Author Produced

Половым путем американских трипаносом в наивный товарищей от мужчин и женщин

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Агент Trypanosoma cruzi болезни Шагаса производит долговечные бессимптомные инфекции, которые резко развиться в клинически признанных патологии. Следующий протокол исследования описывает на базе семьи эпидемиологическое исследование краткосрочных разгадать т. cruzi инфекция передается половым путем от родителей к потомству.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Almeida, A. B., Araújo, P. F., Bernal, F. M., Rosa, A. d., Valente, S. A., Teixeira, A. R. Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates. J. Vis. Exp. (143), e57985, doi:10.3791/57985 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Американским трипаносомозом передается людям triatomine ошибок через пищу загрязненных продуктов питания, переливание крови или случайно в больницах и исследовательских лабораторий. Кроме того инфекции Trypanosoma cruzi врожденно передается от матери chagasic ее потомство, но мужчины-партнера вклад внутриутробное заражение неизвестным. Гнезда и clumps из amastigotes и trypomastigotes в клетках theca завязи, в goniablasts и в просвете семенных канальцев пришли к выводам, что т. cruzi инфекций передающихся половым путем. Протокол исследования здесь представлены результаты семейного обучения населения, показывая паразита ядерной ДНК в мононуклеарных клетках диплоидных крови и в haploid гамет человека предметов. Таким образом три независимых биологических образцов, собранных отдельно один год подтвердил, что т. cruzi инфекции половым потомкам. Интересно, что конкретные т. cruzi антитела отсутствовал в большинстве семьи потомства, что родила Иммунологическая толерантность к антигену паразита. Иммунологическая толерантность был продемонстрирован в курица огнеупорных т. cruzi после первой недели эмбрионального роста, и вылупившихся из яиц бичевать привитых цыплят смогли произвести специфическое антитело. Кроме того инстилляции человеческой спермы эякуляции внутрибрюшинно или во влагалище наивно мышей, принесли amastigotes т. cruzi в придатка яичка, семенных канальцах, семяпроводов и маточных труб при отсутствии воспалительного реакции в иммунной привилегированных органов размножения. Разведение т. cruzi-инфицированных мужчин и женщин мышей с наивными товарищей привели к приобретению инфекции, которые впоследствии были препровождены потомства. Таким образом программу надежные образования, информации и коммуникации, которая предполагает населения и общественных организаций является необходимым для предотвращения болезни Шагаса.

Introduction

Простейших паразитов Trypanosoma cruzi , принадлежащий к семейству Trypanosomatidae подвергается trypomastigote и amastigote этапов жизненного цикла в млекопитающих хостов и существует как epimastigotes в насекомое вектора (поцелуйными: Триатомовые клопы) кишки и в стерильных культуры. В последние десятилетия некоторые исследования показали наличие болезни Шагаса в странах на четырех континентах считается triatomine ошибка бесплатно1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13; дисперсия американских трипаносом был первоначально приписывается латиноамериканских иммигрантов в северном полушарии, но возможность, что некоторые из них автохтонные случаев болезни Шагаса, больше не может быть отказано3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. только узнаваемый эндогенного источник заражения т. cruzi были приписывают chagasic мать передачи паразита потомство в приблизительно 10% беременностей15; мужчины-партнера вклад в утробе инфекции через спермы эякуляции остается непризнанной.

Более века назад, следователи16,17 наблюдается внутриклеточных cruzi т. amastigotes в клетках theca завязи и в зародыше линия клетки яичек острых случаев болезни Шагаса. Гнезда и clumps т. cruzi trypomastigotes и amastigotes в теки клеток яичника, в goniablasts и в просвете семенных канальцев (рис. 1) смертельных случаев острой болезни Шагаса развивать иммунные привилегии в органах воспроизводства в условиях отсутствия воспалительные инфильтраты18,19. В последние десятилетия несколько экспериментальных исследований показали гнезда форм круглые amastigote т. cruzi в семенных канальцах, придатка и семяпроводов также как и матки, труб и яичников клеток теки остро зараженных мышей 1,20,21,22. Кроме того, в ходе исследования семьи к документу передачи простейших митохондриальной ДНК от родителей пациентов Шагаса их потомкам, т. cruzi ядерной ДНК (nDNA) была проверена в человеческих зародышей haploid клетки линии23и этапы жизненного цикла паразитов были замечены в эякуляции chagasic мышей24. Эти выводы согласуются с доклады о иммунной толерантности, достигается потомства т. cruzi -зараженных хостов в отсутствие специфического антитела1,25,26. Кроме того эпидемиологические отчеты, которые предложили распространения эндемических болезни Шагаса в других континентов3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13 теперь поддерживаются экспериментальные исследования, показывающие, что болезнь Шагаса может передаваться половым путем1 . Настоящее исследование представляет протокол эпидемиологическое исследование семьи и показывает, что т. cruzi инфекции распространяется на половое сношение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Человека и животных исследовательских комитетов на факультете медицины Университета Бразилиа одобрил все процедуры с людьми и лабораторных животных, соответственно, в протоколы исследований 2500.167567 и 10411/2011. Комитет по этике общественный фонд больница Гаспар Вианна (протокол № 054/2009 и CONEP 11163/2009) утвердил формы свободного согласия для исследования на местах, с расширением министерства здравоохранения Национальной Комиссии по исследований человеческого (CONEP 2585/04). Протокол был скорректирован для оценки т. cruzi ДНК в диплоидных крови мононуклеаров и гаплоидным гамет из спермы эякуляции. Лабораторных животных получил гуманной помощи; мышей, подвергается пункции сердца до самопожертвования, были под наркозом.

1. набор человека участников

  1. Убедитесь, что исследовательская команда участвует в программе болезнь Шагаса система здравоохранения для оказания медицинской помощи больным Шагаса.
  2. Нанимать человека участников из семей участвуют в этой программе, показаны по крайней мере один случай с лихорадка, общее недомогание, головная боль, тахикардия и отеки, Основные клинические симптомы острой болезни Шагаса14.
  3. Оказания медицинской помощи людям в исследовании семей в течение пяти лет.
  4. Получить 15 мл венозной крови от участников исследования в трех случаях один год врозь, разделите образца на три 5 мл аликвоты и хранить их в холодильнике при температуре 4 ° C.
  5. Сбор 2 мл спермы эякуляции от взрослых добровольцев членов семьи и действуйте, как описано в шаге 3.3.

2. рост численности паразитов

  1. С помощью Алиготе из шага 1.4, смесь крови с 5 единиц гепарина натрия препятствующий свертыванию крови; Сделайте уклон культуры, прививка крови от семьи участников с диагнозом острой болезни Шагаса.
    1. Прививок 5 мл unclotted крови человека в 50 мл колпачок трубки крови агар наклонная плюс 5 мл печени инфузии tryptose среды (LIT) и Проинкубируйте образцы в шейкере при 27 ° C на 3 месяца.
    2. Место 100 мкл супернатанта среды поверх стекла слайды, накройте скользит и поиска для крови epimastigotes т. cruzi под микроскопом, каждые четыре недели.
    3. Урожай epimastigote изолятов в надосадке стерильных LIT среды при 27 ° C; Вымойте клетки в PBS рН 7,4, центрифуги на 1000 x g 10 мин; развести epimastigotes в Пелле в 5 мл Дульбекко изменение основных средних (DMEM).
    4. Прививать вырожденная L6 мышечных клеток культуры колбы с 1 x 10-6 ECI1-ECI21 т. cruzi epimastigote изолирует.
    5. Расти, т. cruzi ECI1 к ECI21 и trypomastigotes архетип Береника в L6 мышцы клеточных культур в 75 мл культуры колбы.
    6. Накормить клетки с 15 мл DMEM при рН 7,4 дополнены с 5% плода бычьим сывороточным, 100 МЕ/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл, 250 Нм L-глютамином и 5% CO2 при 37 ° C1.
    7. Используйте элемент положительные cruzi т. Береника trypomastigotes к фенотипу изолятов ECI1-к ECI21 от культуры ткани, как описано в пункте 5.2.
    8. Отрицательный контроль27 braziliensis лейшманийв среде DMEM, дополнены 20% плода бычьим сывороточным только растут и использовать паразита promastigotes как отрицательный контроль.
    9. Используйте 1 x 10-6 т. cruzi ECI1-ECI21 trypomastigotes в надосадке из клеточной культуры заразить мышей.
    10. Поиск для trypomastigotes т. cruzi в хвост крови после первой недели инфекции.
    11. Поиск гнезда amastigotes гематоксилином эозином окрашенных участков сердца, скелетных мышц, и репродуктивных органов зараженных мышей, один месяц после этого.

3. ДНК добыча и ПЦР-анализа

  1. 5 мл крови (шаг 1.4) аликвота в стерильную пробирку ЭДТА и выполнить плотность градиентного центрифугирования 45 мин на 3000 x g. Использование пипетки урожая мононуклеарных клеток от этапа беловатые выше эритроцитов, мыть белые клетки дважды в 5 мл PBS, рН 7,4, центрифугированием 10 мин на 1500 x g в различных 15 мл трубку, и использовать клетки для экстракции ДНК.
  2. Извлечь ДНК из ECI-1 в ECI-21 т. cruzi, от позитивного управления Беренис т. cruzi, от отрицательного контроля L. braziliensis (шаг 2.1.8) и из теста крови мононуклеаров 109 человеческой семьи исследование темы1 , 27 , 28.
  3. Разбавить 2 мл спермы образцов, полученных на шаге 1.5 в среде DMEM (1:4, v/v); Инкубируйте 45 мин на 5% CO2 и 37 ° C, восстановить сперматозоидов от надосадке после центрифугирования 5 мин на 13 000 x gи извлечь гаплоидным ДНК23.
  4. Место 1 мл клеток в буферной (10 мкм NaCl, 20 мкм ЭДТА, 1% SDS, 0,04% протеиназы K и 1% Дитиотреитол) и смешивать решения путем инверсии и тряски.
    1. Центрифуга для решения для 10 мин на 13000 x g и 25 ° C и передавать столбец спин вязкой супернатант.
    2. Центрифуга столбце спин 1 мин на 10000 x g и отбросить элюата; добавить 500 мкл буфера привязки к столбцу спин (Таблица материалов), центрифуги за 1 мин на 12000 x gи отбросить элюата.
    3. Добавить 600 мкл Отмывающий буфер в столбце спин, центрифуги за 1 мин на 12000 x gи отбросить элюата.
    4. Повторите этот шаг два раза и передавать микро пластиковых пробирок 1.5 мл стерильного столбце спина.
    5. Добавьте 100 мкл буфера TE, инкубировать трубки при комнатной температуре на 2 мин, а затем центрифуга трубки для 1 мин на 12000 x g. Буфер в пробки microcentrifuge содержит ДНК.
    6. Измерять концентрации ДНК, запустив аликвоты на 0,8% агарозном геле и читая поглощения на 260 Нм с спектрофотометром. Храните образцы ДНК при-20 ° C до использования в ПЦР-анализа.
  5. Использование т. cruzi Tcz1/2 грунты отжигом в последовательности определенных конкретных теломер 188-nt зонд29 и запустить ПЦР с ДНК из семьи исследование предметов кровь и сперма, от позитивного управления Беренис т. cruzi и от L. braziliensis отрицательного контроля.
    1. Подготовьте смесь ПЦР с 10 ng шаблона ДНК, 0,4 мкм каждой пары праймеров, 2 U полимеразы дна Taq, 0,2 мкм дНТФ и 15 мкм MgCl2 в 25 мкл окончательный объем.
    2. Инициировать программу амплификации ДНК в 94 ° C за 30 s денатурировать шаблон, и прохладный образцов до 55 ° C за 30 s. Затем, Проинкубируйте образцы на 94 ° C 90 s расширить обожженных праймеров. Возвращение температуры до 94 ° C за 30 s до начала следующего цикла и Проинкубируйте образцы дополнительные 3 мин при 72 ° C. В конце цикла 32nd прохладно образцы для 10 мин при комнатной температуре и хранить их в холодильнике при 4 ° C29.
    3. Усилить т. cruzi ДНК теломер повторить последовательность отжигом праймеров Tcz1/2 на обоих концах.
    4. Анализ продуктов амплификации на 1.3% агарозном геле и наблюдать диапазоны дна 188-nt на УФ осветитель.

4. Южный гибридизации

Примечание: Южной гибридизацией был использован чтобы отменить большинство ложных положительных ампликонов ПЦР в агарозном геле.

  1. Тема продуктов амплификации PCR от неинфицированных контроля, от Шагаса случае положительных элементов управления, от 109 испытательных образцов диплоидных ДНК и гаплоидным ДНК семьи участников 21 исследования в Южной гибридизациях.
  2. Используют т. cruzi 188-nt ДНК конкретного теломер последовательности зонд отжигом праймеров Tcz1/2 показано; ярлык зонд с [α -32P] 2'-деоксиаденозин трифосфата (dATP) с помощью случайного праймера маркировки комплект и анализ продуктов амплификации на 1.3% агарозном геле на 60 V на ночь при 4 ° C.
  3. Передать гель мембраной положительно заряженных нейлон с помощью метода капилляров на ночь.
  4. Гибридизируйте ДНК полос, передан мембраны нейлона с radiolabeled зонд 188-nt, который связывает экоR1 дайджесты геномной ДНК в 25 мкл буфера фермента специфичные для переменной периодов.
  5. Промойте мембрану дважды за 15 мин при 65 ° C с 2 x SSC и 0,1% SDS.
  6. Разоблачить рентгеновские пленки и мембраны нейлона авторадиография полос на мембране на одну неделю.
  7. Растут клоны, выбранных из ПЦР и Южной гибридизацией с продуктами амплификации PCR т. cruzi , которые гибридизированных с конкретным radiolabeled зонд ДНК.
  8. Коммерчески последовательность клоны, используя праймеры Tcz1/2, набор отожженная на т. cruzi -конкретные теломер след2,23.

5. иммунологические анализы

Примечание: Чувствительность и специфичность непрямой иммунофлюоресценции (IIF) и энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) были оценены в сыворотке из шести больных Шагаса в очевидном паразитемии и из шести свободных Шагаса, deidentified сыворотки Банк образцов. Анализы проводятся с двойной сыворотки разведений в PBS, рН 7,4, показали, что IIF в разведениях 1: 100 и ELISA оптических плотностей (СОД) на 0.150 и выше разлучены положительные отрицательные результаты.

  1. Используйте 5 мл unclotted крови аликвота (шаг 1.4) хранится при комнатной температуре в течение 1 ч и центрифуги на 1500 x g для 30 минут, чтобы отделить сыворотку в надосадке.
  2. Выполнение IIF и ELISA в разведениях сыворотки тройные масштаба 1: 100 для обнаружения т. cruzi и л braziliensis антигены, как описано ранее,28.
  3. IIF
    1. Провести пробу IIF в трех экземплярах сыворотки разведениях 109 учебные предметы образцов, полученных на три раза один год друг от друга.
    2. Место 5 мкл суспензии формалина 1% - epimastigotes т. cruzi или promastigotes L. braziliensis на стеклянных вставках; Пусть сухой ночлег паразитов в капюшон при комнатной температуре и хранить слайды стекла при-20 ° C до использования.
    3. Место 20 мкл разведения сыворотки больных поверх стекла слайды покрытием с 5 мкл формалин убит (10 паразитов/мкл) т. cruzi epimastigotes или braziliensis л promastigotes.
    4. Инкубируйте стеклянное скольжение, покрытые скольжения для 1 h во влажной камере при 37 ° C и мыть трижды с PBS.
    5. Инкубировать слайд воздушно-сухой стекла с 1:1,000 разбавления антитела флуоресцеин меченых кролик (Таблица материалов) к IgG человека за 1 ч при 37 ° C; Вымойте и высушите слайд.
    6. Закрепите слайд с крышки выскальзования и рассмотреть его под микроскопом УФ света.
      Примечание: Позитивные экзамен-яблоко зеленый т. cruzi epimastigote силуэт, показано в видео.
  4. ELISA
    1. Запуск ELISA для обнаружения т. cruzi и л braziliensis растворимые антигены (1 мкг/100 мкл в 0,1 М карбонат буфера, рН 9,6) на скважинах с покрытием микроплиты.
    2. Инкубируйте разведения сыворотки 1: 100 в трех экземплярах с покрытием скважин на 2 ч при комнатной температуре.
    3. Мыть тарелки трижды с PBST (PBS, содержащий 0,5% Tween-20), рН 7,4, решение перед сушкой.
    4. Инкубировать пластины с 50 мкл 1:1,000 разведения кролика против IgG антитела для 90 минут при 37 ° C.
    5. Промойте пластины трижды с PBST раствором и дайте им высохнуть при комнатной температуре.
    6. Инкубировать пластины с 100 мкл 1:1,000 разведений щелочной фосфатазы конъюгированных коза анти кролик IgG (Таблица материалов) для 90 минут при 37 ° C.
    7. Мыть тарелки трижды с PBST, добавить субстрата p нитро фенил фосфат и ждать развития цвета.
    8. Читайте в СОД на 630 Нм в многомодовых пластины читателя.
    9. Запуск трех экземплярах разведения сыворотки тест из исследуемой популяции и сюжет СОД для выявления конкретных титры антител т. cruzi .

6. Оценка иммунной толерантности

Примечание: Курица модель системы была использована для тестирования т. cruzi инфекций после первой недели развития эмбриона.

  1. Прививать оплодотворенные яйца куриные с trypomastigotes т. cruzi 100/10 мкл, добываемых из тканевой культуры среднего; прививать макет элемента управления яйца с 10 т. cruzi trypomastigotes за мкл питательной среды. Запечатать отверстие с лентой.
  2. Инкубируйте 21 дней 20 т. cruzi -инфицированных яиц и равное количество оплодотворенных яиц макет элемента управления при 37 ° C и 65% влажности.
  3. Держите цыплят, что люк в инкубаторе за 24 часа и, впоследствии, на 32 ° C в капюшоны с контролем температуры за три недели.
  4. Растут птенцы вылупились из т. cruzi -прививку яйца и яйца макет элемента управления до стадии взрослого в комнате позитивные воздуха давление в 24 ° C, в отдельных клетках, помещены в отдельные проходы.
  5. Вызов всех взрослых птенцов трижды в возрасте шести месяцев с 107 формалин убит trypomastigotes вводят подкожно, еженедельно, по схеме в видео.
  6. Нарисуйте кровь из Вены крыло куриное вылупился из яйца т. cruzi -прививки и макет элементов управления через четыре недели после последнего иммунизации для получения сыворотки.
  7. Использовать куриные сыворотки для обнаружения конкретных т. cruzi антитела IIF и ELISA, как описано в шаге 5 протокола.

7. заражение мышей, т. cruzi от больных Шагаса спермы эякуляции

  1. Использование спермы эякуляции, от взрослого пациента болезнь Шагаса ПЦР + (шаг 1.5) и от индивида взрослого, ПЦР - Шагаса бесплатно.
  2. Используйте две группы 12 один месяц старый BALB/c наивно мышей держали в капюшоны под положительное давление воздуха при 24 ° C и кормят питание ad libitum.
  3. Внушить человека аликвоты Семен Шагаса позитивные (100 мкл) в брюшину и равных количествах во влагалище группы A мышей.
  4. Внушить аликвоты Семен управления свободной Шагаса (100 мкл) в брюшине и равное количество группы B мышей во влагалище.
  5. Пожертвовать экспериментальной мышей под наркозом через пять недель после Семен закапывание и разделах ткани, подлежащих окрашиванию с применением окрасок гематоксилин эозином.
  6. Использование микроскопии для поиска т. cruzi trypomastigotes и amastigotes в сердце, скелетных мышц и репродуктивных органов в группы мышей.

8. Передача инфекции T. cruzi общением

  1. Использование 10 мужских и женских 6 week-old мышей BALB/c в экспериментах.
  2. Прививать пять мужчин и пять самок мышей внутрибрюшинно с 1 x 10-5 т. cruzi trypomastigotes от культуры ткани.
  3. Порода мышей до трех месяцев: группа, я будут формировать пять т. cruzi-инфицированных самок мышей и пяти управления noninfected мужчин товарищей; будет сформирована группа II по пяти т. cruzi -инфицированных мужчин и пять контроля noninfected Женский сопряжения. Будет сформирована группа III, пять мужчин и пяти женщин управления наивно неинфицированных товарищей.
  4. Дом каждого разведения пары в одной клетке внутри сейфа с 5 мм сетки и замок в двери для предотвращения побега.
  5. Кормить мышей Чоу и воды ad libitum. Поднимите в общей сложности 70 отъема потомков в группы II и я по крайней мере за шесть недель.
  6. Рисовать крови путем пункции сердца от родителей (FO) и потомства (F1) мышах под наркозом, пожертвовать мышей и представить разделы сердца, скелетных мышц, и репродуктивных органов для патологических анализа.

9. Оценка иммунных привилегий

  1. Получения ткани с т. cruzi-инфицированных и наивно контроля мышей (шаг 8.6) и нарезать 4 µm толщиной секции парафин врезанных образцов.
  2. Удаление парафина и обезвоживанию секции на стеклянных скольжениях с несколькими изменениями ксилол и градуированных моет с 100% до 70% этанол, за 1 мин.
  3. Инкубируйте разделов ткани с 0,05% сапонинов, следуют три автомойки дистиллированной водой при комнатной температуре.
  4. Заблокировать разделы ткани с 5% обезжиренное сухое молоко для 45 мин мыть слайды в 0,1 М PBST и инкубировать секции с Шагаса мыши анти-т. cruzi сыворотки или сыворотки мышь управления неинфицированных 1:20 и разбавления за 2 ч.
  5. Вымойте слайды трижды за 5 мин в PBST и сухой при комнатной температуре до инкубации с 1:1,000 разрежения щелочной фосфатазы конъюгированных кролик борьбе мыши IgG.
  6. Промыть слайды в PBST и 100 мкл 3,3' диаминобензидин для 5 минут инкубации, следуют три автомойки с PBST и counterstaining с гематоксилином Харрис 30 s.
  7. Вымойте слайды в дистиллированной воде в течение 5 мин, обезвоживает их в 70%, 80%, 90% и 100% этанола за 1 мин и смонтировать их в буферизации глицерина.
  8. Изучить слайды с ярко поля световой микроскоп и захватить фото изображения с microcamera с программным обеспечением и анализатор программы.
  9. Документ иммунные привилегии паразита в отсутствии воспалительной реакции в репродуктивных органах.

10. Статистический анализ

  1. Использование биомедицинских редактировать для анализа последовательностей, выполняют рядов с взрыва и определить E-значение статистической значимости (p < 0,05).
  2. Выполните односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) и Тьюки тест применяется для сравнения ОД означает, плюс или минус стандартных отклонений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Это исследование, проведенное в соответствии с протоколом, направленных для выявления острых случаях болезнь Шагаса, клинических и паразитологии экзаменов. Пробы венозной крови были подвергнуты прямой микроскопического исследования и в пробирке культуры для роста паразита. 21 острых случаях болезнь Шагаса показал т. cruzi в крови. Протокол исследования обеспеченных изоляции т. cruzi ECI1-ECI21 от острой болезни Шагаса и ДНК образцов выставлены положительные следы ДНК в оставшейся части населения исследование: nDNA ПЦР-анализов дали типичный теломер повторяющихся последовательностей с настоящее, а также cruzi т. Береника архетип1188-nt полос. Шагаса дел и членов их семей, которые добровольно вызвались принять участие в исследовании были сгруппированы в четыре семьи1.

В этом исследовании семьи т. cruzi nDNA был, ПЦР, усиливается с праймером устанавливает1,23 отжигом в конкретных теломер последовательности от каждой из 21 острых случаев болезни Шагаса. Эти т. cruzi nDNA ампликонов гибридизированных с определенной последовательности radiolabeled зонд (рис. 2); клонирование и секвенирование показало, что ампликонов состоит из T. cruzi 188-nt теломер повторить мотив. Специфика этих процедур гибридизации был показан в отрицательный контроль, проводимый с л braziliensis promastigotes. Анализ патологии проверяется, что hemoflagellates в острой больных болезнью Шагаса были действительно опасной т. cruzi. Мы заключаем, что т. cruzi nDNA (188-bp) Группа нашла в 21 острых случаях Шагаса (рис. 2) является прямым проявлением стойких инфекций.

Половым путем Trypanosoma cruzi в организме человека

Для оценки соотношения т. cruzi инфекций, мы применили нуклеиновой кислоты тест для обнаружения высокой чувствительности паразита следы в семьи исследование населения1. В эти анализы ПЦР продуктов амплификации, которые гибридизированных с конкретным radiolabeled зонд 188-nt сформирован nDNA полос в 76,1% (83/109) испытательных образцов; результаты Южной гибридизацией nDNA-PCR амплификация продуктов с конкретными 188-nt radiolabeled зонд показаны на рисунке 3. Кроме того гибридизациях показал паразита ДНК в зародышевых клеток линии добровольцев членов семьи (рис. 4).

IIF работал на фенотип ECI1 для trypomastigotes ECI21 cruzi т. с человеческой сыворотки IgG от Шагаса болезнь сыворотки банка образца с паразитологии демонстрацией простейших в крови, и флюоресцеином конъюгированных против человека, который использовался IgG . Cruzi т. Береника был положительный контроль для Шагаса антитела, и отрицательный контроль был Промастиготы его семьи относительной л braziliensis. Рисунок 5 показывает, что позитивные яблоко зеленый силуэт Беренис архетип коррелирует с одичал типа T. cruzi конверт, показано в видео.

ELISA и IIF выявили конкретные т. cruzi антител1,28 в 28,4% (31/109) испытательных образцов. Результаты ELISA и IIF, также, как те от Ампликон ПЦР nDNA и Южной гибридизациях, строятся на рисунке 6. Расхождения между результаты следы nDNA-PCR и лиц с специфическим антителом, анализов изображены в heredograms (рис. 7), А семьи, четыре темы имели положительные nDNA и анти -cruzi т. антитела и 11 были только позитивный nDNA; пять мужчин были т. cruzi в эякуляте спермы. В семье B с 44 человек, 11 имели специфических антител т. cruzi и 23 было специфическим антителом и паразита nDNA; семь человек были т. cruzi в эякуляте спермы. Семья C с 29 членов антитела и т. cruzi nDNA в пяти лиц, а 17 паразита nDNA только; четыре мужчины имели положительные nDNA ПЦР в эякуляте спермы. В семье D, среди 21 предметов 11 конкретных анти -cruzi т. антитела и след nDNA, и девять были только положительные nDNA-PCR. Рисунок 3, рис. 6 и 7 Рисунок изображают широкого расхождения среди результаты, последовательно, в биологических образцах, полученных от семьи предметов в трех независимых экспериментах, запускать один год друг от друга.

Таблица 1 показывает количественные различия между IIF, ELISA и nDNA ПЦР-анализов в образцах из семей человека исследование A-D. Расхождения между соотношения антитела анализов (28,4%) и тех положительных нуклеиновой кислоты анализов (76,1%) являются статистически значимой (p < 0,005). В этих семьях различия между группами, т. cruzi -инфицированных людей (III и IV) приходилось 62,6% (52/83) населения, показаны только тест положительный нуклеиновых кислот. Широкие расхождения среди соотношения позитивного nDNA следы и те конкретные т. cruzi антитела были объяснены экспериментов, проведенных в системе модель курица.

Иммунологическая толерантность

Проведена оценка иммунного ответа в группах кур, поднятые до стадии взрослого в отдельных клетках в отдельные проходы, содержащие наивно управления кур (A); макет элемента управления кур вылупился из яйца, привиты с питательной среды (B); и кур от прививки trypomastigotes яйца (C) т. cruzi 26. Взрослых кур в группах B и C были оспорены три раза с формалином убит cruzi т. trypomastigote антигена, еженедельно, как показано в видео. ELISA и анализов IIF выполнялись с сывороткой собранных от группы A, B и C кур один месяц после вызов. Рисунок 8 показывает отсутствие специфического антитела в группы A и C кур, которые резко контрастируют с специфическим антителом производства в группе B, иммунизированных с т. cruzi антигена. Результаты четко показали иммунной толерантности в группе C вылупившихся из т. cruzi-прививку яйца.

Половым путем Попробуйте panosoma cruzi в системе модель мыши

Кроме того, инфективности т. cruzi из эякулята пациента Шагаса, положительный результат в PCR и не хватало специфическое антитело, была продемонстрирована через закапывание 100 мкл спермы в полость перитонеальный самцов мышей и через равное количество спермы, привили во влагалище. Пять недель спустя, гнезда amastigote т. cruzi были обнаружены в сердце и скелетных мышц, и кусты дифференциации паразитов присутствовали в просвет семявыносящих и маточные трубы. Интересно, что разрушительные воспалительные реакции не окружать, гнезда и clumps т. cruzi amastigotes (рис. 9).

В две группы мышей, внутрибрюшинно прививанным с 1 x 10-5 т. cruzi Береника trypomastigotes формы1,30, далее была проведена оценка передачи половым путем инфекций, т. cruzi 31. В опытной группе я, 10 т. cruzi -инфицированных мужчин, повязана с 10 наивно управления самок мышей. В опытной группе II 10 т. cruzi -инфицированных самок, повязана с 10 мужчин управления наивными. На рисунке 10 показано, что т. cruzi-инфицированных мышей-самцов (A-E) и т. cruzi -инфицированных самок мышей (F-до G) принесли 188-ВР nDNA полосы (нечетные номера). После разведения, наивно товарищей (четные) легко приобрел т. cruzi после уникальный сексуальный контакт с chagasic мат. Подобные повторные эксперименты, проведенные в одинаковых условиях подтвердили, что каждый наивно женщина или мужчина мыши, сексуально повязана с т. cruzi-инфицированных мужчин или женщин приобрела flagellate инфекции. Эти nDNA инфицированными основатели (F0) генерируется потомства, что они подняли в возрасте до шести недель. Затем, испытаний и контроля неинфицированных мышей были Блед через прокол сердца для сбора примерно 0,5 мл крови. NDNA ПЦР-анализов показали, что учредителей (F0) сексуально приобрела инфекций были препровождены потомства F1, как показано 188-ВР nDNA полосы (рис. 11). F1 потомства были nDNA положительным в 41 70 проверенных проб (58,6%). Из этих мышей с nDNA полос наводящий вертикально от инфекций, как мало, как 9 из 41 (22%) т. cruzi антител.

F1 потомства мышей были принесены в жертву под наркозом, и тканях тела были подвергнуты иммунной и патологических пероксидаза окрашивание анализы. Результаты этих экспериментов показано на рисунке 12. Результаты для amastigotes т. cruzi были задокументированы в интерстициальных клеток придатка яичка и в goniablasts; amastigotes, дифференцироваться в trypomastigotes присутствовали в просвете семенных канальцев в отсутствие воспалительных реакций.

Figure 1
Рисунок 1 . Trypanosoma cruzi инфекции в семенных канальцах мальчика, который умер от острой болезни Шагаса . Microphotograph из файла доктор Тейшейра, 197018. Т. cruzi формы находятся в goniablasts, и кусты amastigotes и бесплатные trypomastigotes (стрелки) присутствуют в просвете семенных канальцах в отсутствие воспалительных инфильтратов1. Гематоксилином эозином пятна. Бар, 20 мкгм. печатается с разрешения издателя и авторы1,19.

Figure 2
Рисунок 2 . След от Trypanosoma cruzi от острой болезни Шагаса. Т. cruzi nDNA-PCR амплификация продуктов формируется 188-nt полос с конкретным radiolabeled зонд 188-nt. TC, т. cruzi; NC, отрицательный контроль. Перепечатано с разрешения издателя и автора1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Южный blotting анализ Trypanosoma cruzi инфекции в субъектов человека исследования семей. Семья A - все 15 предметов показал конкретные nDNA-PCR 188-nt полос. В семье B в общей сложности 35 43 субъектов (81,4%) сформировал конкретные nDNA полос. В семье C среди 29 членов, 22 (75,8%) образовали nDNA полос. В семье D 11 21 предметов (52,4%) был nDNA полос. Т. cruzi-конкретные nDNA полосы были подтверждены клонирование и секвенирование. Перепечатано с разрешения издателя и автора1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . Активный Trypanosoma cruzi инфекции в сперме кончить от исследования семьи добровольцев. Инфекции у больных Шагаса эякуляции, определены диапазоны 188-bp nDNA-PCR. TC, т. cruzi положительный контроль. NC, L. braziliensis отрицательного контроля. Перепечатано с разрешения издателя и автора1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 . Фенотип Trypanosoma cruzi с антитела сыворотки больных болезнь Шагаса. Cruzi т. отождествляется с антитела IgG сыворотки Шагаса, которое признает паразита trypomastigote лечить с FITC-меченых моноклональных Ab против человека IgG. Анти-cruzi т. Ab не признают лейшмании braziliensis promastigotes. Вставки показывают негативный контроль. Бары, 20 мкм. печатается с разрешения издателя и автора1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 6
Рисунок 6 . Графическое представление ELISAs и nDNA ПЦР-анализов в семье исследование населения. I группы (n = 10) и группу II (n = 20) были отрицательный контроль и положительный контроль sera, соответственно, от инфекций, т. cruzi с паразитологии демонстрации. Группа III (n = 31) включены образцы из семьи предметов с 188-ВР nDNA полос и специфических антител к T. cruzi. Группа IV (n = 52) состояла из образца от субъектов с т. cruzi инфекции обнаружены ампликонов 188-nt nDNA ПЦР в отсутствие специфического антитела. Группа V (n = 26) были отрицательные испытательных образцов, включая инфекции свободный человек в семьи исследовании. Перепечатано с разрешения издателя и автора1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 . Heredograms и картирование Trypanosoma cruzi- зараженные семьи населения. На рисунке показана расхождений среди соотношения анти-т. cruzi антител и те nDNA ПЦР-анализов. Открытые площади и круг, негативные мужчины и женщины. Красные квадраты и круги,т. cruzi антитела положительных анти - и nDNA-PCR. Черные квадраты и круги, только положительные nDNA-PCR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 8
Рисунок 8 . Иммунологическая толерантность в КУР, вылупившихся из Trypanosoma cruzi- привиты яйца. A) профиль преимунную антител в макет управления кур (n = 10). B) ответ специфическое антитело в элементе наивно кур с т. cruzi антигена (n = 20). C) отсутствие специфического иммунного ответа в КУР вылупившихся из т. cruzi-прививку яйца после вызов с т. cruzi антигена (n = 20). Оптическая плотность разница между A и C (024 ± 0,17) к B (0,85 ± 0,6) является статистически значимым (p < 0,05). Эта цифра была изменена ссылка26 и перепечатана с разрешения от издателя и автора.

Figure 9
Рисунок 9 . Инфекционный Trypanosoma cruzi в человека эякуляции переводится активного заражения мышиных. Аликвоты о Шагаса пациента эякуляции были привил в брюшной полости или во влагалище мышей. Мышей были принесены в жертву через три недели после инстилляции. Топ пер., cruzi т. amastigotes гнезда в самом сердце (слева) и в скелетных мышцах (справа). Нижнюю полосу, т. cruzi amastigote гнезда в семяпроводов (слева) и в маточных труб (справа). Вставки показывает деления amastigote (круг). Обратите внимание на отсутствие воспалительных инфильтратов в разделах ткани. Гематоксилином эозином пятна. Бары: сверху и снизу слева, 20 мкм; внизу справа, 10 мкм. печатается с разрешения издателя и автора1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 10
Рисунок 10 . Передачи половым путем Trypanosoma cruzi инфекции в мыши модель системы общением. Передача инфекции т. cruzi от chagasic для наивного товарищей свидетельствуют конкретные nDNA 188-ВР полосы показали в южной части гибридизациях. Верхняя полоса) Prebreeding профили продуктов амплификации PCR т. cruzi -инфицированных мышей и наивно мышей. Нечетные числа указывают т. cruzi-инфицированных мужчин A-E и образцы женщин F-к я мыши. Наивные девушки (2-в-10) и мужчин (12-20) мышах четные числа. Нижнюю полосу, после разведения, профили показывают, что даже мышей 2-в-20 приобретены т. cruzi инфекции. Перепечатано с разрешения издателя и автора1,30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 11
Рисунок 11 . Trypanosoma cruzi вертикально инфекция передается от F0 chagasic родителей потомства мышей F1. Chagasic родительского половым т. cruzi , встреча единого селекции. Т. cruzi-инфицированных самок были вязка мужчины наивно A-E, и наивно самок были вязка т. cruzi -инфицированных мужчин F-J. После разведения, все учредители (F0) показали положительный простейших nDNA-PCR 188-bp группы. Южный blotting выявили конкретные nDNA группа после гибридизации с radiolabeled зонд 188-nt в большинстве F1 пометов. NC, L. braziliensis отрицательный контроль; TC, т. cruzi положительный контроль. Перепечатано с разрешения издателя и автора1,31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 12
Рисунок 12 . Гистопатология документально Trypanosoma cruzi половым от F0, F1 потомства и иммунной толерантности в отсутствии воспалительной реакции. В разделах рост т. cruzi форм в придатка, goniablasts и семенных канальцев мышей F1. Мышей были принесены в жертву под наркозом, и иммунной пероксидаза окрашенных разделы были рассмотрены под микроскопом. Микрофотографиями Показать пероксидаза окрашенных коричневатые иммунных т. cruzi amastigotes в интерстициальных из придатка яичка (A) и clumps дифференцироваться в сарай в просвет семенных trypomastigotes amastigotes трубочку (B, C и F). Гнездо amastigote, видели в goniablast (D). Положительный контроль мыши семенных канальцах нормальная гистология (E). Обратите внимание на отсутствие воспалительных инфильтратов в семенниках мышей F1, показаны нагрузок Шагаса паразитов. Гимзе. Бары: A, B, C и E, 20 мкм; D и F, 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1. Расхождения между соотношения позитивного IIF и ELISA экзаменов и те nDNA-PCR анализов проб собранные от человека исследования семей A-к-D *

Группы ** Элиза: сыворотка анти-т. cruzi Ab (%) Т. cruzi nDNA-PCR (%)
Контроль Ab - ПЦР - (n = 10) 10/10 100 10/10 100
II - управления Ab + ПЦР + 20/20 100 20/20 100
(n = 20)
III - Chagas Ab + ПЦР + ᵟ 31/109 28.4 31/109 28.4
(n = 31)
IV - Chagas Ab - ПЦР + ᵟ - - 83/109 76,1
(n = 52)
V - свободные Шагаса Ab - ПЦР- 26/109 23.9 26/109 23.9
(n = 26)
* Результаты трех независимых ELISA и nDNA-PCR анализов в пробах в трех различных случаях на годы 1, 2 и 3. [1]. усиление 188-nt т. cruzi ДНК повторить, клонирование и секвенирование подтвердили.
** Различия между отрицательным (группы I и V) и позитивные темы (группы III и IV) являются статистически значимой (p < 0,05).
ᵟ расхождения между группами III и IV, объясняется иммунной толерантности в отсутствие антител т. cruzi достиг в 62,6% (52/83) ПЦР позитивные предметов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь, мы обсуждаем на базе семьи исследовательский протокол, который ответил на вопрос ли человеческие болезни Шагаса проистекает из половым внутривидовых т. cruzi инфекции. Ранние исследования не может представить доказательства передачи половым путем инфекций, т. cruzi , вероятно потому, что имеющиеся данные и информацию о болезни Шагаса были получены отдельно от индивидуальных3,4, 5,6,,78,9,10,11,12,13. Нахождение т. cruzi в семенных канальцах мальчика (рис. 1) была искра, что стимулировало клинические и эпидемиологические исследования. Теоретически после нескольких десятилетий, когда семьи изучения подходов и технологий, указанных в настоящем протоколе исследования были доступны, этапов жизненного цикла т. cruzi появилась в человека эякулята1,19.

Прямые паразитологии демонстрация простейших в 21 острых случаях болезнь Шагаса имеет решающее значение для проверки nDNA-PCR амплификация продуктов, которые сформировали конкретных групп в пробах из всех предметов, остро инфицированных с т. cruzi. Этот маркер точки обслуживания Лаборатория оценили результаты анализов иммунологических и нуклеиновых кислот. Основные долгосрочные Шагаса болезнь семьи исследование, таким образом, сочетает в себе результаты в людях с результатами, полученными в групп лабораторных животных. Исследования, проведенные в соответствии с протоколом, показали в первый раз, т. cruzi инфекций передающихся половым путем в людей1.

Широкий разница между коэффициенты от паразита специфические антитела анализов и тестов нуклеиновой кислоты указывает, что большинство nDNA следы результатом половым случаев в отсутствие конкретных анти- cruzi т. антител. Таким образом т. cruzi передачи половым путем в выставке положительное nDNA в отсутствие конкретных IgG антитела членов семьи было обусловлено иммунной толерантности.

Иммунологическая толерантность был продемонстрирован в системе модель курица огнеупорных т. cruzi инфекций после первой недели эмбрион роста1,25,26,,3233, 34. После этого, незрелой иммунной системой неспособность признать паразита как компонент иностранного органа указано курица в конце зрелой иммунной системы терпимости по отношению к cruzi Т. Учитывая эти результаты терпимость представляет собой природный феномен1 результате самопознания иммунной системы и поддержания своих собственных компонентов тела при физиологических условиях25,26, 32 , 33 , 34. переход от состояния иммунной толерантности к Аутоиммунные болезни Шагаса сердца таким образом может быть связан с эффекторных клеток изменениями, вытекающими из т. cruzi кинетопласта (kDNA) мутации в хозяина генома1 ,2,-14,-23,-25,-26.

Важнейшие шаги в протоколе исследования описывают основные техники модификации и устранения неполадок для того чтобы раскрыть половым Шагаса паразитов1,14,23,25, 26: я) выбор исследования семей с случаями острого Шагаса болезнь35,36; ii) изоляция из дикого типа т. cruzi из крови острых случаях; iii) получения образцов ДНК из семей участников крови жгутиконосцев, из архетипа Беренис т. cruzi , от положительных deidentified банк образцов ДНК и от отрицательной контроля L. braziliensis; iv) исполняющая аккуратные технические процедуры для демонстрации, что участников жгутиконосцев nDNA след идентична Беренис т. cruzi архетипа и образцов ДНК этих положительных банка; v) работает независимый тройные nDNA footprinting для демонстрации инфекции T. cruzi в члены семьи три раза один год друг от друга; vi) обеспечение того, что техника nDNA-PCR, проведенных с точки зрения ухода дает результаты подтверждены клонирования и секвенирования всех ампликонов отжигом для конкретных грунтовка множеств, таким образом последовательно показаны последовательности 188-nt cruzi т. 1,25,28,,2930; vii) с использованием высокого качества торговой марки реагентов для воспроизведения титры антител в образцах сыворотки, собранных в три различных временных точках; viii) протокол семьи исследования выявили существующие живой инфекции в зародышевых клеток линии после демонстрации nDNA cruzi т. в отсутствие конкретных сыворотке антител в спермы эякуляции, собранных от Шагаса паразит инфицированных 1человек; ix) точки зрения является, что протокол исследования предназначены для разгадать половым cruzi т. инфекции следует раскрывать автохтонных болезнь Шагаса на пяти континентах; x) nDNA и kDNA следы безопасный диагноз хронической бессимптомной болезни Шагаса в1,людей2; xi) в отсутствие nDNA, мутацияcruzi т. kDNA последовательность1,2,23,25,26 только является маркером лаборатории достижение дифференциальный диагноз от идиопатическая дилатационная кардиомиопатии23,25,37,,3839.

Кроме того вирулентным т. cruzi , документированы в Шагаса пациента эякуляции были способны инициирование распространенных инфекций после инстилляции в мыши влагалище и в брюшной полости. Патологии исследование показало гнезда amastigote т. cruzi , в сердце и скелетные мышцы также, как в семяпроводов и маточные трубы. Интересно, что паразит гнезда не провоцирует воспалительные реакции, которые препятствовали бы жизненно важные репродуктивные функции. Отсутствие воспалительных реакций делает иммунные привилегии в жизненно важным функциональным органом структур40,41,42,,4344,45 и поэтому объясняет необузданных рост т. cruzi в репродуктивных органах.

Кроме того экспериментальные исследования в chagasic мышей, которые разводят с наивными товарищей далее объяснил передачи половым путем инфекций, т. cruzi в организме человека. Инфицированных женщин и мужчин половым т. cruzi на неинфицированных наивно товарищей во время полового акта, и большинство их помета приобрели т. cruzi вертикально переданы потомства от родителя. В этих экспериментах первоначальный этап упомянул росту т. cruzi в трубку и матки, а также в семенных канальцах и семяпроводов, где проходил иммунных привилегий. Затем половым произошло через паразитарные этапов в сперме или выделениями матки во влагалище. Иммунные привилегии40,41,42,,4344,45 — явление, которое позволяет некоторых органов (репродуктивной системы, глаз и мозга) с помощью воспалительные реакции и избежать повреждения важные, конфиденциальные и конкретные функции,40. Гормоны41 и несколько иммунных факторов помощью макрофаги41,42,43, естественные киллеры41, Т-лимфоцитов и T-регулирования (Treg) клетки, таким образом оркеструя ингибирование ряда провоспалительных цитокинов и иммунной привилегия триггеры40,41,42,,4344,45.

Передачи половым путем т. cruzi инфекции от самцов и самок наивно партнеров показывает, что контроль болезни Шагаса требует международной солидарности. Обсуждали здесь результаты предполагают, что необходимы более творческие исследования. Следующие непосредственной цели являются достижимыми: я) для разработки высокопроизводительных платформ для конкретных и высокочувствительный нуклеиновой кислоты тестирования для достижения точного диагноза, направленных для предотвращения инфекции, передающиеся половым, переливание крови и пересадки органов, а также содействия клинических и эпидемиологических расследований для определения диагноза и распространенности болезни Шагаса; ii) для продвижения программы развития многоцентровое наркотиков для получения новых препаратов для ликвидации инфекции T. cruzi ; и iii) осуществить соответствующее образование, информационные и коммуникационные программы, которая включает в себя участие школ, церквей, общественных организаций и учреждений здравоохранения по предотвращению распространения болезни Шагаса.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы признаем, лабораторное оборудование и критические замечания Изабела Dourado, Карла Араужу, и умный Гомес и технической помощи Бруно Dalago и Рафаэль Андраде. Мы в долгу перед фондом для развития науки (FAPDF), Национальный исследовательский совет, министерства науки и технологии (CNPq/MCT) и агентство для подготовки людских ресурсов, Министерство образования (накидки / ME), Бразилия, для поддержки этих расследований.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCIP and NBT redox system Sigma-Aldrich 681 451 001
Blood DNA Purification columns Amersham Biosciences 27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.   Perkin Elmer   BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm AMRESCO 064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Eco RI Invitrogen 15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated Southern Biotech        2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated Biocompare MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane GE Healthcare RPN303B
Hybridization oven Thomas Scientific 95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software Olympus, Japan
Molecular probes labeling System Invitrogen 700-0030
Nsi I Sigma-Aldrich R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit GE Healthcare 28-9042-70
Plate reader  Bio-Tek GmBH 2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated Sigma-Aldrich A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated Sigma-Aldrich F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated Sigma Aldrich A2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated Biorad MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine Sigma-Aldrich G25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Thermal cycler system Biorad, USA 1709703
Vector Systems Promega A1380

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Araujo, P. F., et al. Sexual transmission of American trypanosomiasis in humans: a new potential pandemic route for Chagas parasites. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112, (6), 437-446 (2017).
  2. Teixeira, A. R. L., Nitz, N., Bernal, F. M., Hetch, M. M. Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model. Journal of Visualized Experiments. (65), 3716 (2012).
  3. Kalil-Filho, R. Globalization of Chagas Disease Burden and New Treatment Perspectives. Journal of the American College of Cardiology. 66, (10), 1190-1192 (2015).
  4. Nunes, M. C. P., Dones, W., Morillo, A., Encina, J. J., Ribeiro, A. L. Chagas Disease: An Overview of Clinical and Epidemiological Aspects. Journal of the American College of Cardiology. 62, (9), 767-776 (2013).
  5. Pinazo, M. J., Gascon, J. Chagas disease: from Latin America to the world. Reports in Parasitology. 2015, (4), 7-14 (2015).
  6. Kessler, D. A., Shi, P. A., Avecilla, S. T., Shaz, B. H. Results of lookback for Chagas disease since the inception of donor screening at New York Blood Center. Transfusion. 53, (5), 1083-1087 (2013).
  7. Klein, N., Hurwitz, I. R. Globalization of Chagas Disease: A Growing Concern in Nonendemic Countries. Epidemiology Research International. (2012).
  8. Pérez-Molina, J. A., Norman, F., López-Vélez, R. Chagas disease in non-endemic countries: epidemiology, clinical presentation and treatment. Current Infectious Diseases Report. 14, (3), 263-274 (2012).
  9. Hotez, P. J., et al. Chagas disease: "the new HIV/AIDS of the Americas". PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1498 (2012).
  10. Schmunis, G. A., Yadon, Z. E. Chagas disease: a Latin American health problem becoming a world health problem. Acta Tropica. 115, (1-2), 14-21 (2010).
  11. Franco-Paredes, C., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. The Unfinished Public Health Agenda of Chagas Disease in the Era of Globalization. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3, (7), e470 (2009).
  12. Teixeira, A. R. L., Vinaud, M., Castro, A. M. Emerging Chagas Disease. In: Chagas Disease: - A Global Health Problem. 3, Bentham Science Publishers. New York. Chapter 3 18-39 (2009).
  13. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infectious Diseases. 13, (4), 342-348 (2013).
  14. Teixeira, A. R. L., Hecht, M. M., Guimaro, M. C., Sousa, A. O., Nitz, N. Pathogenesis of Chagas Disease: Parasite Persistence and Autoimmunity. Clinical Microbiology Review. 24, (3), 592-630 (2011).
  15. Murcia, L., et al. Risk factors and primary prevention of congenital Chagas disease in a nonendemic country. Clinical Infectious Diseases. 56, (4), 496-502 (2013).
  16. Chagas, C. New human trypanosomiasis. Morphology and lifecycle of Schizotrypanum cruzi, the cause of a new human disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 1, 159 (1909).
  17. Vianna, G. Contribution to the study of the Pathology of Chagas disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 3, 276 (1911).
  18. Teixeira, A. R. L., Roters, F., Mott, K. E. Acute Chagas disease. Gazeta Médica da Bahia. 3, 176-186 (1970).
  19. Teixeira, A. R. L., et al. Prevention and Control of Chagas Disease – An Overview. International STD Research, Reviews. 7, (2), 1-15 (2018).
  20. Rios, A., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113, (1), 3-8 (2018).
  21. Lenzi, H. L., et al. Trypanosoma cruzi: compromise of reproductive system in acute murine infection. Acta Tropica. 71, (2), 117-129 (1998).
  22. Carvalho, L. O. P., et al. Trypanosoma cruzi and myoid cells from seminiferous tubules: Interaction and relation with fibrous components of extra cellular matrix in experimental Chagas’ disease. International Journal of Experimental Pathology. 90, (1), 52-57 (2009).
  23. Hecht, M. M., et al. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 12, e9181 (2010).
  24. Alarcon, M., et al. Presencia de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en el plasma seminal de ratones con infección aguda. Boletín Malariología y Salud Ambiental. 51, 237 (2011).
  25. Teixeira, A. R. L., et al. Trypanosoma cruzi in the Chicken Model: Chagas-Like Heart Disease in the Absence of Parasitism. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5, (3), e1000 (2011).
  26. Guimaro, M. C., et al. Inhibition of Autoimmune Chagas-Like Heart Disease by Bone Marrow Transplantation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, (12), e3384 (2014).
  27. Oliveira, C. I., et al. Leishmania braziliensis isolates differing at the genome level display distinctive features in BALB/c mice. Microbes and Infection. 6, (11), 977-984 (2004).
  28. Mendes, D. G., et al. Exposure to mixed asymptomatic infections with Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis and Leishmania chagasi in the human population of the greater Amazon. Tropical Medicine, International Health. 12, 629 (2007).
  29. Moser, D. R., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 27, (7), 1477-1482 (1989).
  30. Da Silva, A. R. Sexual transmission of Trypanosoma cruzi in mus musculus [MsD thesis]. University of Brasília. Brasília. Available from http://repositório.unb.br/handle/10482/14829 (2013).
  31. Ribeiro, M., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113, (1), 3-8 (2018).
  32. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172, (4379), 603-606 (1953).
  33. Burnet, F., Fenner, F. The production of Antibodies. MacMillan. Melbourne, Australia. (1949).
  34. Hasek, M. Parabiosis of birds during their embryonic development. Chekhoslovatskaia Biology. 2, (1), 29-31 (1953).
  35. Coura, J. R., Junqueira, A. C. V., Fernades, O., Valente, S. A., Miles, M. A. Emerging Chagas Disease in Amazonian Brazil. Trends Parasitology. Trends Parasitology. 18, (4), 171-176 (2002).
  36. Teixeira, A. R. L., et al. Emerging Chagas disease: Trophic network and cycle of transmission of Trypanosoma cruzi from palm trees in the Amazon. Emerging Infectious Diseases. 7, (1), 100112 (2001).
  37. Hazebroek, M., Dennert, R., Heymans, S. Idiopathic dilated cardiomyopathy: possible triggers and treatment strategies. Netherland Heart Journal. 20, (7-8), 332-335 (2012).
  38. Arimura, T., Hayashi, T., Kimura, A. Molecular etiology of idiopathic cardiomyopathy. Acta Myologica. 26, (3), 153-158 (2007).
  39. Dec, W. G., Fuster, V. Idiopathic Dilated Cardiomyopathy. New England Journal of Medicine. 33, 1564-1575 (1994).
  40. Niederkorn, J. Y. See no evil, hear no evil, do no evil: the lessons of immune privilege. Nature Immunology. 7, (4), 354-359 (2006).
  41. Smith, B. E., Braun, R. E. Germ cell migration across Sertoli cell tight junctions. Science. 338, (6118), 798-802 (2012).
  42. Garth, A., Wilbanks, J., Streilein, W. Fluids from immune privileged sites endow macrophages with the capacity to induce antigen-specific immune deviation via a mechanism involving transforming growth factor-β. European Journal of Immunology. 22, (4), 1031-1036 (1992).
  43. Meng, J., Anne, R., Greenlee, C., Taub, J., Braun, R. E. Sertoli Cell-Specific Deletion of the Androgen Receptor Compromises Testicular Immune Privilege in Mice. Biology of Reproduction. 85, (2), 254-260 (2011).
  44. Fujisaki, J., et al. In vivo imaging of Treg cells providing immune privilege to the haematopoietic stem-cell niche. Nature. 474, (7350), 216-219 (2011).
  45. Wood, K. J., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nature Review Immunology. 3, (3), 199-210 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics