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男性と女性からのナイーブの仲間にアメリカトリパノソーマの性行

Immunology and Infection

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Summary

シャーガス病のcruziエージェントには、長期的な無症候性感染症臨床的に認められた病理に突然発展するが生成されます。次の研究プロトコルでは、親から子孫に性的送信T. クルーズトリパノソーマ感染症を解明する短期家族ベース疫学的研究について説明します。

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Almeida, A. B., Araújo, P. F., Bernal, F. M., Rosa, A. d., Valente, S. A., Teixeira, A. R. Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates. J. Vis. Exp. (143), e57985, doi:10.3791/57985 (2019).

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Abstract

アメリカのトリパノソーマ症は、輸血や病院や研究所では誤って汚染された食物の摂取を介してサシガメによって人間に送信されます。加えて、クルーズトリパノソーマ感染は先天性 chagasic 母から彼女の子孫に、男性パートナーの貢献子宮内で汚染が知られています。巣と amastigotes と trypomastigotes、卵巣の卵胞膜細胞、goniablasts と精細管の内腔の塊の示唆されたt. 原因感染症、性感.ここに研究のプロトコルは、二倍体血単核細胞およびヒトの半数体の配偶子に寄生虫核 DNA を示す家族調査の人口の結果を示します。したがって、収集 1 年離れて 3 つの独立した生体試料は、 t. の原因の感染症が子孫に性感を確認しました。特定の興味深いことに、 t. の原因抗体が欠席した寄生虫抗原に対する免疫寛容を退屈させる家族の子孫の大半で。胚の成長の最初の週後鶏t. の原因に難治性の免疫寛容を示したし、鞭毛を接種した卵から孵化した雛は特定の抗体を生産することができませんでした。また、人間の精液の注入射精腹腔内や精巣上体、精細管、精管欠損症の炎症子宮管のt. の原因amastigotes が得られた素朴なマウスの膣に再現の免疫特権臓器の反応。T. の原因の繁殖-子孫に転送された後で感染症の取得で起因した素朴な仲間と感染した男性と女性のマウス。したがって、人口や社会団体を含む堅牢な教育、情報、コミュニケーション プログラムはシャーガス病を防ぐために必要と認められます。

Introduction

Trypanosomatidae 哺乳類のホストで trypomastigote と amastigote のライフ サイクル段階を経るし、昆虫ベクトルで epimastigotes として存在するファミリーに属する原虫クルーズトリパノソーマ(サシガメ: クロタマゴバチ) 腸の培養。ここ数十年、いくつかの研究は triatomine バグ無料1,2,3,4,5,を考慮する 4 つの大陸の国でシャーガス病の存在を示しています。6,7,8,9,10,11,12,13;アメリカトリパノソーマの分散が、北半球へのラテン アメリカの移民に起因した最初がシャーガス病の土着の場合がある可能性を拒否できなくできる3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14. t. 原因伝送のみ認識可能な内因性ソースは chagasic 母親の妊娠15; の約 10% で子孫に伝寄生虫に帰されています男性パートナーの貢献精液射精を子宮内で感染症が埋もれていた。

1 世紀以上前、捜査官16,17観察細胞内のt. の原因卵巣の卵胞膜細胞および胚の amastigotes ライン シャーガス病の場合は急性の精巣の細胞。巣およびt. の原因trypomastigotes と amastigotes、卵巣の卵胞膜細胞、goniablasts および致命的な急性シャーガス病例の精細管 (図 1) の内腔の群生の臓器の免疫特権を開発します。炎症のない状態で再現、肺浸潤18,19.最近十年間にいくつかの実験的研究示されているt. の原因のラウンド amastigote 形態の巣、精細管、精巣上体、精管も子宮、チューブおよび卵巣のように鋭く感染マウス莢膜細胞1,,2021,22。さらに、彼らの子孫、 t. の原因核 DNA (nDNA) に親シャーガス患者からミトコンドリア DNA を人間の半数体生殖線細胞23、検証した原生動物の譲渡を文書化する研究の過程で、寄生虫のライフ サイクルのステージは、chagasic マウス24の射精で観察されました。これらの調査結果は、 t. の原因 -感染抗体1,25,26の不在でホストの子孫によって達成される免疫寛容に関する報告書と一致しています。また、他の大陸3,4,5,6,7,8 固有のシャーガス病の広がりを提案した疫学的報告書 ,9,1011,12,13 1 シャーガス病が性的に送信することができますを示している実験の研究によってサポートされています.現在の調査疫学家族研究プロトコルおよびt. クルーズトリパノソーマ感染症が性行為で伝達されることを表します。

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Protocol

人間、ブラジリア大学の医学部の動物研究委員会、それぞれ研究プロトコル 2500.167567 10411/2011 でヒトと実験動物のすべてのプロシージャを承認しました。(プロトコル ナンバー 054/2009 と CONEP 11163/2009) 公共財団病院ガスパール ヴァイアナの倫理委員会は、フィールド研究の拡張子に、省の保健委員会人間研究 (CONEP 2585 年 04 月) のための無料の同意フォームを承認しました。プロトコルは DNA 二倍体血単核細胞および精液射精の半数体の配偶子のt. の原因を評価するために調節されました。実験動物が人道的なケアを受信しました。犠牲、前に心臓穿刺を受けるマウス麻酔下にあった。

1. 人間の参加者の募集

  1. 研究チームは、シャーガス患者に医療を提供する医療システム シャーガス病プログラムに参加できることを確認します。
  2. 家族プログラムに登録を少なくとも 1 つを伴った発熱、倦怠感、頭痛、頻脈、浮腫、急性シャーガス病14の主な臨床症状を示すから人間の参加者を募集します。
  3. 5 年の期間のため研究家族の人々 に医療を提供します。
  4. 3 回 1 年間離れて調査の関係者から静脈血の 15 mL を取得、サンプルを 3 つの 5 mL 因数に分割、4 ° C で冷蔵庫に保管
  5. 大人のボランティア家族から精液射精の 2 mL を収集し、3.3 のステップの説明に従います。

2. 寄生虫の成長

  1. 血液の抗凝固ナトリウム ヘパリンの 5 単位を混ぜて手順 1.4 から因数を使用すると、血液の接種による急性のシャーガス病の診断と家族参加者から斜面文化を作る。
    1. 50 mL スクリュー キャップ チューブ血液寒天傾斜プラス肝注入 tryptose 培地 (点灯) 5 mL に unclotted 人間の血液 5 mL を接種して 3ヶ月の 27 ° C でシェーカーのサンプルをインキュベートします。
    2. スライド ガラスの上に培養上清中の 100 μ L を配置、4 週間ごと伝票や血液、顕微鏡下でのt. の原因epimastigotes の検索でカバーします。
    3. 27 ° C で無菌の点灯中清 epimastigote 分離株を収穫します。PBS pH 7.4 では、1,000 x gで 10 分間の遠心分離機のセルを洗浄します。ダルベッコ修飾必須培地 (DMEM) 5 mL にペレットの epimastigotes を希釈します。
    4. 合流 L6 筋細胞培養フラスコを接種する 1 x 10 の6 ECI1-ECI21 t. の原因epimastigote が分離されました。
    5. ベレニス原型 trypomastigotes L6 筋細胞培養 75 mL 培養フラスコでT. 原因に ECI21 ECI1 を育ててください。
    6. 15 ml DMEM の ph 7.4 250 nM L-グルタミン, と 5% CO2 37 ° C1で 100 μ g/mL ストレプトマイシン、ペニシリン 100 IU/mL 5% ウシ胎児血清を添加した細胞をフィードします。
    7. ステップ 5.2 で説明されている陽性対照表現型t. 原因ベレニス trypomastigotes は組織培養由来 ECI1-ECI21 を使用します。
    8. ネガティブ コントロールリーシュ マニア braziliensis27 20% 牛胎児血清のみと DMEM を成長し、ネガティブ コントロールとして寄生虫 promastigotes を使用します。
    9. マウスに感染するのに細胞培養から上清に 1 × 106 t. 原因ECI1-ECI21 trypomastigotes を使用します。
    10. 尾血液感染の最初の週後にt. の原因trypomastigotes を検索します。
    11. ヘマトキシリン ・ エオジン染色の心臓、骨格筋、感染マウスの生殖器官のセクション 1 ヶ月後に amastigotes の巣を検索します。

3. DNA の抽出、PCR 解析

  1. 5 mL の血液 (手順 1.4) の生殖不能の EDTA 管に分注を配置し、3,000 x gの 45 分の密度勾配遠心法を実行します。ピペットを使用して、赤血球上の白っぽい相から単核細胞を採取、PBS、pH 7.4 では、異なる 15 mL チューブに 1,500 × gで 10 分間の遠心分離によっての 5 mL で 2 回白い細胞を洗浄し、DNA の抽出のためのセルを使用します。
  2. ECI 21 t. の原因ベレニスのt. の原因、ネガティブ コントロールl. braziliensis (ステップ 2.1.8) から正のコントロールからに ECI 1 から DNA を抽出し、109 人間家族のテスト血の単核の細胞から研究課題1,27,28
  3. 手順 1.5 DMEM (1:4 v/v) で得られた精子試料の希釈 2 mL5% CO2の 45 分と 37 ° C の孵化、13,000 x gで 5 分間遠心分離後の上清から精子を回復および半数体 DNA23を抽出します。
  4. 抽出バッファー内セルの 1 mL を配置 (10 μ M, 20 μ M EDTA, 塩化ナトリウム 1 %sds、プロテイナーゼ K 0.04% と 1% ジチオトレイトール)、インバージョンとその揺れによってソリューションをミックス。
    1. 13,000 x gおよび 25 ° C で 10 分間のソリューションを遠心し、粘性の上澄みをスピン列に転送します。
    2. 遠心 10,000 × gで 1 分間スピン列と溶出液; を破棄スピン列 (テーブルの材料) を 500 μ L 結合バッファーを追加、12,000 × gで 1 分間遠心および溶出液を捨てます。
    3. 600 μ L の洗浄液を回転カラムに追加、12,000 × gで 1 分間遠心、溶出液を捨てます。
    4. 2 回、この手順を繰り返し、スピン列を滅菌 1.5 mL マイクロ遠心チューブに転送します。
    5. TE バッファーの 100 μ L 管、2 分間室温でインキュベート、12,000 × gで 1 分間チューブを遠心分離を追加します。遠心チューブ内のバッファーには、DNA が含まれています。
    6. 0.8% の agarose のゲルの因数を実行することにより、吸光度 260 を読んで DNA 濃度の測定分光光度計の nm。PCR 解析で使用するまで-20 ° C で DNA サンプルを格納します。
  5. 特定 188 nt 特定テロメア シーケンスにアニール使用t. の原因Tcz1/2 プライマー プローブ29と家族研究被験者の血液と精子、ベレニスのt. の原因の肯定的な制御およびから DNA を PCR を実行、L. braziliensisネガティブ コントロール。
    1. 10 ng テンプレート DNA、プライマー、2 U の Taq DNA ポリメラーゼ、0.2 μ M dNTPs と 15 μ M MgCl2 25 μ L 最終巻の各ペアの 0.4 μ M と PCR の混合物を準備します。
    2. 30 94 ° C で DNA 増幅プログラムを開始テンプレートを変性し、30 の 55 ° C にサンプルを冷却する s s。90 94 ° C でサンプルをインキュベートし、アニールされたプライマーの拡張する s。30 94 ° C まで温度を返す次のサイクルを開始し、サンプルをインキュベート s 72 ° C でさらに 3 分32ndサイクルの終わりには、室温で 10 分間のサンプルを冷却、4 ° C29で冷蔵庫で保管します。
    3. 両方の下肢に Tcz1/2 プライマーをアニールt. 原因DNA テロメア反復配列を増幅します。
    4. 1.3% の agarose のゲルの拡大の製品を分析し、UV イルミネーターで 188 nt DNA バンドを確認します。

4.交配

注:交配は agarose のゲルの偽肯定的な PCR 産物のほとんどを破棄する使用されました。

  1. シャーガス ケース ポジティブ コントロール、二倍体 DNA の 109 のテスト サンプルからは交配する 21 研究家族参加者の半数体の DNA から、感染していないコントロールからの PCR 増幅産物を対象します。
  2. T. 原因188 nt DNA 特定テロメア シーケンス プローブが表示 Tcz1/2 プライマーをアニールを採用します。[α-32P] 2'-デオキシアデノシン三リン酸 (dATP) 任意プライマー分類のキットを使用して、プローブのラベルおよび 60 V 4 ° C で一晩で 1.3% の agarose のゲルの拡大の製品を分析
  3. 一晩キャピラリー方式正荷電のナイロン膜にゲルを転送します。
  4. 標識の 188 nt のプローブは、可変期間の 25 μ L の酵素特有のバッファーにバインドを genomic DNA のエコR1 ダイジェストとナイロン膜に転送 DNA バンドを交配させます。
  5. 2 x SSC と 0.1 %sds の 65 ° C で 15 分間 2 回膜を洗浄します。
  6. 1 週間の x 線映画をナイロン膜やオートラジオグラフィー膜のバンドを公開します。
  7. 特定の標識 DNA プローブとハイブリダイズするt. 原因PCR 増幅の製品と PCR およびの交配から選択されたクローンを成長します。
  8. 商業的、t. の原因 -特定のテロメア フット プリント2,23に焼なましを設定 Tcz1/2 プライマーを使用してクローンをシーケンスします。

5. 免疫アッセイ

注: 感度と特異度 (IIF) 間接蛍光抗体法と酵素免疫測定法 (ELISA) を評価した明白な寄生症 6 例にシャーガスと 6 シャーガス無料からの血清の血清を提供銀行のサンプル。法は、1: 100 希釈で IIF と ELISA 光学密度 (ODs) 0.150 と上記負の結果から正を分離を明らかにした PBS、pH 7.4 でダブル血清希釈で実施。

  1. 1 時間室温で保管 unclotted 血液分注 (手順 1.4) 5 mL を使用して、上清に血清を分離する 30 分間 1,500 × gで遠心分離機します。
  2. T. の原因L. braziliensis抗原28.を前述のように検出する血清希釈液の調製帳票 1: 100 の IIF と ELISA を実行します。
  3. IIF 関数
    1. 3 回 1 年間隔に 109 研究被験者の試料の帳票血清希釈液で IIF アッセイを行ってください。
    2. 場所 5 μ L 懸濁液、ホルマリン 1% - t. の原因epimastigotes またはガラス スライド上にL. braziliensis promastigotes 治療常温フードで寄生虫一晩乾燥させて、使用するまで-20 ° C でスライド ガラスを格納します。
    3. スライド ガラスの上に患者の血清希釈の場所 20 μ L コーティング 5 μ L の不活化 (10 寄生虫/μ L) t. の原因epimastigotes またはL. braziliensis promastigotes。
    4. 37 ° C で三度 PBS で洗浄湿室に 1 h のスリップで覆われたガラス スライドを孵化させなさい。
    5. 37 ° C で 1 時間人間の IgG にフルオレセイン標識ウサギ抗体 (材料表) の縮尺希釈で乾ガラス スライドを孵化させなさい洗浄し、スライドを乾燥します。
    6. カバー スリップのスライドをマウントし、紫外光顕微鏡下で調べます。
      注: 肯定的な試験は、アップル グリーンのビデオで示すように、 t. の原因epimastigote シルエット。
  4. ELISA
    1. T. の原因およびコーティング マイクロ プレートのウェルにL. braziliensis可溶性抗原 (pH 9.6 0.1 M 炭酸バッファーに 1 μ g/100 μ L) を検出するための elisa 法を実行します。
    2. 室温で 2 時間帳票コーティングされた井戸の 1: 100 血清希釈を孵化させなさい。
    3. 三度 PBST でプレートを洗う (0.5% を含む PBS トゥイーン 20)、pH 7.4、乾燥する前にソリューション。
    4. 縮尺希釈ウサギ抗ひと IgG 抗体の 37 ° C で 90 分の 50 μ L をプレートを孵化させなさい
    5. 三度 PBST ソリューションでプレートを洗浄し、室温で乾燥すること。
    6. 37 ° C で 90 分のアルカリ性ホスファターゼ共役ヤギ抗ウサギ IgG (材料表) の縮尺希釈液を 100 μ l 添加でプレートを孵化させなさい
    7. PBST で三度プレートを洗浄、基板 p ニトロ フェニルりん酸を追加し、発色を待ちます。
    8. 630 で ODs を読む nm マルチモード プレート リーダー。
    9. 調査の人口からテスト血清の帳票の希薄を実行し、具体的に特定する ODs をプロットt. の原因抗体。

6. 免疫寛容の評価

注: 鶏モデル システムは胚の最初の 1 週間後t. の原因の感染症をテストに使用だった。

  1. 組織培養培地; から収穫 100/10 μ t. の原因trypomastigotes とチキン肥沃な卵を接種します。培地 μ L あたり 10 t. の原因trypomastigotes と模擬卵を接種します。テープで穴を塞ぐ。
  2. 21 日は 20 t. の原因-感染した卵と数 37 ° C 湿度 65% でモック肥沃な卵を孵化させなさい。
  3. 雛そのハッチ 24 h と、その後、32 ° c 温度制御が付いているフードでインキュベーターで 3 週間保ちます。
  4. T. の原因 -接種卵および 24 ° c、別の通路に置かれた個々 のケージで肯定的な空気圧個室で大人の段階に模擬卵から孵化した雛を育てます。
  5. ビデオのスキームによると、毎週、皮下を注入 107不活化 trypomastigotes で生後 6 か月で 3 回すべての大人の女に挑戦します。
  6. T. の原因-接種した卵からはモックのコントロール血清を取得する最後の予防接種後 4 週間を孵化した鶏の翼の静脈から血液を描画します。
  7. 鶏血清を使用して、特定の検出 iif 関数とプロトコルの手順 5 で説明した ELISA によるt. の原因抗体。

7. 感染マウスのシャーガス患者の精液射精からのt. の原因

  1. 大人の PCR + シャーガス病患者 (ステップ 1.5) と PCR-シャーガス無料大人個人から精液射精を使用します。
  2. 12 歳 1 か月 BALB/c 素朴なマウス 24 ° C で肯定的な空気圧の下フードの保管し、供給食品広告自由の 2 つのグループを使用します。
  3. 腹膜とグループ A マウスの膣に等しい量に人間シャーガス陽性精液因数 (100 μ L) を植え付けます。
  4. 腹膜と膣内に B 群のマウスの同量にコントロール シャーガス無料精液因数 (100 μ L) を植え付けます。
  5. 麻酔下で実験的マウスを犠牲に精液注入後 5 週間とヘマトキシリン - エオシン染色組織切片の対象します。
  6. Trypomastigotes t. の原因や心臓、骨格筋、マウスのグループでは生殖器に amastigotes を検索する顕微鏡を使用します。

8 肉体関係によってt. クルーズトリパノソーマ感染症の伝送

  1. 実験では 10 の男性と女性 6 週齢 BALB/c マウスを使用します。
  2. 男性 5 名、1 x 10 の5組織培養からt. の原因trypomastigotes と腹腔内 5 雌マウスに接種します。 
  3. 生後 3 カ月までのマウスを繁殖: 私は 5 t. の原因によって形成されるグループ-感染したメスのマウスと 5 制御マダニ、男性の仲間。II 群で形成される 5 t. の原因-感染した男性と 5 はマダニの女性仲間を制御します。III 群は男性 5 名と女性 5 制御感染素朴な仲間によって形成されます。
  4. 各家の脱出を防ぐために 5 mm グリッドとロックのドアとセーフティ ボックスの中に配置 1 つのケージのペア繁殖。
  5. 食事と水のアドリブは、マウスを供給します。離乳し、少なくとも 6 週間のグループ II と I で 70 の合計を上げます。
  6. 親 (FO) と麻酔下での子孫 (F1) マウスから心臓穿刺による採血、マウスを犠牲にし、心臓、骨格筋、病理学的分析のための生殖器官のセクションを送信します。

9. 免疫特権の評価

  1. T. の原因から組織を取得-感染と素朴なマウス (手順 8.6) を制御し、4 μ m 厚いセクションにパラフィン包埋試料をカットします。
  2. パラフィンを取り外して、キシレンのいくつかの変更とスライド ガラスおよび 1 分の 100% を 70% エタノールで傾斜洗浄にセクションを脱水します。
  3. 室温で 3 つの蒸留水洗浄後一度、0.05% サポニンと切片を孵化させなさい。
  4. 0.1 m PBST スライド 45 分洗浄 5% 無脂肪粉ミルクの切片をブロックし、セクションとシャーガス マウス抗t. 原因血清または、1:20 で感染コントロール マウス血清を孵化させなさい 2 h のための希薄。
  5. PBST とアルカリ性フォスファターゼ共役ウサギ抗マウス IgG の縮尺希釈培養する前に常温乾燥、三度 5 分用のスライドを洗ってください。
  6. PBST スライドをリンスに、3, 3' 5 分孵化、PBST と 3 つの洗浄および 30 のハリス ヘマトキシリンと counterstaining に続いてジアミノベンジジンを 100 μ l 添加 s。
  7. 5 分間蒸留水でスライドを洗って 70%、80%、90%、および 1 分の 100% エタノールの脱水にバッファーに格納されたグリセリンでそれらをマウントします。
  8. 明視野光学顕微鏡でスライドを確認し、ソフトウェアとアナライザー プログラム超小型カメラで写真画像をキャプチャします。
  9. 生殖器の炎症性反応の不在で寄生虫の免疫特権を文書化します。

10. 統計解析

  1. 医学編集を使用して、配列解析のため、爆発で線形を行い、E 値の統計的有意 (p < 0.05) を特定します。
  2. 一方向の分散分析 (ANOVA) を実行し、OD を比較するためのテューキー検定は、プラスまたはマイナスの標準偏差を意味します。

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Representative Results

プロトコルに従ってこの調査は臨床および寄生虫の検査によるシャーガス病の急性のケースを検出することを目的しました。直接顕微鏡検査と培養寄生虫の成長のために静脈採血を受けた。シャーガス病 21 急性例は血のt. の原因を示した。研究プロトコル セキュリティで保護されたt. 原因ECI1 の分離-急性シャーガス病から ECI21、DNA サンプル展示調査の人口の残りの部分で肯定的な DNA の足跡: nDNA PCR の試金は典型的なテロメア反復配列を得られました。t. 原因ベレニス原型1だけでなく、現在の 188 nt バンド。シャーガス ケースと研究に参加するボランティア、家族のメンバーは、4 人家族1に分類できた.

この家族の研究では、 t. の原因nDNA は PCR プライマーで増幅設定1,23 21 急性シャーガス病の例のそれぞれから特定のテロメア シーケンスに焼鈍だった。これらのt. の原因nDNA amplicons 交配特定 radiolabeled シーケンス プローブ (図 2)。クローニングとシーケンス、amplicons にt. の原因188 nt テロメアの繰り返しモチーフがで構成されることを明らかにしました。これらの交配手順の特異性は、 L. braziliensis promastigotes 共演ネガティブ コントロールに示されました。病理解析検証急性シャーガス病患者の hemoflagellates が本当に病原性t. の原因T. 原因nDNA (188-bp) バンドわかった 21 急性シャーガス場合 (図 2)、持続感染の直接デモを終えてください。

人間のcruzi トリパノソーマの原因の性的感染

T. 原因感染症の比率を評価するには、家族研究人口1寄生虫足跡の高感度検出のための核酸検査を適用されます。これらの PCR の試金特定の radiolabeled 188 nt プローブとハイブリダイズ増幅製品はテスト サンプルの 76.1% (83/109) で nDNA バンドを結成特定の 188 nt radiolabeled プローブ nDNA PCR 増幅産物のの交配の結果は、図 3のとおりです。さらに、交配はボランティアの家族 (図 4) の生殖細胞系列で寄生虫の DNA を示した。

Iif 関数を用いて、血中原虫の寄生虫のデモンストレーションとシャーガス病血清銀行サンプルから血清 IgG と ECI21 t. の原因trypomastigotes に、ECI1 表現型と蛍光標識抗ひと IgG が使用されました。.T. 原因ベレニスはシャーガス抗体のポジティブ コントロールと負のコントロールは、家族の promastigote 相対L. braziliensis図 5は、ベレニス原型の肯定的なアップル グリーンのシルエットが野生型に関連付けられているを示していますビデオに示すt. 原因封筒。

Elisa 法と IIF 明らかに特定のt. の原因抗体1,28テスト サンプルの 28.4% (31/109)。ELISA と、iif 関数と同様 nDNA PCR 増幅との交配からの結果は、図 6にプロットされます。NDNA PCR の足跡と抗体アッセイは、heredograms (図 7)、家族、4 科目で描かれているからそれらの結果の間で不一致があった nDNA と反t. の原因抗体、および 11 のみ持っていた肯定的な正 nDNA;5 つの男性は、精液射精のt. の原因を持っていた。家族 B 44 人、11 があった特定のt. の原因抗体および 23 特異抗体と寄生虫 nDNA; の両方を持っていた。7 人の個人は、精液射精でt. の原因を持っていた。29 メンバーと家族 C 抗体およびt. の原因nDNA 5 人でいて 17 寄生虫 nDNA 単独で;4 つの男性は、精液の射精で nDNA PCR 陽性を持っていた。家族ニ 21 科目のうち 11 いたし特定アンチt. の原因抗体 nDNA フット プリントと正 nDNA PCR だけがあった 9。図 3図 6図 7 1 年間離れて実行 3 つの独立した実験で家族の被験者から得られた生体試料中に一貫してある結果の中で広い不一致が描かれています。

表 1 A ~ D の人間研究家族からのサンプルで、IIF、ELISA、nDNA PCR の試金の量的な違いを示しています。抗体アッセイ (28.4%) の比率と肯定的な核酸の試金 (76.1%) の間の相違が統計的に有意 (p < 0.005)。これらの家族t. の原因 -感染 (III, IV) の人々 のグループ間の違いは、肯定的な核酸テストを単独で示す、人口の 62.6% (52/83) を占めています。広い不一致正 nDNA 足跡の比率や特定のt. の原因の間で抗体が鶏モデル システムでの実験によって説明されました。

免疫寛容

大人の段階に素朴なコントロール鶏 (A) を含む別の通路に個々 のケージで育てられている鶏のグループで実施した免疫反応の評価培地 (B) を接種した卵から孵化したモック コントロール鶏t. の原因trypomastigotes 接種卵 (C)26から孵化した鶏。大人のグループ B と C は、不活化を 3 回が挑戦された鶏t. の原因trypomastigote 抗原、毎週、ビデオに示すように。Elisa 法と IIF の試金から実行された血清の収集とグループ A、B および C 鶏チャレンジ後 1 ヶ月。図 8は、グループ B のt. の原因抗原で免疫した特異抗体産生と鋭く対照グループ A および C 鶏の特定の抗体の有無を示します。結果、明らかに免疫グループ C の公差がt. の原因から孵化・卵を接種します。

性的感染みてください。マウス モデルにおけるpanosoma の原因

またと雄マウスの腹腔内に精液の 100 μ l 注入を通してシャーガス患者の射精を PCR で陽性、特定の抗体に欠けていたからt. の原因の感染を示した、精液を膣に注入の同量。5 週間後、 t. の原因amastigote 巣が心臓や骨格筋で検出された寄生虫を差別化の塊精管・卵管内腔に存在していた.興味深いことに、破壊的な炎症反応の巣とt. の原因amastigotes (図 9) の塊前後でした。

T. 原因感染症の性的感染の評価は 1 × 105 t. 原因ベレニス trypomastigotes フォーム1,30、腹腔内接種したマウスの 2 つのグループで実施されたさらに 31。私、10 t. の原因 -感染男性 10 素朴なコントロール雌マウスと交配実験群。実験群 II、10 t. の原因-感染女性 10 素朴な制御の男性と交配します。図 10は、 t. の原因-感染男性マウス (A ・ E) とt. の原因 -雌マウスの感染 (F-g) 188 bp nDNA バンド (奇数番号) が得られました。繁殖後素朴な仲間 (偶数番号) は容易に次の chagasic 仲間とユニークな性的な出会いのt. の原因を取得しました。同一の条件下で行われる同様の繰り返し実験をそれぞれ素朴な女性または男性マウスを性的交尾t. の原因と確認-感染した男性や女性は鞭毛の感染を取得します。これら nDNA 正創設者 (F0) には、彼らは 6 週間の時代まで調達した子孫が生成されます。コントロール テストしマウスの感染、心臓穿刺ブレッド経由では、約 0.5 mL の血液を収集します。NDNA PCR の試金は、188 bp nDNA バンド (図 11) で示すように、創設者 (F0) 取得した性的感染された F1 子孫に送信されることを示した。F1 子孫の検討 70 (58.6%) サンプル 41 nDNA 陽性であった。NDNA バンド 41 (22%) の 9 t. の原因抗体を持っていたいくつかの垂直買収感染症の挑発的なこれらのマウス。

F1 子孫マウスが、麻酔下で犠牲になった、体の組織病理学的および免疫ペルオキシダーゼ染色解析を行った。これらの実験の結果は図 12のとおりです。T. の原因amastigotes の結果は、精巣の間質細胞と goniablasts; に記載されていたamastigotes trypomastigotes に炎症反応のない状態で精細管の内腔に存在していた。

Figure 1
図 1.クルーズトリパノソーマ急性のシャーガス病の亡くなった少年の精細管における感染症.医師・ テイシェイラのファイル、1970年18から顕微鏡写真。T. 原因フォームは、goniablasts と amastigotes、無料 trypomastigotes (矢印) の塊、炎症細胞の浸潤1.の不在で精細管の内腔に存在ヘマトキシリン-エオシン汚れ。バー、20 μm. 出版社と著者1,19の許可を得て転載。

Figure 2
図 2.足跡 cruzi トリパノソーマの原因急性シャーガス病からT. 原因nDNA PCR 増幅産物は、特定の radiolabeled 188 nt プローブの 188 nt バンドを形成しました。Tc、 t. の原因;nc、ネガティブ コントロール。出版社および著者1からの許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3.しみの分析 cruzi トリパノソーマの原因人間研究科の科目で感染します。家族 A - 15 のすべての科目は、特定の nDNA PCR 188 nt バンドを示した。家族 B 43 科目 (81.4%) の 35 の合計は特定 nDNA バンドを結成しました。家族 C の 29 のメンバー間で 22 (75.8%) は nDNA バンドを結成しました。家族 D では、21 人の被験者 (52.4%) の 11 は nDNA バンドを持っていた。T. の原因-特定 nDNA バンドがのクローニングとシーケンスによって確認されました。出版社および著者1からの許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4.アクティブなクルーズトリパノソーマ精液で感染症研究家族ボランティアから射精します。NDNA PCR 188 bp バンドによって識別されるシャーガス患者の射精で感染。Tc、 t. の原因肯定的な制御。Nc、 L. braziliensisネガティブ コントロール。出版社および著者1からの許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5.表現型クルーズトリパノソーマシャーガス病患者の血清抗体とT. 原因寄生虫 trypomastigote を認識するシャーガス血清 IgG 抗体が付いては、FITC 標識モノクローナル Ab 抗ひと IgG と扱われます。反t. 原因Abリーシュ マニア braziliensis promastigotes を認識しません。インセットは、否定的なコントロールを表示します。バー、20 μ m. 転載、出版社と著者1の許可を得ています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

Figure 6
図 6.Elisa と家族 nDNA PCR の試金のグラフィック表現研究人口の。グループ I (n = 10) と II のグループ (n = 20) 寄生虫のデモンストレーションとt. 原因感染症からそれぞれネガティブ コントロールとポジティブ コントロール血清であった。グループ III (n = 31) t. の原因に 188 bp nDNA バンド特異抗体と家族の被験者からのサンプルが含まれています。グループ IV (n = 52) 特定の抗体の有無で nDNA PCR 188 nt amplicons によって検出されたt. 原因感染症被験者からのサンプルで構成されています。グループ V (n = 26) 家族における感染症、フリーの人で構成される負のテスト サンプルでした。出版社および著者1からの許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7.Heredograms とのマッピング、トリパノソーマの原因-家族の人口に感染しますT. の原因抗体と nDNA PCR の試金は、アンチの比率の間での不一致を示します。空白の正方形と円、負のオスとメス。赤い四角形や円、正反t. の原因抗体や nDNA PCR。黒の四角や丸、正 nDNA PCR だけ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

Figure 8
図 8.孵化した鶏の免疫の許容トリパノソーマの原因-卵を接種します。モック コントロール鶏 A) 効果をもたなかった抗体プロファイル (n = 10)。T. の原因抗原挑戦 B) 素朴なコントロールで特定の抗体応答鶏 (n = 20)。C) 鶏の特異的免疫反応の欠如がt. の原因から孵化- t. の原因抗原チャレンジ後卵を接種 (n = 20)。光学濃度の違い A と C (024 ± 0.17) B に向かって (0.85 ± 0.6) は統計的に有意 (p < 0.05)。この図は参照26から変更されているし、出版社や著者から許可を得て転載です。

Figure 9
図 9.感染 cruzi トリパノソーマの原因人間の射精でアクティブなマウス感染につながります。シャーガス患者射精の因数は、腹腔内にまたはマウスの膣内に注入されました。マウスは、投与後 3 週間を犠牲にされました。トップ レーン、 t. の原因amastigotes 巣 (左) 心臓、骨格筋 (右)。下レーン、 t. の原因amastigote の巣 (左)輸精管および子宮管 (右)。挿入は、分割 amastigote (円) を示しています。ティッシュ セクションの炎症細胞の浸潤がないことに注意してください。ヘマトキシリン-エオシン汚れ。バー: 上、下左、20 μ m右下、10 μ m. 転載、出版社と著者1の許可を得て。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 10
図 10.性行クルーズトリパノソーマ肉体関係によってマウス感染モデル システムの交配で明らかに特定 nDNA 188 bp バンドによって示される素朴な仲間に chagasic からt. 原因感染症の伝染。トップ レーン) t. の原因 -感染マウスの素朴なマウスの PCR 増幅の製品のプロファイルを Prebreeding。奇数の数字は、 t. の原因-男性 A に E と F-私はマウス女性サンプルを感染しています。偶数は、素朴な女性 (2-10) と男性 (12-20) マウスです。下レーン、繁殖、マウス 2-20 取得t. 原因感染症をもプロファイル表示後。出版社および著者1,30からの許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 11
図 11. Cruzi トリパノソーマの原因 F0 chagasic 親から F1 子孫マウスに感染を垂直方向に転送します。Chagasic 親は、単一の繁殖の出会いによってt. 原因感染症が送信されます。T. の原因-感染した女性は素朴な男性 A ~ E、交配し、素朴な交配されたt. の原因 -感染男性 F j.繁殖後、は、すべての起業家 (F0) は肯定的な原虫 nDNA PCR 188 bp のバンドを示した。しみが付くことで、交配後 F1 リットルの大多数の radiolabeled 188 nt プローブでの特定 nDNA バンドを明らかに。Nc、 L. braziliensisネガティブ コントロール;Tc、 t. の原因肯定的な制御。出版社および著者1,31からの許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 12
図 12.記載されている病理 cruzi トリパノソーマの原因炎症反応のない状態で F1 の子孫と免疫寛容を F0 から性病。精巣上体、goniablasts、F1 マウスの精細管でt. 原因フォームの成長を示します。麻酔下マウスと免疫ペルオキシダーゼ染色切片を顕微鏡で調べた。顕微鏡写真を示す茶色の免疫ペルオキシダーゼ染色t. の原因 (副睾丸の間質性の amastigotes) と amastigotes trypomastigotes、精の内腔に小屋へと分化の塊尿細管 (B C、およびF)。Goniablast (D) に見られる amastigote の巣。肯定的な制御マウスの精細管標準組織学 (E)。シャーガス寄生虫の負荷を示す F1 マウスの精巣に炎症細胞の浸潤がないことに注意してください。ギムザ染色。バー: A、B、C および E、20 μ mD および F、10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

表 1。正 iif 関数と ELISA 試験の比とサンプル nDNA PCR の試金のそれら間の相違は人間の研究家族 A から収集した-に-D *

グループ * * ELISA: 血清抗-t. 原因Ab (%) T. 原因nDNA PCR (%)
コントロール Ab-PCR - (n = 10) 10/10 100 10/10 100
II 制御 Ab + PCR + 20/20 100 20/20 100
(n = 20)
シャーガス III-Ab + PCR + ᵟ 31/109 28.4 31/109 28.4
(n = 31)
IV-シャーガス Ab-PCR + ᵟ - - 83/109 76.1
(n = 52)
V-シャーガス無料 Ab-PCR- 26/109 23.9 26/109 23.9
(n = 26)
* 3 つの独立した elisa 法と nDNA PCR の試金の結果は 1、2、3 年で 3 つの異なる場面で収集されたサンプルで実行されます。[1]. 188 nt t. 原因DNA の増幅を繰り返してクローニングとシーケンスによって確認されました。
* * (グループ I, V) 否定と肯定的な科目 (グループ III と IV) 間の違いは、統計的に有意 (p < 0.05) です。
ᵟ グループ III と IV t. の原因抗体の不在で免疫寛容によって説明される間の相違は、PCR 陽性被験者の 62.6% (52/83) で達成。

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Discussion

人間シャーガス病が性病種族内のt. の原因に由来かどうかの質問に答えた家族ベースの研究プロトコルについて論じる本、感染症。初期の研究を提供できなかったt. の原因の感染症、性行為感染の証拠おそらくシャーガス病についての情報と利用可能なデータは別途個別3,4から得られたので 5,6,7,8,9,1011,12,13。(図 1) の少年の精細管のt. の原因の発見は、臨床的、疫学的調査に拍車をかけたスパークでした。数十年後多分家族研究アプローチとこの研究計画書に記載されている技術は利用可能であったt. の原因のライフ サイクル段階に登場、人間の射精1,19

21 急性シャーガス病の例に、原生動物の直接寄生虫デモだったt. の原因に急性感染しているすべての科目からのサンプルの特定のバンドを形作った nDNA PCR 増幅製品を検証することが重要。このポイント ・ オブ ・ ケア検査マーカーには、免疫学的および核酸のアッセイの結果が評価されます。長期的な基礎的シャーガス病家族研究は、したがって、実験動物のグループで得られるものと人間の所見を兼ね備えています。研究初めて明らかにしたプロトコルによると、 t. の原因感染症は性的人間1で送信されます。

寄生虫特異抗体アッセイから比、核酸テストからのそれらの広範な違いは nDNA 足跡の大半がアンチt. の原因特定の不在で性病の場合に起因することを示します抗体。したがって、正 nDNA 特異 IgG 抗体の不在を示す家族のt. の原因の性的感染は免疫寛容のためだった。

胚の成長1,25,26,32,33の最初の週後t. の原因の感染症を難治性鶏モデル システムの免疫寛容を示した 34。未熟な免疫システムの体の外部コンポーネントに対する鶏の後半成熟した免疫寛容を示される寄生虫を認識することができないことその後、 T の原因。これらの結果の点から見て許容範囲は免疫システムの自己認識と生理的条件25,26,独自の車体部品の保守から生じる自然現象132,33,34. 自己免疫性心臓病に対する免疫寛容の状態からの移行は、ホストのゲノム1 t. の原因キネトプ ラスト (kDNA) 変異から生じるエフェクター細胞変更に従って関連付けられる、2,14,23,25,26

研究プロトコルの重要なステップを記述する主要な技術変更および性病シャーガス寄生虫1,14,23,25を開示するためにトラブルシューティング 26:私)急性シャーガス病35,36; 症例研究家族を選択します。ii) は野生型のt. の原因; 急性例の血液からの分離iii) 取得 DNA サンプル家族の参加者の血する鞭毛虫類、ベレニスのt. の原因原型、肯定的な提供銀行の DNA のサンプル、負から制御・ l ・ braziliensis;iv) 参加者のケイソウ nDNA フット プリントがベレニケのt. の原因原型とそれらの肯定的な銀行の DNA サンプル; を同一であることを実証する実行の整頓された技術的な手順3 回 1 年間離れて; 家族のt. の原因の感染症を示すv) 実行している独立した帳票 nDNA フット プリントvi) は、ケア実施 nDNA pcr クローニングと特定のプライマーをアニールされたすべての産物をシーケンスによって確認された結果を生成することを確保する設定、従って一貫して示すt. 原因188 nt シーケンス1,25,28,29,30;vii) まだ 3 つ異なる時間ポイントで採取中の抗体価を再現する高品質商標試薬を使用してviii) 家族研究プロトコルは、シャーガス寄生虫感染から収集した精液射精で血清抗体価の不在でt. 原因nDNA のデモに、生殖細胞に既存のライブ感染症を明らかにしました。個人1;ix) 視点は、性病を解明する研究のプロトコルが設計されているt. の原因の感染症は、5 つの大陸に土着のシャーガス病を表わすべきであります。x)、nDNA と kDNA 足跡を確保人間1,2無症候性慢性シャーガス病の診断xi)、nDNA の不在で、突然変異t. の原因のkDNA シーケンス1,2,23,25,26だけではの研究所のマーカー特発性拡張型心筋症23,25,37,38,39から鑑別診断を達成します。

また、シャーガス患者射精に記載されている病原性のt. の原因だったマウス膣と、腹腔内に注入時に広範な感染を開始できます。病理研究心と輸精管と子宮管のように骨格筋と同様にt. の原因amastigote 巣を示した。興味深いことに、寄生虫の巣は重要な生殖機能を妨げる炎症反応を刺激しました。炎症反応の有無が重要な機能的な身体構造40,41,42,43,44,45免疫特権をレンダリングするため生殖器官にt. の原因の uncurbed の成長について説明します。

さらに、素朴な仲間と繁殖 chagasic マウスにおける実験的研究はさらにt. の原因感染症人間の性行を説明しました。感染した女性と男性は肉体関係の間に感染していない素朴な仲間にt. の原因感染症を送信および仔の大半を取得垂直親から子孫への転送のt. の原因。これらの実験の初期段階はチューブと子宮、精細管、精管、免疫特権が起こったt. の原因の成長に呼ばれます。その後、精液や膣に子宮分泌物の寄生段階を経て性行が発生しました。免疫特権40,41,42,43,44,45は、レセプターいくつかの器官 (生殖器系、目、そして脳) ができる現象炎症反応と重要な敏感な特定の機能の40の損傷を防ぐ。ホルモン41といくつか免疫因子レセプター マクロファージ41,42,43、ナチュラル キラー細胞41、T リンパ球や T 規制 (Treg) 細胞、このように調整、炎症性サイトカインと免疫特権トリガー40,41,42,43,44,45の数の抑制。

T. 原因感染の男性と女性から素朴なパートナーの性的感染はシャーガス病のコントロールが国際的な連帯を必要とすることを示します。記載結果より創造的な研究が必要なことをお勧めします。次の当面の目標は達成されます:私)高スループットや機密性の高い核酸テスト性行為によって感染する感染症の予防を目指して、正確な診断に到達するためのプラットフォームを開発するには血液の輸血、臓器移植、診断とシャーガス病の有病率を決定する臨床と疫学のお問い合わせを促進します。ii) t. 原因感染症の撲滅のための新しい薬を入手する多施設共同薬剤開発プログラムを促進するためにiii)適切な教育、学校の参加を含む情報とコミュニケーションのプログラムを実装する教会、社会組織およびシャーガス病のまん延を防ぐために保健機関。

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Disclosures

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

Acknowledgments

我々 は、研究所の施設とイザベラ ドラーダ、カーラ アラウージョと巧妙なゴメスの批判的なコメント、ブルーノ ・ Dalago、ラファエル ・ アンドラーデの技術的な支援を認めます。我々 は科学の進歩 (FAPDF)、国立研究評議会、省科学技術 (研究集会/MCT) のための基礎および機構の人材育成、教育省にお世話になっている (岬/私)、ブラジル、これらを支援するため調査。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCIP and NBT redox system Sigma-Aldrich 681 451 001
Blood DNA Purification columns Amersham Biosciences 27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.   Perkin Elmer   BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm AMRESCO 064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Eco RI Invitrogen 15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated Southern Biotech        2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated Biocompare MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane GE Healthcare RPN303B
Hybridization oven Thomas Scientific 95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software Olympus, Japan
Molecular probes labeling System Invitrogen 700-0030
Nsi I Sigma-Aldrich R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit GE Healthcare 28-9042-70
Plate reader  Bio-Tek GmBH 2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated Sigma-Aldrich A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated Sigma-Aldrich F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated Sigma Aldrich A2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated Biorad MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine Sigma-Aldrich G25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Thermal cycler system Biorad, USA 1709703
Vector Systems Promega A1380

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