Author Produced

الاتصال الجنسي من المثقبيات الأمريكية من الذكور والإناث إلى الأصحاب ساذج

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

مثقبيه الكروزية وكيلاً لمرض شاغاس تنتج الالتهابات أعراض طويلة الأمد التي تتحول فجأة إلى الأمراض سريرياً المعترف بها. بروتوكول البحث التالية توضح دراسة المدى القصير وبائية القائم على الأسرة لكشف الكروزية ت. العدوى تنتقل جنسياً من الأصل إلى النسل.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Almeida, A. B., Araújo, P. F., Bernal, F. M., Rosa, A. d., Valente, S. A., Teixeira, A. R. Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates. J. Vis. Exp. (143), e57985, doi:10.3791/57985 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

داء المثقبيات الأمريكي ينتقل إلى البشر بالبق triatomine عن طريق ابتلاع الأغذية الملوثة، بنقل الدم أو عن طريق الخطأ في المستشفيات والمختبرات البحثية. وباﻹضافة إلى ذلك، ينتقل العدوى مثقبيه الكروزية خلقيا من أم تشاجاسيك إلى نسلها، ولكن مساهمة الشريك الذكر للتلوث داخل الرحم غير معروف. وتوحي نتائج أعشاشها وكتل من amastigotes ومن trypomastigotes في الخلايا القراب المبيض وجونيابلاستس في التجويف الخصي تنتقل العدوى الكروزية. ت. . بروتوكول البحث هنا يعرض نتائج جمهرة الدراسة الأسرة يظهر الطفيلي الحمض النووي في خلايا الدم مثنوية وحيدات النوى وفي الأمشاج فرداني من البشر. وهكذا، أكدت ثلاث عينات بيولوجية مستقلة جمعها سنة واحدة وبصرف النظر أن ت الكروزية العدوى كانت تنتقل إلى ذرية. من المثير للاهتمام، المحددة جسم الكروزية ت. كان غائبا في معظم ذرية الأسرة التي تتحمل التسامح المناعية للمستضد الطفيلي. التسامح المناعي تجلى في الدجاج الصهر إلى الكروزية ت. بعد الأسبوع الأول من النمو الجنينية والكتاكيت التي فقست من البيض تلقيح السوطيات غير قادر على إنتاج الأجسام المضادة المحددة. وعلاوة على ذلك، أنزل تقطير المني البشري إينترابيريتونيلي أو في المهبل من السذاجة الفئران أسفرت عن amastigotes الكروزية. ت. في البربخ وأنبوب سيمينيفيروس، الاسهر وأنبوب الرحم مع عدم وجود التهابات ردود الفعل في أجهزة المناعة المميز للاستنساخ. تربية الكروزية. ت.-الفئران الذكور والإناث المصابة مع الأصحاب ساذجة أدت إلى اكتساب العدوى، التي أحيلت لاحقاً إلى الذرية. وبالتالي، يعتبر برنامج قوي التعليم والمعلومات والاتصالات يشمل السكان والمنظمات الاجتماعية اللازمة لمنع مرض شاغاس.

Introduction

بروتوزوا مثقبيه الكروزية تنتمي إلى عائلة تريبانوسوماتيداي يخضع لمراحل دورة الحياة تريبوماستيجوتي وأماستيجوتي في الثدييات المضيفين وموجود ابيماستيجوتيس في الحشرات ناقلات الأمراض (الرضوفي: Triatominae) القناة الهضمية وفي الثقافة أكسينيك. في العقود الأخيرة، أظهرت العديد من الدراسات وجود مرض شاغاس في البلدان في القارات الأربع تعتبر triatomine الشوائب الحرة1،2،3،،من45، 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13؛ تشتت المثقبيات الأمريكي يعزى في البداية إلى المهاجرين من أمريكا اللاتينية إلى نصف الكرة الشمالي، ولكن يمكن لم يعد رفض إمكانية أن بعض من حالات مرض شاغاس أصلي3،4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14-وقد تم المسند المصدر الذاتية يمكن التعرف عليها فقط من انتقال الكروزية. ت. نقل الأم تشاجاسيك الطفيلي إلى الذرية في حوالي 10% من حالات الحمل15؛ وظلت مساهمة الشريك الذكر بالتهابات في الرحم عن طريق السائل المنوي الدفقات غير المعترف بها.

قبل أكثر من قرن من الزمان ولاحظ المحققون16،17 داخل الخلايا الكروزية. ت. amastigotes في الخلايا القراب المبيض والجرثومية خط خلايا الخصيتين للحالات الحادة من مرض شاغاس. أعشاشها وكتل الكروزية. ت. trypomastigotes و amastigotes في خلايا القراب المبيض، وفي جونيابلاستس وفي التجويف الخصي (الشكل 1) للحالات المميتة الحاد مرض شاغاس تطوير امتياز الحصانة في أجهزة استنساخ في الغياب الالتهابات تتسرب18،19. في العقود الأخيرة، عدد قليل من الدراسات التجريبية قد أظهرت أعشاش أشكال الكروزية. ت. أماستيجوتي جولة في أنبوب سيمينيفيروس والبربخ، و الاسهر كذلك كما هو الحال في الرحم والأنابيب والمبيض خلايا القراب من الفئران المصابة حادة 120،،،من2122. وعلاوة على ذلك، من خلال دراسات الأسرة لتوثيق نقل بروتوزوا تم التحقق من الحمض النووي من مرضى داء شاغاس الأبوية لذريتهم، الحمض النووي الكروزية. ت. (ندنا) في الخلايا الجرثومية فرداني البشرية خط23، و ولوحظت في الدفقات تشاجاسيك الفئران24مراحل دورة حياة الطفيلي. هذه النتائج الاتفاق مع تقارير عن التسامح المناعي حققته الذرية الكروزية. ت.-إصابة المضيفين في حالة عدم وجود جسم محدد1،،من2526. بالإضافة إلى ذلك، التقارير الوبائية التي اقترح انتشار مرض شاغاس متوطن إلى سائر القارات3،4،5،6،7،8 ،،من910،11،،من1213 معتمدة الآن بالدراسات التجريبية التي تبين أن داء شاغاس يمكن أن تنتقل عن طريق الاتصال الجنسي1 . التحقيق الحالي ويعرض على بروتوكول دراسة الوبائية أسرة ويبين أن ت الكروزية العدوى ينتشر عن طريق الاتصال الجنسي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الإنسان ولجان بحوث الحيوان من "كلية الطب التابعة" لجامعة برازيليا وافق جميع الإجراءات مع البشر والحيوانات المختبرية، على التوالي، في بروتوكولات البحوث 2500.167567 و 10411 2011. وافقت "لجنة الأخلاقيات" العام مؤسسة مستشفى غاسبار فيانا (البروتوكول رقم 054/2009 وهذا 11163/2009) أشكال الموافقة الحرة للدراسة الميدانية، مع ملحق لوزارة "الصحة اللجنة الوطنية" المعنية "البحوث البشرية" (هذا 2585/04). تم تعديل البروتوكول لتقييم الكروزية ت. الحمض النووي في خلايا الدم مثنوية وحيدات النوى وفي الأمشاج فرداني من الدفقات السائل المنوي. الحيوانات المختبرية وتلقى الرعاية الإنسانية؛ وكانت الفئران، تعرض لثقب القلب قبل التضحية، تحت التخدير.

1-تجنيد المشاركين البشرية

  1. ضمان أن يشارك فريق البحث في "برنامج مرض شاغاس نظام الصحة" تقديم الرعاية الصحية لمرضى داء شاغاس.
  2. تعيين المشاركين البشرية من الأسر المسجلين في البرنامج، تظهر حالة واحدة على الأقل مع الحمى والشعور بالضيق، والصداع، وعدم انتظام دقات القلب وذمة، الأعراض السريرية الرئيسية ل مرض شاغاس الحادة14.
  3. تقديم الرعاية الصحية للناس في أسر الدراسة لمدة خمس سنوات.
  4. الحصول على 15 مل دم الوريدي من المشاركين في الدراسة في ثلاث مناسبات سنة واحدة عن بعضها البعض وتقسيم العينة إلى ثلاثة مل 5 مختبرين وتخزينها في الثلاجة على 4 درجة مئوية.
  5. جمع 2 مل الدفقات السائل المنوي من أفراد الأسرة البالغين المتطوعين والمضي قدما كما هو موضح في الخطوة 3، 3.

2-نمو الطفيليات

  1. استخدام قاسمة من الخطوة 1، 4، خلط الدم مع 5 وحدات للتجلط صوديوم الهيبارين؛ جعل ثقافة منحدر بتلقيح الدم من المشاركين الأسرة مع تشخيص مرض شاغاس الحادة.
    1. تلقيح 5 مل الدم البشري أونكلوتيد إلى 50 مل ملولبة أنبوب الدم-أجار مائل بالإضافة إلى 5 مل من الكبد ضخ-تريبتوسي المتوسطة (ليرة)، واحتضان العينة في شاكر عند 27 درجة مئوية لمدة 3 أشهر.
    2. ضع 100 ميليلتر من المتوسط طافية فوق الشرائح الزجاجية، وتغطي مع كشوف والبحث عن الدم ابيماستيجوتيس الكروزية ت تحت المجهر، كل أربعة أسابيع.
    3. حصاد يعزل ابيماستيجوتي في المادة طافية من أكسينيك يره المتوسطة عند 27 درجة مئوية؛ تغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4، أجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 10 دقائق؛ تمييع ابيماستيجوتيس في بيليه في 5 مل من تعديل في دولبيكو الأساسية المتوسطة (دميم).
    4. تطعيم العضلات L6 المتلاقية خلية ثقافة قوارير يعزل مع 1 × 106 ECI1 إلى ECI21 الكروزية. ت. ابيماستيجوتي.
    5. تنمو الكروزية. ت. ECI1 إلى ECI21 و trypomastigotes ركبة برنيس في الثقافات الخلية العضلات L6 في قوارير الثقافة 75 مل.
    6. تغذية الخلايا مع 15 مل دميم على درجة الحموضة 7.4 تستكمل مع 5% مصل بقرى الجنين، البنسلين 100 وحدة دولية/مل، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، 250 نانومتر لام الجلوتامين، و 5% CO2 في1من 37 درجة مئوية.
    7. استخدام عنصر تحكم إيجابية برنيس الكروزية. ت. trypomastigotes على النمط الظاهري المعزولة ECI1 إلى ECI21 من زراعة الأنسجة، كما هو موضح في الخطوة 5، 2.
    8. تنمو السيطرة السلبية ليشمانيا برازيلية27 في دميم وتستكمل مع 20% فقط الجنين المصل البقري، واستخدام بروماستيجوتيس الطفيلي كعنصر سلبي.
    9. استخدم 1 × 106 الكروزية. ت. ECI1 إلى ECI21 trypomastigotes في المادة طافية من ثقافة الخلية لتصيب الفئران.
    10. البحث عن trypomastigotes الكروزية. ت. في ذيل الدم بعد الأسبوع الأول من العدوى.
    11. البحث عن أعشاش amastigotes في الهيماتوكسيلين-ويوزين الملون أقسام القلب والهيكل العظمى والعضلات، والأجهزة التناسلية للفئران المصابة، بعد ذلك بشهر واحد.

3. استخراج الحمض النووي وتحاليل PCR

  1. ضع 5 مل الدم (الخطوة 1.4) الكوة في أنبوب يدتا عقيمة، وأداء الكثافة المتدرجة الطرد المركزي لمدة 45 دقيقة في 3,000 س ز. استخدام ماصة حصاد الخلايا وحيدات النوى من مرحلة مبيضة أعلاه الخلايا الحمراء ويغسل خلايا البيضاء مرتين في 5 مل من برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4، بالطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في س 1,500 ز في أنبوب مختلفة 15 مل، واستخدام الخلايا لاستخراج الحمض النووي.
  2. استخراج الحمض النووي من ECI-1 إلى 21 القياسي الكروزية. ت.، من مراقبة إيجابية برنيس الكروزية. ت.، من مراقبة سلبية لام برازيلية (الخطوة 2.1.8)، ومن اختبار الدم الخلايا وحيدات النوى من الأسرة البشرية 109 دراسة المواضيع1 , 27 , 28.
  3. تمييع 2 مل الحيوانات المنوية العينات التي تم الحصول عليها في الخطوة 1، 5 في دميم (1:4، v/v)؛ احتضانها ل 45 دقيقة في 5% CO2 و 37 درجة مئوية، واسترداد المني من المادة طافية بعد الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في س 13,000 ز، واستخراج الحمض النووي فرداني23.
  4. ضع 1 مل الخلايا في المخزن المؤقت لاستخراج (10 ميكرون كلوريد الصوديوم، 20 ميكرومتر يدتا، 1% الحزب الديمقراطي الصربي، 0.04% البروتيناز-ك، وديثيوثريتول 1%)، ومزيج من الحلول بانعكاس وتهتز.
    1. الطرد المركزي حلول 10 دقيقة في 13,000 س ز و 25 درجة مئوية، ونقل المادة اللزجة طافية على عمود دوران.
    2. الطرد المركزي في عمود الدوران 1 دقيقة في 10,000 س ز وتجاهل النذرة؛ إضافة 500 ميليلتر ملزم العازلة لعمود الدوران (جدول المواد) والطرد المركزي أنه لمدة 1 دقيقة في س 12,000 ز، وتجاهل النذرة.
    3. إضافة 600 ميليلتر الغسيل العازلة لعمود الدوران والطرد المركزي أنه لمدة 1 دقيقة في س 12,000 ز، وتجاهل النذرة.
    4. كرر هذه الخطوة مرتين، ونقل العمود تدور أنبوب الطرد مركزي الصغرى معقم 1.5 مل.
    5. إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات، احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة، وثم الطرد المركزي في أنبوب لمدة 1 دقيقة في س 12,000 ز. يحتوي المخزن المؤقت في أنبوب ميكروسينتريفوجي على الحمض النووي.
    6. قياس تركيزات الحمض النووي عن طريق تشغيل مختبرين على 0.8% [اغروس] هلام ومن خلال قراءة امتصاص في 260 نيوتن متر مع جهاز المطياف الضوئي. تخزين عينات الحمض النووي في-20 درجة مئوية حتى استخدامها في تحليل PCR.
  5. استخدام الكروزية. ت. Tcz1/2 كبسولة تفجير تعتيق لتسلسل محدد telomere المحددة 188 nt التحقيق29 وتشغيل ال [بكر] مع الحمض النووي من مواضيع الدراسة الأسرة الدم والحيوانات المنوية ومراقبة إيجابية برنيس الكروزية ت من مراقبة سلبية لام برازيلية .
    1. إعداد الخليط PCR مع 10 نانوغرام قالب الحمض النووي، 0.4 ميكرون لكل زوج من الإشعال و 2 "يو بوليميراز الدنا" بوليميراز 0.2 ميكرون دنتبس 15 ميكرون مجكل2 في وحدة تخزين نهائي 25 ميليلتر.
    2. الشروع في برنامج تضخيم الحمض النووي في 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية تجريدها من القالب، وتبريد العينات إلى 55 درجة مئوية لمدة 30 ق. ثم احتضان هذه العينات في 94 درجة مئوية ل 90 s تمديد كبسولة تفجير ملدنة. عودة درجة الحرارة إلى 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية بدء الدورة التالية، واحتضان هذه العينات 3 دقائق إضافية عند 72 درجة مئوية. في نهاية الدورةالثانية والثلاثون، تبريد العينات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتخزينها في الثلاجة على 4 درجة مئوية29.
    3. تضخيم الحمض النووي الكروزية ت. telomere تكرار تسلسل تعتيق للإشعال Tcz1/2 على كل الأطراف.
    4. تحليل منتجات التضخيم على 1.3% [اغروس] هلام ومراعاة شرائط الحمض النووي 188-nt على الأشعة فوق البنفسجية-إضاءة.

4-التهجين الجنوبي

ملاحظة: استخدمت التهجين الجنوبي لتجاهل معظم أمبليكونس بكر إيجابية كاذبة في [اغروس] هلام.

  1. تخضع منتجات التضخيم بكر من الضوابط غير مصاب، من عناصر إيجابية حالة داء شاغاس، من 109 اختبار عينات من الحمض النووي مثنوية ومن الحمض النووي فرداني المشاركين 21 دراسة الأسرة إلى جنوب هيبريديزيشنز.
  2. توظيف telomere الخاصة بالحمض النووي 188-nt الكروزية ت. تسلسل التحقيق تعتيق للإشعال Tcz1/2؛ تسمية التحقيق مع [α-32ف] 2-ديوكسيادينوسيني ثلاثي الفوسفات (داتب) استخدام تمهيدي عشوائية وصفها كيت، وتحليل منتجات التضخيم على 1.3% [اغروس] هلام 60 الخامس بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  3. نقل الجل إلى غشاء نايلون مشحونة بشكل إيجابي باستخدام الأسلوب الشعرية بين عشية وضحاها.
  4. هجن العصابات الحمض النووي تنقل إلى غشاء نايلون مع المسبار 188-nt راديولابيليد، الذي يربط النبذ R1 الإيكولوجيةمن الحمض النووي الجينومي في 25 ميليلتر من المخزن المؤقت المحدد لأنزيم لفترات متغيرة.
  5. يغسل الغشاء مرتين لمدة 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية مع الحزب الديمقراطي الصربي x SSC و 0.1% 2.
  6. تعرض أفلام الأشعة السينية لغشاء النايلون وأوتوراديوجراف العصابات في الغشاء لمدة أسبوع واحد.
  7. تنمو المستنسخين مختارة من التهجين بكر و الجنوب مع منتجات التضخيم PCR الكروزية. ت. ، الذي يتم تهجين مع مسبار الحمض النووي راديولابيليد محددة.
  8. تجارياً تسلسل الحيوانات المستنسخة باستخدام كبسولة تفجير Tcz1/2 تعيين ملدنة الكروزية. ت.-telomere محددة البصمة2،23.

5-المناعية فحوصات

ملاحظة: حساسية وخصوصية الفلورة غير المباشرة (IIF) ومقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (إليزا) قيمت في المصل من ستة مرضى داء شاغاس مع تطفلن يمكن إثباته، ومن ستة خالية من داء شاغاس، ديدينتيفيد المصل بنك العينات. فحوصات أجريت مع تخفيف المصل المزدوج في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4، كشفت عن أن فصل IIF في تخفيف 1: 100 واليسا الضوئية الكثافة (ODs) 0.150 وما فوقها الإيجابية من النتائج السلبية.

  1. استخدم 5 مل الدم أونكلوتيد اليكووت (الخطوة 1، 4) تحفظ في درجة حرارة الغرفة ح 1، والطرد المركزي أنه في س 1,500 ز لمدة 30 دقيقة لفصل المصل في المادة طافية.
  2. أداء IIF واليسا في تخفيف المصل ثلاث 1: 100 للكشف عن المستضدات الكروزية. ت. و برازيلية ل. كما هو موضح سابقا28.
  3. IIF
    1. إجراء المقايسة IIF في تخفيف المصل ثلاث موضوعات الدراسة 109 العينات التي تم الحصول عليها في ثلاث مناسبات سنة واحدة وبصرف النظر.
    2. ضع 5 ميليلتر معلقات الفورمالين 1%-تعامل الكروزية. ت. ابيماستيجوتيس أو بروماستيجوتيس لام برازيلية على الشرائح الزجاجية؛ السماح الطفيليات الجافة بين عشية وضحاها في غطاء محرك السيارة في درجة حرارة الغرفة وتخزين الشرائح الزجاجية في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    3. ميليلتر 20 مكان لتخفيف المصل المرضى على أعلى الشرائح الزجاجية المغلفة مع 5 ميليلتر ابيماستيجوتيس الكروزية ت قتل الفورمالين (10 الطفيليات/ميليلتر) أو برازيلية ل. بروماستيجوتيس.
    4. احتضان شريحة زجاجية مغطاة بكشف عن ح 1 في غرفة رطبة في 37 درجة مئوية ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
    5. احتضان الشريحة الزجاجية الهواء المجفف بإضعاف 1:1,000 لجسم الأرنب المسمى فلوريسسين (جدول المواد) إلى مفتش البشرية ح 1 في 37 درجة مئوية؛ غسل وتجفيف الشريحة.
    6. جبل الشريحة مع زلة الغطاء وفحصه تحت مجهر ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
      ملاحظة: امتحان إيجابية التفاح أخضر الكروزية. ت. ابيماستيجوتي صورة ظلية، يظهر في الفيديو.
  4. أليسا
    1. تشغيل إليزا للكشف عن الكروزية. ت. و لام برازيلية المستضدات القابلة للذوبان (1 ميكروغرام/100 ميليلتر في المخزن المؤقت للكربونات 0.1 M، pH 9.6) في الآبار المغلفة الميكروسكوبية.
    2. احتضان تخفيف المصل 1: 100 في الآبار المغلفة ثلاث من أجل ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
    3. غسل الأطباق ثلاث مرات مع ببست (برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5% توين-20)، الرقم الهيدروجيني 7.4، الحل قبل التجفيف.
    4. احتضان اللوحات مع 50 ميليلتر من إضعاف 1:1,000 أرنب الإنسان المضادة الأجسام المضادة مفتش لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    5. غسل الأطباق ثلاث مرات مع الحل ببست، والسماح لهم جاف في درجة حرارة الغرفة.
    6. احتضان اللوحات مع 100 ميليلتر لتخفيف 1:1,000 من الماعز مترافق الفوسفاتيز القلوية أرنب المضادة IgG (جدول المواد) لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    7. غسل الأطباق ثلاث مرات مع ببست، إضافة الركيزة فنيترو فينيل الفوسفات، والانتظار لوضع اللون.
    8. قراءة المواد المستنفدة للأوزون في 630 نيوتن متر في قارئ لوحة المتعدد.
    9. تشغيل تخفيف ثلاث من اختبار المصل من جمهرة الدراسة والأرض المواد المستنفدة للأوزون لتحديد المحددة الكروزية ت جسم التتر.

6-تقييمات للتسامح المناعي

ملاحظة: استخدم نظام نموذجي لدجاج لاختبار T. الكروزية العدوى بعد الأسبوع الأول من وضع الجنين.

  1. تطعيم الدجاج البيض خصبة مع 100/10 ميليلتر الكروزية. ت. trypomastigotes تحصد من زراعة الأنسجة المتوسطة؛ تلقيح البيض مراقبة وهمية مع 10 trypomastigotes الكروزية ت كل ميليلتر الثقافة المتوسطة. ختم الحفرة مع الشريط.
  2. احتضان 20 ت. الكروزية-إصابة البيض وعدد مساو من البيض خصبة مراقبة صورية في 37 درجة مئوية و 65% رطوبة لمدة 21 يوما.
  3. إبقاء الدجاج أن هاتش في الحاضنة ح 24، وبعد ذلك، عند 32 درجة مئوية في أغطية مع التحكم في درجة الحرارة لمدة ثلاثة أسابيع.
  4. تنمو الفراخ فقست من ت. الكروزية-تلقيح البيض ومن البيض مراقبة صورية لمرحلة الكبار في غرفة ضغط جوي إيجابية في 24 درجة مئوية، في أقفاص فردية في ممرات منفصلة.
  5. تحدي جميع الدجاج الكبار ثلاث مرات في غضون ستة أشهر عمر مع 107 قتل الفورمالين trypomastigotes حقن تحت الجلد، أسبوعيا، وفقا للمخطط في شريط الفيديو.
  6. سحب الدم من الوريد جناح الدجاج فقست من البيض ت الكروزية-تلقيح ومن عناصر صورية أربعة أسابيع بعد التحصين الأخير للحصول على المصل.
  7. استخدام المصل الدجاج للكشف المحددة جسم الكروزية T. IIF وإليزا كما هو موضح في الخطوة 5 من البروتوكول.

7-عدوى الفئران الكروزية ت من السائل المنوي المرضى داء شاغاس أنزل

  1. استخدام الدفقات السائل المنوي من مريض مرض "شاغاس" PCR + الكبار (الخطوة 1، 5) ومن فرد بالغ PCR شاغاس خالية.
  2. استخدام مجموعتين من 12 شهرا واحداً بالب/ج الفئران ساذجة في أغطية تحت ضغط الهواء الإيجابي في 24 درجة مئوية وتغذيها الغذاء libitum الإعلانية.
  3. غرس مختبرين السائل المنوي مصابات بداء شاغاس البشرية (100 ميليلتر) في الغشاء البريتوني وكميات متساوية في المهبل من مجموعة من الفئران.
  4. غرس مختبرين السائل المنوي التحكم خالية من داء شاغاس (100 ميليلتر) في الصفاق ومبلغ مساو في المهبل من الفئران المجموعة ب.
  5. التضحية الفئران التجريبية تحت التخدير خمسة أسابيع بعد إينستيليشنز السائل المنوي وإخضاع الفروع الأنسجة لتلطيخ مع الهيماتوكسيلين ويوزين.
  6. استخدام الفحص المجهري للبحث عن الكروزية. ت. trypomastigotes و amastigotes في القلب والهيكل العظمى والعضلات، والأعضاء التناسلية في مجموعات من الفئران.

8-انتقال الإصابة العدوى الكروزية ت قبل الجماع

  1. استخدام 10 الذكور والإناث عمرها ست الأسبوع بالب/ج الفئران في التجارب.
  2. تلقيح الذكور الخمسة والفئران الإناث خمس إينترابيريتونيلي مع 1 × 105trypomastigotesالكروزية ت من زراعة الأنسجة. 
  3. تتكاثر الفئران حتى ثلاثة أشهر عمر: الفريق سوف يكون شكلتها خمسة الكروزية. ت.-مراقبة الفئران الإناث المصابة وخمسة مصاب الأصحاب الذكور؛ سيتم تشكيل الفريق الثاني بخمسة ت الكروزية-إصابة الذكور وخمسة التحكم مصاب الأصحاب الإناث. سيتم تشكيل المجموعة الثالثة بخمسة من الذكور والاصحاب السذاجة وقاية التحكم الإناث خمسة.
  4. تربية البيت كل زوج في قفص واحد توضع داخل مربع آمنة مع الشبكة وقفل في باب 5 ملم لمنع الهروب.
  5. تغذية الفئران تشاو ومتواصلة للمياه. رفع إجمالي 70 الفطام نسلها في المجموعات الثانية، ومدتها ستة أسابيع على الأقل.
  6. سحب الدم من ثقب القلب من الوالدين (FO) والفئران ذرية (F1) تحت التخدير والتضحية الفئران، ويقدم أقسام القلب والهيكل العظمى والعضلات، والأجهزة التناسلية للتحليل الباثولوجي.

9-تقييم امتياز الحصانة

  1. الحصول على أنسجة من الكروزية. ت.-المصابة والسذاجة التحكم في الفئران (الخطوة 8، 6)، ويقتطع جزءا لا يتجزأ من البارافين العينات 4 ميكرومتر سميكة المقاطع.
  2. إزالة البارافين ويذوي المقاطع على الشرائح الزجاجية مع العديد من التغييرات من زيلين نفط ويغسل متدرج مع الإيثانول 100% و 70%، لكل 1 دقيقة.
  3. احتضان الفروع الأنسجة مع صابونين 0.05% مرة واحدة، تليها ثلاث يغسل الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة.
  4. كتلة أقسام الأنسجة مع 5% الحليب المجفف الخالي عن 45 دقيقة يغسل الشرائح في 0.1 م ببست واحتضان الفروع مع داء شاغاس الماوس مضاداتالكروزية ت المصل أو المصل الماوس التحكم وقاية في 01:20 تمييع ح 2.
  5. تغسل شرائح ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في ببست وجاف في درجة حرارة الغرفة قبل الحضانة مع إضعاف 1:1,000 أرنب مترافق الفوسفاتيز القلوية الماوس المضادة IgG.
  6. شطف الشرائح في ببست وإضافة 100 ميليلتر من 3,3 ' ديامينوبينزيديني لحضانة 5 دقيقة، تليها ثلاث يغسل مع ببست وكونتيرستينينج مع هاريس توضع لمدة 30 ثانية.
  7. يغسل الشرائح في الماء المقطر لمدة 5 دقائق ويذوي لهم في 70% و 80%، 90% والإيثانول 100% لمدة 1 دقيقة وجبل لهم في الغليسرين مخزنة بشكل مؤقت.
  8. دراسة الشرائح مع مجهر ضوء الساطع الحقل، والتقاط الصور الفوتوغرافية مع ميكروكاميرا مع برنامج محلل والبرمجيات.
  9. وثيقة شرف محصنة ضد الطفيليات في غياب ردود فعل التهاب في الجهاز التناسلي.

10. التحليلات الإحصائية

  1. استخدام "تحرير الطب الحيوي" لتحليل تسلسل وإجراء التحالفات مع انفجار، وتحديد أهمية ه-القيمة الإحصائية (p < 0.05).
  2. القيام تحليل تباين أحادي اتجاه (ANOVA)، واختبار توكي لمقارنة وسائل OD زائد أو ناقص الانحرافات المعيارية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هدف هذا البحث، وفقا للبروتوكول، للكشف عن الحالات الحادة من مرض شاغاس بالامتحانات السريرية وعلم الطفيليات. عينات الدم الوريدي تعرضوا للفحص المجهري المباشر، والثقافة في المختبر لنمو الطفيلي. وأظهرت إحدى وعشرون حالة حادة من مرض شاغاس الكروزية. ت. في الدم. بروتوكول البحث تأمين عزل الكروزية. ت. ECI1-ECI21 من مرض شاغاس الحادة، والحمض النووي أظهرت عينات إيجابية بصمات الحمض النووي في ما تبقى جمهرة الدراسة: فحوصات ندنا-بكر أسفرت عن تسلسل تكرار telomere نموذجية مع عصابات 188-nt الحالي فضلا عن ركبة برنيس الكروزية ت. 1. حالات داء شاغاس وأفراد أسرهم الذين تطوعوا للمشاركة في الدراسة قسمت إلى أربع عائلات1.

في هذه الدراسة الأسرة، كان ندنا الكروزية ت. بكر تضخيم مع التمهيدي مجموعات1،23 تعتيق لتسلسل telomere محددة من كل من حالات مرض شاغاس الحادة 21. هذه أمبليكونس ندنا الكروزية T. المهجنة مع المسبار تسلسل معين راديولابيليد (الشكل 2)؛ الاستنساخ وتسلسل كشفت أن أمبليكونس تتألف من عزر تكرار 188-nt telomere الكروزية. ت. . وأبدى خصوصية هذه الإجراءات التهجين بمراقبة سلبية أدوا برازيلية ل. بروماستيجوتيس. التحقق من صحة التحليل علم الأمراض أن هيموفلاجيلاتيس في مرضى مرض شاغاس الحادة كانت حقاً ضراوة الكروزية ت. نخلص إلى أن الفرقة (188-bp) ندنا الكروزية ت. وجدت في القرن 21 الحادة حالات داء شاغاس (الشكل 2) دليل مباشر للالتهابات المستمرة.

الاتصال الجنسي من المثقبيات الكروزية في البشر

تقييم نسب الإصابات الكروزية. ت. ، قمنا بتطبيق اختبار الحمض النووي للكشف عن حساسية عالية من أقدام الطفيلي في السكان دراسة الأسرة1. في هذه الاختبارات بكر، شكلت منتجات التضخيم بتهجين مع المسبار 188-nt راديولابيليد محددة عصابات ندنا في 76.1 في المائة (83/109) من عينات الاختبار؛ وترد نتائج التهجين الجنوبي من منتجات التضخيم بكر ندنا مع المسبار 188-nt راديولابيليد محددة في الشكل 3. وعلاوة على ذلك، أظهرت هيبريديزيشنز الطفيلي الحمض النووي في خط الخلية الجرثومية من أفراد الأسرة المتطوعين (الشكل 4).

استخدمت IIF للنمط الظاهري ECI1 إلى trypomastigotes ECI21 الكروزية ت مع المصل البشري مفتش من عينة الضفة مصل مرض شاغاس مع مظاهرة الطفيليات بروتوزوي في الدم، ومترافق fluorescein المضادة الإنسان واستخدمت مفتش . الكروزية ت برنيس كان عنصر تحكم إيجابية للأجسام المضادة داء شاغاس، ومراقبة سلبية promastigote أسرته النسبية لام برازيلية. يبين الشكل 5 أن صورة ظلية التفاح الأخضر الإيجابي من ركبة برنيس يرتبط بالبرية-النوع المغلف الكروزية ت. يظهر في الفيديو.

وكشفت أليسا و IIF الخاصة1،الأجسام المضادة الكروزية. ت. 28 28.4 في المائة (31/109) من عينات الاختبار. نتائج ELISA و IIF، فضلا عن أولئك من amplicon ندنا-بكر و جنوب هيبريديزيشنز، المرسومة في الشكل 6. أوجه الاختلاف بين نتائج آثار أقدام ندنا-بكر وتلك من جسم معين يصور فحوصات في هيريدوجرامس (الشكل 7)، ألف أسرة، أربعة مواضيع قد إيجابية قد ندنا والضد مكافحةالكروزية. ت. ، و 11 فقط ندنا الإيجابية؛ وكان خمسة ذكور الكروزية. ت. في قذف المني. في الأسرة ب 44 شخصا، كان 11 المحددة جسم الكروزية. ت. ، و 23 قد جسم معين وندنا الطفيلي؛ وكان سبعة أفراد الكروزية. ت. في قذف المني. الأسرة ج مع أعضاء 29 كان الضد وندنا الكروزية. ت. في خمسة أفراد، وكان 17 ندنا الطفيلي وحدها؛ وكان أربعة ذكور الإيجابية ندنا-بكر في قذف المني. في "د الأسرة"، من بين المواضيع 21، 11 الأجسام المضادةالكروزية ت. مكافحة محددة-والبصمة ندنا، وتسعة كانت إيجابية PCR ندنا وحدها. الرقم 3و الرقم 6 و الرقم 7 تصوير التباين الواسع بين النتائج، دائماً، في العينات البيولوجية التي تم الحصول عليها من مواضيع الأسرة في ثلاث تجارب مستقلة تشغيل سنة واحدة عن بعضها البعض.

ويبين الجدول 1 الفروق الكمية بين IIF و ELISA وفحوصات ندنا-بكر في العينات من الأسر دراسة البشرية ألف إلى دال التفاوت بين نسب فحوصات الأجسام المضادة (28.4 ٪) وفحوصات الحمض النووي إيجابية (76.1 في المائة) هي معتدا به إحصائيا (p < 0.005). في هذه الأسر، استأثرت الاختلافات بين المجموعات الكروزية. ت.-إصابة الأشخاص (الثالث والرابع) 62.6 في المائة (52/83) من السكان، وعرض اختبار حمض النووي إيجابية وحدها. التباين الواسع بين نسب أقدام ندنا الإيجابية وأنشطة محددة الكروزية ت. شرحت جسم بالتجارب التي أجريت في النظام النموذجي الدجاج.

التسامح المناعي

أجرى تقييم الاستجابات المناعية في مجموعات من الدجاج التي أثيرت إلى مرحلة الكبار في أقفاص فردية في ممرات منفصلة تحتوي على السذاجة مراقبة الدجاج (A)؛ مراقبة صورية الدجاج فقست من البيض تلقيح مع الثقافة المتوسطة (ب)؛ ودبرت الدجاج من البيض تلقيح trypomastigotes (ج) الكروزية T. 26. الكبار الدجاج في مجموعات ب وج طعن ثلاث مرات مع الفورمالين-قتل مستضد تريبوماستيجوتي الكروزية. ت. ، أسبوعيا، كما هو موضح في شريط الفيديو. ELISA وفحوصات IIF تم تشغيلها بمصل الدم التي تم جمعها من المجموعة أ، الدجاج ب وج شهر واحد بعد التحدي. ويبين الشكل 8 غياب جسم معين في الدجاج المجموعة ألف وجيم، والتي تتناقض تناقضا حادا مع إنتاج جسم معين في مجموعة ب تحصين مع مستضد الكروزية. ت. . النتائج أظهرت بوضوح المناعة التسامح في المجموعة ج فقست من الكروزية. ت.-تلقيح البيض.

انتقال الجنسية حاول بانوسوما الكروزية في "نظام نموذجي للماوس"

وعلاوة على ذلك، تجلى العدوى الكروزية ت من السائل المنوي مريض داء شاغاس، التي اختبرت إيجابية في ال [بكر] ويفتقر إلى جسم معين، من خلال إينستيليشنز من 100 ميليلتر من السائل المنوي في التجويف البريتوني للفئران الذكور ومن خلال كمية متساوية من السائل المنوي تغرس في المهبل. خمسة أسابيع في وقت لاحق، واكتشفت أعشاش أماستيجوتي الكروزية. ت. في القلب وعضلات الهيكل العظمى، وكتل من التفريق بين الطفيليات كانت موجودة في التجويف الاسهر وأنابيب الرحم. من المثير للاهتمام، لا تطويق ردود الفعل الملتهبة المدمرة أعشاشها وكتل من amastigotes الكروزية. ت. (الشكل 9).

كذلك أجرى التقييم الجنسي انتقال العدوى الكروزية. ت. في مجموعتين من الفئران تلقيح إينترابيريتونيلي مع ت. الكروزية برنيس أشكال trypomastigotes1،30، 1 × 105 31. في المجموعة التجريبية الأولى، 10 ت. الكروزية-إصابة الذكور تزاوج مع 10 السذاجة مكافحة الفئران الإناث. في المجموعة الثانية من التجارب، 10 ت. الكروزية-إصابة الإناث تزاوج مع الذكور مراقبة ساذجة 10. يبين الشكل 10 أن الكروزية. ت.-إصابة الفئران الذكور (من ألف إلى هاء) و ت الكروزية-إصابة الفئران الإناث (والي ز) أسفرت عن عصابات ندنا 188-بي بي (الإعداد الفردية). بعد تربية، اكتسبت الأصحاب السذاجة (الأرقام الزوجية) سهولة الكروزية ت عقب لقاء جنسي فريدة من نوعها مع رفيقه تشاجاسيك. تجارب تكرار مماثلة أنجزت بموجب شروط متطابقة أكدت أن كل الماوس الإناث أو الذكور من السذاجة أن جنسياً تزاوج مع . ت. الكروزية-المصاب ذكرا كان أو أنثى اكتسب العدوى فلاجيلاتي. ولدت هذه الحاملات لندنا المؤسسين (F0) ذرية التي أثاروها حتى سن ستة أسابيع. ذلك الحين، والاختبار والمراقبة وقاية الفئران كانت bled عبر ثقب القلب لجمع حوالي 0.5 مل دم. وأظهرت فحوصات ندنا-بكر أن الالتهابات المؤسسين (F0) المكتسبة عن طريق الاتصال الجنسي وأحيلت إلى ذرية F1، كما هو موضح من قبل عصابات ندنا 188-بي بي (الشكل 11). وكانت ذرية F1 ندنا-الإيجابية في 41 من فحص العينات (58.6%) 70. من هذه الفئران مع عصابات ندنا توحي بالعدوى عمودياً المكتسبة، كقلة كما كان 9 41 (22 في المائة) الأجسام المضادة الكروزية. ت. .

كانت التضحية الفئران ذرية F1 تحت التخدير، وتعرض أنسجة الجسم للتحليلات المرضية والمناعي تلطيخ البيروكسيديز. وترد نتائج هذه التجارب في الشكل 12. تم توثيق النتائج الخاصة amastigotes الكروزية. ت. في الخلايا الخلالي البربخ وفي جونيابلاستس؛ amastigotes التفريق في trypomastigotes كانت موجودة في التجويف الخصي في غياب ردود الفعل الملتهبة.

Figure 1
الشكل 1 . مثقبيه الكروزية العدوى في أنبوب سيمينيفيروس الصبي الذي توفي من مرض شاغاس الحادة . ميكروفوتوجراف من ملف الطبيب تيكسيرا، 197018. أشكال الكروزية. ت. جونيابلاستس، وكتل من amastigotes والحرة trypomastigotes (الأسهم) موجودة في التجويف أنبوب سيمينيفيروس في غياب تتسرب التحريضية1. الهيماتوكسيلين ويوزين البقع. شريط, 20 μم. ريبرينتيد بإذن من الناشر و المؤلف1،19.

Figure 2
الشكل 2 . البصمة من مثقبيه الكروزية من حدة مرض شاغاس. وشكلت منتجات التضخيم بكر ندنا الكروزية ت. العصابات 188-nt مع تحقيق 188-nt راديولابيليد محددة. Tc، الكروزية ت.؛ نورث كارولاينا، مراقبة سلبية. طبع بإذن من الناشر والكاتب1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . جنوب النشاف تحليل مثقبيه الكروزية التهابات في مواضيع الدراسة البشرية الأسر. أ الأسرة--أظهر جميع المواضيع 15 محددة ندنا-PCR العصابات 188-nt. في "ب الأسرة"، تشكل ما مجموعة 35 مواضيع 43 (81.4%) عصابات ندنا محددة. وفي "ج الأسرة"، بين 29 عضوا، شكلت 22 (75.8%) عصابات ندنا. د الأسرة، كان 11 من 21 مواضيع (52.4%) عصابات ندنا. ت. الكروزية-نطاقات محددة ندنا أكدتها الاستنساخ وتسلسلها. طبع بإذن من الناشر والكاتب1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . النشطة مثقبيه الكروزية التهابات في السائل المنوي ينزل من المتطوعين الأسرة دراسة- الالتهابات في الدفقات شاغاس المرضى حددها العصابات 188-بي بي بكر ندنا. Tc، مراقبة إيجابية الكروزية. ت. . نورث كارولاينا، مراقبة سلبية لام برازيلية . طبع بإذن من الناشر والكاتب1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 . النمط الظاهري من مثقبيه الكروزية مع الأجسام المضادة في مصل المرضى مرض شاغاس. الكروزية. ت. وحدد مع الأجسام المضادة IgG المصل شاغاس تسلم تريبوماستيجوتي الطفيلي تعامل مع المسمى فيتك [مونوكلونل] Ab المضادة الإنسان مفتش. مكافحة-Abالكروزية. ت. لا تعترف بروماستيجوتيس ليشمانيا برازيلية . إظهار insets عناصر سلبية. أشرطة، 20 ميكرومتر. Reprinted بإذن من الناشر والكاتب1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 6
الرقم 6 . تمثيل رسومي الساس وفحوصات ندنا-PCR في الأسرة دراسة السكان. المجموعة الأولى (n = 10) والمجموعة الثانية (n = 20) كانت سيطرة سلبية والأمصال مراقبة إيجابية، على التوالي، من التهابات الكروزية ت مع مظاهرة الطفيليات. المجموعة الثالثة (ن = 31) وشملت عينات من مواضيع الأسرة مع العصابات ندنا 188-بي بي والأجسام المضادة المحددة إلى الكروزية. ت.. المجموعة الرابعة (n = 52) شملت عينة من المواضيع مع التهابات الكروزية ت الكشف عنها بواسطة أمبليكونس 188 nt بكر ندنا في حالة عدم وجود جسم معين. المجموعة الخامسة (n = 26) كانت عينات الاختبار السلبي تضم الشعب خالية من العدوى في دراسة الأسرة. طبع بإذن من الناشر والكاتب1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 . هيريدوجرامس ورسم مثقبيه الكروزية- إصابة السكان الأسرة- ويوضح الشكل التناقضات بين نسب مضادات جسمالكروزية. ت. وتلك من فحوصات ندنا-PCR. ساحة مفتوحة ودائرة والسلبية ذكر وأنثى. المربعات الحمراء والدوائر والإيجابية المضادةT. الكروزية الضد وبكر ندنا. المربعات السوداء والدوائر، ندنا-PCR الإيجابية وحدها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 8
الشكل 8 . التسامح المناعي في الدجاج فقست من مثقبيه الكروزية- تلقيح البيض. A) الشخصية الضد بريمن في الدجاج مراقبة صورية (n = 10). الدجاج ب) استجابة الأجسام المضادة المحددة في عنصر تحكم ساذجة وتحدي مع مستضد الكروزية. ت. (n = 20). ج) عدم استجابة مناعية محددة في الدجاج فقست من الكروزية. ت.-تلقيح البيض بعد التحدي مع مستضد الكروزية. ت. (n = 20). الكثافة البصرية الفرق بين ألف وجيم (024 ± 0.17) نحو ب (0.85 ± 0.6) يعتد به إحصائيا (p < 0.05). وهذا الرقم تم تعديله من مرجع26 وهو طبع بإذن من الناشر والمؤلف.

Figure 9
الرقم 9 . المعدية مثقبيه الكروزية في الدفقات البشرية يترجم عدوى مورين نشطة. كانت تغرس مختبرين للدفقات المريض شاغاس في التجويف الصفاقى أو في المهبل من الفئران. وقد ضحى الفئران ثلاثة أسابيع بعد تقطير. لين أعلى، أعشاش amastigotes الكروزية. ت. في القلب (إلى اليسار) وفي الهيكل العظمى والعضلات (يمين). أسفل لين، أعشاش أماستيجوتي الكروزية. ت. في الاسهر (يسار) وفي أنابيب الرحم (يمين). ويبين الإدراج أماستيجوتي فاصل (دائرة). إشعار غياب الالتهابات تتسرب في أقسام الأنسجة. الهيماتوكسيلين ويوزين البقع. أشرطة: أعلى وأسفل اليسار، 20 ميكرومتر؛ أسفل اليمين، 10 ميكرون. Reprinted بإذن من الناشر والكاتب1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 10
الرقم 10 . انتقال الجنسية مثقبيه الكروزية التهابات في الماوس نموذج النظام قبل الجماع. انتقال العدوى الكروزية ت من تشاجاسيك إلى الأصحاب ساذجة أظهرت العصابات 188-بي بي ندنا محددة كشفت في هيبريديزيشنز جنوب . لين أعلى) الملامح بريبريدينج من منتجات التضخيم PCR الكروزية. ت.-إصابة الفئران والفئران ساذجة. تبين الأرقام الفردية الكروزية. ت.-إصابة الذكور من A إلى E وعينات الإناث و--إلى--أنا الماوس. الأرقام الزوجية هي أنثى ساذجة (من 2 إلى 10) والفئران الذكور (12 إلى 20). لين القاع، بعد تربية، إظهار التشكيلات الجانبية حتى الفئران 2 إلى 20 اكتسبت الكروزية ت. الالتهابات. طبع بإذن من الناشر و الكاتب1،30. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 11
الرقم 11 . مثقبيه الكروزية نقل العدوى عمودياً من تشاجاسيك F0 الأبوية للفئران ذرية F1- الأصل تشاجاسيك تنتقل الكروزية ت قبل لقاء تربية واحدة. الكروزية. ت.-تم تزاوج الإناث المصابة بالسذاجة الذكور ألف إلى هاء، وكانت تزاوج الإناث ساذجة لالكروزيه. ت.-إصابة الذكور وج. بعد تربية، أظهرت جميع المؤسسين (F0) الفرقة 188-بي بي ندنا البرزي إيجابية-PCR. النشاف الجنوبية كشفت الفرقة ندنا محددة بعد التهجين مع المسبار 188-nt راديولابيليد في أغلبية ليتر F1. نورث كارولاينا، لام برازيلية المراقبة السلبية؛ Tc، مراقبة إيجابية الكروزية. ت. . طبع بإذن من الناشر و الكاتب1،31. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 12
الرقم 12 . الأنسجة موثقة مثقبيه الكروزية المنقولة من F0 إلى التسامح F1 ذرية والمناعة في غياب فعل التهابية. إظهار المقاطع نمو أشكال الكروزية. ت. في البربخ، وجونيابلاستس، والخصي في الفئران F1. كانت التضحية الفئران تحت التخدير، وتم فحص المقاطع الملون البيروكسيديز محصنة تحت مجهر. Photomicrographs إظهار البنى المناعية الملطخة البيروكسيديز الكروزية. ت. amastigotes في فراغي البربخ (A) وكتل من التفريق إلى إلقاء في التجويف سيمينيفيروس trypomastigotes amastigotes أنبوب (ب، ج، وو). عش أماستيجوتي رأيت في جونيابلاست (د). () أنبوب seminiferous الأنسجة الماوس التحكم الإيجابي في العادية. لاحظ عدم وجود تتسرب التهاب في الخصيتين الفئران F1 عرض كميات من طفيليات داء شاغاس. وصمة عار في جيمسى. أشرطة: A، باء وجيم وهاء، 20 ميكرومتر؛ D و F، 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1. التفاوت بين نسب الامتحانات IIF واليسا إيجابية وفحوصات ندنا-PCR في العينات جمعت من أسر الدراسة البشرية A-إلى-د *

المجموعات * * أليسا: مصل مضادات Abالكروزية. ت. (%) الكروزية ت. ندنا-بكر (%)
مراقبة Ab-بكر-(n = 10) 10/10 100 10/10 100
ثانيا-مراقبة Ab + بكر + 20/20 100 20/20 100
(n = 20)
ثالثا-شاغاس Ab + بكر + ᵟ 31/109 28.4 31/109 28.4
(ن = 31)
رابعا-داء شاغاس Ab-PCR + ᵟ - - 83/109 76.1
(n = 52)
الخامس--خالية من داء شاغاس Ab-بكر- 26/109 23.9 26/109 23.9
(ن = 26)
* نتائج ثلاثة أليسا مستقلة وفحوصات بكر ندنا تشغيل في العينات التي تم جمعها في ثلاث مناسبات مختلفة في السنوات 1 و 2 و 3. [1]-كرر التضخيم من 188-nt الكروزية ت. الحمض النووي أكدت الاستنساخ وتسلسلها.
* * الاختلافات بين المواضيع الإيجابية (مجموعات الثالث والرابع) وسلبية (الفريقين الأول والخامس) هي معتدا به إحصائيا (p < 0.05).
ᵟ التباين بين المجموعات الثالث والرابع شرح بالتسامح المناعي في حالة عدم وجود جسم الكروزية ت. تحقيق 62.6 في المائة (52/83) من مواضيع إيجابية PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، نحن مناقشة بروتوكول بحث القائم على الأسرة أن الإجابة على مسألة ما إذا كان مرض شاغاس البشرية ينبع من يبلغ المنقولة الكروزية ت. الالتهابات. الدراسات المبكرة يمكن أن تقدم أدلة الجنسي انتقال العدوى الكروزية. ت. ، ربما نظراً لأن البيانات المتاحة والمعلومات المتعلقة بمرض شاغاس تم الحصول عليها بشكل منفصل من كل3،4، 5،6،،من78،9،10،11،،من1213. إيجاد الكروزية. ت. في أنبوب سيمينيفيروس صبي (الشكل 1) كانت الشرارة التي حفزت التحقيق السريرية والوبائية. بعد عدة عقود، تصور عندما الأسرة دراسة النهج والتكنولوجيات المبينة في هذا البروتوكول البحوث كانت متاحة، ومراحل دورة الحياة الكروزية ت ظهر في1،السائل المنوي البشري19.

المظاهرة الطفيليات مباشرة من بروتوزوا في 21 حالة مرض شاغاس الحادة كانت حاسمة بالنسبة للتحقق من صحة المنتجات التضخيم ندنا-بكر، التي شكلت نطاقات محددة في عينات من جميع المواضيع إصابة حادة مع الكروزية. ت.. هذه العلامة نقطة من رعاية مختبر تقييم نتائج فحوصات المناعية والحمض النووي. ولذلك، يجمع الأساسية الطويل شاغاس المرض الأسرة الدراسة، النتائج التي توصل إليها في البشر مع تلك التي تم الحصول عليها في مجموعات من الحيوانات المختبرية. البحوث التي أجريت وفقا للبروتوكول وكشفت للمرة الأولى أن ت الكروزية العدوى تنتقل جنسياً في البشر1.

الفرق واسع بين النسب من فحوصات الأجسام المضادة الخاصة بالطفيل، وتلك من اختبارات الحمض النووي يشير إلى أن غالبية آثار أقدام ندنا نجمت عن حالات الأمراض المنقولة جنسياً في الغياب محددة لمكافحة الكروزية ت. الأجسام المضادة. وهكذا، يعود انتقال الجنسية الكروزية. ت. في أفراد الأسرة العارضة ندنا إيجابية نظراً لعدم وجود الأجسام المضادة IgG محددة التسامح المناعي.

التسامح المناعي تجلى في نظام نموذجي دجاج مقاوم للالتهابات الكروزية ت. بعد الأسبوع الأول من الجنين النمو1،،من2526،،من3233، 34. بعد ذلك، عجز المناعي غير ناضجة تعترف الطفيلي كمكون أجنبي للهيئة أشارت إلى التسامح المناعي ناضجة أواخر الدجاج نحو الكروزية تي- وفي ضوء هذه النتائج، التسامح هو ظاهرة طبيعية1 الناجمة عن الاعتراف الذاتي المناعي وصيانة مكوناته الجسم تحت الظروف الفسيولوجية25،26، 32 , 33 , 34-ولذلك يمكن التحول من حالة التسامح المناعي لأمراض القلب داء شاغاس الذاتية المرتبطة بها مع المستجيب خلية التعديلات الناتجة عن الكروزية. ت. كينيتوبلاست (كدنا) الطفرات في جينوم المضيف1 ،2،،من1423،،من2526.

تصف الخطوات الحاسمة في بروتوكول البحث بتعديل الأسلوب الرئيسي واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من أجل الكشف عن الأمراض المنقولة جنسياً شاغاس الطفيليات1،14،،من2325، 26: أنا) تحديد الأسر الدراسة مع الحالات الحادة شاغاس المرض35،36؛ ثانيا) عزل من البرية من نوع الكروزية ت من الدم الحالات الحادة؛ ثالثا) الحصول على عينات من الحمض النووي من المشاركين الدم يجلد الأسر ركبة برنيس الكروزية. ت. ، ومن مصرف ديدينتيفيد إيجابية عينات الحمض النووي، ومن السلبية السيطرة برازيلية ل.؛ رابعا) أداء الإجراءات التقنية مرتبة للبرهنة على أن يجلد ندنا البصمة المشاركين مطابقة لركبة برنيس الكروزية. ت. وهذه عينات الحمض النووي البنك الإيجابية؛ v) footprinting ندنا ثلاث تعمل مستقلة لإثبات الإصابات الكروزية. ت. في أفراد الأسرة في ثلاث مناسبات سنة واحدة عن بعضها البعض؛ سادسا) ضمان أن تقنية PCR ندنا أجرى عند نقطة الرعاية تؤدي النتائج أكدها الاستنساخ وتتابعها جميع أمبليكونس تعتيق للتمهيدي محددة مجموعات، مما يدل على استمرار تسلسل 188-nt الكروزية. ت. 1،،من2528،،من2930؛ سابعا) استخدام الكواشف العلامات التجارية عالية الجودة لإنتاج التتر جسم ما زال في عينات مصل الدم التي تم جمعها في ثلاث نقاط زمنية مختلفة؛ ثامنا) بروتوكول الدراسة الأسرة كشف العدوى الحية الموجودة في الخلايا الجرثومية الخط عند إثبات ندنا الكروزية. ت. وفي غياب من أضداد المصل محددة في السائل المنوي الدفقات التي جمعت من داء شاغاس المصابة بالطفيلي 1من الأفراد؛ تاسعا) وجهة نظر هو أن البروتوكول البحوث الرامية إلى كشف الأمراض المنقولة جنسياً ت الكروزية العدوى ينبغي أن تكشف عن مرض شاغاس أصلي في القارات الخمس؛ x) ندنا وآثار أقدام كدنا تأمين تشخيص مرض شاغاس أعراض مزمنة في البشر1،2؛ الحادي عشر) في غياب ندنا، هو طفرةمن الكروزية T. كدنا التسلسل1،2،23،25،26 وحدة علامة مختبر للحصول على تحقيق تشخيص تفاضلية من القلب المتوسعة مجهول السبب23،25،37،،من3839.

بالإضافة إلى ذلك، كانت قادرة على بدء العدوى على نطاق واسع عند تقطير في المهبل الماوس وفي التجويف الصفاقى ضراوة الكروزية T. موثقة في داء شاغاس الدفقات المريض. وأظهرت دراسة علم الأمراض أعشاش أماستيجوتي الكروزية. ت. في القلب وعضلات الهيكل العظمى، وكذلك كما هو الحال في الاسهر وأنابيب الرحم. من المثير للاهتمام، لم يحدث الاعشاش الطفيلي ردود الفعل الملتهبة التي من شأنه أن يعيق الوظائف الإنجابية الحيوية. يجعل غياب ردود الفعل الملتهبة بامتياز المناعة في الجسم الوظيفية الحيوية هياكل40،41،42،43،،من4445 وبالتالي ويفسر النمو الجامح الكروزية. ت. في الأعضاء التناسلية.

وعلاوة على ذلك، أوضحت الدراسات التجريبية في الفئران تشاجاسيك التي ولدت مع الأصحاب السذاجة الجنسي انتقال العدوى الكروزية. ت. في البشر. المصابة من الإناث والذكور التي تنتقل في الكروزية. ت. للاصحاب السذاجة مصابة أثناء الجماع، وغالبية هذه ليتر المكتسبة الكروزية T. عمودياً المنقولة من الأصل إلى النسل. في هذه التجارب، المرحلة الأولى المشار إليها نمو الكروزية. ت. في الأنبوب وفي الرحم، وكذلك في أنبوب سيمينيفيروس و الاسهر، التي وقع فيها بامتياز الحصانة. ثم حدث انتقال الجنسية من خلال المراحل الطفيلية في السائل المنوي أو في إفرازات الرحم في المهبل. امتياز الحصانة40،41،42،43،،من4445 هو ظاهرة أن يسمح لبعض الأجهزة (الجهاز التناسلي والعينين والدماغ) إلى دوونريجولاتي ردود الفعل الملتهبة وتجنب إلحاق الضرر بوظائف هامة وحساسة ومحددة40. الهرمونات41 وعده عوامل المناعة downregulate الضامة41،،من4243والخلايا القاتلة الطبيعية41ولمفاويه T وخلايا T-التنظيمية (تريغ)، وبالتالي بتدبير تثبيط عدد من السيتوكينات proinflammatory والمناعة-امتياز مشغلات40،41،42،43،،من4445.

انتقال العدوى الكروزية ت من الذكور والإناث للشركاء السذاجة الجنسي يشير إلى أن مكافحة مرض شاغاس يتطلب التضامن الدولي. النتائج التي تناقش هذه الوثيقة تشير إلى أن هناك حاجة إلى بحوث أكثر إبداعاً. قابلة للتحقيق الأهداف الفورية التالية: أنا) لتطوير منصات الفائق لمحددة واختبار الحمض النووي حساسة للغاية للتوصل إلى تشخيص دقيق، تهدف للوقاية من الأمراض التي تنتقل عن طريق الاتصال الجنسي، عمليات نقل الدم وزرع الأعضاء، فضلا عن تيسير التحريات السريرية والوبائية لتحديد التشخيص، وانتشار مرض شاغاس؛ ثانيا) لتعزيز برنامج تنمية المخدرات متعددة المراكز للحصول على أدوية جديدة للقضاء على الالتهابات الكروزية ت. ؛ و الثالث) لتنفيذ التعليم المناسب، وبرنامج المعلومات والاتصالات التي تشمل مشاركة المدارس والكنائس والمنظمات الاجتماعية، والمؤسسات الصحية الحيلولة دون انتشار مرض شاغاس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

نحن نعترف بالمرافق المختبرية والتعليقات الانتقادية Dourado إيزابيلا، كارلا أراوخو، و "ذكي غوميز" ومساعدة تقنية من برونو دالاجو ورفائيل أندرادي. ونحن مدينون للمؤسسة للنهوض بالعلوم (فابدف)، ومجلس البحوث الوطني، ووزارة العلوم والتكنولوجيا (التكنولوجيا)، والوكالة لتدريب الموارد البشرية، وزارة التربية والتعليم (الرؤوس/لي)، البرازيل، لدعم هذه التحقيقات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCIP and NBT redox system Sigma-Aldrich 681 451 001
Blood DNA Purification columns Amersham Biosciences 27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.   Perkin Elmer   BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm AMRESCO 064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Eco RI Invitrogen 15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated Southern Biotech        2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated Biocompare MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane GE Healthcare RPN303B
Hybridization oven Thomas Scientific 95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software Olympus, Japan
Molecular probes labeling System Invitrogen 700-0030
Nsi I Sigma-Aldrich R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit GE Healthcare 28-9042-70
Plate reader  Bio-Tek GmBH 2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated Sigma-Aldrich A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated Sigma-Aldrich F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated Sigma Aldrich A2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated Biorad MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine Sigma-Aldrich G25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Thermal cycler system Biorad, USA 1709703
Vector Systems Promega A1380

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Araujo, P. F., et al. Sexual transmission of American trypanosomiasis in humans: a new potential pandemic route for Chagas parasites. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112, (6), 437-446 (2017).
  2. Teixeira, A. R. L., Nitz, N., Bernal, F. M., Hetch, M. M. Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model. Journal of Visualized Experiments. (65), 3716 (2012).
  3. Kalil-Filho, R. Globalization of Chagas Disease Burden and New Treatment Perspectives. Journal of the American College of Cardiology. 66, (10), 1190-1192 (2015).
  4. Nunes, M. C. P., Dones, W., Morillo, A., Encina, J. J., Ribeiro, A. L. Chagas Disease: An Overview of Clinical and Epidemiological Aspects. Journal of the American College of Cardiology. 62, (9), 767-776 (2013).
  5. Pinazo, M. J., Gascon, J. Chagas disease: from Latin America to the world. Reports in Parasitology. 2015, (4), 7-14 (2015).
  6. Kessler, D. A., Shi, P. A., Avecilla, S. T., Shaz, B. H. Results of lookback for Chagas disease since the inception of donor screening at New York Blood Center. Transfusion. 53, (5), 1083-1087 (2013).
  7. Klein, N., Hurwitz, I. R. Globalization of Chagas Disease: A Growing Concern in Nonendemic Countries. Epidemiology Research International. (2012).
  8. Pérez-Molina, J. A., Norman, F., López-Vélez, R. Chagas disease in non-endemic countries: epidemiology, clinical presentation and treatment. Current Infectious Diseases Report. 14, (3), 263-274 (2012).
  9. Hotez, P. J., et al. Chagas disease: "the new HIV/AIDS of the Americas". PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1498 (2012).
  10. Schmunis, G. A., Yadon, Z. E. Chagas disease: a Latin American health problem becoming a world health problem. Acta Tropica. 115, (1-2), 14-21 (2010).
  11. Franco-Paredes, C., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. The Unfinished Public Health Agenda of Chagas Disease in the Era of Globalization. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3, (7), e470 (2009).
  12. Teixeira, A. R. L., Vinaud, M., Castro, A. M. Emerging Chagas Disease. In: Chagas Disease: - A Global Health Problem. 3, Bentham Science Publishers. New York. Chapter 3 18-39 (2009).
  13. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infectious Diseases. 13, (4), 342-348 (2013).
  14. Teixeira, A. R. L., Hecht, M. M., Guimaro, M. C., Sousa, A. O., Nitz, N. Pathogenesis of Chagas Disease: Parasite Persistence and Autoimmunity. Clinical Microbiology Review. 24, (3), 592-630 (2011).
  15. Murcia, L., et al. Risk factors and primary prevention of congenital Chagas disease in a nonendemic country. Clinical Infectious Diseases. 56, (4), 496-502 (2013).
  16. Chagas, C. New human trypanosomiasis. Morphology and lifecycle of Schizotrypanum cruzi, the cause of a new human disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 1, 159 (1909).
  17. Vianna, G. Contribution to the study of the Pathology of Chagas disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 3, 276 (1911).
  18. Teixeira, A. R. L., Roters, F., Mott, K. E. Acute Chagas disease. Gazeta Médica da Bahia. 3, 176-186 (1970).
  19. Teixeira, A. R. L., et al. Prevention and Control of Chagas Disease – An Overview. International STD Research, Reviews. 7, (2), 1-15 (2018).
  20. Rios, A., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113, (1), 3-8 (2018).
  21. Lenzi, H. L., et al. Trypanosoma cruzi: compromise of reproductive system in acute murine infection. Acta Tropica. 71, (2), 117-129 (1998).
  22. Carvalho, L. O. P., et al. Trypanosoma cruzi and myoid cells from seminiferous tubules: Interaction and relation with fibrous components of extra cellular matrix in experimental Chagas’ disease. International Journal of Experimental Pathology. 90, (1), 52-57 (2009).
  23. Hecht, M. M., et al. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 12, e9181 (2010).
  24. Alarcon, M., et al. Presencia de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en el plasma seminal de ratones con infección aguda. Boletín Malariología y Salud Ambiental. 51, 237 (2011).
  25. Teixeira, A. R. L., et al. Trypanosoma cruzi in the Chicken Model: Chagas-Like Heart Disease in the Absence of Parasitism. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5, (3), e1000 (2011).
  26. Guimaro, M. C., et al. Inhibition of Autoimmune Chagas-Like Heart Disease by Bone Marrow Transplantation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, (12), e3384 (2014).
  27. Oliveira, C. I., et al. Leishmania braziliensis isolates differing at the genome level display distinctive features in BALB/c mice. Microbes and Infection. 6, (11), 977-984 (2004).
  28. Mendes, D. G., et al. Exposure to mixed asymptomatic infections with Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis and Leishmania chagasi in the human population of the greater Amazon. Tropical Medicine, International Health. 12, 629 (2007).
  29. Moser, D. R., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 27, (7), 1477-1482 (1989).
  30. Da Silva, A. R. Sexual transmission of Trypanosoma cruzi in mus musculus [MsD thesis]. University of Brasília. Brasília. Available from http://repositório.unb.br/handle/10482/14829 (2013).
  31. Ribeiro, M., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113, (1), 3-8 (2018).
  32. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172, (4379), 603-606 (1953).
  33. Burnet, F., Fenner, F. The production of Antibodies. MacMillan. Melbourne, Australia. (1949).
  34. Hasek, M. Parabiosis of birds during their embryonic development. Chekhoslovatskaia Biology. 2, (1), 29-31 (1953).
  35. Coura, J. R., Junqueira, A. C. V., Fernades, O., Valente, S. A., Miles, M. A. Emerging Chagas Disease in Amazonian Brazil. Trends Parasitology. Trends Parasitology. 18, (4), 171-176 (2002).
  36. Teixeira, A. R. L., et al. Emerging Chagas disease: Trophic network and cycle of transmission of Trypanosoma cruzi from palm trees in the Amazon. Emerging Infectious Diseases. 7, (1), 100112 (2001).
  37. Hazebroek, M., Dennert, R., Heymans, S. Idiopathic dilated cardiomyopathy: possible triggers and treatment strategies. Netherland Heart Journal. 20, (7-8), 332-335 (2012).
  38. Arimura, T., Hayashi, T., Kimura, A. Molecular etiology of idiopathic cardiomyopathy. Acta Myologica. 26, (3), 153-158 (2007).
  39. Dec, W. G., Fuster, V. Idiopathic Dilated Cardiomyopathy. New England Journal of Medicine. 33, 1564-1575 (1994).
  40. Niederkorn, J. Y. See no evil, hear no evil, do no evil: the lessons of immune privilege. Nature Immunology. 7, (4), 354-359 (2006).
  41. Smith, B. E., Braun, R. E. Germ cell migration across Sertoli cell tight junctions. Science. 338, (6118), 798-802 (2012).
  42. Garth, A., Wilbanks, J., Streilein, W. Fluids from immune privileged sites endow macrophages with the capacity to induce antigen-specific immune deviation via a mechanism involving transforming growth factor-β. European Journal of Immunology. 22, (4), 1031-1036 (1992).
  43. Meng, J., Anne, R., Greenlee, C., Taub, J., Braun, R. E. Sertoli Cell-Specific Deletion of the Androgen Receptor Compromises Testicular Immune Privilege in Mice. Biology of Reproduction. 85, (2), 254-260 (2011).
  44. Fujisaki, J., et al. In vivo imaging of Treg cells providing immune privilege to the haematopoietic stem-cell niche. Nature. 474, (7350), 216-219 (2011).
  45. Wood, K. J., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nature Review Immunology. 3, (3), 199-210 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics