Author Produced

Transmisión sexual de tripanosomas americanos de machos y hembras a compañeros de ingenua

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

El agente Trypanosoma cruzi enfermedad de Chagas produce infecciones asintomáticas de larga duración que convertirse abruptamente en patología clínicamente reconocida. El siguiente protocolo de investigación describe un estudio epidemiológico de corto plazo basado en la familia para desentrañar la infección de T. cruzi transmitida sexual de los padres a la progenie.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Almeida, A. B., Araújo, P. F., Bernal, F. M., Rosa, A. d., Valente, S. A., Teixeira, A. R. Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates. J. Vis. Exp. (143), e57985, doi:10.3791/57985 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Tripanosomiasis americana es transmitido a humanos por insectos triatominos a través de la ingestión de alimentos contaminados, por transfusiones de sangre o por accidente en hospitales y laboratorios de investigación. Además, la infección de Trypanosoma cruzi se transmite congénitamente de la madre chagásica a su descendencia, pero se desconoce la contribución de la pareja masculina a la contaminación en el útero. Los hallazgos de nidos y masas de amastigotes y de tripomastigotos en las células tecales del ovario, en el goniablasts y en el lumen de los túbulos seminíferos sugieren que las infecciones de T. cruzi son de transmisión sexual. El protocolo de investigación en el presente documento presenta los resultados de una población de estudio de la familia que muestra parásitos de ADN nuclear en las células mononucleares de sangre diploides y los gametos haploides de sujetos humanos. Así, tres independientes muestras biológicas recogidas un año aparte confirman que T. cruzi infecciones sexualmente fueron transmitidas a la progenie. Curiosamente, los específicos anticuerpos de T. cruzi era ausente en la mayoría de la progenie familiar que la tolerancia inmunológica a los antígenos del parásito. Tolerancia inmunológica fue demostrada en pollo refractario a T. cruzi después de la primera semana de crecimiento embrionario y polluelos nacieron de los huevos inoculados de flagelados eran incapaces de producir el anticuerpo específico. Por otra parte, la instilación de semen humano eyacula por vía intraperitoneal o en la vagina de ratones ingenuos rindió amastigotes de T. cruzi en el epidídimo del túbulo seminífero, conducto deferente y tubo uterino con la ausencia de inflamación reacciones en los órganos inmunes privilegiados de la reproducción. La cría de T. cruzi-ratones machos y hembras infectados con ingenuos compañeros dio lugar a la adquisición de las infecciones, que más tarde fueron transmitidos a la progenie. Por lo tanto, un robusto programa de educación, información y comunicación que involucra a la población y organizaciones sociales se considera necesario para prevenir la enfermedad de Chagas.

Introduction

El protozoo parásito Trypanosoma cruzi , perteneciente a la familia Trypanosomatidae pasa por etapas de ciclo de vida de trypomastigote y amastigote en huéspedes mamíferos y existe como epimastigotes en el insecto vector (Reduviid: Triatominae) intestinal y en cultivo axénico. En las últimas décadas, varios estudios han demostrado la presencia de la enfermedad de Chagas en los países en cuatro continentes considerados triatominos error gratis1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13; la dispersión de los tripanosomas americanos fue atribuida inicialmente a inmigrantes latinoamericanos en el hemisferio norte, pero la posibilidad de que algunos son casos autóctonos de enfermedad de Chagas ya no puede ser negada3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. la fuente endógena solamente reconocible de la transmisión de T. cruzi se ha atribuido a la transferencia de la madre chagásica del parásito a la descendencia en aproximadamente el 10% de embarazos de15; contribución de la pareja masculina a las infecciones en el útero a través del semen eyaculado ha permanecido desconocida.

Sobre hace un siglo, los investigadores16,17 observó intracelulares de T. cruzi amastigotes en las células tecales del ovario y en el germen de la línea de las células de los testículos de casos agudos de enfermedad de Chagas. Las jerarquías y grupos de T. cruzi tripomastigotos y amastigotes en las células tecales del ovario, en goniablasts y en el lumen de los túbulos seminíferos (figura 1) de casos fatales de la enfermedad de Chagas agudos desarrollan privilegio inmune en los órganos de reproducción en la ausencia de inflamatorio infiltra18,19. En las últimas décadas, algunos estudios experimentales han demostrado nidos de las formas de amastigote redondo de T. cruzi en el túbulo seminífero, epidídimo y conducto deferente , así como en el útero, los tubos y ovario células tecales de los ratones infectados agudo 1,20,21,22. Además, en el curso de estudios de la familia para documentar la transferencia de protozoario la DNA mitocondrial de pacientes de Chagas los padres a sus descendientes, T. cruzi DNA nuclear (nDNA) fue verificada en línea humana germen haploid las células23y etapas del ciclo de vida del parásito se observaron en los eyaculados de chagásicos ratones24. Estos resultados están de acuerdo con informes de la tolerancia inmune lograda por la progenie de T. cruzi -infectados hosts en ausencia de los anticuerpos específicos1,25,26. Además, informes epidemiológicos que sugieren la diseminación de la enfermedad de Chagas endémica a los otros continentes3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13 ahora son apoyados por estudios experimentales que muestran que la enfermedad de Chagas puede transmitirse sexualmente1 . La presente investigación presenta un protocolo de estudio epidemiológico de la familia y demuestra que la infección por T. cruzi se propaga por las relaciones sexuales.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Los humanos y los comités de investigación Animal de la Facultad de medicina de la Universidad de Brasilia aprobaron todos los procedimientos con sujetos humanos y animales de laboratorio, respectivamente, en protocolos de investigación 2500.167567 y 10411/2011. El Comité de ética de la pública Fundación Hospital Gaspar Vianna (Protocolo nº 054/2009 y CONEP 11163/2009) había aprobado los formularios de consentimiento para el estudio de campo, con la extensión para el Ministerio de salud Comisión Nacional de investigación humana (CONEP 2585/04). El protocolo se ajustó para evaluar T. cruzi DNA en células mononucleares de sangre diploides y haploides gametos de semen eyaculado. Los animales de laboratorio recibieron atención humana; los ratones, sometidos a punción de corazón antes de sacrificio, fueron bajo anestesia.

1. reclutamiento de los participantes humanos

  1. Asegúrese de que el equipo de investigación participa en un programa de salud de la enfermedad de Chagas de sistema para entregar atención médica a pacientes de Chagas.
  2. Reclutar a los participantes humanos de familias inscritas en el programa, que muestra al menos un caso con fiebre, malestar general, dolor de cabeza, taquicardia y edema, los principales síntomas clínicos de la de enfermedad de Chagas aguda14.
  3. Entregar atención de salud a las personas en las familias del estudio durante un período de cinco años.
  4. Obtener 15 mL de sangre venosa de los participantes del estudio en tres ocasiones un año aparte, dividir la muestra en tres alícuotas de 5 mL y almacenar en el refrigerador a 4 ° C.
  5. Recolectar 2 mL de las eyaculaciones de semen de familiares voluntarios adultos y proceder como se describe en el paso 3.3.

2. crecimiento de parásitos

  1. Con la alícuota del paso 1.4, mezclar la sangre con 5 unidades de anticoagulantes heparina de sodio; hacer una cultura de la cuesta por la inoculación de sangre de familiares participantes con diagnóstico de enfermedad de Chagas aguda.
    1. Inocular 5 mL de la sangre humana unclotted en una inclinación de 50 mL tapón tubo agar sangre más 5 mL de medio de infusión de hígado-triptosa (LIT) e Incube la muestra en una coctelera a 27 ° C durante 3 meses.
    2. Coloque 100 μl del sobrenadante medio sobre portaobjetos de vidrio, con resbalones y busque sangre epimastigotes de T. cruzi al microscopio, cada cuatro semanas.
    3. Cosecha de los aislamientos de epimastigote en el sobrenadante de LIT axénico a 27 ° C; lavar las células pH PBS 7.4, centrifugar a 1.000 x g durante 10 min; diluir los epimastigotes en el sedimento en 5 mL de medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM).
    4. Inocular los frascos de cultivo celular de L6 músculo confluentes con 1 x 106 ECI1-ECI21 T. cruzi epimastigote aislantes.
    5. Crecen las ECI1 a ECI21 de T. cruzi y la Berenice arquetipo tripomastigotos en cultivos de células musculares L6 en frascos de cultivo de 75 mL.
    6. Alimentar las células con 15 mL de DMEM a pH 7.4 suplementado con 5% de suero fetal bovino, penicilina 100 UI/mL, estreptomicina μg/mL 100, 250 nM L-glutamina y 5% CO2 en 37 ° C1.
    7. Utilizar el control positivo tripomastigotos Berenice de T. cruzi al fenotipo de los aislamientos ECI1-ECI21 de cultivo de tejidos, como se describe en el paso 5.2.
    8. Crecer el control negativo de Leishmania braziliensis27 en DMEM suplementado con suero bovino fetal 20% solamente y utilizar los promastigotes del parásito como un control negativo.
    9. Utiliza 1 x 106 T. cruzi ECI1-ECI21 tripomastigotos en el sobrenadante de cultivo celular para infectar ratones.
    10. Búsqueda de T. cruzi tripomastigotos en la sangre de la cola después de la primera semana de la infección.
    11. Buscar los nidos de amastigotes en hematoxilina-eosina manchada las secciones de corazón, músculo esquelético y los órganos reproductivos de ratones infectados, un mes después de eso.

3. Análisis PCR y extracción de ADN

  1. Coloque 5 mL de la sangre (paso 1.4) alícuota en un tubo estéril con EDTA y realizar la centrifugación gradiente de densidad por 45 min a 3.000 x g. Utilice una pipeta para cosechar las células mononucleares de la fase blanquecina por encima de los eritrocitos, las células blancas de la colada dos veces en 5 mL de PBS, pH 7,4, por centrifugación 10 min a 1.500 x g en un tubo de 15 mL diferentes y utilizar las células para la extracción de ADN.
  2. Extraer el ADN de ECI-1 ECI-21 T. cruzi, de Berenice T. cruzi, de L. braziliensis (paso 2.1.8), control negativo control positivo y de las células mononucleares de la sangre prueba de familia humana 109 estudiar temas1 , 27 , 28.
  3. Diluir 2 mL de las muestras de esperma obtenidas en el paso 1.5 en DMEM (1:4, v/v); Incubar durante 45 min a 5% CO2 y 37 ° C, recuperar espermatozoides desde el sobrenadante tras la centrifugación durante 5 min a 13.000 x gy extraer el ADN haploide23.
  4. Colocar 1 mL de las células en tampón de extracción (10 μm NaCl, 20 μm EDTA, 1% SDS, 0.04% proteinasa-K y Ditiotreitol 1%) y las soluciones de inversión y agitando la mezcla.
    1. Centrifugue las soluciones 10 min a 13.000 x g y 25 ° C y transferir el sobrenadante viscoso a una columna de vuelta.
    2. Centrifugar 1 min a 10.000 x g en la columna de la vuelta y desechar el efluente; Añadir 500 μl de tampón de unión a la columna de spin (Tabla de materiales), centrifugue durante 1 min a 12.000 x gy descartar el eluato.
    3. Añadir 600 μl de tampón de lavado a la columna de spin, centrifugue durante 1 min a 12.000 x gy descartar el eluato.
    4. Repita este paso dos veces y transferir la columna spin a un tubo de micro centrífuga de 1,5 mL estéril.
    5. Añadir 100 μl de buffer TE, incubar el tubo a temperatura ambiente durante 2 minutos y luego centrifugar el tubo durante 1 min a 12.000 x g. El búfer en el tubo de microcentrífuga contiene el ADN.
    6. Medir las concentraciones de ADN mediante la ejecución de partes alícuotas en un gel de agarosa 0,8% y leer la absorbancia a 260 nm con un espectrofotómetro. Almacenar las muestras de ADN a-20 ° C hasta su utilización en el análisis PCR.
  5. Cartillas de T. cruzi Tcz1/2 de uso recocidos a la secuencia específica 188-nt telomere específico sonda29 y ejecutar la PCR con ADN de sangre y esperma de los sujetos de estudio de la familia, desde el control positivo de Berenice T. cruzi y de la Control negativo de L. braziliensis .
    1. Preparar la mezcla PCR con 10 plantilla ng ADN, 0,4 μm de cada par de primers, 2 U de Taq ADN polimerasa, 0,2 μm dNTPs y 15 μm MgCl2 en un volumen final de 25 μl.
    2. Iniciar el programa de amplificación de ADN a 94 ° C por 30 s para desnaturalizar la plantilla y enfriar las muestras a 55 ° C para 30 s. Luego, incubar las muestras a 94 ° C por 90 s para extender los cebadores recocidos. Regresar la temperatura a 94 ° C por 30 s para iniciar el próximo ciclo e incubar las muestras un adicional 3 min a 72 ° C. Al final del ciclo 32nd , enfriar las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente y guarde en el refrigerador a 4 ° C29.
    3. Amplificar una secuencia de repetición de telómeros de ADN de T. cruzi recocida a los cebadores Tcz1/2 en ambos extremos.
    4. Analizar los productos de amplificación en gel de agarosa al 1,3% y observe las bandas de ADN de 188-nt en un iluminador de rayos UV.

4. hibridación de Southern

Nota: El hibridación meridional fue utilizado para descartar la mayoría de los amplicones PCR positivo falso en el gel de agarosa.

  1. Someter los productos de amplificación de PCR de controles no infectados, de caso controles positivos de Chagas, de 109 muestras de prueba de ADN diploide y haploide ADN de 21 participantes familiar al sur de hibridaciones.
  2. Emplear la T. cruzi 188-nt específicos ADN telómeros secuencia punta de prueba recocido a los iniciadores de Tcz1/2 que se muestra; la sonda con [α -32P] 2'-desoxiadenosina trifosfato (dATP) usando un random primer kit de etiquetado de la etiqueta y analizar los productos de amplificación en gel de agarosa 1.3% en 60 V durante la noche a 4 ° C.
  3. Transferir el gel a una membrana de nylon cargada positivamente el método capilar durante la noche.
  4. Hibridar las bandas de ADN transferidas a la membrana de nylon con la sonda radiactiva de 188-nt, que vincula los resúmenes EcoR1 de la DNA genomic en 25 μl de la solución de enzima específica durante periodos variables.
  5. Lavar la membrana dos veces durante 15 min a 65 ° C con 2 x SSC y 0.1% SDS.
  6. Exponer las películas de rayos x a la membrana de nylon y autoradiograph las bandas en la membrana por una semana.
  7. Crecen los clones seleccionados de PCR y Southern hibridación con los productos de amplificación de PCR de T. cruzi , que se hibridó con la sonda radiactiva específica de ADN.
  8. Comercialmente la secuencia de los clones usando los cebadores Tcz1/2 set de recocido para el T. cruzi -telomere específico huella2,23.

5. inmunológicos ensayos

Nota: La sensibilidad y especificidad de la inmunofluorescencia indirecta (IIF) y el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) se evaluaron en el suero de seis pacientes de Chagas con parasitemia demostrable y de seis Chagas-gratis, deidentified suero muestras del Banco. Los ensayos se realizaron con las diluciones dobles del suero en PBS, pH 7,4, reveladas que el IIF en diluciones de 1: 100 y las densidades ópticas ELISA (ODs) a 0.150 y superior separaron lo positivo de los resultados negativos.

  1. Utilizar 5 mL de la alícuota de la sangre unclotted (paso 1.4) mantenido a temperatura ambiente durante 1 h y centrifugar a 1.500 x g durante 30 min para separar el suero en el sobrenadante.
  2. Realizar IIF y ELISA en diluciones del suero de 1: 100 por triplicado para detectar los antígenos de T. cruzi y L. braziliensis como se describió anteriormente28.
  3. IIF
    1. Realizar el ensayo IIF en diluciones de suero triplicados de muestras de los sujetos de 109 estudio en tres ocasiones separadas un año.
    2. Colocar 5 suspensiones de μl de la formalina al 1% - Tratado de epimastigotes de T. cruzi o promastigotes de L. braziliensis en portaobjetos; que los parásitos seque durante la noche en una capilla a temperatura ambiente y guardar las diapositivas de cristal a-20 ° C hasta su uso.
    3. Lugar 20 μl de las diluciones de suero de los pacientes sobre portaobjetos de vidrio había revestido con 5 μl de epimastigotes de T. cruzi mató a formalina (10 parásitos/μL) o L. braziliensis promastigotes.
    4. Incubar el portaobjetos de vidrio cubierto con un resbalón por 1 h en cámara húmeda a 37 ° C y lavar tres veces con PBS.
    5. Incubar el portaobjetos de vidrio secado al aire con una dilución de 1:1,000 de un anticuerpo de conejo marcado con fluoresceína (Tabla de materiales) IgG anti-humano por 1 h a 37 ° C; lavar y secar el portaobjetos.
    6. Montar el portaobjetos con un cubreobjetos y examinar bajo un microscopio de luz UV.
      Nota: Un examen positivo es un verde manzana T. cruzi epimastigote silueta, se muestra en el video.
  4. ELISA
    1. Ejecute un ELISA para la detección de T. cruzi y los antígenos solubles de L. braziliensis (1 μg/100 μl de tampón de carbonato de 0.1 M, pH 9.6) en pozos de la microplaca recubiertos.
    2. Incubar las diluciones del suero 1: 100 en pocillos recubiertos por triplicado por 2 h a temperatura ambiente.
    3. Lavar las placas tres veces con SAFT (PBS con 0,5% Tween-20), pH 7,4, solución antes del secado.
    4. Incubar las placas con 50 μl de una dilución de 1:1,000 de conejo anti-IgG anticuerpo durante 90 minutos a 37 ° C.
    5. Lavar las placas tres veces con solución de Saft y déjelos secar a temperatura ambiente.
    6. Incubar las placas con 100 μl de las diluciones 1:1,000 de cabra conjugado con fosfatasa alcalina anti-IgG de conejo (Mesa de los materiales) durante 90 minutos a 37 ° C.
    7. Lavar las placas tres veces con SAFT, añadir el fosfato del substrato p-nitro fenil y esperar para desarrollo de color.
    8. Leer el ODs a 630 nm en un lector de placas multimodo.
    9. El triplicado diluciones del suero prueba desde la población de estudio y parcela ODs para identificar la específica títulos de anticuerpos de T. cruzi .

6. evaluación de tolerancia inmunológica

Nota: Un sistema modelo de pollo fue utilizado para probar las infecciones de T. cruzi después de la primera semana del desarrollo embrionario.

  1. Inoculan huevos fértiles de gallina con tripomastigotos de T. cruzi de 100/10 μl de medio de cultivo de tejidos; inocular huevos control simulado con 10 tripomastigotos de T. cruzi por μl de medio de cultivo. Selle el orificio con cinta.
  2. Incubar 20 huevos de T. cruzi -infectados y un número igual de huevos fértiles de control simulado a 37 ° C y 65% de humedad durante 21 días.
  3. Mantener los pollitos hatch en la incubadora durante 24 h y, posteriormente, a 32 º C en capillas con control de temperatura durante tres semanas.
  4. Crecen los polluelos que nacieron de huevos de T. cruzi -inoculado y de huevos de control simulado a la etapa adulta en una habitación de presión de aire positiva a 24 ° C, en jaulas individuales colocados en pasillos separados.
  5. Desafiar a todos los pollos adultos tres veces en seis meses de edad con 107 muertos por formol tripomastigotos inyectados por vía subcutánea, cada semana, según el esquema en el video.
  6. Extraer la sangre de una vena del ala de pollitos que nacieron de los huevos de T. cruzi -inoculado y de los falso controles cuatro semanas después de la última inmunización para obtener el suero.
  7. Usar el suero de pollo para detectar los específicos anticuerpos de T. cruzi por IIF y ELISA como se describe en el paso 5 del protocolo.

7. infección de ratones con T. cruzi de eyaculaciones de semen de pacientes de Chagas

  1. Utilice las eyaculaciones de semen de un paciente adulto de la enfermedad de Chagas PCR + (criterio 1.5) y de un individuo adulto PCR - Chagas-libre.
  2. Uso dos grupos de 12 ratones de ingenuo BALB/c de un mes de edad mantuvieron en capillas bajo la presión de aire positiva a 24 ° C y alimentan con alimento ad libitum.
  3. Inculcar las porciones de semen humanas de Chagas positivo (100 μL) en el peritoneo y cantidades iguales dentro de la vagina de los ratones del grupo A.
  4. Inculcar las porciones de semen control libre de Chagas (100 μL) en el peritoneo y una cantidad igual en la vagina de los ratones del grupo B.
  5. Sacrificar a los ratones experimentales bajo anestesia cinco semanas después de las instilaciones de semen y someter las secciones de tejido para tinción con hematoxilina-eosina.
  6. Uso de microscopía para buscar tripomastigotos de T. cruzi y los amastigotes en el corazón, músculo esquelético y los órganos reproductivos en grupos de ratones.

8. transmisión de la infección por T. cruzi por las relaciones sexuales

  1. Utilizar ratones BALB/c seis semanas de edad 10 masculinos y femeninos en los experimentos.
  2. Inocular cinco masculinos y cinco femeninos ratones por vía intraperitoneal con 1 x 105tripomastigotos deT. cruzi de la cultura del tejido. 
  3. Los ratones se reproducen hasta tres meses de edad: Grupo estará formado por cinco T. cruzi-control de ratones hembra infectados y cinco los compañeros masculinos; Grupo II se formará por cinco T. cruzi -infectados masculino y cinco de control los compañeros femeninos. Grupo III estará formado por cinco hombre y cinco mujeres control ingenuo no infectado compañeros.
  4. Casa cada par en una jaula dentro de una caja fuerte con una puerta de rejilla y bloqueo de 5 mm para evitar fuga de cría.
  5. Alimentar los ratones chow y agua ad libitum. Recaudar un total de 70 destete progenie en los grupos II y por lo menos seis semanas.
  6. Extraer la sangre por punción del corazón de los padres (FO) y ratones de progenie (F1) bajo anestesia, sacrificar a los ratones y presentar las secciones de corazón, músculo esquelético y los órganos reproductivos para análisis patológico.

9. evaluación de privilegio inmune

  1. Obtener tejidos de T. cruzi-infectados e ingenuo ratones (paso 8.6) y cortar las muestras incluidas en parafina de 4 μm de secciones gruesas.
  2. Retirar la parafina y deshidratar las secciones sobre portaobjetos de vidrio con varios cambios de xileno y graduales lavados con etanol 100% a 70%, durante 1 minuto.
  3. Incubar las secciones de tejido con saponina de 0.05%, seguido de tres lavados de agua destilada a temperatura ambiente.
  4. Bloquear las secciones de tejido con 5% leche en polvo descremada 45 min lavado las diapositivas en 0,1 M SAFT e incubar las secciones con el Chagas ratón anti-T. cruzi suero o con el suero de ratón de control no infectado en un 1:20 dilución por 2 h.
  5. Lave los portaobjetos tres veces durante 5 min en SAFT y seco a temperatura ambiente antes de la incubación con una dilución de 1:1,000 del anti-ratón IgG conejo conjugado con fosfatasa alcalina.
  6. Enjuague los portaobjetos en SAFT y añadir 100 μl de 3,3' diaminobenzidina para una incubación de 5 minutos, seguida de tres lavados con Saft y contratinción con hematoxilina de Harris 30 s.
  7. Lavar los portaobjetos en agua destilada durante 5 minutos, deshidratar en 70%, 80%, 90% y etanol al 100% durante 1 min y montarlos en glicerina tamponada.
  8. Examinar los portaobjetos con un microscopio óptico de campo brillante y captura imágenes con una microcámara con software y un programa de analizador.
  9. Documento el privilegio inmune del parásito en la ausencia de reacciones inflamatorias de los órganos reproductivos.

10. estadísticos análisis

  1. Utilice edición biomédica para el análisis de la secuencia, realizar alineaciones con explosión y determinar la significación estadística (p < 0.05) de valor electrónico.
  2. Realizar un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y la prueba de Tukey para comparar las medias de OD más o menos desviaciones estándar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Esta investigación, llevada a cabo según el protocolo, dirigido a detectar casos agudos de enfermedad de Chagas por exámenes clínicos y parasitológicos. Muestras de sangre venosa fueron sometidas a examen microscópico directo y cultivo in vitro para el crecimiento del parásito. Veintiún casos agudos de enfermedad de Chagas mostraron T. cruzi en sangre. El protocolo de investigación aseguró el aislamiento de T. cruzi ECI1-ECI21 de la enfermedad de Chagas aguda, y la DNA muestras exhiben huellas de DNA positivo en el resto de la población de estudio: análisis PCR nDNA rindieron la secuencia repetición telomérica típico con las bandas de 188-nt presentes así como el T. cruzi Berenice arquetipo1. Los casos de Chagas y sus familiares que se ofrecieron para participar en el estudio se agruparon en cuatro familias1.

En este estudio de la familia, el nDNA de T. cruzi fue PCR amplificado con el primer establece1,23 recocido a la secuencia telomérica específicos de cada uno de los 21 casos de enfermedad de Chagas agudos. Estos amplicones nDNA de T. cruzi cruzado por hibridación con la sonda de secuencia radiactiva específica (figura 2); el clonaje y secuenciación revelaron que los amplicones compuesto por el motivo de repetición T. cruzi telomere 188-nt. La especificidad de estos procedimientos de hibridación fue mostrada en el control negativo con promastigotes de L. braziliensis . El análisis de patología validado que la hemoflagellates en los pacientes de enfermedad de Chagas agudos eran realmente virulentas T. cruzi. Concluimos que la banda de T. cruzi nDNA (188-bp) se encuentra en el 21 aguda Chagas casos (figura 2) es una manifestación directa de infecciones persistentes.

Transmisión sexual del Trypanosoma cruzi en humanos

Para evaluar la proporción de las infecciones de T. cruzi , se aplicó la prueba de ácido nucleico para la detección de alta sensibilidad de las huellas del parásito en la población de estudio de la familia1. En estos ensayos PCR, los productos de amplificación que hibridación con la sonda radiactiva específica de 188-nt forman bandas nDNA en 76,1% (83/109) de las muestras de prueba; los resultados de hibridación meridional de los productos de amplificación PCR nDNA con la sonda radiactiva de 188-nt específico se muestran en la figura 3. Además, las hibridaciones demostraron el parásito del ADN en la línea de la célula de germen de voluntarios miembros de la familia (figura 4).

IIF fue empleada al fenotipo el ECI1 a tripomastigotos ECI21 T. cruzi con el suero humano IgG de una muestra de banco del suero de enfermedad de Chagas con demostración parasitológica de los protozoos en la sangre, y un fluoresceína conjugado anti humano que IgG fue utilizado . T. cruzi Berenice fue un control positivo para el anticuerpo de Chagas, y el control negativo fue el promastigote de su familia pariente L. braziliensis. La figura 5 muestra que la silueta verde positivo del arquetipo de Berenice se correlaciona con el tipo salvaje envolvente de T. cruzi se muestra en el video.

El ELISA y el IIF revelaron el específicos de T. cruzi anticuerpos1,28 en 28.4% (31/109) de las muestras de prueba. Los resultados de ELISA y IIF, así como los del nDNA-PCR amplicones e hibridaciones Southern , se representan gráficamente en la figura 6. Las discrepancias entre los resultados de las huellas del nDNA-PCR y los de los anticuerpos específicos ensayos están representados en el heredograms (figura 7), A familia, cuatro sujetos tenían positivo nDNA y el anticuerpo anti -T. cruzi y 11 tenían sólo la nDNA positivo; los cinco hombres tenían T. cruzi en el eyaculado de semen. En familia B con 44 personas, 11 tenían los específicos anticuerpos de T. cruzi y 23 tenían el anticuerpo específico y el nDNA de parásito; siete individuos tenían T. cruzi en el eyaculado de semen. Familia C con 29 miembros tenía el anticuerpo y el nDNA de T. cruzi en cinco personas y 17 tenían el parásito nDNA sola; cuatro machos tenían el nDNA-PCR positivo en la eyaculación de semen. En familia, entre 21 sujetos, 11 tenían los anticuerpos específicos anti -T. cruzi y la huella del nDNA y nueve tenían nDNA-PCR positivo solo. Figura 3, figura 6 y figura 7 representan las amplias discrepancias entre los resultados, constantemente, en las muestras biológicas de temas familiares en tres experimentos independientes separados un año.

La tabla 1 muestra las diferencias cuantitativas entre el IIF, el ELISA y los ensayos de nDNA-PCR en las muestras de las familias de estudio humano un a D. Las discrepancias entre las proporciones de los análisis de anticuerpos (28.4%) y los de análisis de ácidos nucleicos positiva (76,1%) están estadísticamente significativa (p < 0.005). En estas familias, las diferencias entre los grupos de T. cruzi -infectado personas (III y IV) representaron el 62.6% (52/83) de la población, mostrando solo una prueba positiva de ácido nucleico. Las amplias discrepancias entre los cocientes del nDNA positiva huellas y las de la específica de T. cruzi anticuerpos fueron explicados por los experimentos realizados en el sistema de modelo de pollo.

Tolerancia inmunológica

La evaluación de las respuestas inmunes que se llevó a cabo en grupos de pollos criados en la etapa adulta en jaulas individuales en los pasillos separados que contienen pollos control de ingenuo (A); control simulado pollos nacieron de huevos inoculados con medio de cultivo (B); y gallinas nacieron del T. cruzi inoculado tripomastigotos huevos (C)26. Pollos del adulto en los grupos B y C se desafiaron tres veces con la formalina-mató a antígeno de T. cruzi trypomastigote, semanal, como se muestra en el video. El ELISA y los ensayos IIF se ejecutaron con el suero recogido del grupo A, B y C pollos un mes después de. La figura 8 muestra la ausencia de anticuerpos específicos en el grupo A y C pollos que contrastaban fuertemente con la producción de anticuerpos específicos en el grupo B inmunizado con el antígeno de T. cruzi . Los resultados mostraron claramente inmune tramado de tolerancia en el grupo C de T. cruzi-inocular huevos.

Transmisión sexual del Tratar de panosoma cruzi en un modelo de ratón sistema

Por otra parte, la infectividad de T. cruzi de eyaculado de un paciente de Chagas, que dieron positivo en la PCR y carecía de los anticuerpos específicos, se demostró a través de instilaciones de 100 μl de semen en la cavidad peritoneal de ratones machos y por un misma cantidad de semen a la vagina. Cinco semanas más tarde, los nidos de amastigote del T. cruzi fueron detectados en el corazón y los músculos esqueléticos, y matas de diferenciar parásitos estaban presentes en el lumen de los conductos deferentes y tubo uterino. Curiosamente, las reacciones inflamatorias destructivas no rodean a las jerarquías y grupos de los amastigotes de T. cruzi (figura 9).

Además se llevó a cabo la evaluación de la transmisión sexual de infecciones por T. cruzi en dos grupos de ratones inoculados por vía intraperitoneal con 1 x 105 T. cruzi Berenice tripomastigotos formas1,30, 31. En el grupo experimental I, 10 T. cruzi -infectados varones con 10 ratones hembras control de ingenuo. En el grupo experimental II, 10 T. cruzi -hembras apareadas con machos de control ingenuo 10 infectados. La figura 10 muestra que el T. cruzi-infectado ratones machos (A E) y el T. cruzi -infectado de ratones femeninos (F-g) rindió 188-bp nDNA bandas (números impares). Después de criar, los compañeros de ingenuo (números pares) fácilmente adquirieron T. cruzi tras un único encuentro sexual con un compañero de chagásicos. Experimentos de repetición similares realizados en condiciones idénticas confirmaron que cada ratón ingenuo hombre o mujer que sexualmente acoplado con un T. cruzi-hembra o macho infectado adquirió la infección flagelada. Estos fundadores de nDNA-positivos (F0) generan progenie que levantó hasta la edad de seis semanas. Entonces, la prueba y el control no infectados ratones fueron sangrado por punción de corazón para recoger aproximadamente 0,5 mL de sangre. El análisis del nDNA-PCR demostraron que las infecciones de los fundadores (F0) sexualmente adquiridas fueron transmitidas a la progenie de la F1, como se muestra por las bandas del nDNA 188-bp (figura 11). La progenie de la F1 era nDNA-positivos en 41 de las 70 muestras (58.6%) examinadas. De estos ratones con bandas nDNA sugestivos de infecciones verticalmente adquiridas, como pocos como 9 de 41 (22%) tenían anticuerpos contra T. cruzi .

Los ratones de progenie F1 fueron sacrificados bajo anestesia, y los tejidos del cuerpo fueron sometidos a análisis patológicos e inmunes tinción de peroxidasa. Los resultados de estos experimentos se muestran en la figura 12. Los resultados de los amastigotes de T. cruzi fueron documentados en las células intersticiales del epidídimo y en goniablasts; amastigotes diferenciarse en tripomastigotos estaban presentes en el lumen de los túbulos seminíferos en la ausencia de reacciones inflamatorias.

Figure 1
Figura 1 . Trypanosoma cruzi infección en el túbulo seminífero de un muchacho que murió de la enfermedad de Chagas aguda . Microphotograph de archivo médico Teixeira, 197018. Las formas de T. cruzi están en goniablasts, y masas de amastigotes y libre tripomastigotos (flechas) están presentes en el lumen del túbulo seminífero en ausencia de infiltrados inflamatorios1. Las manchas de la hematoxylin-eosina. De la barra, 20 μm. reimpreso con permiso de la editorial y los autores1,19.

Figure 2
Figura 2 . La huella de Trypanosoma cruzi de enfermedad de Chagas aguda. Los productos de amplificación del nDNA-PCR de T. cruzi forman bandas 188-nt con una sonda radiactiva específica de 188-nt. TC, T. cruzi; NC, control negativo. Reimpreso con permiso de la editorial y el autor1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . Southern blotting análisis de Trypanosoma cruzi infecciones en sujetos de estudio humano familias. A familia - 15 todos los temas demostraron el nDNA-polimerización en cadena específica bandas 188-nt. En B de familia, un total de 35 de los 43 sujetos (81,4%) formaron las bandas específicas nDNA. En familia, entre los 29 miembros, 22 (75,8%) formaron las bandas nDNA. En la familia D, 11 de 21 sujetos (52,4%) tenían las bandas nDNA. El T. cruzi-nDNA específico bandas fueron confirmados por clonación y secuenciación. Reimpreso con permiso de la editorial y el autor1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . El activo Trypanosoma cruzi infecciones en el semen eyaculan de estudio voluntarios familiares. Las infecciones en el eyaculado de pacientes de Chagas identificado por las bandas de 188-bp nDNA-PCR. TC, control positivo de T. cruzi . NC, control negativo de L. braziliensis . Reimpreso con permiso de la editorial y el autor1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . El fenotipo de Trypanosoma cruzi con el anticuerpo del suero de pacientes de la enfermedad de Chagas. T. cruzi identificados con el anticuerpo de IgG de suero de Chagas que reconoce el trypomastigote parásito tratado con un marcado con FITC monoclonal Ab anti-IgG humanas. Anti-T. cruzi Ab no reconoce los promastigotes de Leishmania braziliensis . Los bajorrelieves muestran los controles negativos. Bares, 20 μm. reimpreso con permiso de la editorial y el autor1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 6
Figura 6 . Representación gráfica de los análisis de PCR nDNA en la familia y Elisa estudio de población. Grupo I (n = 10) y grupo II (n = 20) fueron el control negativo y los sueros de control positivo, respectivamente, de las infecciones de T. cruzi con demostración parasitológica. Grupo III (n = 31) incluye muestras de familia con las bandas de 188-bp nDNA y anticuerpos específicos para T. cruzi. Grupo IV (n = 52) compuesto por una muestra de sujetos con infecciones por T. cruzi detectados por el PCR nDNA 188-nt amplicones en ausencia de anticuerpos específicos. Grupo V (n = 26) fueron negativos prueba las muestras de la infección de personas en el estudio de la familia. Reimpreso con permiso de la editorial y el autor1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 . El heredograms y el mapeo de la Trypanosoma cruzi- infectados población familia. La figura muestra las discrepancias entre las proporciones de la anti -T. cruzi anticuerpos y los de los ensayos de PCR nDNA. Plaza abierta y círculo, negativo macho y hembra. Cuadrados rojos y círculos, positivo anti -T. cruzi anticuerpos y PCR nDNA. Negro cuadrados y círculos, nDNA-PCR positivo solamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 8
Figura 8 . La tolerancia inmune en los pollos que nacieron de Trypanosoma cruzi- inocular huevos. A) Perfil de anticuerpos suero preinmunizado en los pollos de control simulado (n = 10). Pollos de B) la respuesta de anticuerpos específicos en el control de ingenuo con el antígeno de T. cruzi (n = 20). C) la ausencia de una respuesta inmune específica en pollos nacieron de T. cruzi-inocular huevos después del desafío con el antígeno de T. cruzi (n = 20). La diferencia de densidad óptica entre A y C (024 ± 0,17) hacia B (0,85 ± 0.6) es estadísticamente significativa (p < 0,05). Esta cifra ha sido modificada de la referencia26 y es reimpreso con permiso de la editorial y el autor.

Figure 9
Figura 9 . La infecciosa Trypanosoma cruzi en eyaculados humanos se traduce en una infección murine activa. Alícuotas de eyaculados de pacientes de Chagas fueron inculcados en la cavidad peritoneal o en la vagina de los ratones. Los ratones fueron sacrificados tres semanas después de la instilación. Calle superior, nidos de amastigotes de T. cruzi en el corazón (izquierda) y en el músculo esquelético (derecha). Carril inferior, nidos de amastigote del T. cruzi en los conductos deferentes (izquierda) y en el tubo uterino (derecha). El inserto muestra una divisoria amastigote (círculo). Observe la ausencia de infiltrados inflamatorios en las secciones de tejido. Las manchas de la hematoxylin-eosina. Bares: superior e inferior izquierda, 20 μm; abajo a la derecha, 10 μm. reimpreso con permiso de la editorial y el autor1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10 . La transmisión sexual del Trypanosoma cruzi sistema de modelo de infecciones en el ratón por las relaciones sexuales. La transmisión de las infecciones de T. cruzi de chagásicos a ingenuos compañeros demostrados por las bandas de 188-bp nDNA específicas reveladas en las hibridaciones sur . Perfiles de Prebreeding carril superior) de los productos de amplificación de PCR de T. cruzi -infectadas ratones y los ratones de ingenuo. Los números impares indican t.cruzi-infectados varón de A E y F a I mujer ratón muestras. Los números son mujer ingenua (2-10) y ratones macho (12 a 20). Carril inferior, después de la cría, la serie de perfiles que incluso ratones 2 a 20 adquiridos infecciones de T. cruzi . Reimpreso con permiso de la editorial y el autor de1,30. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 11
Figura 11 . La Trypanosoma cruzi infección verticalmente se transfiere de los chagásicos F0 parental a los ratones de progenie F1. El padre de chagásicos transmite las infecciones de T. cruzi por el encuentro de una sola cría. El T. cruzi-hembras infectadas fueron acopladas a hombres ingenuos A E, y las hembras de ingenuo se acoplado a los machos de T. cruzi -infectados F-J. Después de criar, todos los fundadores (F0) mostraron la banda de 188-bp positivo protozoos nDNA-PCR. Borrar meridional reveló la banda nDNA específicos después de la hibridación con la sonda radiactiva de 188-nt en la mayoría de las camadas F1. NC, control negativo de L. braziliensis ; TC, control positivo de T. cruzi . Reimpreso con permiso de la editorial y el autor de1,31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 12
Figura 12 . La histopatología documentada Trypanosoma cruzi enfermedades de transmisión sexual de F0 F1 tolerancia progenie e inmune en la ausencia de una reacción inflamatoria. Las secciones muestran el crecimiento de las formas de T. cruzi en el epidídimo, goniablasts y los túbulos seminíferos de los ratones de la F1. Los ratones fueron sacrificados bajo anestesia, y las secciones manchadas de peroxidasa inmunes se examinaron bajo un microscopio. Las microfotografías muestran pardusco inmune tinción de peroxidasa de T. cruzi amastigotes en intersticial del epidídimo (A) y masas de amastigotes diferenciarse en tripomastigotos arrojar en el lumen de los seminíferos túbulo (B, C y F). El nido de amastigote en un goniablast (D). Histología normal del túbulo seminífero de ratón de control positivo (E). Observe la ausencia de infiltrados inflamatorios en los testículos de los ratones de la F1 que muestra las cargas de los parásitos del Chagas. Tinción de Giemsa. Bares: A, B, C y E, 20 μm; D y F, 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Las discrepancias entre las proporciones de exámenes IIF y ELISA positivo y los de análisis nDNA-PCR en las muestras recolectaron de las familias del estudio A-a-D *

Grupos ** ELISA: suero anti-T. cruzi Ab (%) NDNA-PCR de T. cruzi (%)
Control Ab - PCR - (n = 10) 10/10 100 10/10 100
II - Control Ab + PCR + 20/20 100 20/20 100
(n = 20)
III - Chagas Ab + PCR + ᵟ 31/109 28.4 31/109 28.4
(n = 31)
IV - Chagas Ab - PCR + ᵟ - - 83/109 76.1
(n = 52)
V - Chagas-libre Ab - PCR- 26/109 23.9 26/109 23.9
(n = 26)
* Resultados de tres ensayos de nDNA-PCR y ELISA independiente funcionamiento en muestras recolectadas en tres ocasiones diferentes en años 1, 2 y 3. [1]. la amplificación de 188-nt T. cruzi DNA repetir confirmada por clonación y secuenciación.
** Las diferencias entre negativos (grupos I y V) y los temas positivos (grupos III y IV) son estadísticamente significativas (p < 0.05).
ᵟ las diferencias entre los grupos III y IV, explicado por la tolerancia inmune en la ausencia de anticuerpos de T. cruzi lograron en 62.6% (52/83) de los temas positivos de PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aquí, discutimos un protocolo de investigación basado en la familia que la pregunta de si la enfermedad de Chagas humana proviene de enfermedades de transmisión sexual interespecífica T. cruzi infecciones. Los primeros estudios no pudieron proporcionar evidencia de la transmisión sexual de infecciones por T. cruzi , probablemente porque los datos disponibles y la información sobre enfermedad de Chagas se obtuvieron por separado de los individuales3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13. El hallazgo de T. cruzi en el túbulo seminífero de un niño (figura 1) fue la chispa que impulsó la investigación clínica y epidemiológica. Después de varias décadas, concebible cuando estudio de familia dispusiera de enfoques y tecnologías descritas en este protocolo de investigación, etapas del ciclo de vida de T. cruzi aparecieron en el eyaculado humano1,19.

La demostración parasitológica directa del protozoario en 21 casos de enfermedad de Chagas agudos fue crucial para validar los productos de amplificación nDNA-PCR, que formaron bandas específicas en muestras de todos los sujetos gravemente infectados con T. cruzi. Este marcador de punto de atención laboratorio evaluó los resultados de los ensayos inmunológicos y ácidos nucleicos. El largo plazo Chagas enfermedad familiar estudio fundamental, por lo tanto, combina los resultados en seres humanos con los obtenidos en grupos de animales de laboratorio. La investigación realizada según el protocolo revelado por primera vez que T. cruzi infecciones son de transmisión sexual en los seres humanos1.

La amplia diferencia entre los cocientes de los ensayos de anticuerpos específicos del parásito y los de las pruebas de ácido nucleico indica que la mayoría de las huellas del nDNA resultó de casos enfermedades de transmisión sexual en la ausencia de específicas anti T. cruzi anticuerpos. Así, la transmisión sexual de T. cruzi en los miembros de la familia que nDNA positiva en ausencia de los anticuerpos IgG específicos fue debido a la tolerancia inmunológica.

Tolerancia inmunológica fue demostrada en un sistema modelo de pollo refractario a las infecciones de T. cruzi después de la primera semana del embrión crecimiento1,25,26,32,33, 34. Después de eso, del sistema inmune inmaduro incapaz de reconocer el parásito como un componente extranjero del cuerpo indica tolerancia de sistema inmunológico maduro finales de pollo con cruzi T. En vista de estos resultados, la tolerancia es un fenómeno natural1 resultante de autoreconocimiento del sistema inmune y el mantenimiento de sus propios componentes de cuerpo bajo condiciones fisiológicas25,26, 32 , 33 , 34. por lo tanto el cambio del estado de tolerancia inmunológica autoinmune enfermedad cardíaca de Chagas puede ser asociado con modificaciones de células efectoras resultando de mutaciones de cinetoplasto (kDNA) de T. cruzi en genoma1 del host ,2,14,23,25,26.

Los pasos críticos en el protocolo de investigación describen la modificación principal técnica y solución de problemas con el fin de divulgar las enfermedades de transmisión sexual Chagas parásitos1,14,23,25, 26: i) seleccionar el estudio de familias con casos de de35,de la enfermedad de Chagas aguda36; ii) aislamiento de tipo salvaje T. cruzi de la sangre de los casos agudos; iii) obtención de muestras de ADN de flagelados de sangre de las familias participantes, desde el arquetipo de Berenice T. cruzi , de muestras de ADN del Banco de deidentified positivo y de negativo controlan de L. braziliensis; iv) realizar procedimientos técnicos ordenados para demostrar que la huella de los participantes flagelados nDNA es idéntica a la del arquetipo de Berenice T. cruzi y ésas positivo Banco muestras de ADN; huella de funcionamiento independiente nDNA triplicado v) para demostrar las infecciones de T. cruzi en los miembros de la familia en tres ocasiones un año aparte; vi) asegurar que la técnica de PCR nDNA llevó a cabo en el punto de atención produce resultados confirmados por clonación y secuenciación de los amplicones de recocido de la cartilla específica fija, así que constantemente muestra la secuencia de 188-nt de T. cruzi 1,25,28,29,30; vii) reactivos de marcas de alta calidad para reproducir los títulos de anticuerpos en muestras de suero recogidas en tres momentos diferentes; viii) el protocolo de estudio de la familia reveló la infección vivo existente en las células de la línea de germen a la demostración de la nDNA de T. cruzi en la ausencia de anticuerpos específicos del suero en semen eyaculado de infectadas por el parásito del Chagas personas1; ix) la perspectiva es que el protocolo de investigación diseñado para desentrañar las enfermedades de transmisión sexual infecciones por T. cruzi deben revelar la enfermedad de Chagas autóctona en los cinco continentes; x) el nDNA y las huellas de kDNA garantizar el diagnóstico de enfermedad de Chagas crónica asintomática en los seres humanos1,2; xi) en la ausencia de la nDNA, la mutaciónde T. cruzi kDNA secuencia1,2,23,25,26 solo es un marcador de laboratorio para lograr el diagnóstico diferencial de las miocardiopatías dilatadas idiopáticas23,25,37,38,39.

Además, el virulento T. cruzi en eyaculados de pacientes de Chagas fueron capaces de iniciar infecciones generalizadas en instilación dentro de la vagina de ratón y en la cavidad peritoneal. El estudio de patología mostró nidos de amastigote del T. cruzi en el corazón y los músculos esqueléticos, así como en el conducto deferente y el tubo uterino. Curiosamente, los nidos de parásitos no provocaron reacciones inflamatorias que obstaculizarían las funciones reproductivas vitales. La ausencia de reacciones inflamatorias representa el privilegio inmune en el cuerpo vital funcional estructuras40,41,42,43,44,45 y por lo tanto explica el crecimiento desenfrenado de T. cruzi en los órganos reproductivos.

Además, los estudios experimentales en ratones chagásicos que con ingenuos compañeros explican, además, la transmisión sexual de infecciones por T. cruzi en humanos. Los machos y hembras infectadas transmiten las infecciones de T. cruzi a los compañeros de ingenuo no infectada durante las relaciones sexuales, y la mayoría de sus camadas adquirió el T. cruzi verticalmente transferido de padres a la progenie. En estos experimentos, la fase inicial se refirió al crecimiento de T. cruzi en el tubo y en el útero, así como en los túbulos seminíferos y conducto deferente, donde ocurrió el privilegio inmune. Entonces, la transmisión sexual ocurrió a través de las fases parasitarias en el semen o las secreciones uterinas dentro de la vagina. Privilegio inmune40,41,42,43,44,45 es un fenómeno que permite que algunos órganos (sistema reproductivo, ojos y cerebro) a regular a la baja las reacciones inflamatorias y evitar daños a funciones importantes, sensible y específica40. Las hormonas41 y varios factores inmunes downregulate macrófagos41,42,43, células de asesino naturales41, linfocitos T y células T reguladoras (Treg), orquestando así el inhibición de una serie de citocinas proinflamatorias y disparadores de privilegio inmunitario40,41,42,43,44,45.

La transmisión sexual de infecciones por T. cruzi de machos y hembras a ingenuos socios indica que el control de la enfermedad de Chagas requiere solidaridad internacional. Los resultados discutidos en este documento sugieren que se necesita investigación más creativo. Están posible alcanzables los siguientes objetivos inmediatos: i) para el desarrollo de plataformas de alto rendimiento específico y altamente sensible ácido nucleico pruebas para llegar a un diagnóstico preciso, con el objetivo de la prevención de infecciones transmitidas por las relaciones sexuales, las transfusiones de sangre y trasplante de órganos así como facilitar las investigaciones clínicas y epidemiológicas para determinar el diagnóstico y la prevalencia de la enfermedad de Chagas; ii) para promover un programa de desarrollo de drogas multicéntricos para obtener nuevos fármacos para la erradicación de infecciones por T. cruzi ; y iii) implementar una educación conveniente, programa de información y comunicación que incluye la participación de las escuelas, iglesias, organizaciones sociales y las instituciones de salud para prevenir la propagación de la enfermedad de Chagas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

Reconocemos que las instalaciones de laboratorio y las observaciones críticas de Izabela Dourado, Carla Araujo y Gomes inteligente y la asistencia técnica de Bruno Dalago y Rafael Andrade. Estamos agradecidos a la Fundación para el avance de la ciencia (FAPDF), el Consejo Nacional de investigación, Ministerio de ciencia y tecnología (CNPq/MCT) y la Agencia para la formación de recursos humanos, Ministerio de Educación (CAPES / ME), Brasil, para apoyar a estos investigaciones.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCIP and NBT redox system Sigma-Aldrich 681 451 001
Blood DNA Purification columns Amersham Biosciences 27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.   Perkin Elmer   BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm AMRESCO 064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Eco RI Invitrogen 15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated Southern Biotech        2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated Biocompare MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane GE Healthcare RPN303B
Hybridization oven Thomas Scientific 95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software Olympus, Japan
Molecular probes labeling System Invitrogen 700-0030
Nsi I Sigma-Aldrich R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit GE Healthcare 28-9042-70
Plate reader  Bio-Tek GmBH 2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated Sigma-Aldrich A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated Sigma-Aldrich F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated Sigma Aldrich A2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated Biorad MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine Sigma-Aldrich G25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Thermal cycler system Biorad, USA 1709703
Vector Systems Promega A1380

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Araujo, P. F., et al. Sexual transmission of American trypanosomiasis in humans: a new potential pandemic route for Chagas parasites. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112, (6), 437-446 (2017).
  2. Teixeira, A. R. L., Nitz, N., Bernal, F. M., Hetch, M. M. Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model. Journal of Visualized Experiments. (65), 3716 (2012).
  3. Kalil-Filho, R. Globalization of Chagas Disease Burden and New Treatment Perspectives. Journal of the American College of Cardiology. 66, (10), 1190-1192 (2015).
  4. Nunes, M. C. P., Dones, W., Morillo, A., Encina, J. J., Ribeiro, A. L. Chagas Disease: An Overview of Clinical and Epidemiological Aspects. Journal of the American College of Cardiology. 62, (9), 767-776 (2013).
  5. Pinazo, M. J., Gascon, J. Chagas disease: from Latin America to the world. Reports in Parasitology. 2015, (4), 7-14 (2015).
  6. Kessler, D. A., Shi, P. A., Avecilla, S. T., Shaz, B. H. Results of lookback for Chagas disease since the inception of donor screening at New York Blood Center. Transfusion. 53, (5), 1083-1087 (2013).
  7. Klein, N., Hurwitz, I. R. Globalization of Chagas Disease: A Growing Concern in Nonendemic Countries. Epidemiology Research International. (2012).
  8. Pérez-Molina, J. A., Norman, F., López-Vélez, R. Chagas disease in non-endemic countries: epidemiology, clinical presentation and treatment. Current Infectious Diseases Report. 14, (3), 263-274 (2012).
  9. Hotez, P. J., et al. Chagas disease: "the new HIV/AIDS of the Americas". PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1498 (2012).
  10. Schmunis, G. A., Yadon, Z. E. Chagas disease: a Latin American health problem becoming a world health problem. Acta Tropica. 115, (1-2), 14-21 (2010).
  11. Franco-Paredes, C., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. The Unfinished Public Health Agenda of Chagas Disease in the Era of Globalization. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3, (7), e470 (2009).
  12. Teixeira, A. R. L., Vinaud, M., Castro, A. M. Emerging Chagas Disease. In: Chagas Disease: - A Global Health Problem. 3, Bentham Science Publishers. New York. Chapter 3 18-39 (2009).
  13. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infectious Diseases. 13, (4), 342-348 (2013).
  14. Teixeira, A. R. L., Hecht, M. M., Guimaro, M. C., Sousa, A. O., Nitz, N. Pathogenesis of Chagas Disease: Parasite Persistence and Autoimmunity. Clinical Microbiology Review. 24, (3), 592-630 (2011).
  15. Murcia, L., et al. Risk factors and primary prevention of congenital Chagas disease in a nonendemic country. Clinical Infectious Diseases. 56, (4), 496-502 (2013).
  16. Chagas, C. New human trypanosomiasis. Morphology and lifecycle of Schizotrypanum cruzi, the cause of a new human disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 1, 159 (1909).
  17. Vianna, G. Contribution to the study of the Pathology of Chagas disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 3, 276 (1911).
  18. Teixeira, A. R. L., Roters, F., Mott, K. E. Acute Chagas disease. Gazeta Médica da Bahia. 3, 176-186 (1970).
  19. Teixeira, A. R. L., et al. Prevention and Control of Chagas Disease – An Overview. International STD Research, Reviews. 7, (2), 1-15 (2018).
  20. Rios, A., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113, (1), 3-8 (2018).
  21. Lenzi, H. L., et al. Trypanosoma cruzi: compromise of reproductive system in acute murine infection. Acta Tropica. 71, (2), 117-129 (1998).
  22. Carvalho, L. O. P., et al. Trypanosoma cruzi and myoid cells from seminiferous tubules: Interaction and relation with fibrous components of extra cellular matrix in experimental Chagas’ disease. International Journal of Experimental Pathology. 90, (1), 52-57 (2009).
  23. Hecht, M. M., et al. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 12, e9181 (2010).
  24. Alarcon, M., et al. Presencia de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en el plasma seminal de ratones con infección aguda. Boletín Malariología y Salud Ambiental. 51, 237 (2011).
  25. Teixeira, A. R. L., et al. Trypanosoma cruzi in the Chicken Model: Chagas-Like Heart Disease in the Absence of Parasitism. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5, (3), e1000 (2011).
  26. Guimaro, M. C., et al. Inhibition of Autoimmune Chagas-Like Heart Disease by Bone Marrow Transplantation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, (12), e3384 (2014).
  27. Oliveira, C. I., et al. Leishmania braziliensis isolates differing at the genome level display distinctive features in BALB/c mice. Microbes and Infection. 6, (11), 977-984 (2004).
  28. Mendes, D. G., et al. Exposure to mixed asymptomatic infections with Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis and Leishmania chagasi in the human population of the greater Amazon. Tropical Medicine, International Health. 12, 629 (2007).
  29. Moser, D. R., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 27, (7), 1477-1482 (1989).
  30. Da Silva, A. R. Sexual transmission of Trypanosoma cruzi in mus musculus [MsD thesis]. University of Brasília. Brasília. Available from http://repositório.unb.br/handle/10482/14829 (2013).
  31. Ribeiro, M., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113, (1), 3-8 (2018).
  32. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172, (4379), 603-606 (1953).
  33. Burnet, F., Fenner, F. The production of Antibodies. MacMillan. Melbourne, Australia. (1949).
  34. Hasek, M. Parabiosis of birds during their embryonic development. Chekhoslovatskaia Biology. 2, (1), 29-31 (1953).
  35. Coura, J. R., Junqueira, A. C. V., Fernades, O., Valente, S. A., Miles, M. A. Emerging Chagas Disease in Amazonian Brazil. Trends Parasitology. Trends Parasitology. 18, (4), 171-176 (2002).
  36. Teixeira, A. R. L., et al. Emerging Chagas disease: Trophic network and cycle of transmission of Trypanosoma cruzi from palm trees in the Amazon. Emerging Infectious Diseases. 7, (1), 100112 (2001).
  37. Hazebroek, M., Dennert, R., Heymans, S. Idiopathic dilated cardiomyopathy: possible triggers and treatment strategies. Netherland Heart Journal. 20, (7-8), 332-335 (2012).
  38. Arimura, T., Hayashi, T., Kimura, A. Molecular etiology of idiopathic cardiomyopathy. Acta Myologica. 26, (3), 153-158 (2007).
  39. Dec, W. G., Fuster, V. Idiopathic Dilated Cardiomyopathy. New England Journal of Medicine. 33, 1564-1575 (1994).
  40. Niederkorn, J. Y. See no evil, hear no evil, do no evil: the lessons of immune privilege. Nature Immunology. 7, (4), 354-359 (2006).
  41. Smith, B. E., Braun, R. E. Germ cell migration across Sertoli cell tight junctions. Science. 338, (6118), 798-802 (2012).
  42. Garth, A., Wilbanks, J., Streilein, W. Fluids from immune privileged sites endow macrophages with the capacity to induce antigen-specific immune deviation via a mechanism involving transforming growth factor-β. European Journal of Immunology. 22, (4), 1031-1036 (1992).
  43. Meng, J., Anne, R., Greenlee, C., Taub, J., Braun, R. E. Sertoli Cell-Specific Deletion of the Androgen Receptor Compromises Testicular Immune Privilege in Mice. Biology of Reproduction. 85, (2), 254-260 (2011).
  44. Fujisaki, J., et al. In vivo imaging of Treg cells providing immune privilege to the haematopoietic stem-cell niche. Nature. 474, (7350), 216-219 (2011).
  45. Wood, K. J., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nature Review Immunology. 3, (3), 199-210 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics