마우스 췌 장 내 분 비 세포의 단일 셀 Transcriptomic 분석

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

단일 셀 RNA 시퀀싱 뒤 미 발달, 신생아 및 산 후 췌 내 분 비 세포의 격리 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법을 사용 하면 분석 췌 장 내 분 비 계보 개발의 셀이 transcriptomic 역학.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Li, L. C., Yu, X. X., Zhang, Y. W., Feng, Y., Qiu, W. L., Xu, C. R. Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells. J. Vis. Exp. (139), e58000, doi:10.3791/58000 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

독도에서 클러스터는 췌 장 내 분 비 세포는 혈액 포도 당 안정성과 에너지 대사 조절. 인슐린 분 비 하는 β 세포를 포함 하 여 독도에 뚜렷한 세포 유형 배아 단계에서 일반적인 내 분 비 창시자에서 구분 됩니다. 미 숙 내 분 비 세포는 세포 증식을 통해 확장 하 고 긴 출생 후 발달 기간 동안 성숙. 그러나, 이러한 프로세스를 기본 메커니즘 명확 하 게 정의 되지 않습니다. 단일 셀 RNA 시퀀싱은 뚜렷한 세포 인구와 추적 세포 계보 차별화 경로 특성에 대 한 유망한 접근 이다. 여기, 우리는 배아, 신생아 및 산 후 췌에서 고립 된 췌 장 β 세포의 단일 셀 RNA 시퀀싱에 대 한 메서드를 설명합니다.

Introduction

췌는 포유동물에 중요 한 변화 기관 이다. 췌 장 내 분 비와 외 분 비 구획 구성 됩니다. 췌 장 내 분 비 세포, 인슐린을 생산 하는 β 세포와 글 루카 곤 생성 α 세포를 포함 하 여 독도 Langerhans에 함께 클러스터링 하 고 전할 조직의 포도 당 항상성 조절. 내 분 비 세포의 기능 장애 결과 당뇨병 mellitus, 전세계 주요 공중 보건 문제가 되 고 있습니다.

췌 장 내 분 비 세포는 Ngn3에서 파생 된+ embryogenesis1동안 창시자. 나중에, perinatal 기간 동안 내 분 비 세포 증식 양식 미 성숙한 독도를. 이 미 성숙한 세포 개발 하 고 점차 성숙한 독도, 성인2혈액 포도 당 항상성 조절에 나가도록 풍부한 되는 계속.

비록 transcriptional 요인의 그룹 β 세포 분화를 조절 하는 발견 되었습니다, β 세포의 정확한 성숙 통로 아직 명확 하지 않습니다. 또한, β 세포 성숙 프로세스는 또한 셀 번호 확장3,4 의 규정 및 세포질이5,6세대 포함 한다. 그러나, 이러한 프로세스의 규제 메커니즘 하지 되었습니다 잘 공부 했습니다.

단일 셀 RNA 시퀀싱은 셀 부분 모집단을 프로 파일링 하 고 세포 계보 발달 경로7추적 수 있는 강력한 방법입니다. 이 기술, 단일 셀 레벨8에서 췌 장 섬 개발 중 발생 하는 이벤트를 해독 수 있습니다 키를 활용. 단일 셀 RNA 시퀀싱 프로토콜 중 스마트 seq2 향상 된 감도 정확도, 그리고 낮은 비용9표준 시 약의 사용 전장 cDNA의 생성을 허용 한다. 스마트 seq2 시퀀싱10cDNA 라이브러리를 만드는 데 약 2 일 소요 됩니다.

여기, 우리는 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)를 사용 하 여 성인 Ins1-RFP 유전자 변형 마우스11, 태아의 췌에서 형광 표시 된 β 세포의 격리 하는 방법을 제안 하 고 transcriptomic의 성능 분석에 스마트 seq2 기술 (그림 1)를 사용 하 여 단일 셀 수준입니다. 이 프로토콜은 일반, 병리학 및 노화 상태에서 각종 췌 장 내 분 비 세포의 transcriptomes 분석을 확장할 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 북경 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 췌 장 격리

  1. E17.5 (배아 일 17.5) 배아에 대 한:
    1. 질 플러그 나타나면 시간 포인트에 따라 배아 하루 0.5 예상.
    2. CO2 관리에 의해 임신 쥐를 희생. 스프레이 70% 알코올로 복 부 모피입니다.
    3. 갈비뼈에 확장 하는 생식 기 지역에서가 위로 V 자형 절 개를 확인 합니다. 이 프로세스는 완전히 복 부 구멍을 열립니다 합니다.
    4. 복 부 구멍에서 자 궁 해 부를 포함 하는 차가운 PBS 10 cm 접시에 넣습니다.
    5. 다른 조직, 태 반 및 탯 줄 등을 제거 하는 stereomicroscope 아래 얇은 밀고 집게와 자 궁에서 태아를 해 부. 차가운 PBS를 포함 하는 10 cm 접시에 모든 배아를 배치 합니다.
    6. 태아의 복 부 구멍을 열고 눈물 고 팔꿈치 핀셋으로 내장 조직에 밖으로 파고. 내장 조직 차가운 PBS를 포함 하는 6 cm 블랙 하단 접시에 전송 합니다.
    7. 췌 장 부분 복 부의 왼쪽 상단에 있으며, 위, 비장, 십이지 장 ( 그림 2A에서 노란색 점선)12에. 집게를 사용 하 여 내장 조직에서 췌를 분리 하 고 0.5 mg/mL 차가운 콜라 솔루션의 5 mL를 포함 하는 20 mL 유리병으로 췌 장 조직 함께 수영장: 0.5 mg/mL 콜라 P 절연 버퍼 (HBSS 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2 를 포함 하 5 mM 포도 당, pH 7.4).
  2. P0-P15 (출생 후 하루 0-15) 마우스:
    1. 희생 하 고 벤치탑 보호 테이프의 조각에 사지를 준수 하 여 마우스를 해결. 스프레이 70% 알코올로 복 부 모피입니다.
    2. 1.1.3 단계에서 설명한 대로 완전히 복 부 구멍을 엽니다. 마우스의 왼쪽을 밖으로 창 자를 당겨. 이 절차는 췌 십이지 장, 위, 및 비장 돌출부를 노출 합니다. 신중 하 게 해 부 췌 (그림 2B)12 의 모든 엽 고 0.5 mg/mL 차가운 콜라 솔루션의 5 mL를 포함 하는 20 mL 유리병으로 췌 장 조직 함께 수영장.
  3. P18-P60 (출생 후 하루 18-60) 마우스:
    1. 콜라 솔루션을 준비 합니다. 사용할 준비까지 얼음에 계속.
    2. 마우스를 희생 하 고 (단계 1.1.2와 1.1.3) 위에서 언급 한 복 부 구멍을 엽니다.
      참고: 간 다치게 하지 않아, 간 어떤 상처에 담 즙 덕트 흐름 압력을 감소 다음 단계의 관류 효율성을 줄일 것 이다.
    3. 칼을 제거 합니다. 마우스의 오른쪽을 창 밖으로 당겨 그리고 쓸 개 ( 그림 2C에서 흰색 화살표) 및 일반적인 담 관을 노출 하는 각 측에의 왼쪽 및 오른쪽 중간 엽 밀어.
    4. 측면에 서는 담 관 십이지 장 (그림 2D)를 입력 하는 사이트는 위와 더 낮은 위치에서 작은 선박 클램프의 쌍으로 십이지 장을 클램프.
      참고: 췌 장의 위 또는 비장 돌출부 클램프 하지 마십시오. 콜라 솔루션 하지 고정 하는 경우 다음 단계에서 췌의 위장과 비장 엽으로 흐르게 됩니다.
    5. 0.5 mg/mL 차가운 콜라 솔루션의 5 mL을 주사기를 쓸 개에 30g 바늘을 삽입. 신중 하 고 원활 하 게, 일반적인 담 관을 통해 바늘을 조작 합니다.
    6. 마우스의 크기에 따라 0.5 mg/mL 차가운 콜라 솔루션의 1-5 mL를 주입 하 여 췌 장 perfuse. 주사는 느리고 지속적인 덕트에서 미 끄 러에서 바늘을 방지 하 고 높은 액체 압력 파열에서 소장을 방지 해야 합니다. 주사는 췌 완전히 확장 완료 됩니다.
    7. 재 관류 후 즉시 집게를 사용 하 여 복 부 구멍에서 췌 장 (노란 점선 그림2d에서)를 해 부. 장소 20 mL 유리병 0.5 mg/mL 차가운 콜라 솔루션의 5 mL를 포함 하는 조직. 한 번에 둘 이상의 마우스를 조작, 마우스 하나를 perfuse 하 고 모든 마우스 해 부 될 때까지 20 mL 유리병에 차가운 콜라 솔루션으로 조직 수영장.

2. 콜라 소화와 섬 고립

  1. 37 ° C 물 목욕으로 췌 장 조직을 포함 하는 20 mL 유리병 장소와 온도 equilibrate를 3 분 동안 품 어.
  2. 부드럽게 다른 3 ~ 5 분에 대 한 튜브를 흔들. 경우 췌 장 조직을 완벽 하 게 비정상적으로 증가, 그것은 마지막으로 균일 하 게 분산 때까지 작은 조직 조각으로 점차적으로 해리 됩니다. 소화 시간은 췌 크기와 관류 효율에 따라 달라 집니다.
  3. 새로운 50 mL 원심 분리기 관으로 0.25 m m 나일론 여과기를 통해 소화 제품을 필터링 합니다. 철저 하 게 얼음 처럼 차가운 PBS를 포함 20 mL 주사기를 사용 하 여 여과기 세척.
  4. E17.5 P15 췌 위해 3.1 단계로 건너뜁니다.
  5. P18-P60 췌, 1 분 동안 200 x g 에서 원심 및 삭제는 상쾌한. 다시 차가운 PBS와 조직을 일시 중단 합니다.
  6. 6 cm 블랙 하단 접시에 조직 서 스 펜 션의 5 mL를 붓으십시오. 췌 장 독도 작은, 소형, 유백색 백색 구조 이며 포상 조직을 느슨하게 하 고 반투명 화이트. 독도와 200 μ 피 펫을 선택 하 고 차가운 PBS의 작은 금액을 포함 하는 1.5 mL 튜브에 그들을 전송.

3. 췌 장 조직이 나 독도의 트립 신 소화

  1. 원심 관 췌 장 조직이 나 200 x g 4 ° C에서 1 분 동안에 독도 포함 하 고는 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 삭제.
  2. 다시 0.25 %trypsin-EDTA와 펠 릿을 일시 중단 하 고 37 ° C 물 욕조에 품 어. 외피의 4 분 후 부드럽게 및 가끔 1 분 200 μ 팁을 사용 하 여 (피 펫)을 발음.
    참고: E17.5 P3 췌, 1 mL 트립 신-EDTA 추가. P4-P15 췌 3 mL 트립 신-EDTA를 추가 합니다. 100-300 독도 대 한 트립 신-EDTA 1 mL를 추가 합니다. 트립 신-EDTA 조직의 양에 따라의 볼륨을 조정 합니다.
  3. 0.4 x 양의 찬 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 추가 하 여 소화를 중지 하 고 부드러운 소용돌이 의해 혼합.
  4. 4 ° c.에 3 분 동안 250 x g 에서 원심 분리기 펠 릿을 방해 하지 않고는 상쾌한을 버리십시오.
  5. 다시 200 μ 차가운 FACS 버퍼와 셀을 일시 중단 (HBSS 포함 하는 1 %FBS, pH 7.4). 5 mL FACS 튜브에 세포를 전송.
  6. 신속 하 게 세포 현 탁 액 소화 되지 않은 큰 조직 파편을 제거 하는 필터를 통해 전달할 수 있도록 FACS 튜브를 회전 합니다. 단일 셀 서 스 펜 션 튜브에서는 이제 FACS 정렬에 대 한 준비가 되었습니다.

4. 단일 세포 세포의 용 해

  1. 세포 세포의 용 해 버퍼를 준비 합니다.
    참고: 층 류와 UV 소독 후드 아래 모든 실험을 수행 합니다. 모든 튜브, 접시와 피 펫 팁 해야 RNase-DNase 무료 /. 후드와 사용 하기 전에 RNase 멀리 솔루션 펫 오염을.
    1. 얼음에 시 약을 녹여: dNTP (10 m m), 올리고 dT 프라이 머 (10 μ M), 및 ERCC 재고 솔루션 (1:20).
    2. 1:5 x 10 ERCC 희석 nuclease 무료 물5 .
    3. 필요한 세포 세포의 용 해 버퍼의 볼륨을 계산 합니다. RNase 억제제 (40 U/μ), 0.2% (vol/vol) 트라이 톤 X-100, dNTP, 올리고 dT 뇌관의 1 μ의 각 셀에 대 한 4.05 μ의 최종 볼륨을 희석된 ERCC의 0.05 μ 1 μ의 1.9 μ의 0.1 μ를 추가 합니다.
    4. 약 0.2 mL 얇은 8-스트라이프 PCR 튜브 또는 96 잘 접시에 세포 세포의 용 해 버퍼 수. 원심 관 또는 30 접시 4 ° c.에 s
      참고: x g 및 다음 단계에서 800 x g에서 96 잘 접시 7500에서 0.2 mL 얇은 8-스트라이프 PCR 튜브 원심.
  2. 단일 셀 따기 그리고 세포입니다.
    1. 수동으로 선택 FACS 8 스트립 PCR 튜브는 30-40 µ m 모 세관 피 펫를 사용 하 여 Ins1-RFP+ FACS 버퍼에 단일 셀을 정렬 하거나 직접 96 잘 접시로 Ins1-RFP+ 단일 셀을 정렬 합니다. 단일 셀을 포함 하는 볼륨 미만 0.3 μ 간주 됩니다.
      참고: 사용 하 여 앞으로 살포 높이 (FSC-H) vs 분산형 영역 (FSC-A) 남자 용 상의 차별에 대 한 제어 전략, FSC-H 대 측 분산형 지역 파편 및 형광 Ins1-RFP+ 셀 (그림 3A-3C) 정렬을 위한 게이팅 (SSC A). 채집 방법에 대 한 300 μ FACS 버퍼를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 대상 셀을 정렬 합니다. 적절 한 최종 농도 5-10 셀/μ. 따라 버퍼 볼륨을 조정 합니다. 플레이트 수집 방법에 대 한 악기의 설명서에 따라 96 잘 접시의 각 음에 단일 셀을 정렬 합니다. 7 , 13
    2. 소용돌이 관 또는 세포를 lyse RNA를 분리 하는 접시. 원심 관 또는 30 접시 s 4 ° C에서 그리고 즉시 얼음에 그들을 배치.
      참고: 셀 저장할 수 있습니다-80 ° C에 1 주일에 대 한.

5. 단일 셀 cDNA 증폭

  1. 반전 녹음 방송 (실시간)
    1. RT 시 약 (표 1) 얼음에 녹여
    2. 3 분 동안 72 ° C에서 샘플을 품 어 및 즉시 넣어 튜브 또는 적어도 1 분에 대 한 얼음에 플레이트 짧게 원심 튜브 또는 30 접시 4 ° c.에 s
      참고: 사용 하 여 105 ° C가 열 뚜껑 열 cycler 모든 외피.
    3. 표 1에 설명 된 대로 모든 반응에 대 한 실시간 믹스를 준비 합니다.
    4. 10 μ의 총 볼륨을가지고 각 샘플에 실시간 믹스의 5.7 μ 분배. 부드럽게 소용돌이 믹스와 30에 대 한 원심 분리기 4 ° c.에 s
    5. 샘플 열 cycler에 놓고 다음과 같은 실시간 프로그램을 시작: 90 분, 10 주기 (2 분, 2 분 동안 42 ° C 50 ° C), 42 ° C 15 분 및 4 ° c.에 보류에 대 한 70 ° C
  2. PCR의 사전 증폭
    1. PCR 시 약 (표 2) 얼음에 녹여
    2. 표 2에 설명 된 대로 모든 반응에 대 한 PCR 믹스를 준비 합니다.
    3. 첫 번째 가닥 반응을 포함 하는 각 샘플을 PCR 혼합의 15 μ 분배. 부드럽게 소용돌이 믹스와 30에 대 한 원심 분리기 4 ° c.에 s
    4. 샘플 열 cycler에 놓고 다음 PCR 프로그램 시작: 3 분, 18 주기 98 ° C (20 98 ° C s, 67 ° C 15에 대 한 s, 6 분 동안 72 ° C), 72 ° C 5 분 및 4 ° c.에서 개최
      참고: PCR 제품 1 주일 미만 4 ° C에 또는에서-20 ° C /-80 ° C 최대 6 개월까지 저장할 수 있습니다.
  3. PCR 정화입니다.
    1. 소용돌이 의해 잘 혼합 하 고 이전 단계에서 각 샘플을 다시 일시 중단 된 DNA 정화 구슬 (1x)의 25 μ를 추가 합니다. 다음, 신속 하 게 튜브 또는 액체를 수집 하지만 구슬의 타협을 방지를 위해 상 온에서 판 스핀.
      참고: 15 분을 사용 하기 전에 철저 하 게 소용돌이 실내 온도에 DNA 정화 구슬 Equilibrate.
    2. 실 온에서 5 분 동안 품 어.
    3. 튜브 또는 자기 접시에 적절 한 해결책은 때까지 서 서 다음 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
    4. 마그네틱 스탠드에 있는 동안 구슬 씻어 갓된 80% 에탄올의 200 μ 추가, 30 품 어 s, 다음 신중 하 게 제거 하 고 에탄올 솔루션 삭제.
      참고: 80% (vol/vol) 에탄올 솔루션 준비 되어야 한다 갓 각 시간.
    5. 2 세척 총 5.3.4 단계를 반복 합니다.
    6. 조심 스럽게 제거 하 고 나머지 삭제 또는 플레이트 마그네틱 스탠드에는 에탄올 솔루션 및 공기 건조 튜브 동안 구슬.
      참고: 최대 차입 효율성을 지키는 구슬 지나치게 건조 하지 마십시오.
    7. 구슬에서 DNA 대상 elute 하는 소용돌이 의해 잘 혼합 nuclease 무료 물 11 μ를 추가 합니다. 다음, 신속 하 게 튜브 또는 격판덮개 회전 고 마그네틱 스탠드에 배치 하는 때까지 솔루션은 분명 하다. 새로운 PCR 튜브에 샘플의 10 μ를 전송.
      참고: 경우 이합체 cDNA 크기 분포 감지에 따라 정화의 단일 라운드는 이합체를 완전히 제거 하려면 다시 정화. 샘플에 남아 허용 하는 경우는 이합체 cDNA 수율 계산을 좌우할 수 있다.
  4. CDNA의 품질 확인 합니다.
    1. 임의로 샘플 cDNA 총 수확량은 fluorometer를 사용 하 여 검색을 선택 합니다.
    2. 실시간 PCR (정량) (그림 4E)에 의해 마커 유전자 표현 레벨을 평가 합니다. 40 배 희석 하 여 샘플을 정량 384-잘 접시를 사용 하 여 수행의 1 μ를 제거 합니다. 표 3에 설명 된 대로 정량 믹스를 준비 합니다. 사이클링 조건: 10 분, 45 주기 동안 95 ° C (95 ° C 10 s, 15에 대 한 60 ° C s, 72 ° C 15 s).
    3. 임의로 샘플 악기를 병렬 모 세관 전기 이동 법을 사용 하 여 크기 분포를 검색을 선택 합니다.

6입니다. cDNA 도서관 건축

  1. Tagmentation Tn5 transposase에 의해 반응입니다.
    1. 검색 단계는 fluorometer를 사용 하 여 5.4.2에서 정량-선택한 셀의 cDNA 총 수익률. 시작 물자로 cDNA의 사용 2 ng.
    2. Tagmentation 반응 시 약 (표 4) 얼음에 녹여
    3. 0.2 mL 얇은 8-스트라이프 PCR 튜브, 표 4에 설명 된 대로 tagmentation 반응 준비 하 고 신중 하 게 소용돌이 의해 혼합. 다음, 신속 하 게 상 온에서 솔루션 아래로 회전 합니다.
    4. 10 분 동안 55 ° C에서 샘플을 품 어와 4 ° c.에서 개최
    5. 즉시 tagmented 반응을 중지 하는 DNA를 포함 하는 각 샘플을 5 x TS의 2 μ를 추가 합니다. 소용돌이에 의해 신중 하 게 혼합 하 고 스핀 실 온에서 솔루션 다운 신속 하 게.
    6. 실 온에서 5 분을 위한 혼합물을 품 어. DNA는 최종 농축 PCR 즉시 처리 해야 합니다.
  2. 어댑터 출혈 조각 증폭
    1. PCR 시 약 (표 5) 얼음에 녹여
    2. 표 5에 설명 된 대로, 농축 PCR 믹스를 준비 하 고 소용돌이 의해 신중 하 게 혼합. 다음, 신속 하 게 상 온에서 솔루션 아래로 회전 합니다.
    3. 다음 프로그램을 사용 하 여 PCR을 수행: 72 ° C 10 분, 30 대 98 ° C에 대 한 s, 8 사이클 (15 98 ° C s, 60 ° C 30에 대 한 s, 3 분 동안 72 ° C), 72 ° C 5 분 및 4 ° c.에서 개최
      참고: 주기 수 예상된 라이브러리 DNA 금액에 따라 달라 집니다.
  3. 크기 선택과 PCR 정화입니다.
    1. 소용돌이 의해 잘 혼합 하 고 이전 단계에서 각 샘플을 다시 일시 중단 된 DNA 정화 구슬 (0.7 x)의 14 μ를 추가 합니다. 다음, 신속 하 게 액체를 수집 하지만 구슬의 타협을 방지를 위해 상 온에서 관 회전.
      참고: 15 분을 사용 하기 전에 철저 하 게 소용돌이 실내 온도에 DNA 정화 구슬 Equilibrate.
    2. 실 온에서 5 분 동안 품 어.
    3. 튜브 적절 한 마그네틱 스탠드에 솔루션은 분명 때까지, 신중 하 게 새로운 튜브 스트립에는 상쾌한 전송 놓고 이전 튜브 스트라이프를 삭제 합니다.
    4. 다시 일시 중단 된 DNA 정화 구슬의 3 μ 추가 (0.15 x) 각 샘플 튜브 스트라이프에 소용돌이 의해 잘 혼합. 다음, 신속 하 게 상 온에서 관 회전.
    5. 실 온에서 5 분 동안 품 어.
    6. 튜브 또는 자기 접시에 적절 한 해결책은 때까지 서 서 다음 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
    7. 마그네틱 스탠드에 있는 동안 구슬 씻어 갓된 80% 에탄올의 200 μ 추가, 30 품 어 s, 다음 신중 하 게 제거 하 고 에탄올 솔루션 삭제.
      참고: 80% (vol/vol) 에탄올 솔루션 준비 되어야 한다 갓 각 시간.
    8. 2 세척 총 6.3.7 단계를 반복 합니다.
    9. 조심 스럽게 제거 하 고 나머지 삭제 또는 플레이트 마그네틱 스탠드에는 에탄올 솔루션 및 공기 건조 튜브 동안 구슬.
      참고: 최대 차입 효율성을 지키는 구슬 지나치게 건조 하지 마십시오.
    10. 구슬에서 DNA 대상 elute 하는 소용돌이 의해 잘 혼합 nuclease 무료 물 11 μ를 추가 합니다. 다음, 신속 하 게 튜브 또는 격판덮개 회전 고 마그네틱 스탠드에 배치 하는 때까지 솔루션은 분명 하다. 새로운 튜브 스트라이프에 샘플의 10 μ를 전송.
  4. 최종 cDNA 라이브러리의 품질 확인 합니다.
    1. fluorometer을 사용 하 여 각 라이브러리의 농도 측정 하 고 병렬 모 세관 전기 이동 법 악기를 사용 하 여 크기 분포를 확인 합니다.
      참고: DNA 수율은 일반적으로 각 라이브러리에 대 한 15-25 ng 사이. 250에서 배열 하는 조각 450에 혈압 혈압 관찰 될 것 이다. 이합체 정화, 후 그대로 크기 분포 검사에 의해 확인, 만약 한 번 더 DNA 정화 구슬 x 1와 정화.
  5. 라이브러리 풀링
    1. 대략 조각 크기, 그들 중 누구도 같은 조합의 N6XX 및 N8XX 어댑터를 포함 하는 보장 하는 각 샘플에서 DNA의 수영장 동일 금액을 기반으로 합니다.

7. DNA 시퀀싱

  1. 높은 처리량 시퀀싱 시스템을 사용 하 여 51 bp 일자형 연속을 주제 바코드 라이브러리. 제조 업체의 프로토콜에 따라 시퀀싱을 수행 합니다. 각 셀의 시퀀싱 깊이 약 1 백만 읽고 평균8, 적어도 0.5 백만 셀14당 읽습니다.

8. 생물 정보학 분석

  1. 시퀀싱 품질 평가 및 정렬.
    1. 다음 매개 변수 FastQC (v0.11.3)15 를 사용 하 여 시퀀스 된 읽기의 품질 평가: "fastqc-추출-o output_dir input_fastq".
    2. ERCC 시퀀스는 명령을 사용 하 여 마우스 게놈 병합 "mm10.fa ERCC.fa 고양이 > mm10_ERCC.fa".
    3. 빌드 bowtie2 (v2.2.5)16 인덱스 다음 매개 변수: "bowtie2-빌드 mm10_ERCC.fa mm10_ERCC".
    4. Tophat2를 사용 하 여 읽기 정렬 (v2.1.0)17 다음 매개 변수: "tophat2-o output_dir-G gene.gtf-transcriptome 색인 trans_index mm10_ERCC input_fastq".
  2. 유전자 표현 레벨을 계량.
    1. 수 매핑된 매개 변수가 HTSeq (v 0.6.0)18 를 사용 하 여 각 유전자에 대 한 읽기: ' htseq-카운트-f bam-r pos-s-a 30 accepted_hits.bam gene.gtf > read_count.txt '.
    2. 진 식 레벨 백만 (TPM)19당 성적을 정상화.
  3. 셀의 품질 관리
    1. 미만 0.5 백만 매핑된 읽기 또는 미만 4000 유전자를 가진 세포를 제외 (TPM > 1).
      참고: 제외 기준 셀 유형 및 시퀀스 깊이에 따라 달라 집니다.
    2. 내 분 비 마커 ( Gcg α 세포, β 세포에 대 한예를 들어, Ins1 )에 게, 표현 하는 세포를 유지 하 고 비 내 분 비 마커 (백혈구에 대 한예를 들어, Spi1 )를 표현 하는 셀을 제외 합니다.
  4. 주성분 분석 (PCA)
    1. 앞에서 설명한20ERCC 스파이크 기능에 따라 매우 변수 유전자를 식별 합니다.
    2. PCA "PCA" r에서와 FactoMineR (v1.31.4)21, 패키지 기능을 사용 하 여 수행 log2(TPM + 0.1) 높은 변수 유전자의.
    3. Ggplot2와 PCA 결과 시각화 (v2.0.0)22.
  5. 계층적 클러스터링입니다.
    1. FactoMineR (v1.31.4)21"dimdesc" 기능을 사용 하 여 가장 높은 주성분 (PC) 선적으로 유전자를 식별 합니다.
    2. Log2 함수 R 패키지 gplots (v3.0.1)23, "heatmap.2"를 사용 하 여 계층적 클러스터링 수행 (TPM + 1) 유전자를 로드 하는 높은 PC의 상대 값.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

췌 미 발달, 신생아 및 산 후 마우스에서 해 부 했다 (그림 2A 2B). 쥐 출생 후 하루 18 보다 더 오래 된, 대 한 소화 효과 관류;의 정도에 따라 달라 집니다. 따라서, 주사 섬 격리에 대 한 가장 중요 한 단계는 (그림 2C-2E표 6). 이 단계 동안 췌를 채울 수 있어서 많은 콜라 주입 했다. 완전히 비정상적된 췌 2D 그림에에서 표시 됩니다. 경우는 관류 성공 (그림 2E), 하지만 샘플은 소중한 췌 나중에 충분 한 소화를 위한 작은 조각으로 찢 겨 수 있습니다.

관류, 후 췌 장 조직 독도 (그림 2F) 출시를 작은 조각으로 소화 했다. FACS 정렬 시간 단축, 우리는 독도 미리 선택 하 여 내 분 비 세포를 농축. 독도의 크기는 마우스 연령과 소화 강도 따라 달라질 수 있습니다. 때때로,는 독도 모양에서 라운드 되지 않습니다. 독도 색상과 소형 상태 (그림 2G표 6)에 따라 선택 되어야 합니다. 유전자 변형 마우스 스트레인은 GFP 등 내 분 비 세포에 대 한 RFP 기자 진 경우는 독도 수 또한 형광 현미경 선택 됩니다.

Ins1-RFP+ 세포 (그림 3A-3 C) 분류, FACS에 의해 순화 했다 하 고 단일 셀 모 세관 피 펫을 사용 하 여 단일 셀 RNA-seq (그림 3D)에 대 한 선택 했다. 성공적으로 증폭 된 cDNA 전장 500 위에 있어야 혈압 1.5 kb에서 2 kb로 농축 되 고. 또한, 일반적으로 인슐린 성적표 (그림 4A) 나타내는 수 있습니다 Ins1-RFP+ 세포에서 관찰 된 cDNA의 500-600 bp 농축이입니다. 그러나, 일부 비정상적인 상황 관찰된10 (표 6) 되었습니다. 예를 들어 cDNA 조각 100에 가까운 혈압은 뇌관 이합체 (그림 4B)는 일반적으로 DNA 정화 단계를 반복 하 여 제거 해야 하는 과도 한 뇌관에 의해 발생. 뇌관 이합체의 존재 다음 도서관 건축을 위해 사용 되는 전체 cDNA 수익률의 계산에 영향을 미칠 수 있습니다. 100 사이 cDNA 조각 bp 및 500 bp 보통 대표 저하 RNase 오염 등 나쁜 세포 상태 또는 시 약 문제에 의해 발생 하는 cDNA (그림 4C). 이 조건 하에서 DNA 저하의 원인을 파악 하 고 소요를 제외 해야 합니다. 예를 들어, 좋은 셀 상태를 보장 하기 위해, 조직을 소화 해야 하 고 신속 하 고 부드럽게, 셀 정렬 되어야 작업을 모든 종류의 오염 물질을 피하기 위해 신중 하 게 수행 되어야 합니다.

시퀀싱에 대 한 cDNA 라이브러리의 정화 후 우리는 샘플을 DNA 정화 구슬의 다른 비율을 추가 하기 위한 지침에 따라 다양 한 크기의 cDNA 조각을 얻었다. 예를 들어 우리가 250에서 배열 하는 cDNA를 얻을 수 있습니다 혈압 450 추가 0.7 x와 첫 번째 DNA 정화 구슬 x 0.15 bp와 두 번째 라운드 정화, 각각 (그림 4D). 이 단계는 높은 성공 비율이 있다. 그러나, 약 100의 조각이 있다면 혈압, 이합체 (표 6) 제거 하려면 DNA 정화 구슬 x 1으로 다시 라이브러리를 순화 하는 것이 좋습니다. Unremoved 이합체 DNA 정량화를 기울일 것 이다 고 각 샘플에서 고르지 못한 데이터 수집에는 샘플 풀링 결과 좌우할 것 이다.

우리는 생물 정보학 접근법 (그림 5A)과 시퀀싱 데이터를 분석. 시퀀싱 품질 평가 점수는 품질 평가 (그림 5B)을 시퀀싱 하는 동안 30 보다 큰 해야 합니다. 맞춤 후 읽기의 80-90% 참조 게놈에 매핑될 것 예상 된다. 다운스트림 분석에 대 한 고품질의 세포를, 우리 미만 0.5 백만 매핑된 읽기로 셀 제외 또는 4000 미만으로 검출 유전자 (그림 5C 5d). PCA와 계층적 클러스터링, 후 우리와 다른 그룹8heterogeneously 표현 했다 유전자 확인 셀의 다른 그룹 특징.

Figure 1
그림 1: 단일 셀 마우스 췌 장 내 분 비 세포의 RNA-seq 도식 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 췌 장 해 부, 관류 및 섬 따기. (A) E17.5 배아 (위)에서 (더 낮은) 배아 췌 장 조직의 해 부. 노란 점선 정하는 췌 장 조직. 눈금 막대 = 1000 µ m. (B) P10 마우스 (왼쪽)에서 (오른쪽) 산 후 췌 장 조직의 해 부. 눈금 막대 = 1000 µ m. (C D) (C) 전에 P60 마우스의 췌 장 조직 및 (D) 재 관류 후. 노란 점선 정하는 췌 장 조직. 흰색 화살표 쓸 개를 나타냅니다. (E) P60 마우스의 부분적으로 perfused 췌 장 조직. 빨간색 화살표는 췌 장의 잘 perfused 영역을 나타냅니다. 파란색 화살표는 췌의 저조한 perfused 영역을 나타냅니다. (F)는 췌 장 조직 (위)에 전에 전후 (낮은) 콜라 소화. (G) 화살표 콜라 소화 췌 장 조직에서 발표 되었던 독도 가리킵니다. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 30-40 µ m 모 세관 피펫은 현미경으로 세포를 수동으로 따기. (A C) 단계별 FACS 게이팅 Ins1-RFP+ 셀을 정렬. (D)는 밝은 동그라미 표시 셀 이며 튜브 모 세관 피 펫. 더 나은 형태 (화살표) 셀을 선택 하 고 클러스터 셀 (화살촉)를 무시 한다. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 품질 탐지 악기를 병렬 모 세관 전기 이동 법에 의해 Ins1-RFP+ 세포의 cDNA 및 라이브러리 크기 분포의. 성공적으로 미리 증폭 된 cDNA의 결과 (A) 대표. 일반적으로, cDNA 프로필 500 이상 이어야 한다 ~1.5–2 kb 피크와 혈압. (B) 뇌관 이합체 피크 미리 증폭 된 cDNA의 대표적인 결과. 뇌관 이합체 피크는 약 100 100 사이 bp. (C) 파편 중 증폭 된 cDNA의 프로필 bp 및 500 bp cDNA 저하의 가능성을 나타냅니다. (D) cDNA의 크기 분포 라이브러리 250 사이 혈압과 450 bp 다음이이 프로토콜에서 언급 된 정화 단계. (E) 식 정량 (왼쪽)와 상대 cDNA 라이브러리에서 Ins2 의 수준을 시퀀싱 데이터 (오른쪽). x-axes 고유 8 단일 셀 샘플을 나타냅니다. Y 축 (왼쪽) Gapdh (CtGapdh-CtIns2 + 6)를 기준으로 정규화 ΔCt을 나타내고 y 축 (오른쪽) Ins2 Gapdh (로그2(TPM 기준의 표준화 된 식 수준 Ins2 / TPMGapdh)). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 단일 셀 transcriptome 데이터의 생물 정보학 분석. (A)의 생물 정보학 분석 파이프라인. (B) 읽기의 모든 기지를 통해 품질 평가 점수를 시퀀싱. (C) 매핑된 읽기 수의 분포. (D) 검색 된 유전자 수의 분포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

구성 요소 볼륨 (µ L)
역전사 (200 U / µ L) 0.5
RNase 억제제 0.25
첫 번째 가닥 버퍼 (5 배) 2
DTT (100 mM) 0.5
Betaine (5m) 2
MgCl2 (1m) 0.06
TSO (100 Μ M) 0.1
Nuclease 무료 물 0.29
5.7

표 1: RT 시 약 5.7 µ L 반응 각 샘플에 대 한 구성 요소를 믹스.

구성 요소 볼륨 (µ L)
첫번째 물가 반응 10
DNA 중 합 효소 (2 x ReadyMix) 12.5
PCR 뇌관 (10 µ M)은 0.25
Nuclease 무료 물 2 월 25 일
25

표 2: PCR 사전 증폭 시 약 혼합 25 µ L 반응 각 샘플에 대 한 구성 요소

구성 요소 볼륨 (µ L)
SYBR 녹색 마스터 믹스 5
뇌관 (5 µ M) 0.5
Nuclease 무료 물 2.5
cDNA 2
10

표 3: 정량 Pcr 시 약 10 µ L 반응 표준 384-잘 접시를 사용 하 여 구성 요소를 믹스.

구성 요소 볼륨 (µ L)
5 x TTBL 1.6
2 ng cDNA 변수
ddH2O 변수
마주 믹스 V5 2
8

표 4: Tagmentation 시 약 각 샘플에 대 한 8 µ L 반응에서 구성 요소를 믹스.

구성 요소 볼륨 (µ L)
ddH2O 1.6
이전 단계의 제품 10
5 탭 x 4
N6XX 2
N8XX 2
0.4
20

표 5: 농축 PCR 시 약 믹스 구성 요소 20 µ L 각 샘플에 대 한 반응에.

단계 문제 가능성 솔루션
1.3.4 클램프의 미 끄 러 내장의 외부 표면은 젖은 작은 양의 중간 collegenase 및 leakness의 존재에 의해 발생 부드럽게 십이지 장 벽과 면봉과 복 부 구멍에 있는 다른 기관 벽을 교환
1.3.6 내장 파열 소장 액체 압력 너무 높습니다. 사출 속도 느리게
2.6 독도 따기 때 독도 외 분 비 조직에 충실 Insufficent 소화 소화 기간과 강도 떨고 연장
5.3 PCR 확대 후 cDNA 항복이 낮습니다. 나쁜 상태에 있는 셀 신선 하 고 좋은 상태에서 세포를 유지
5.4 또는 6.4 뇌관 이합체를 볼 수 있다 과도 한 프라이 머 정화는 cDNA DNA 정화 구슬 (0.8:1 또는 1:1 비율)을 한 번 더
5.4 PCR 확대 후 저하 된 cDNA 셀 이나 오염 된 시 약의 품질 좋은 조건에서 세포를 유지 또는 시 약 변경
6.3 DNA의 양이 낮은 도서관 건설 후 너무 몇 PCR 주기 또는 cDNA의 품질은 좋지 않다 사이클의 수를 증가 또는 cDNA 도서관 건축 하기 전에 품질을 보장

표 6: 문제 해결.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

이 프로토콜에서 우리는 췌 장 β 세포의 단일 셀 식 프로필 공부에 대 한 효과적이 고 사용 하기 쉬운 방법 시연. 배아, 신생아 및 산 후 췌 내 분 비 세포를 분리 하 고 단일 셀 transcriptomic 분석을 수행 하려면이 메서드를 사용할 수 있습니다.

가장 중요 한 단계 좋은 조건에서 단일 β 세포의 고립입니다. 완전히 끼얹는다 췌 후속 소화에 더 나은 응답합니다. 일반적으로 등 쪽 췌 장에서 발생, 부족 한 관류 낮은 섬 항복 발생 합니다. 관류, 후 소화 시간과 강도 떨고 특별 한 주의 필요로 합니다. -소화, 긴 외피 시간에서 그리고 활기찬 떨고, 조각으로는 독도 끊을 수 있다. 부족 한 소화는 완전히 인접 조직에서는 독도 분리 하지 것입니다. 췌 장의 소화, 후에 독도 손 따기 보다는 조밀도 기온 변화도 원심 분리에 의해 정화 되었다. 밀도 그라데이션 원심 독도 풍요롭게 수 있습니다, 비록 많은 작은 독도 또는 포상 조직으로 연결 하는 독도 실수로 삭제 됩니다. 따기 포상 조직, 비효율적인 트립 신 소화를 발생할 수 있습니다 고 순도 β 세포의 감소를 방지 하려고 합니다.

독립적인 생물 복제는 생물학적 다양성 및 일괄 처리 효과 구별을 위한 필요 합니다. 2 생물 복제 하는 경우 PCA에는 비슷한 패턴을가지고 결과 클러스터링에 비슷한 하위 그룹을 포함,이 샘플 신뢰할 수 있는 생물 학적 변화를 공개 수 있습니다. 그렇지 않으면, 추가 생물 복제 결과 확인 해야 합니다. 췌 장 같은 대사 기관에 대 한 circadian 시계24 와 관련 된 셀 상태 일괄 차이 대 한 계정 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 하루 중 같은 시간에 모든 샘플을 수집 하는 것이 좋습니다.

이 방법의 제한 때문에 우리는 각 셀에 대 한 라이브러리를 생성 하는 낮은 처리량입니다. 반응에 과도 한 뇌관으로 cDNA 도서관 건설 전후 일반적으로 해야 될 정화 뇌관 이합체를 완전히 제거 하려면 두 번. 이 프로세스는 시간이 많이 소요 됩니다. 최근에, 수정 된 프로토콜25 어느 정도이 문제를 해결할 수 있는 보고 되었다. 이 프로토콜에서 셀 전용 바코드 반전 녹음 방송 단계 cDNA 파편을 라벨. 따라서, 각 셀의 cDNA 함께 풀링된 수 있습니다 및 다음 정화, 도서관 건축에 의해 따라. 이 수정 상당히 도서관 건축의 처리량을 증가 시킵니다. 그러나,이 수정된 방법은 덜 민감한 이며 셀 당 적은 유전자를 감지. 또한,이 방식은 3' 감소 읽기 범위와 메서드를 계산 합니다. 따라서, 스마트 seq2 여전히 췌 장 개발에 대 한 가장 적합 한 방법입니다.

다른 종에서 췌 장의 준비 다를 수 있습니다. 인간의 췌에서 독도 이전 프로토콜26,27다음 격리 될 수 있습니다. 그리고 고립 된 독도 단일 셀28 으로 해리 될 수 있습니다이 메서드를 사용 하 여 단일 세포 분석을 수행 합니다. 이 메서드는 포유류 췌 장의 개발, 질병 및 중생의 연구에 널리 적용할 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

우리는 생명 과학 컴퓨팅 플랫폼에 대 한 단백질 과학, 베이징 (북경 대학) 및 북경 칭화 센터에 대 한 국립 센터를 감사합니다. 이 작품의 과학 및 기술 (2015CB942800), 국립 자연 과학 재단의 중국 (31521004, 31471358, 및 31522036), 중국과의 북경 칭화 센터에서 C. R.X. 생명 과학에 대 한 자금에 의해 지원 되었다

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase P Roche 11213873001
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200114
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30071.03
Dumont #4 Forceps Roboz RS-4904
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5058
30 G BD Needle 1/2" Length BD 305106
Stereo Microscope Zeiss Stemi DV4
Stereo Fluorescence microscope Zeiss Stereo Lumar V12
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5424R
Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap BD-Falcon 352235
96-Well PCR Microplate Axygen PCR-96-C
Silicone Sealing Mat Axygen AM-96-PCR-RD
Thin Well PCR Tube Extragene P-02X8-CF
Cell sorter BD Biosciences BD FACSAria
Capillary pipette Sutter B100-58-10
RNaseZap Ambion AM9780
ERCC RNA Spike-In Mix Life Technologies 4456740
Distilled water Gibco 10977
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
dNTP mix New England Biolabs N0447
Recombinant RNase Inhibitor Takara 2313
Superscript II reverse transcriptase Invitrogen 18064-014
First-strand buffer (5x) Invitrogen 18064-014
DTT Invitrogen 18064-014
Betaine Sigma-Aldrich 107-43-7
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Nuclease-free water Invitrogen AM9932
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) KAPA Biosystems KK2601
VAHTS DNA Clean Beads XP beads Vazyme N411-03
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32854
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix Vazyme Q121-02
TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina Vazyme TD502 Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE
TruePrep Index Kit V3 for Illumina Vazyme TD203 Include 16 N6XX and 24 N8XX
High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit Advanced Analytical Technologies DNF-474
1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl
4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4
0.44 mM KH2PO4
Isolation buffer 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4
FACS buffer 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4
NaCl Sigma-Aldrich S5886
KCl Sigma-Aldrich P9541
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6297
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S5136
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
HEPES Sigma-Aldrich H4034
MgCl2 Sigma-Aldrich M2393
Oligo-dT30VN primer 5'-AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGTACT30VN-3'
TSO 5'-AAGCAGTGGTATCAAC
GCAGAGTACATrGrG+G-3'
ISPCR primers 5'-AAGCAGTGGTAT
CAACGCAGAGT-3'
Gapdh Forward primer 5'-ATGGTGAAGGTC
GGTGTGAAC-3'
Gapdh Reverse primer 5'-GCCTTGACT
GTGCCGTTGAAT-3'
Ins2 Forward primer 5'-TGGCTTCTTC
TACACACCCA-3'
Ins2 Reverse primer 5'-TCTAGTTGCA
GTAGTTCTCCA-3'

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129, (10), 2447-2457 (2002).
  2. Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. On the origin of the beta cell. Genes & Development. 22, (15), 1998-2021 (1998).
  3. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429, (6987), 41-46 (2004).
  4. Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8, (3), 281-293 (2011).
  5. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
  6. Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535, (7612), 430-434 (2016).
  7. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42, (14), 8845-8860 (2014).
  8. Qiu, W. L., et al. Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level. Cell Metabolism. 25, (5), 1194-1205 (2017).
  9. Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, (11), 1096-1098 (2013).
  10. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9, (1), 171-181 (2014).
  11. Piccand, J., et al. Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice. Diabetes. 63, (1), 203-215 (2014).
  12. Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
  13. Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single cell isolation and analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
  14. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9, (1), 75 (2017).
  15. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  16. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, (4), 357-359 (2012).
  17. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, (4), (2013).
  18. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31, (2), Oxford, England. 166-169 (2015).
  19. Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences. 131, (4), 281-285 (2012).
  20. Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10, (11), 1093-1095 (2013).
  21. Le, S., Josse, J., Husson, F. FactoMineR: An R package for multivariate analysis. Journal of Statistical Software. 25, (1), (2008).
  22. Hadley, W. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. Springer Science & Business Media. (2009).
  23. Warnes, G., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Huber, W., Liaw, A., Lumley, T., Mächler, M., Magnusson, A., Möller, S. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data. Available from: https://cran.r-project.org/package=gplots (2016).
  24. Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466, (7306), 627-631 (2010).
  25. Li, L., et al. Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions. Cell Stem Cell. (2017).
  26. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  27. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  28. Teo, A. K. K., et al. Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures. Cell Death Discovery. 4, (14), (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics