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Transmission sexuelle du trypanosome américaine des mâles et des femelles à des camarades de Naive

Immunology and Infection

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Summary

L’agent de la maladie de Chagas de Trypanosoma cruzi produit durable des infections asymptomatiques qui brusquement se développent en pathologie cliniquement reconnue. Le protocole de recherche suivant décrit une étude épidémiologique axée sur la famille de court terme pour démêler l’infection de T. cruzi transmise sexuellement des parents aux descendants.

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Almeida, A. B., Araújo, P. F., Bernal, F. M., Rosa, A. d., Valente, S. A., Teixeira, A. R. Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates. J. Vis. Exp. (143), e57985, doi:10.3791/57985 (2019).

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Abstract

Trypanosomiase américaine est transmise aux humains par punaises triatomes par l’ingestion d’aliments contaminés, par transfusion sanguine ou accidentellement dans les hôpitaux et les laboratoires de recherche. En outre, l’infection par Trypanosoma cruzi est congénitalement transmise d’une mère chagasic à sa progéniture, mais la contribution du partenaire masculin à une contamination in utero est inconnue. Les résultats des nids et des touffes d’amastigotes et des trypomastigotes dans les cellules de la thèque de l’ovaire, dans le goniablasts et dans la lumière des tubules séminifères suggèrent que les infections de T. cruzi sont transmises sexuellement. Le protocole de recherche ci-après présente les résultats d’une étude familiale population montrant parasite ADN nucléaire dans les cellules mononucléaires de sang diploïde et chez les gamètes haploïdes de sujets humains. Ainsi, trois échantillons biologiques indépendants recueillis un an d’intervalle confirment que T. cruzi infections ont été sexuellement transmissibles à la descendance. Fait intéressant, le spécifique anticorps T. cruzi est absent dans la plupart des descendants famille qui portait une tolérance immunitaire à l’antigène de parasite. Tolérance immunitaire a été démontrée dans le poulet réfractaire T. cruzi après la première semaine de croissance embryonnaire et poussins éclos des oeufs inoculés flagellé étaient incapables de produire l’anticorps spécifique. En outre, l’instillation du sperme humain éjacule par voie intrapéritonéale ou dans le vagin de souris naïves a donné T. cruzi amastigotes dans l’épididyme, canal déférent et tube séminifère, tube utérin avec l’absence d’inflammatoire réactions dans les organes immunitaires privilégiés de reproduction. L’élevage de T. cruzi-des souris mâles et femelles infectées avec des camarades de naïf a abouti à l’acquisition des infections, qui ont été ensuite transmis à la descendance. Par conséquent, un solide programme d’éducation, information et communication qui implique la population et les organisations sociales est jugé nécessaire pour empêcher la maladie de Chagas.

Introduction

Le protozoaire parasite Trypanosoma cruzi , appartenant à la famille des Trypanosomatidae subit des trypomastigotes et amastigote étapes du cycle de vie chez les hôtes mammifères et existe sous la forme épimastigotes dans de l’insecte vecteur (Reduve : Triatominae) tube digestif et en culture axénique. Ces dernières décennies, plusieurs études ont montré la présence de la maladie de Chagas dans les pays sur quatre continents, a examiné les triatomes bug gratuit1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13; la dispersion des trypanosomes américains a été initialement attribuée à des immigrants latino-américains à l’hémisphère Nord, mais il est possible que certains soient des cas autochtones de la maladie de Chagas peut ne plus nier3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. la source endogène uniquement reconnaissable de transmission de T. cruzi a été attribuée au transfert de la mère chagasic du parasite à la descendance dans environ 10 % des grossesses15; contribution du partenaire masculin aux infections in utero par le biais de sperme éjaculats est restée méconnue.

Il y a plus d’un siècle les enquêteurs16,17 observé intracellulaire T. cruzi amastigotes dans les cellules de la thèque de l’ovaire et dans le germe de la ligne des cellules des testicules des cas aigus de la maladie de Chagas. Les nids et les touffes de T. cruzi trypomastigotes et amastigotes dans les cellules de la thèque de l’ovaire, dans goniablasts et dans la lumière des tubes séminifères (Figure 1) des cas de maladie de Chagas aiguës mortels développent privilège immunitaire dans les organes de reproduction en l’absence d’inflammatoire infiltre18,19. Ces dernières décennies, quelques études expérimentales ont démontré les nids des formes amastigotes rond de T. cruzi dans le tube séminifère, l’épididyme et des canaux déférents ainsi que dans l’utérus, les tubes et les ovaires cellules de la thèque de souris infectées aiguë 1,20,21,22. En outre, dans le cadre des études familiales de documenter le transfert de protozoaire l’ADN mitochondrial de parental Chagas patients à leurs descendants, T. cruzi ADN nucléaire (Adnn) a été vérifiée en ligne de humaine germinale haploïde cellules23, et étapes du cycle de vie parasite ont été observés dans les éjaculats de chagasic souris24. Ces résultats sont en accord avec les rapports sur la tolérance immunitaire atteint par les descendants des hôtes T. cruzi -infectées en l’absence de l’anticorps spécifique1,25,26. En outre, les rapports épidémiologiques qui a suggéré la propagation de la maladie de Chagas endémique aux autres continents3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13 sont actuellement supportés par des études expérimentales montrant que la maladie de Chagas peut être transmise sexuellement1 . La présente enquête présente un protocole de l’étude épidémiologique de famille et montre que l’infection par T. cruzi se propage par les rapports sexuels.

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Protocol

L’être humain et les comités de recherche animale de la faculté de médecine de l’Université de Brasilia a approuvé toutes les procédures avec des sujets humains et des animaux de laboratoire, respectivement, dans les protocoles de recherche 2500.167567 et 10411/2011. Le Comité d’éthique de l’hôpital Public fondation Gaspar Vianna (protocole nº 054/2009 et CONEP 11163/2009) a approuvé les formulaires de consentement libre pour l’étude de terrain, avec extension à la ministère de la santé National Commission on Human Research (CONEP 2585/04). Le protocole a été ajusté pour évaluer T. cruzi ADN dans les cellules mononucléaires de sang diploïde et dans les gamètes haploïdes de sperme éjaculats. Les animaux de laboratoire a reçu tous les soins ; les souris, soumis à la perforation cardiaque avant le sacrifice, étaient sous anesthésie.

1. le recrutement des participants humains

  1. Veiller à ce que l’équipe de recherche participe à un programme de maladie Chagas de système de santé à fournir des soins de santé aux patients de Chagas.
  2. Recruter des participants humains issus de familles inscrites au programme, montrant au moins un cas de fièvre, malaise, maux de tête, tachycardie et l’oedème, les principaux symptômes cliniques de maladie Chagas aiguë14.
  3. Fournir des soins de santé à la population dans l’étude des familles pour une période de cinq ans.
  4. Obtenir 15 mL de sang veineux par les participants de l’étude à trois reprises un an d’intervalle, diviser l’échantillon en trois parties aliquotes de 5 mL et entreposez-les au réfrigérateur à 4 ° C.
  5. Recueillir des 2 mL des sperme éjaculats de membres bénévoles adultes et procéder comme indiqué au point 3.3.

2. la croissance des parasites

  1. Sur la partie aliquote de l’étape 1.4, mélanger le sang avec 5 unités d’anticoagulants héparine de sodium ; faire une culture de la pente par l’inoculation de sang des participants familiales avec le diagnostic de la maladie de Chagas aiguë.
    1. Ensemencer des 5 mL du sang humain coagulé dans une pente de gélose au sang tube 50 mL bouchon à vis plus 5 mL de milieu de perfusion hépatique-tryptose (allumé) et incuber l’échantillon dans un shaker à 27 ° C pendant 3 mois.
    2. Déposer 100 µL de milieu surnageant au-dessus des lames de verre, couvrir avec glissades et recherche de sang épimastigotes de T. cruzi sous le microscope, toutes les quatre semaines.
    3. Récolter les isolats épimastigotes dans le surnageant du milieu axénique de LIT à 27 ° C ; laver les cellules dans le tampon au phosphate pH 7.4, centrifuger à 1 000 x g pendant 10 min ; diluer les épimastigotes dans le culot dans 5 mL de milieu essentiel modifié de Dulbecco (DMEM).
    4. Ensemencer les flacons de culture de cellule de muscle L6 confluentes avec 1 x 106 ECI1-à-ECI21 T. cruzi épimastigotes isole.
    5. Cultiver la ECI1-à-ECI21 de T. cruzi et les trypomastigotes archétype de Bérénice en cultures de cellules de muscle de L6 en flacons de culture de 75 mL.
    6. Nourrir les cellules avec 15 mL de DMEM à pH 7,4 additionné de sérum de veau fœtal 5 % 100 UI/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, 250 nM L-glutamine et 5 % de CO2 à 37 ° C1.
    7. Utilisez le contrôle positif de T. cruzi Bérénice trypomastigotes au phénotype les isolats ECI1-à-ECI21 de culture de tissus, comme indiqué au point 5.2.
    8. Cultiver le contrôle négatif Leishmania braziliensis27 en DMEM additionné de 20 % sérum de veau fœtal seulement et d’utiliser les promastigotes de parasite comme témoin négatif.
    9. Utiliser 1 x 106 T. cruzi ECI1-à-ECI21 trypomastigotes dans le surnageant de culture cellulaire à infecter des souris.
    10. Recherche de T. cruzi trypomastigotes dans le sang de la queue après la première semaine de l’infection.
    11. Cherchez les nids d’amastigotes à l’hématoxyline-éosine teinté de sections du coeur, le muscle squelettique et les organes reproducteurs des souris infectées, un mois par la suite.

3. extraction d’ADN et analyses PCR

  1. Placer 5 mL de sang (étape 1.4) aliquote dans un tube EDTA stérile et effectuer la centrifugation en gradient de densité pendant 45 min à 3 000 x g. Utiliser une pipette pour récolter les cellules mononucléaires de la phase blanchâtre au-dessus de globules rouges, laver les cellules blanches deux fois dans 5 mL de PBS, pH 7,4, par centrifugation pendant 10 min à 1 500 g dans un tube de différents 15 mL et utilisent les cellules pour l’extraction de l’ADN.
  2. Extraire l’ADN d’ECI-1 ECI-21 T. cruzi, depuis le contrôle positif de Bérénice T. cruzi, à partir du contrôle négatif L. braziliensis (étape 2.1.8) et depuis les cellules mononucléaires du sang test de 109 famille humaine étudier des sujets1 , 27 , 28.
  3. Diluer 2 mL des échantillons de sperme obtenu à l’étape 1.5 en DMEM (1:4, v/v) ; incuber pendant 45 min à 5 % de CO2 et 37 ° C, récupérer des spermatozoïdes du surnageant après centrifugation pendant 5 min à 13 000 x get extraire l' haploïde de l’ADN23.
  4. Placer 1 mL des cellules dans le tampon d’extraction (10 µM NaCl, 20 µM EDTA, 1 % SDS, 0,04 % protéinase-K et le dithiothréitol 1 %) et mélanger les solutions par inversion et secouant.
    1. Centrifuger les solutions pendant 10 min à 13 000 x g et 25 ° C et transférer le surnageant visqueux dans une colonne.
    2. Centrifuger la colonne à centrifuger pendant 1 min à 10 000 x g et éliminer l’éluat ; ajouter 500 µL de tampon de liaison à la colonne (Table des matières), il centrifuger pendant 1 min à 12 000 x get éliminer l’éluat.
    3. Ajouter 600 µL de tampon de lavage à la colonne de spin, il centrifuger pendant 1 min à 12 000 x get éliminer l’éluat.
    4. Répéter cette étape deux fois et le transfert de la colonne dans un tube à centrifuger micro stérile de 1,5 mL.
    5. Ajouter 100 µL de tampon de TE, incuber les tubes à température ambiante pendant 2 min et centrifuger le tube pendant 1 min à 12 000 x g. La mémoire tampon dans le tube de microcentrifuge contient l’ADN.
    6. Mesurer les concentrations d’ADN en exécutant des aliquotes sur un gel d’agarose 0,8 % et par la lecture de l’absorbance à 260 nm avec un spectrophotomètre. Conserver les échantillons d’ADN à-20 ° C jusqu'à l’utilisation dans l’analyse PCR.
  5. Amorces de T. cruzi Tcz1/2 utilisation recuites à la séquence spécifique 188-nt spécifique télomère probe29 et exécuter le PCR avec l’ADN, de sang et le sperme des sujets de l’étude familiale, depuis le contrôle positif de Bérénice T. cruzi et de la L. braziliensis contrôle négatif.
    1. Préparer le mélange PCR avec 10 modèle ng ADN, 0,4 µM de chaque paire d’amorces, 2 U de Taq DNA polymerase, 0,2 dNTPs µM et 15 µM MgCl2 dans un volume final de 25 µL.
    2. Lancer le programme d’amplification de l’ADN à 94 ° C pendant 30 s à dénaturer le modèle et laisser refroidir les échantillons à 55 ° C pendant 30 s. Puis, incuber les échantillons à 94 ° C pendant 90 s à étendre les amorces de recuit. La température de retour à 94 ° C pendant 30 s pour lancer le prochain cycle et incuber les échantillons une supplémentaire de 3 min à 72 ° C. À la fin du cycle 32nd , refroidir les échantillons pendant 10 min à température ambiante et entreposez-les au réfrigérateur à 4 ° C29.
    3. Amplifier une séquence répétée de T. cruzi ADN télomérique recuite pour les amorces de Tcz1/2 aux deux extrémités.
    4. Analyser les produits d’amplification sur un gel d’agarose de 1,3 % et observer les bandes d’ADN de 188-nt sur un UV-illuminateur.

4. l’hybridation Southern

Remarque : L’hybridation Southern servait à jeter de la plupart des amplicons PCR positifs fausses dans le gel d’agarose.

  1. Soumettre les produits d’amplification PCR des contrôles sains, de cas témoins positifs Chagas, 109 échantillons d’ADN diploïde et haploïde ADN des 21 participants familiale d’hybridations méridionales .
  2. Employer la T. cruzi 188-nt spécifique de l’ADN télomérique séquence sonde recuite pour les amorces de Tcz1/2 illustrés ; Étiquetez la sonde avec [α -32P] 2'-adénosine triphosphate (dATP) utilisant une amorce aléatoire kit d’étiquetage et d’analyser les produits d’amplification sur un gel d’agarose de 1,3 % à 60 V pendant une nuit à 4 ° C.
  3. Transférer le gel sur une membrane de nylon chargé positivement à l’aide de la méthode capillaire du jour au lendemain.
  4. Hybrider les bandes d’ADN transférés à la membrane en nylon avec la sonde radioactive 188-nt, qui lie les condensés de EcoR1 de l’ADN génomique de 25 µL du tampon enzymatique spécifique pendant des périodes variables.
  5. Laver la membrane deux fois pendant 15 min à 65 ° C avec 2 SDS x SSC et 0,1 %.
  6. Exposer les films radiographiques à la membrane de nylon et autoradiogramme les bandes sur la membrane pendant une semaine.
  7. Cultiver les clones sélectionnés de l’hybridation avec les produits d’amplification PCR de T. cruzi , qui sont hybridés avec la sonde spécifique d’ADN radiomarquée PCR et du Sud .
  8. Dans le commerce des séquences des clones en utilisant les amorces Tcz1/2 set recuits au T. cruzi -télomère spécifiques empreinte2,23.

5. tests immunologiques

Remarque : La sensibilité et la spécificité de l’immunofluorescence indirecte (IFI) et de l’immuno enzymatique (ELISA) ont été évaluées dans le sérum de six Chagas patients présentant une parasitémie démontrable et de six Chagas exempt, dépersonnaliser sérum échantillons de la banque. Les essais effectués avec les dilutions doubles de sérum dans du PBS, pH 7,4, a révélé que l’IIF à des dilutions au 1/100 et les densités optiques ELISA (ODs) à 0,150 et plus séparent le positif des résultats négatifs.

  1. Utilisez 5 mL du sang coagulé aliquot (étape 1.4) conservé à température ambiante pendant 1 h et il centrifuger à 1 500 g pendant 30 min séparer le sérum dans le surnageant.
  2. Effectuer l’IIF et ELISA dans les dilutions de sérum au 1/100 en triple pour détecter les antigènes de T. cruzi et L. braziliensis comme décrit plus haut28.
  3. IIF
    1. Effectuer l’essai de l’IIF dans les dilutions du sérum en triple d’échantillons de le 109 étude sujets obtenus à trois reprises un an d’intervalle.
    2. Placer 5 suspensions µL de la formaline 1 % - traités T. cruzi épimastigotes ou L. braziliensis promastigotes sur lames de verre ; laisser sécher jusqu’au lendemain parasites sous une hotte à température ambiante et stocker les lames de verre à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
    3. Place 20 µL de dilutions de sérum du patient sur le dessus de lames de verre recouvert de 5 µL du formol-tués (10 parasites/µL) T. cruzi épimastigotes ou L. braziliensis promastigotes.
    4. Incuber la lame de verre recouverte d’un feuillet pendant 1 h dans une chambre humide à 37 ° C et laver trois fois avec du PBS.
    5. Incuber la lame de verre séché à l’air avec une dilution de 1 : 1 000 d’un anticorps de lapin marqué à la fluorescéine (Table des matières) IgG humaines pendant 1 h à 37 ° C ; Lavez et séchez la diapositive.
    6. Monter la lame avec une lamelle couvre-objet et l’examiner sous un microscope à lumière UV.
      Remarque : Un examen positif est un vert pomme T. cruzi épimastigotes silhouette, montré dans la vidéo.
  4. ELISA
    1. Exécuter une épreuve ELISA pour détecter le T. cruzi et les antigènes solubles L. braziliensis (1 µg/100 µL de tampon carbonate de 0,1 M à pH 9,6) sur microplaque enduite.
    2. Incuber les dilutions de sérum au 1/100 dans une microplaque en triple pendant 2 h à température ambiante.
    3. Laver les plaques trois fois avec PBST (PBS contenant 0,5 % Tween-20), pH 7,4, solution avant le séchage.
    4. Incuber les boîtes avec 50 µL d’une dilution de 1 : 1 000 des anticorps de lapin anti-human IgG pendant 90 min à 37 ° C.
    5. Laver les plaques trois fois avec la solution PBST et laissez-les sécher à température ambiante.
    6. Incuber les boîtes avec 100 µL de dilutions de 1 : 1 000 de chèvre de conjugué à la phosphatase alcaline anti-rabbit IgG (Table des matières) pendant 90 min à 37 ° C.
    7. Laver les plaques trois fois avec PBST, ajouter du phosphate de phényle substrat p-nitro et attendre pour le développement de la couleur.
    8. Lire l’ODs à 630 nm dans un lecteur de plaque multimode.
    9. Exécuter les dilutions en triple de sérum à l’essai de la population étudiée et tracer l’ODs afin d’identifier les particuliers les titres d’anticorps T. cruzi .

6. les évaluations d’une tolérance immunitaire

NOTE : Un système de modèle de poulet a été utilisé pour tester les infections de T. cruzi après la première semaine du développement embryonnaire.

  1. Ensemencer des oeufs fertiles avec 100/10 µL T. cruzi trypomastigotes récoltées sur milieu de culture tissulaire ; inoculer contrôle faux oeufs avec 10 T. cruzi trypomastigotes pour µL de milieu de culture. Sceller le trou avec du ruban adhésif.
  2. Incuber 20 T. cruzi -infectées oeufs et un nombre égal d’oeufs fertiles de simulacre de contrôle à 37 ° C et 65 % d’humidité pendant 21 jours.
  3. Garder les poussins qui éclosent dans l’incubateur pendant 24 h et ensuite à 32 ° C dans des hottes avec contrôle des températures pendant trois semaines.
  4. Cultiver les poussins éclos des oeufs T. cruzi -inoculés et des œufs de simulacre de contrôle au stade adulte dans une chambre de pression d’air positif à 24 ° C, dans des cages individuelles, placés dans les allées séparées.
  5. Défier tous les poussins adultes trois fois à l’âge de six mois avec 107 trypomastigotes tués par formol injectés par voie sous-cutanée, toutes les semaines, selon le schéma dans la vidéo.
  6. Prélever du sang d’une veine de l’aile des poulets éclos des oeufs de T. cruzi -inoculées et des contrôles de simulacres de quatre semaines après la dernière vaccination pour obtenir le sérum.
  7. Utiliser le sérum de poulet pour détecter les propres anticorps de T. cruzi par l’IIF et ELISA tel que décrit à l’étape 5 du protocole.

7. infection des souris par T. cruzi de sperme des patients Chagas éjacule

  1. Utiliser les sperme éjaculats chez un patient de maladie de Chagas PCR + adult (étape 1.5) et chez un individu adulte PCR - Chagas-libre.
  2. Utilisez deux groupes de 12 souris BALB/c un mois naïf détenus dans les hottes sous pression d’air positive à 24 ° C et nourris ad libitumde la nourriture.
  3. Inculquer les aliquotes de sperme Chagas positif humains (100 µL) dans le péritoine et égales dans le vagin de souris du groupe A.
  4. Inculquer les aliquotes de sperme contrôle exempt de Chagas (100 µL) dans le péritoine et un montant égal dans le vagin de souris du groupe-B.
  5. Sacrifier les souris expérimentales sous anesthésie, cinq semaines après les instillations de sperme et les coupes de tissus de la coloration à l’hématoxyline-éosine.
  6. La microscopie permet de rechercher des trypomastigotes T. cruzi et amastigotes dans le coeur, le muscle squelettique et les organes reproducteurs dans des groupes de souris.

8. transmission de l’infection par T. cruzi par rapports sexuels

  1. Utilisez la souris BALB/c six semaines 10 mâles et femelles dans les expériences.
  2. Inoculer 5 mâles et cinq femelles par voie intrapéritonéale avec 1 x 105 T. cruzi trypomastigotes de la culture de tissus.
  3. Reproduire les souris jusqu'à l’âge de trois mois : groupe j’ai sera formée par cinq T. cruzi-souris femelles infectées et cinq contrôle camarades masculins infectés ; groupe II sera formé par cinq T. cruzi -infecté mâle et cinq contrôle infectés femelle s’accouple. Groupe III sera formé de cinq hommes et cinq femmes contrôle naïf non infecté mates.
  4. Maison chaque couple dans une cage placée à l’intérieur d’un coffre avec une porte de grille et de lock-in de 5 mm pour empêcher la fuite de reproducteur.
  5. Nourrir les souris chow et eau ad libitum. Lever un total de 70 descendants dans les groupes II et j’ai le sevrage pendant au moins six semaines.
  6. Prélever du sang par ponction cardiaque de la parentale (FO) et la souris de descendants (F1) sous anesthésie, sacrifier les souris et soumettre des sections du coeur, le muscle squelettique et des organes reproducteurs pour analyse pathologique.

9. évaluation du privilège immunitaire

  1. Obtenir des tissus de T. cruzi-infectés et contrôler la souris (étape 8,6) naïf et couper les échantillons de paraffine en coupes épaisses de 4 µm.
  2. Enlever la paraffine et déshydrater les sections sur les lames de verre avec plusieurs changements de xylène et graduées lavages avec de l’éthanol 100 % à 70 %, de 1 min chacun.
  3. Incuber les coupes de tissus avec 0,05 % de saponine une seule fois, suivie de trois lavages de l’eau distillée à température ambiante.
  4. Bloquer les coupes de tissus avec 5 % de lait en poudre pour 45 min. Lavez les diapositives de 0,1 M PBST et incuber les sections avec le Chagas souris anti-T. cruzi sérum ou avec du sérum de souris de contrôle non infecté à un 01:20 dilution pendant 2 h.
  5. Lavez les diapositives trois fois pendant 5 min dans du PBST et sec à la température ambiante avant l’incubation avec une dilution de 1 : 1 000 de la anti-souris IgG de lapin de conjugué à la phosphatase alcaline.
  6. Rincer les lames dans le PBST et ajouter 100 µL de diaminobenzidine 3,3' pour une incubation de 5 min, suivie de trois lavages avec PBST et contre-coloration à l’hématoxyline Harris pendant 30 s.
  7. Laver les lames dans l’eau distillée pendant 5 min, les déshydrater à 70 %, 80 %, 90 % et 100 % éthanol pendant 1 min et montez-les en glycérine tamponnée.
  8. Examiner les diapositives avec un microscope optique lumineux-zone et capturer des images de photo avec une micro-caméra avec logiciel et un programme d’analyseur.
  9. Le document le privilège immunitaire du parasite en l’absence de réactions inflammatoires dans les organes reproducteurs.

10. statistical analyses

  1. Utilisation biomédicale Edit pour analyse de la séquence, d’exécuter des alignements avec BLAST et déterminer la signification statistique de E-valeur (p < 0,05).
  2. Effectuer une analyse de variance (ANOVA) et le test de Tukey à comparer l’OD signifie plus ou moins les écarts-types.

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Representative Results

Cette recherche, menée selon le protocole, qui vise à détecter les cas aigus de la maladie de Chagas par des examens cliniques et parasitologiques. Échantillons de sang veineux ont été soumis à l’examen microscopique direct et de la culture in vitro pour la croissance du parasite. Vingt et un cas aigus de la maladie de Chagas a montré de T. cruzi dans le sang. Le protocole de recherche obtenu l’isolement de T. cruzi ECI1-ECI21 de la maladie de Chagas aiguë, et l’ADN échantillons présentés des empreintes ADN positifs dans le reste de la population étudiée : études Adnn-PCR a donné la séquence typique de télomères avec les bandes de 188-nt présents ainsi que le T. cruzi Bérénice archétype1. Les cas de Chagas et des membres de leur famille qui se porte volontaire pour participer à l’étude ont été regroupés en quatre familles1.

Dans cette étude familiale, l’Adnn T. cruzi est amplifié avec les amorces PCR définit1,23 recuite à la séquence télomérique spécifiques de chacun des 21 cas de maladie de Chagas aiguës. Ces T. cruzi Adnn amplicons hybridé avec la sonde de séquence radioactif spécifique (Figure 2) ; le clonage et le séquençage a révélé que les amplicons comprenant le motif de répétition télomérique 188-nt T. cruzi . La spécificité de ces procédures d’hybridation a été affichée dans le contrôle négatif effectué avec L. braziliensis promastigotes. L’analyse de la pathologie validé que les hemoflagellates chez les patients de la maladie de Chagas aiguës sont vraiment virulents T. cruzi. Nous concluons que la bande (188 pb) de T. cruzi Adnn trouvé dans les 21 aiguë Chagas cas (Figure 2) est une manifestation directe des infections persistantes.

Transmission par voie sexuelle de Trypanosoma cruzi chez l’homme

Afin d’évaluer les rapports entre les infections de T. cruzi , nous avons appliqué le test des acides nucléiques pour la détection de la sensibilité élevée de l’empreinte du parasite dans l’étude familiale population1. Dans ces analyses par PCR, les produits d’amplification qui hybridaient avec la sonde spécifique de 188-nt radioactive forment Adnn bandes à 76,1 % (83/109) des échantillons essayés ; les résultats d’hybridation Southern des produits Adnn-PCR amplification avec la sonde radioactive de 188-nt spécifique sont indiquées à la Figure 3. En outre, les hybridations ont montré l’ADN du parasite dans la lignée germinale des membres de la famille bénévoles (Figure 4).

IIF travaillait au phénotype du ECI1 à ECI21 T. cruzi trypomastigotes avec le sérum humain IgG auprès d’un échantillon de banque sérum de la maladie de Chagas avec démonstration parasitologique du protozoaire dans le sang, et un fluorescéine conjugué anti-human Qu'igg a été utilisé . T. cruzi Bérénice était un contrôle positif pour les anticorps de Chagas, et le contrôle négatif était le promastigote de sa famille relative L. braziliensis. La figure 5 montre que la silhouette de vert pomme positive de l’archétype de Bérénice est corrélée avec le sauvage-type enveloppe de T. cruzi montré dans la vidéo.

L’ELISA et l’IIF a révélé le spécifique T. cruzi anticorps1,28 à 28,4 % (31/109) des échantillons essayés. Les résultats de l’ELISA et IIF, ainsi que ceux de l’amplicon Adnn-PCR et les hybridations méridionales , sont tracés sur la Figure 6. Les écarts entre les résultats de l’empreinte Adnn-PCR et ceux de l’anticorps spécifique dosages sont représentés dans la heredograms (Figure 7), A de la famille, quatre sujets avaient positive Adnn et l’anticorps anti -T. cruzi et 11 avait seulement le Adnn positif ; les cinq hommes avaient T. cruzi dans le sperme de sperme. Dans la famille B 44 personnes, 11 avait le spécifique anticorps T. cruzi et 23 ont l’anticorps spécifique tant l’Adnn parasite ; sept personnes avaient T. cruzi dans le sperme de sperme. Famille C avec 29 membres avait l’anticorps et le T. cruzi Adnn chez les cinq personnes, et 17 ont l’Adnn parasite seul ; les quatre hommes avaient Adnn-PCR positive dans l’éjaculat de sperme. En famille D, parmi les 21 sujets, 11 avait l’anticorps spécifiques anti -T. cruzi et l’empreinte Adnn et neuf avaient Adnn-PCR positif seul. Figure 3, Figure 6 et Figure 7 représentent les grandes divergences parmi les résultats, toujours, dans les échantillons biologiques provenant de sujets familles dans trois expériences indépendantes, exécuter un an d’intervalle.

Le tableau 1 montre les différences quantitatives entre l’IFI, ELISA et les dosages Adnn-PCR dans les échantillons issus de l’étude humaine A-à-D. Les divergences entre les rapports des dosages d’anticorps (28,4 %) et ceux des analyses positives des acides nucléiques (76,1 %) sont statistiquement significatives (p < 0,005). Dans ces familles, les différences entre les groupes de personnes T. cruzi -infecté (III et IV) représentaient 62,6 % (52/83) de la population, montrant un test positif d’acide nucléique seul. Les larges écarts entre les ratios des empreintes positives Adnn et ceux de l' spécifiques de T. cruzi anticorps ont été expliquées par les expériences menées dans le système de modèle de poulet.

Tolérance immunitaire

L’évaluation des réactions immunitaires réalisée en groupes de poulets élevés au stade adulte dans des cages individuelles dans les allées distinctes contenant des poulets de contrôle naïf (A) ; simulacre de contrôle poulets issus de œufs inoculés avec milieu de culture (B) ; et poulets éclosent du T. cruzi oeufs inoculés trypomastigotes (C)26. L’adulte de poulets dans les groupes B et C ont été contestés trois fois avec le formol-tué T. cruzi trypomastigotes antigène, hebdomadaire, comme montré dans la vidéo. Le test ELISA et les dosages de l’IIF ont été exécutés avec le sérum recueilli du groupe A, B et C poulets unmois après la provocation. La figure 8 montre l’absence de l’anticorps spécifique groupe A et C chez les poulets, qui contraste fortement avec la production d’anticorps spécifiques dans le groupe B immunisé avec l’antigène de T. cruzi . Les résultats montrent clairement le système immunitaire éclos de tolérance dans le groupe C de la T. cruzi-inoculé des oeufs.

Transmission sexuelle du Essayez panosoma cruzi dans un système de modèle de souris

En outre, le pouvoir infectieux de T. cruzi d’éjaculat du patient Chagas, qui été testés positifs à la PCR et manquait de l’anticorps spécifique, a été démontré grâce à des instillations de 100 µL de sperme dans la cavité péritonéale de souris mâles et à travers un quantité égale de sperme instillée dans le vagin. Cinq semaines plus tard, les nids d’amastigotes de T. cruzi ont été détectés dans le coeur et les muscles squelettiques et des touffes de différencier les parasites étaient présents dans la lumière du canal déférent et tube utérin. Fait intéressant, les réactions inflammatoires destructrices ne pas entourer les nids et les massifs des T. cruzi amastigotes (Figure 9).

L’évaluation de la transmission sexuelle des infections de T. cruzi a été encore effectuée chez deux groupes de souris inoculées par voie intrapéritonéale avec 1 x 105 T. cruzi Bérénice trypomastigotes formes1,30, 31. Dans le groupe expérimental, I, 10 T. cruzi-infectés par les mâles s’est accouplés avec 10 souris femelles de naïve contrôle. Dans le groupe expérimental II, 10 T. cruzi -infecté femelles accouplées à 10 mâles du témoin naïf. La figure 10 montre que le T. cruzi-infecté les souris mâles (A à E) et le T. cruzi -infecté les souris femelles (F-g) a révélé 188-bp Adnn bandes (numéros impairs). Après la reproduction, les compagnons de naïve (nombres) acquis facilement T. cruzi suite à une rencontre sexuelle unique avec un compagnon de chagasic. Des expériences similaires répétées effectuées dans des conditions identiques a confirmé que chaque souris naïves de sexe féminin ou masculin qui sexuellement s’est accouplé avec un T. cruzi-infecté mâle ou femelle contracté l’infection flagellée. Ces fondateurs Adnn-positive (F0) généré progéniture qu’ils ont élevé jusqu'à l’âge de six semaines. Puis, le test et le contrôle non infectés souris ont été saignés par la ponction cardiaque à recueillir environ 0,5 mL de sang. Les dosages Adnn-PCR ont montré que les infections sexuellement acquises (F0) des fondateurs ont été transmises à la progéniture F1, comme en témoignent les bandes de 188-bp Adnn (Figure 11). La progéniture F1 était positifs Adnn dans 41 des 70 (58,6 %) échantillons analysés. De ces souris avec des bandes d’Adnn suggestifs d’infections acquises verticalement, aussi peu que 9 de 41 (22 %) présentaient des anticorps de T. cruzi .

Les souris de la progéniture F1 ont été sacrifiés sous anesthésie, et les tissus de l’organisme ont été soumis à des analyses pathologiques et immunitaires coloration à la peroxydase. Les résultats de ces expériences sont indiquées à la Figure 12. Les résultats pour les amastigotes de T. cruzi ont été documentés dans les cellules interstitielles de l’épididyme et dans goniablasts ; amastigotes differenciation en trypomastigotes étaient présents dans la lumière des tubes séminifères en l’absence de réactions inflammatoires.

Figure 1
Figure 1 . Trypanosoma cruzi infection dans le tube séminifère d’un garçon qui est décédé de la maladie de Chagas aiguë . Microphotographie du fichier du docteur Teixeira, 1970,18. Les formes de T. cruzi sont en goniablasts et bouquets d’amastigotes et gratuit trypomastigotes (flèches) sont présents dans la lumière du tube séminifère en l’absence d’infiltrats inflammatoires1. Les taches de l’hématoxyline-éosine. Bar, 20 µm. réimprimé avec la permission de l’éditeur et les auteurs1,19.

Figure 2
Figure 2 . L’empreinte de Trypanosoma cruzi de la maladie de Chagas aiguë. Les produits d’amplification PCR-Adnn T. cruzi forment bandes 188-nt avec une sonde spécifique de 188-nt radioactive. TC, T. cruzi; Caroline du Nord, contrôle négatif. Réimprimé avec la permission de l’éditeur et l' auteur1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 . Southern blotting analyse de Trypanosoma cruzi les infections chez les sujets d’étude humaine familles. A famille - tous les 15 sujets a montré l’Adnn-PCR spécifique bandes 188-nt. Famille b, un total de 35 43 sujets (81,4 %) a formé les bandes Adnn spécifiques. Famille c, entre les 29 membres, 22 (75,8 %) a formé les bandes Adnn. Famille d, 11 des 21 sujets (52,4 %) avait les bandes Adnn. Le T. cruzi-bandes Adnn spécifiques ont été confirmés par clonage et séquençage. Réimprimé avec la permission de l’éditeur et l' auteur1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 . L’active Trypanosoma cruzi infection dans le sperme éjacule d’étude familiale bénévoles. Les infections dans les éjaculats Chagas patients identifiés par les bandes de 188-bp Adnn-PCR. TC, T. cruzi contrôle positif. Caroline du Nord, L. braziliensis contrôle négatif. Réimprimé avec la permission de l’éditeur et l' auteur1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 . Le phénotype des Trypanosoma cruzi avec les anticorps de sérum des patients de la maladie de Chagas. T. cruzi identifiés avec les anticorps de type IgG sériques Chagas qui reconnaît les trypomastigotes parasite traités avec un marqué FITC monoclonal Ab anti-IgG humaines. L’anti-T. cruzi Ab ne reconnaît pas les promastigotes de Leishmania braziliensis . Les EISN montrent les témoins négatifs. Barres, 20 µm. reproduit avec la permission de l’éditeur et l' auteur1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 6
Figure 6 . Représentation graphique des tests Elisa et études Adnn-PCR de la famille des population à l’étude. Groupe I (n = 10) et du groupe II (n = 20) étaient respectivement de contrôle négatif et les sérums de contrôle positifs, par T. cruzi infections avec démonstration parasitologique. Groupe III (n = 31) inclure des échantillons provenant de sujets familles avec les bandes de 188-bp Adnn et anticorps spécifiques T.cruzi. Groupe IV (n = 52) composé d’échantillon de sujets avec T. cruzi infections détectées par les amplicons Adnn-PCR de 188-nt en l’absence de l’anticorps spécifique. Groupe V (n = 26) étaient des échantillons négatifs comprenant le peuple exempt d’infection dans l’étude de la famille. Réimprimé avec la permission de l’éditeur et l' auteur1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 . La heredograms et la cartographie de la Trypanosoma cruzi- infecté la population familiale. La figure montre les différences entre les rapports de l’anti -T. cruzi anticorps et ceux des analyses Adnn-PCR. Place ouverte et circle, négatif mâle et femelle. Carrés rouges et cercles etT. cruzi anticorps positif anti - Adnn-PCR. Les carrés noirs et des cercles, Adnn-PCR positif seul. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 8
Figure 8 . La tolérance immunitaire chez les poulets issus de Trypanosoma cruzi- inoculées oeufs. A) profil d’anticorps preimmune dans les poulets de simulacre de contrôle (n = 10). Poules B) la réponse d’anticorps spécifiques dans le contrôle de naïf a contesté avec l’antigène de T. cruzi (n = 20). C) l’absence d’une réponse immunitaire spécifique chez les poulets éclos dans le T. cruzi-utilisés des oeufs après leur défi avec l’antigène de T. cruzi (n = 20). La différence de densité optique entre A et C (024 ± 0,17) vers B (0,85 ± 0,6) est statistiquement significative (p < 0,05). Ce chiffre de référence26 a été modifié et est reproduit avec la permission de l’éditeur et l’auteur.

Figure 9
Figure 9 . L’infectieux Trypanosoma cruzi dans les éjaculats humaines se traduit par une infection active de la murine. Aliquotes de Chagas éjaculats patients ont été instillées dans la cavité péritonéale ou dans le vagin de la souris. Les souris ont été euthanasiées trois semaines après l’instillation. Top lane, T. cruzi amastigotes nids dans le cœur (à gauche) et dans le muscle squelettique (à droite). Ruelle du bas, T. cruzi amastigote nids dans le canal déférent (à gauche) et dans les tubes utérins (à droite). L’encart montre une démarcation amastigote (cercle). Notez l’absence d’infiltrats inflammatoires dans les sections de tissu. Les taches de l’hématoxyline-éosine. Bars : haut et bas à gauche, 20 µm ; en bas à droite, 10 µm. reproduit avec la permission de l’éditeur et l' auteur1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10 . La transmission sexuelle du Trypanosoma cruzi les infections chez la souris modèle système de rapports sexuels. La transmission des infections de chagasic T. cruzi à naïf camarades démontrées par les bandes de 188-bp Adnn spécifique révélés dans les hybridations méridionales . Profils d’accumulation top lane) des produits PCR amplification des souris T. cruzi -infectés et des souris naïves. Les nombres impairs indiquent le T. cruzi-infecté A mâle-à-E et des échantillons de F-à-je souris femelle. Les nombres sont naïfs femelle (2 à 10) et la souris mâle (12 à 20). Ruelle du bas, après la reproduction, l’émission de profils que même les infections de T. cruzi souris 2 à 20 acquis. Réimprimé avec la permission de l’éditeur et l’auteur1,30. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 11
Figure 11 . Le Trypanosoma cruzi infection est passée verticalement le F0 chagasic parental à la souris de la progéniture F1. Le parent chagasic transmissibles le T. cruzi par une rencontre unique de reproduction. Le T. cruzi-femelles infectées ont été accouplés aux hommes naïfs A-E, et les femelles naïfs ont été accouplées pour les mâles de T. cruzi-infectés par F.-J. Après la reproduction, tous les fondateurs (F0) a montré la bande de 188-bp positive protozoaire Adnn-PCR. Transfert de Southern , a révélé la bande Adnn spécifique après hybridation avec la sonde radioactive de 188-nt dans la majorité des portées F1. Caroline du Nord, L. braziliensis témoin négatif ; TC, T. cruzi contrôle positif. Réimprimé avec la permission de l’éditeur et l’auteur1,31. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 12
Figure 12 . L’histopathologie documenté Trypanosoma cruzi sexuellement transmissibles de F0 F1 progéniture et immunitaire tolérance en l’absence d’une réaction inflammatoire. Les sections présentent la croissance des formes T. cruzi dans l’épididyme, des goniablasts et des tubules séminifères des souris F1. Les souris ont été euthanasiées sous anesthésie, et les sections colorés à la peroxydase du système immunitaires ont été examinées au microscope. Les photomicrographies montrent brunâtre teinté peroxydase immunitaire T. cruzi amastigotes dans l’interstitiel de l’épididymeA ()) et bouquets d’amastigotes differenciation en trypomastigotes hangar dans la lumière de la séminifères tubule (B, C et F). Le nid de l’amastigote vu dans un goniablast (D). Histologie normale de la souris de contrôle positif tube séminifère (E). Notez l’absence d’infiltrats inflammatoires dans les testicules des souris F1 montrant les charges des parasites Chagas. Coloration de Giemsa. Barres : A, B, C et E, 20 µm ; D et F, 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Le tableau 1. Les divergences entre les rapports des examens IIF et ELISA positifs et celles des essais Adnn-PCR dans des échantillons prélevés dans des familles d’étude humaine A-à-D *

Groupes ** ELISA : sérum anti-T. cruzi Ab (%) T. cruzi Adnn-PCR (%)
I-Control Ab - PCR - (n = 10) 10/10 100 10/10 100
II - contrôle Ab + PCR + 20/20 100 20/20 100
(n = 20)
III - Chagas Ab + PCR + ᵟ 31/109 28,4 31/109 28,4
(n = 31)
IV - Chagas Ab - ACP + ᵟ - - 83/109 76.1
(n = 52)
V - Chagas-free Ab - PCR- 26/109 23,9 26/109 23,9
(n = 26)
* Résultats des trois indépendante ELISA et études Adnn-PCR dans des échantillons prélevés en trois occasions différentes aux années 1, 2 et 3. [1]. l’amplification de la 188-nt T. cruzi ADN répéter confirmé par clonage et séquençage.
** Les différences entre les résultats négatifs (groupes I et V) et les sujets positifs (groupes III et IV) sont statistiquement significatives (p < 0,05).
ᵟ les différences entre les groupes III et IV a expliqué par la tolérance immunitaire en l’absence de l’anticorps de T. cruzi atteint 62,6 % (52/83) des sujets positifs PCR.

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Discussion

Ici, nous discutons un protocole de recherche axée sur la famille qui ont répondu à la question de savoir si trypanosomiase humaine découle sexuellement intraspécifique T. cruzi infections. Les premières études ne pouvaient pas fournir la preuve de la transmission sexuelle des infections de T. cruzi , probablement parce que les données disponibles et des informations sur la maladie de Chagas ont été obtenus séparément de l’individuel3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13. La conclusion de T. cruzi dans le tube séminifère d’un garçon (Figure 1) a été l’étincelle qui a éperonné enquête clinique et épidémiologique. Après plusieurs décennies, éventuellement lors de l’étude de la famille des approches et les techniques décrites dans le présent protocole de recherche étaient disponibles, étapes du cycle de vie T. cruzi est apparu dans l’éjaculat humain1,19.

La manifestation parasitologique directe du protozoaire dans 21 cas de maladie de Chagas aiguës était cruciale pour valider les produits d’amplification Adnn-PCR, qui a formé les bandes spécifiques dans les échantillons de tous les sujets gravement infectés par T. cruzi. Ce marqueur de point-of-care laboratoire a évalué les résultats des analyses immunologiques et acides nucléiques. La fondamentale à long terme Chagas disease familiale study, par conséquent, combine les résultats chez l’homme avec ceux obtenus dans les groupes d’animaux de laboratoire. Les recherches menées conformément au protocole a révélé pour la première fois que T. cruzi infections sont sexuellement transmissibles à l’homme1.

La large différence entre les rapports des dosages d’anticorps spécifique au parasite et celles de l’acide nucléique des tests indique que la majorité des empreintes Adnn résulte de cas sexuellement en l’absence de spécifiques anti- T. cruzi anticorps. Ainsi, la transmission sexuelle de T. cruzi dans l’exposant Adnn positive en l’absence de l’anticorps IgG spécifiques de membres de la famille était en raison de la tolérance immunitaire.

Tolérance immunitaire a été démontrée dans un système de modèle de poulet réfractaire aux infections de T. cruzi après la première semaine de croissance des embryons1,25,26,32,33, 34. Par la suite, du système immunitaire immature inaptitude à reconnaître le parasite comme une composante étrangère du corps indiqué tolérance de système immunitaire mature fin du poulet vers T cruzi. Compte tenu de ces résultats, la tolérance est un phénomène naturel1 résultant de la reconnaissance de soi et l’entretien de ses propres composants de corps sous des conditions physiologiques25,26, du système immunitaire 32 , 33 , 34. le passage de l’état de tolérance immunitaire aux maladies auto-immunes du cœur de Chagas peut donc être associé avec des modifications de cellules effectrices résultant de mutations kinétoplaste (Kadn) T. cruzi dans le génome de l’hôte1 ,2,14,23,25,26.

Les étapes essentielles dans le protocole de recherche décrivent la modification principale technique et dépannage pour divulguer les sexuellement transmissibles Chagas parasites1,14,23,25, 26: j’ai) sélection des familles d’étude des cas de35,de la maladie de Chagas36aiguë ; ii) isolant de type sauvage de T. cruzi du sang des cas aigus ; iii) pour obtenir des échantillons d’ADN de flagellés de sang des familles participants, de l’archétype de Bérénice T. cruzi , des échantillons d’ADN positif banque anonymisés et partir du négatif contrôlent L. braziliensis; iv) exécution des procédures techniques bien rangés pour démontrer que l’empreinte des participants flagellés Adnn est identique à celui de l’archétype de Bérénice T. cruzi et ces positif banque d’échantillons d’ADN ; empreinte de la v) en cours d’exécution indépendant Adnn en triple pour démontrer les infections de T. cruzi chez les membres de la famille à trois reprises un an d’intervalle ; vi) veiller à ce que la technique d’Adnn-PCR réalisée au point de soins donne des résultats confirmés par clonage et séquençage tous les amplicons recuites à l’amorce spécifique définit, montrant ainsi constamment la séquence de 188-nt T. cruzi 1,25,28,29,30; vii) utilisant des réactifs de qualité marque de reproduire les titres d’anticorps encore dans des échantillons de sérum prélevés à trois moments différents ; viii), le protocole de l’étude familiale a révélé l’infection direct existante dans les cellules germinales lors de la démonstration de l’Adnn T. cruzi en l’absence d’anticorps sériques spécifiques dans les éjaculats sperme prélevés Chagas infectés par le parasite individus1; ix) du point de vue est que le protocole de recherche conçu pour démêler les sexuellement les infections de T. cruzi doivent divulguer la maladie de Chagas autochtone sur les cinq continents ; x) l’Adnn et les empreintes de Kadn sécuriser le diagnostic de la maladie de Chagas chronique asymptomatique dans les humains1,2; xi) en l’absence de l’Adnn, la mutationde la T. cruzi Kadn séquence1,2,23,25,26 seul est un marqueur pour le laboratoire réaliser le diagnostic différentiel de la cardiomyopathie dilatée idiopathique23,25,37,38,,39.

En outre, le virulent T. cruzi documentées dans les patients éjaculats Chagas étaient capable d’initier des infections généralisées après instillation dans le vagin de la souris et dans la cavité péritonéale. L’étude de la pathologie montre T. cruzi amastigote nids dans le coeur et les muscles squelettiques ainsi que dans le canal déférent et le tube utérin. Fait intéressant, les nids de parasite n’a pas provoqué de réactions inflammatoires qui entravent les fonctions vitales de reproduction. L’absence de réactions inflammatoires rend le privilège immunitaire dans un corps fonctionnel vital structures40,41,42,43,44,45 et par conséquent explique la croissance effrénée de T. cruzi dans les organes reproducteurs.

En outre, les études expérimentales chez la souris chagasic qui se reproduisent avec des camarades de naïf a réexpliqué la transmission sexuelle du T. cruzi infections chez l’homme. Les femelles infectées et les mâles les T. cruzi infections transmettent pour les compagnons de naïf non infectées pendant les rapports sexuels, et le T. cruzi verticalement transféré du parent aux descendants a acquis la majorité de leurs portées. Dans ces expériences, la phase initiale visée à la croissance de T. cruzi dans le tube et dans l’utérus, ainsi que dans le tube séminifère et le canal déférent, où tenait le privilège immunitaire. Ensuite, la transmission sexuelle a eu lieu à travers les stades parasitaires dans le sperme ou les sécrétions utérines dans le vagin. Privilège immunitaire40,41,42,43,44,45 est un phénomène qui permet à certains organes (système reproducteur, des yeux et cerveau) à downregulate des réactions inflammatoires et éviter d’endommager les fonctions importantes, sensible et spécifique de40. Hormones41 et plusieurs facteurs immunitaires downregulate macrophages41,42,43, cellules tueuses naturelles41, lymphocytes T et cellules T-régulatrices (Treg), orchestrant ainsi la inhibition d’un certain nombre de cytokines proinflammatoires et déclencheurs de privilège immunitaire40,41,42,43,44,45.

La transmission sexuelle des infections de T. cruzi des mâles et des femelles à naïf partenaires indique que le contrôle de la maladie de Chagas exige la solidarité internationale. Les résultats discutés ci-après donnent à penser qu’il faut des recherches plus créatifs. Les objectifs immédiats suivants sont réalisables : j’ai) à développer des plates-formes de haut débit spécifique et hautement sensible des acides nucléiques tests pour arriver à un diagnostic précis, visant à la prévention des infections transmises par voie sexuelle, transfusion sanguine et transplantation d’organes ainsi que faciliter les enquêtes épidémiologiques et cliniques afin de déterminer le diagnostic et la prévalence de la maladie de Chagas ; ii) de promouvoir un programme de développement de drogue multicentrique afin d’obtenir de nouveaux médicaments pour l’éradication des infections de T. cruzi ; et iii) à mettre en œuvre une éducation appropriée, le programme d’information et de communication qui inclut la participation des écoles, des églises, des organisations sociales et les établissements de santé pour prévenir la propagation de la maladie de Chagas.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Nous reconnaissons les installations de laboratoire et les commentaires critiques de Izabela Dourado, Carla Araujo et habile Gomes et l’assistance technique de Bruno Dalago et Rafael Andrade. Nous sommes reconnaissants à la Fondation pour l’avancement des sciences (FAPDF), le Conseil National de recherches, ministère de la Science et de technologie (CNPq/MCT) et l’agence de formation des ressources humaines, ministère de l’éducation (CAPES / ME), Brésil, pour soutenir ces enquêtes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCIP and NBT redox system Sigma-Aldrich 681 451 001
Blood DNA Purification columns Amersham Biosciences 27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.   Perkin Elmer   BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm AMRESCO 064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Eco RI Invitrogen 15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated Southern Biotech        2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated Biocompare MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane GE Healthcare RPN303B
Hybridization oven Thomas Scientific 95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software Olympus, Japan
Molecular probes labeling System Invitrogen 700-0030
Nsi I Sigma-Aldrich R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit GE Healthcare 28-9042-70
Plate reader  Bio-Tek GmBH 2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated Sigma-Aldrich A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated Sigma-Aldrich F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated Sigma Aldrich A2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated Biorad MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine Sigma-Aldrich G25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Thermal cycler system Biorad, USA 1709703
Vector Systems Promega A1380

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References

  1. Araujo, P. F., et al. Sexual transmission of American trypanosomiasis in humans: a new potential pandemic route for Chagas parasites. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112, (6), 437-446 (2017).
  2. Teixeira, A. R. L., Nitz, N., Bernal, F. M., Hetch, M. M. Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model. Journal of Visualized Experiments. (65), 3716 (2012).
  3. Kalil-Filho, R. Globalization of Chagas Disease Burden and New Treatment Perspectives. Journal of the American College of Cardiology. 66, (10), 1190-1192 (2015).
  4. Nunes, M. C. P., Dones, W., Morillo, A., Encina, J. J., Ribeiro, A. L. Chagas Disease: An Overview of Clinical and Epidemiological Aspects. Journal of the American College of Cardiology. 62, (9), 767-776 (2013).
  5. Pinazo, M. J., Gascon, J. Chagas disease: from Latin America to the world. Reports in Parasitology. 2015, (4), 7-14 (2015).
  6. Kessler, D. A., Shi, P. A., Avecilla, S. T., Shaz, B. H. Results of lookback for Chagas disease since the inception of donor screening at New York Blood Center. Transfusion. 53, (5), 1083-1087 (2013).
  7. Klein, N., Hurwitz, I. R. Globalization of Chagas Disease: A Growing Concern in Nonendemic Countries. Epidemiology Research International. (2012).
  8. Pérez-Molina, J. A., Norman, F., López-Vélez, R. Chagas disease in non-endemic countries: epidemiology, clinical presentation and treatment. Current Infectious Diseases Report. 14, (3), 263-274 (2012).
  9. Hotez, P. J., et al. Chagas disease: "the new HIV/AIDS of the Americas". PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1498 (2012).
  10. Schmunis, G. A., Yadon, Z. E. Chagas disease: a Latin American health problem becoming a world health problem. Acta Tropica. 115, (1-2), 14-21 (2010).
  11. Franco-Paredes, C., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. The Unfinished Public Health Agenda of Chagas Disease in the Era of Globalization. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3, (7), e470 (2009).
  12. Teixeira, A. R. L., Vinaud, M., Castro, A. M. Emerging Chagas Disease. In: Chagas Disease: - A Global Health Problem. 3, Bentham Science Publishers. New York. Chapter 3 18-39 (2009).
  13. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infectious Diseases. 13, (4), 342-348 (2013).
  14. Teixeira, A. R. L., Hecht, M. M., Guimaro, M. C., Sousa, A. O., Nitz, N. Pathogenesis of Chagas Disease: Parasite Persistence and Autoimmunity. Clinical Microbiology Review. 24, (3), 592-630 (2011).
  15. Murcia, L., et al. Risk factors and primary prevention of congenital Chagas disease in a nonendemic country. Clinical Infectious Diseases. 56, (4), 496-502 (2013).
  16. Chagas, C. New human trypanosomiasis. Morphology and lifecycle of Schizotrypanum cruzi, the cause of a new human disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 1, 159 (1909).
  17. Vianna, G. Contribution to the study of the Pathology of Chagas disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 3, 276 (1911).
  18. Teixeira, A. R. L., Roters, F., Mott, K. E. Acute Chagas disease. Gazeta Médica da Bahia. 3, 176-186 (1970).
  19. Teixeira, A. R. L., et al. Prevention and Control of Chagas Disease – An Overview. International STD Research, Reviews. 7, (2), 1-15 (2018).
  20. Rios, A., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113, (1), 3-8 (2018).
  21. Lenzi, H. L., et al. Trypanosoma cruzi: compromise of reproductive system in acute murine infection. Acta Tropica. 71, (2), 117-129 (1998).
  22. Carvalho, L. O. P., et al. Trypanosoma cruzi and myoid cells from seminiferous tubules: Interaction and relation with fibrous components of extra cellular matrix in experimental Chagas’ disease. International Journal of Experimental Pathology. 90, (1), 52-57 (2009).
  23. Hecht, M. M., et al. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 12, e9181 (2010).
  24. Alarcon, M., et al. Presencia de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en el plasma seminal de ratones con infección aguda. Boletín Malariología y Salud Ambiental. 51, 237 (2011).
  25. Teixeira, A. R. L., et al. Trypanosoma cruzi in the Chicken Model: Chagas-Like Heart Disease in the Absence of Parasitism. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5, (3), e1000 (2011).
  26. Guimaro, M. C., et al. Inhibition of Autoimmune Chagas-Like Heart Disease by Bone Marrow Transplantation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, (12), e3384 (2014).
  27. Oliveira, C. I., et al. Leishmania braziliensis isolates differing at the genome level display distinctive features in BALB/c mice. Microbes and Infection. 6, (11), 977-984 (2004).
  28. Mendes, D. G., et al. Exposure to mixed asymptomatic infections with Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis and Leishmania chagasi in the human population of the greater Amazon. Tropical Medicine, International Health. 12, 629 (2007).
  29. Moser, D. R., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 27, (7), 1477-1482 (1989).
  30. Da Silva, A. R. Sexual transmission of Trypanosoma cruzi in mus musculus [MsD thesis]. University of Brasília. Brasília. Available from http://repositório.unb.br/handle/10482/14829 (2013).
  31. Ribeiro, M., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113, (1), 3-8 (2018).
  32. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172, (4379), 603-606 (1953).
  33. Burnet, F., Fenner, F. The production of Antibodies. MacMillan. Melbourne, Australia. (1949).
  34. Hasek, M. Parabiosis of birds during their embryonic development. Chekhoslovatskaia Biology. 2, (1), 29-31 (1953).
  35. Coura, J. R., Junqueira, A. C. V., Fernades, O., Valente, S. A., Miles, M. A. Emerging Chagas Disease in Amazonian Brazil. Trends Parasitology. Trends Parasitology. 18, (4), 171-176 (2002).
  36. Teixeira, A. R. L., et al. Emerging Chagas disease: Trophic network and cycle of transmission of Trypanosoma cruzi from palm trees in the Amazon. Emerging Infectious Diseases. 7, (1), 100112 (2001).
  37. Hazebroek, M., Dennert, R., Heymans, S. Idiopathic dilated cardiomyopathy: possible triggers and treatment strategies. Netherland Heart Journal. 20, (7-8), 332-335 (2012).
  38. Arimura, T., Hayashi, T., Kimura, A. Molecular etiology of idiopathic cardiomyopathy. Acta Myologica. 26, (3), 153-158 (2007).
  39. Dec, W. G., Fuster, V. Idiopathic Dilated Cardiomyopathy. New England Journal of Medicine. 33, 1564-1575 (1994).
  40. Niederkorn, J. Y. See no evil, hear no evil, do no evil: the lessons of immune privilege. Nature Immunology. 7, (4), 354-359 (2006).
  41. Smith, B. E., Braun, R. E. Germ cell migration across Sertoli cell tight junctions. Science. 338, (6118), 798-802 (2012).
  42. Garth, A., Wilbanks, J., Streilein, W. Fluids from immune privileged sites endow macrophages with the capacity to induce antigen-specific immune deviation via a mechanism involving transforming growth factor-β. European Journal of Immunology. 22, (4), 1031-1036 (1992).
  43. Meng, J., Anne, R., Greenlee, C., Taub, J., Braun, R. E. Sertoli Cell-Specific Deletion of the Androgen Receptor Compromises Testicular Immune Privilege in Mice. Biology of Reproduction. 85, (2), 254-260 (2011).
  44. Fujisaki, J., et al. In vivo imaging of Treg cells providing immune privilege to the haematopoietic stem-cell niche. Nature. 474, (7350), 216-219 (2011).
  45. Wood, K. J., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nature Review Immunology. 3, (3), 199-210 (2003).

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