq'ın ana avantajı yüksek çözünürlükte ve düşük arka plan transcriptionally nişanlı ve aktif polimeraz açıklayacak kapasitesini olmakla birlikte, onun çekiciliğini azaltmak iki ayrı nokta vardır: (i) Bu teknik olarak zordur ve gerektirir çekirdeği ve (ii) çekirdeği manipülasyonlar yalıtım sistemi28bazı tedirginlikler tanıtmak. Başka bir 3' ucu üzerine doğmakta olan RNA, şablon DNA ve RNA polimeraz II arasında oluşan son derece kararlı Üçlü Kompleks immunoprecipitation elde edilen tutanaklar sıralama dayanan NET-seq alternatiftir. Bu yaklaşım bir baz çifti çözünürlükte doğmakta olan RNA'ların karakterizasyonu sağlar ve değiştirilmiş RNA polimeraz II immunoprecipitation aracılığıyla mRNA işleme etkinlikler keşfedebilirsiniz (serin-5 fosforilasyon, örneğin)2,3 , 29. Bununla birlikte, hangi biz üç vurgulamak bazı engeller sunar. Birincisi, RNA polimeraz II hedefleme antikorlar genellikle çok özel olmakla birlikte, antikor verimliliği üzerinde bağlıdır. İkinci olarak, RNA böylece bize geri önceki konuya lider bozulması kuluçka dönemleri sırasında eğilimli olabilir (daha az verimli antikorlar süreleri, RNA bozulma daha duyarlı bırakarak daha uzun kuluçka gerektirebilir)29. Üçüncü ve özellikle içinde memeliler, MNase sindirim ve boyut seçimi benzersiz sıra hizalama29,30dışarıda.

Burada biz yeni sentezlenmiş RNA metabolik etiketleme için detaylı bir protokol kullanılabilir diğer yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında farklı avantajları vardır S. cerevisiae 4tU kullanılarak sunulan. Transkripsiyon tedirginlikler için son derece hassas olduğu için hücreleri en fizyolojik koşullarda saklanması gerekebilir. Örneğin, GRO-seq transcriptionally nişanlı RNA polimeraz II hücre/çekirdek maruz kalma sarkosyl aracılığıyla tutuklanması anlamına gelir. Ancak, sarkosyl tedavi inhibitör çeşitli hücresel11olarak tanımlanmıştır. Bu durumda, 4tU veya 4sU açıklanan konsantrasyon, metabolik etiketleme sigara perturbing ve gözle görülür hücre homeostazı, özellikle kısa süre maruz kalma etkilemez. Transkripsiyon inhibisyon mRNA yarı-hayat ölçmek için kullanarak diğer yöntemler aksine, cDTA veya 4tU-seq ve montaj dinamik modelleme ile soğukkanlı hücrelerdeki her tek mRNA yıkımı oranları belirler. Bu nedenle, bir tek yöntem aynı anda hem sentezi ve belirli hücre türü üzerinde bütün transcriptome çürüme oranları ele alabilir. CDTA veya 4tU-seq son derece güvenilir normalleştirme yöntemlerden yararlanır beri yani spike-in, kullanım farklı veri kümeleri olabilir birlikte analiz ve doğrudan karşılaştırıldığında. Son olarak, metabolik etiketleme ve miktar yeni sentezlenmiş RNA'ın herhangi bir belirli donanım gerektirmez gibi herhangi bir moleküler biyoloji laboratuarında kolayca uygulanabilir bir teknik olduğunu. Bu büyük olasılıkla daha fazla sistematik olarak RNA üretim ve yıkımı Mayalar, yanı sıra yüksek ökaryotlarda keşfetmek için kullanılmak üzere eğilimi bu teknik oldukça büyük yayılması açıklar.

RNA canlı hücreler diğer nükleozit analogları, yani 5-bromouridine (BrU)31,32 veya 5-ethynyluridine (AB)33,34kullanarak etiketli. Nabız-RNA etiketli BrU yalıtım deneyler arasında farklı verimliliği olabilir anti-BrdU antikor arıtma kullanır. EU etiketli RNA kovalent tıklayın Kimya azalan bakiyeli ajanlarla ters thiol değişiklik aksine sigara tersinir konjugasyon önde gelen kullanarak biotin için Birleşik. BrU ve EU etiketleme memeli hücrelerinde genom çapında RNA çürüme oranları31,32 belirlemek için veya yeni doğmakta olan RNA sentezi34,35değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ancak, BrU veya AB etiketleme S. cerevisiaeiçinde tanımlanmıştır değil. Nitekim, nükleozit analogları alımını nükleozit ışınlama ifadesi gerektirir ve böylece, bu yöntemler ile 4tU etiketleme daha mayası içinde daha az esnek görünür.

4tU etiketleme süre adapte edilebilir ve soru göre değişir. S. cerevisiae, 6 dk kısa bir etiketleme darbe sentezinde sağlar mRNA değerlendirirken yeni kopya etmek mRNA düzeyleri en az RNA bozulması tarafından etkilenir. Önce değiştirilmiş nükleotit doğmakta olan RNA dahil edilebilir gecikme süresini az 1 dk olduğunu düşünürsek, bu 6-min etiketleme süre yeni sentezlenmiş RNA makul bir miktarda saflaştırılmış garanti eder. Böyle protokol Miller vd tarafından tanımlandığı şekilde, 11, kullanılan farklı S. cerevisiae içinde mutantlar mRNA sentezi ve RNA global değişiklikler ortaya çıkarmak için9,10,22,26,27, çürüme. 36. artık bu etiketleme süresi (3 h) S. cerevisiae12. tüm mRNA'ların çürüme oranları belirlemek için 4tU ile etiketleme metabolik bir darbe kovalamaca kullanıldı Son olarak, son derece kısa (üzerinden 1,5 dk) 4tU etiketleme RNA işleme kinetik tomurcuklanma ve fisyon mayası13,25,37incelemek için kullanılmıştır.

Yine de, bu yöntem nispeten düşük verim etiketli RNA tüm iletişim kuralı sonunda iyileşti gibi bazı sınırlamalar vardır. Özellikle bu protokolü ise süre Maya, Başlangıç materyali hiçbir sınırlama yoktur ve bu bir sorun olabilir metazoan hücreleri çözümlerken, varlık içinde vivokullanılmaktadır. Biotinylation olan verimlilik uzak tamamlandıktan ve bir üç 4sU kalıntılarında etiketli RNA5değiştirmek için tahmini etiketli RNA havuz, iletişim kuralının sınırlayıcı adımlardan biri. Son zamanlarda bu methanethiosulfonate (MTS) kullanımını gösterdi-biotin, biotin-HPDP, yerine kurtarılan RNA38verimini artırır. Ancak, bu araştırma grubu yayınlanmamış sonuçlarından ve sonuçları Rutkowski ve Dölken göre MTS-biotin tam thiol etiketli RNA özellikle sorunlu zaman düşük miktarda olan etiketlenmemiş RNA, arınma için önde gelen çoğu özgü, değildir Arıtılmış39. Metabolik etiketleme 4tU/4sU kullanarak başka bir sınırlama hangi RNA polimeraz hisli doğasında hızıdır. RNA polimeraz II ortalama hızı yaklaşık 3.5 kb/dak40,41,42olarak tahmin edildi. Bu nedenle, etiketleme 6 dk içinde polimeraz kapasitesi 15-20 kb uyarlamak için olur. Böylece, bir kısa darbe-etiketleme ile 4tU/4sU ile bir deneyde, sadece 3' sonunda yeni transkripsiyonu RNA parçası etiketli, 5' uç bölgeleri 4tU/4sU toplamadan önce önceden varolan iken. Böylece, etiketli RNA'ların arıtma da önceden var olan uçları 5' tutanaklar, özellikle için olduğu gibi memeli hücreleri uzun transkript zenginleştiriyor. TT-seq, adlı bir rafine Protokolü içinde bu önyargı üstesinden gelmek için ayıklanan RNA etiketli sonication yeni sentezlenmiş türler43arıtma önce tarafından parçalanır.

Özet olarak, 4tU-seq adres transkripsiyon değişiklikleri belirli bir bağlamda için mükemmel bir yoldur. Yine de, ve protokol oldukça basit olmakla birlikte, sonuçta nispeten geniş olmak birkaç farklı adımlardan oluşur. Bu iletişim kuralı RNA başından sonuna kadar işler, her şeyden önce temiz ve bozulma ücretsiz örnek için gereken tüm koşulları yerine getirilmesi zorunlu çünkü. Bu nedenle, tüm reaktifler RNase free olmalı ve tüm malzemeler RNA, her şeyi iyice ve düzenli olarak temizleme RNase Dekontaminasyon solüsyonu ile işleme için ayrılmış olması. Biotin tepki çok özel olsa da, ikinci olarak, tepki vermedi biotin HPDP fazlalığı (streptavidin boncuk ile kovalent RNA, örneğin bağlı değildir biotin doygunluk) önlemek için örnek üzerinden kaldırılması gerekir. İletişim kuralında, açıklandığı gibi üçüncü, belirtilen streptavidin kaplı manyetik boncuklar kullanımı tavsiye edilir, birkaç biz gruplar araştırma beri konuştuk tüm bu boncuklar arka plan düzeyleri daha düşük yol açtı belirtti. Dördüncü olarak, uygun kalite ve deneysel kontrolleri kullanılmalıdır. 4tU/4sU için maruz bırakılmamalıdır hücrelerden elde edilen örnekler içerir. Bu örnekler adresi arka plan düzeyleri için çok değerli olacak ve deneme sırasında emin olmak için etiketli RNA ile kirlenme meydana gelmez. Ayrıca, örnek için yeni sentezlenmiş RNA zenginleştirilmiş olup olmadığını sınamak için başka bir mükemmel bir RT-qPCR gerçekleştirmek için alternatiftir karşı bir intro içeren gen primerler kullanılarak. Astar 3' ucu ve 5' ucuna iki ardışık exon ve intron veya tersitamamlayıcı olmalıdır. Son olarak, Mikroarray hibridizasyon sıralama önce RT-qPCR tarafından örnekleri doğrulamak. Bunun için farklı düzeylerde ifade ve yönetmelik ile farklı genler seçilen analiz ve. En iyi şekilde, bu RNA (kararlı durum ve yeni sentezlenmiş RNA) iki farklı bölümler için yapılmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Onun desteği için Laszlo Tora ve V. Fisher, K. Schumacher ve F. El Saafin kendi tartışmalar için teşekkür ederiz. Tüberküloz Marie Curie-ITN Bursu (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) tarafından desteklenen ve Fondation ark. Bu eser fonlarından Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda ANR-10-LABX-0030-INRT, Agence Nationale de la Recherche çerçeve programı Investissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02 altında tarafından yönetilen bir Fransız Devlet fonu tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Thiouracil Sigma-Aldrich Cat# 440736
Rapamycin Euromedex Cat# SYN-1185
Countess II FL Automated Cell Counter ThermoFisher N/A
RiboPure RNA Purification kit, yeast ThermoFisher Cat# AM1926
NanoDrop 2000 Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
TURBO DNA-free Kit ThermoFisher AM1907
EZ-Link HPDP Biotin ThermoFisher Cat# 21341
Thiolutin Abcam ab143556
µMACS Streptavidin kit Miltenyi Biotec Cat# 130-074-101
Transcriptor Reverse Transcriptase Roche 03 531 295 001
SYBR Green I Master Roche 4707516001
GeneChip Yeast Genome 2.0 ThermoFisher 900555
GeneChip Fluidics Station 450 ThermoFisher 00-0079
GeneChip Scanner 3000 7G ThermoFisher 00-0210

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
  2. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469, (7330), 368-373 (2011).
  3. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 4 Unit 4 11-17 (2012).
  4. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, (2), 232-237 (2005).
  5. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, (9), 1959-1972 (2008).
  6. Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (15), 6164-6169 (2007).
  7. Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
  8. Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28, (6), 884-885 (2012).
  9. Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52, (1), 52-62 (2013).
  10. Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22, (7), 1350-1359 (2012).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
  12. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22, (15), 2787-2795 (2011).
  13. Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12, (2), 857 (2016).
  14. Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68, (1), 130-143 (2017).
  15. Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28, (18), 1999-2012 (2014).
  16. Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68, (1), 118-129 (2017).
  17. Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13, (4), 573-585 (2004).
  18. Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405, (6787), 701-704 (2000).
  19. Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42, (4), 536-549 (2011).
  20. Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518, (7539), 376-380 (2015).
  21. Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39, (12), 5025-5035 (2011).
  22. Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63, (3), 433-444 (2016).
  23. Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153, (5), 1000-1011 (2013).
  24. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31, (6), 925-932 (2008).
  25. Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20, (10), 1645-1652 (2014).
  26. Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66, (1), 77-88 (2017).
  27. Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741 (2017).
  28. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13, (10), 720-731 (2012).
  29. Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11, (3), 413-428 (2016).
  30. Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8, (1), 53822 (2013).
  31. Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9, (11), 1370-1379 (2012).
  32. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22, (5), 947-956 (2012).
  33. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (41), 15779-15784 (2008).
  34. Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358, (6359), 119-122 (2017).
  35. Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68, (5), 872-884 (2017).
  36. Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155, (5), 1075-1087 (2013).
  37. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
  38. Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59, (5), 858-866 (2015).
  39. Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
  40. Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14, (9), 796-806 (2007).
  41. Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10, (4), 605-618 (2015).
  42. Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16, (11), 1128-1133 (2009).
  43. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352, (6290), 1225-1228 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics