Fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre Transcriptomic analizleri

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases tek hücreli RNA sıralama tarafından takip endokrin hücrelerden yalıtım için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, analizleri sağlar pankreatik endokrin lineage gelişimi, heterojen ve transcriptomic dinamikleri hücre.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Li, L. C., Yu, X. X., Zhang, Y. W., Feng, Y., Qiu, W. L., Xu, C. R. Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells. J. Vis. Exp. (139), e58000, doi:10.3791/58000 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Adacıklar içinde kümelenir, pankreatik endokrin hücreleri kan glikoz istikrar ve enerji metabolizmasını düzenler. Adacıkları, insülin salgılayan β hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinde ortak endokrin ataları embriyonik evre sırasında farklı. Olgunlaşmamış endokrin hücreleri hücre proliferasyonu ile genişletin ve gelişimsel bir uzun postnatal dönemde olgun. Ancak, bu işlemlerin altında yatan mekanizmaları açıkça tanımlı değil. Tek hücreli RNA-sıralama farklı hücre popülasyonlarının ve izleme hücre lineage farklılaşma yollar karakterizasyonu için umut verici bir yaklaşımdır. Burada, tek hücreli RNA-sıralama izole pankreas β hücre embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases için bir yöntemi açıklanmaktadır.

Introduction

Pankreas memelilerde yaşamsal metabolik bir organdır. Pankreas endokrin ve ekzokrin bölmeleri oluşur. Pankreatik endokrin hücreleri insülin üreten hücrelerin β ve glukagon üreten α hücreleri de dahil olmak üzere, birlikte adacıkları of Langerhans küme ve coordinately sistemik glikoz homeostazı düzenler. Disfonksiyon endokrin hücreleri sonuçlar diyabet mellitus, dünya çapında bir önemli halk sağlığı sorunu haline gelmiştir.

Endokrin pankreas hücreleri Ngn3 elde edilen+ ataları embriyogenez1sırasında. Daha sonra perinatal dönemde endokrin hücreleri için formu olgunlaşmamış adacıkları çoğalırlar. Bu olgunlaşmamış hücreleri devam geliştirmek ve yavaş yavaş zengin kan glikoz homeostazı yetişkin2düzenleyen skarların haline olgun adacıkları haline gelir.

Transkripsiyon faktörleri bir grup, β hücre farklılaşması düzenleyen tespit rağmen β hücrelerinin hassas olgunlaşma yolu hala belli değil. Ayrıca, β hücre olgunlaşma süreci de hücre sayı genişleme3,4 düzenlenmesi ve hücresel heterojenite5,6nesil içerir. Ancak, düzenleyici mekanizmaları bu süreçlerin de incelenmiştir değil.

Tek hücreli RNA-sıralama hücre altgrupları profil ve hücre lineage gelişim yolları7iz güçlü bir yaklaşımdır. Bu teknoloji, pankreas adacık geliştirme sırasında meydana gelen olayları tek hücre düzeyi8' de deşifre anahtar yararlanarak. Tek hücreli RNA-sıralama protokolleri arasında geliştirilmiş hassasiyet ve doğruluk ve daha düşük maliyet9standart reaktifler kullanımı tam uzunlukta cDNA nesil akıllı-seq2 sağlar. Akıllı-seq2 sıralama10için bir cDNA Kütüphanesi oluşturmak için yaklaşık iki gün alır.

Burada, floresans aktif hücre (FACS) sıralama kullanarak bir yöntem pancreases, fetal floresans etiketli β hücrelerinden yetişkin Ins1-RFP transgenik fareler11, yalıtım için önerdiğimiz ve transcriptomic performans analizleri tek hücre düzeyi, akıllı-seq2 teknolojisiyle (Şekil 1). Bu iletişim kuralı tüm pankreatik endokrin hücre tiplerinin normal, patolojik ve yaşlanma Birleşik Devletleri transcriptomes analiz etmek için genişletilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Pekin Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. pankreas yalıtım

  1. E17.5 (embriyonik gün 17,5) embriyo için:
    1. Embriyonik gün 0,5 vajinal tak görüntülendiğinde zaman noktası bakarak tahmin ediyoruz.
    2. Hamile fareler CO2 yönetim tarafından kurban. Sprey % 70 alkol ile karın kürk.
    3. Genital bölge için kaburga uzanan üzerinden makasla V şeklinde bir kesi yapmak. Bu işlem tamamen karın boşluğu açılacaktır.
    4. Rahim karın boşluğu dışında incelemek ve soğuk PBS içeren bir 10 cm çanak yerleştirin.
    5. Embriyolar rahim üzerinden diğer dokular, plasenta ve göbek kordonu gibi kaldırma bir stereomicroscope altında ince uçlu forseps ile incelemek. Tüm embriyoların soğuk PBS içeren bir 10 cm tabak yerleştirin.
    6. Embriyo karın boşluğu açık gözyaşı ve dirsek cımbız ile visseral doku kazmak. Visseral doku soğuk PBS içeren 6 cm siyah-alt çanak içine aktarın.
    7. Pankreas karın sol üst köşesinde bulunur ve mide, dalak ve oniki parmak bağırsağı ( Şekil 2Asarı noktalı çizgi)12' ye ekler. Pancreases forseps kullanarak visseral dokusundan ayırmak ve pankreas dokusu birlikte 5 mL 0.5 mg/mL soğuk collagenase çözeltisi içeren 20 mL şişe havuzu: 0,5 mg/mL collagenase P yalıtım arabelleği (HBSS 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2 içeren 5 mM glikoz, pH 7,4).
  2. P0-P15 (Doğum sonrası gün 0-15) fareler için:
    1. Kurban ve bacaklarda benchtop Koruyucu bandı ile bir parça kalarak tarafından fare düzeltmek. Sprey % 70 alkol ile karın kürk.
    2. Tamamen karın boşluğu 1.1.3. adımda açıklandığı gibi açın. Bağırsaklar dışarı ve fare sol tarafına çek. Bu yordamı pankreas, mide, duodenal ve dalak lobları harekete geçirecek. Dikkatle tüm pankreas (Şekil 2B)12 lobları teşrih ve pankreas dokusu birlikte 5 mL 0.5 mg/mL soğuk collagenase çözeltisi içeren 20 mL şişe havuz.
  3. P18-P60 (Doğum sonrası gün 18-60) fareler için:
    1. Collagenase çözüm hazırlamak. Buz üzerinde kullanım için hazır kadar devam et.
    2. Fare kurban ve karın boşluğu (yukarıdaki adım 1.1.2 ve 1.1.3) belirtildiği gibi açın.
      Not: karaciğer zarar vermeyin, herhangi bir yara için karaciğer safra kanalını akış basıncı azaltmak ve aşağıdaki adımı perfüzyon verimliliğini azaltmak.
    3. Xiphoid kaldırın. Dışarı ve sağ tarafa fare bağırsağı çekin ve sol ve sağ orta lob Karaciğer safra kesesi ( Şekil 2Cbeyaz ok) ve ortak safra kanalını ortaya çıkarmak için her tarafına itin.
    4. Küçük gemi Kelepçeler nerede safra kanalını duodenum (Şekil 2B) girer sitesi kanat alt ve üst konumda bir çift ile duodenum kelepçe.
      Not: pankreas gastrik veya dalak lobları kelepçe değil. Collagenase çözüm mide ve dalak lob sabitlenmiş Eğer sonraki adımda pankreasın içine akışı değil.
    5. 5 mL 0.5 mg/mL soğuk collagenase çözeltisi ile bir şırıngaya doldur ve 30 G iğne safra kesesi yerleştirin. Dikkatli ve düzgün, iğneyi ortak safra kanalını aracılığıyla manipüle.
    6. Pankreas 1 – 5 mL fare büyüklüğüne bağlı olarak 0,5 mg/mL soğuk collagenase çözeltisi enjekte edilerek sıvı. Enjeksiyon-meli var olmak yavaş ve sürekli iğne kanal dışına kaymasını önlemek için ve yüksek sıvı basınç altında patlama bağırsak önlemek için. Enjeksiyon pankreas tam olarak genişletilmiş olduğuna ne zaman tamamlanır.
    7. Pankreas ( Şekil2D sarı noktalı çizgi) hemen sonra perfüzyon forseps kullanarak karın boşluğu dışında incelemek. Doku 5 mL 0.5 mg/mL soğuk collagenase çözeltisi içeren 20 mL şişede yerleştirin. Bir kerede birden fazla fare manipüle, fareler tek tek sıvı ve tüm fareler disseke kadar 20 mL şişe soğuk collagenase çözüm içine belgili tanımlık doku havuz.

2. collagenase sindirim ve adacık yalıtım

  1. 37 ° C su banyosu pankreas dokusu içeren 20 mL şişe yerleştirin ve kuluçkaya sıcaklık equilibrate 3 dakikadır.
  2. Başka bir 3-5 dk için tüp hafifçe sallayın. Pankreas dokusu tamamen şişirilir, nihayet düzgün dağınık olduğunu kadar bu yavaş yavaş küçük doku parçalara ayırmak. Sindirim zaman pankreas boyutuna ve perfüzyon verimliliği bağlı olarak değişir.
  3. Sindirilir ürün 0,25 mm naylon süzgeç aracılığıyla yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne filtre. Buz gibi PBS içeren 20 mL şırınga kullanarak süzgeç iyice yıkayın.
  4. E17.5-P15 pancreases için 3.1 adıma atlayın.
  5. P18-P60 pancreases için vasıl 200 x g 1 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Soğuk PBS ile doku yeniden askıya alma.
  6. Doku süspansiyon 5 mL 6 cm siyah-alt çanak içine dökün. Pankreas adacıkları küçük, kompakt, Sütlü beyaz yapılar ve acinar doku gevşek ve yarı saydam beyazdır. Adacıkları 200 μL pipet ile almak ve soğuk PBS küçük bir miktar içeren bir 1,5 mL tüp içine aktarabilirsiniz.

3. tripsin sindirim pankreas dokusu veya adacıkları

  1. Pankreas dokusu veya adacıkları 200 x g 4 ° C'de 1 dk. için de içeren tüp santrifüj kapasitesi ve süpernatant Pelet bozmadan atın.
  2. Pelet % 0.25 tripsin-EDTA ile yeniden askıya alma ve bir 37 ° C su banyosunda kuluçkaya. Kuluçka 4 dk sonra yavaşça ve zaman zaman (pipet) 200 μL ipuçlarını kullanarak 1dk için Aspire edin.
    Not: E17.5-P3 pancreases için 1 mL tripsin-EDTA ekleyin. P4-P15 pancreases için 3 mL tripsin-EDTA ekleyin. 100-300 adacıkları için 1 mL tripsin-EDTA ekleyin. Tripsin-EDTA doku miktarına göre ses düzeyini ayarlayın.
  3. Sindirim 0.4 x birim soğuk fetal Sığır serum (FBS) ekleyerek durdurmak ve nazik girdap tarafından karıştırın.
  4. 4 ° C'de 3 dk 250 x g , santrifüj Süpernatant Pelet bozmadan atmak.
  5. 200 μL soğuk FACS arabellek içeren hücreleri yeniden askıya alma (HBSS % 1'i içeren FBS, pH 7,4). Hücreleri bir 5 mL FACS tüp aktarın.
  6. Hızlı bir şekilde hücre süspansiyon sindirilmemiş büyük doku enkaz kaldırmak için filtreden geçmek izin vermek için FACS tüp spin. Tüp tek hücre süspansiyon şimdi FACS sıralamak için hazırdır.

4. tek hücre lizis

  1. Hücre lizis arabellek hazırlayın.
    Not: tüm deneylerin laminar akış ile UV sterilize örtünün altında gerçekleştirin. Bütün borular, plakalar ve pipet ipuçları RNase - meli var olmak / DNaz ücretsiz. Hood ve pipetler kullanmadan önce RNase dış saha çözümü ile dezenfekte etmek.
    1. Reaktifler buz çözme: dNTP (10 mM), oligo-dT astar (10 mikron) ve ERCC stok çözümü (1:20).
    2. ERCC 1:5 x 10 için seyreltik5 nükleaz ücretsiz su ile.
    3. Hücre lizis arabellek gerekli hacmi hesaplamak. RNase inhibitörü (40 U/μL), %0,2 (vol/vol) Triton X-100, 1 μL dNTP, 1 μL oligo-dT astar ve her hücre için 4,05 μL son hacmiyle seyreltilmiş ERCC 0,05 μL 1.9 μL 0.1 μL ekleyin.
    4. Aliquot 0.2 mL ince duvar 8-şerit PCR tüpleri veya 96-şey tabak hücre lizis arabelleğine. Tüpler veya tabak 30 santrifüj kapasitesi 4 ° C'de s
      Not: 0.2 mL ince duvar 8-şerit PCR tüpleri 7500 x g ve 96-şey plakaları vasıl 800 x g aşağıdaki adımlarda, santrifüj kapasitesi.
  2. Tek hücreli malzeme çekme ve lizis.
    1. El ile çekme FACS FACS arabellek Ins1-RFP+ tek kişilik hücrelerde bir 30-40 µm kapiller pipet kullanarak 8-şerit PCR tüpler içine sıralanmış veya doğrudan Ins1-RFP+ tek hücreleri 96-şey kalıplara sıralamak. Tek bir hücre içeren birim daha az 0.3 μL olarak kabul edilir.
      Not: Kullanım ileri dağılım yükseklik (FSC-H) vs dağılım alanı (FSC-A) gating stratejisi tamamen ayrımcılık için ileri, FSC-H vs yan dağılım alanı (SSC-A) enkaz ve floresan Ins1-RFP+ hücre (Şekil 3A-3C) sıralamak için geçişi için. Malzeme çekme yöntemi için 300 μL FACS arabellek içeren bir 1,5 mL tüp içine hedef hücreleri sıralamak. Uygun son 5-10 hücreler/μL bölgedir. Arabellek sesi buna göre ayarlayın. Plaka toplama yöntemi için tek hücreli bir 96-şey plaka araç manuel takip her kuyuya sıralayın. 7 , 13
    2. Girdap tüpler veya hücreleri parçalayıcı ve RNA serbest bırakmak için tabak. Tüpler veya tabak 30 santrifüj kapasitesi s 4 ° C'de ve hemen onları buza koyun.
      Not: Hücreleri-80 ° C'de bir hafta boyunca saklanır.

5. tek hücreli cDNA amplifikasyon

  1. Ters transkripsiyon (RT).
    1. Buz üzerinde RT reaktifler (Tablo 1) çözülme.
    2. 3 dk 72 ° C'de örnekleri kuluçkaya ve hemen koymak borular veya en az 1 dk. buz tabakalarına kısaca tüpler veya tabak 30 santrifüj kapasitesi 4 ° C'de s
      Not: Kullanım bir termal cycler 105 ° C ısıtılmış kapak ile tüm incubations için.
    3. RT mix tüm reaksiyonlar için Tablo 1' de açıklandığı şekilde hazırlayın.
    4. RT Mix 10 μL toplam için ses getirmek için her örnek için 5,7 μL dağıtmak. Yavaşça girdap karışımı ve santrifüj 30 s 4 ° C'de
    5. Örnekleri termal cycler yerleştirin ve RT programı aşağıdaki gibi başlatın: 90 dakika, 10 döngüsü (2 dk, 42 ° C için 2 dk 50 ° C), 42 ° C 15 dk ve 4 ° C'de tutmak için 70 ° C
  2. PCR öncesi amplifikasyon.
    1. PCR reaktif (Tablo 2) buz çözme.
    2. PCR karışımı tüm reaksiyonlar için Tablo 2' de açıklandığı şekilde hazırlayın.
    3. İlk-strand reaksiyonları içerir her örnek için PCR karışımı 15 μL dağıtmak. Yavaşça girdap karışımı ve santrifüj 30 s 4 ° C'de
    4. Örnekleri termal cycler yerleştirin ve aşağıdaki PCR programı Başlat: 3 dk, 18 döngüleri için 98 ° C (98 ° C 20 s, 15 67 ° C s, 6 dk. 72 ° C), 5 min ve tutun 4 ° C'de 72 ° C
      Not: PCR ürünü daha az bir hafta için 4 ° C'de veya -20 ° C/-80 ° C 6 ay saklanabilir.
  3. PCR arıtma.
    1. Yeniden askıya alınmış DNA arıtma boncuk (1 x) 25 μL her örnek için önceki adımı ve de tarafından girdap karışımı ekleyin. Sonra hızlı bir şekilde tüp veya tabak oda sıcaklığında sıvı toplamak ama boncuk yerleşim önlemek için spin.
      Not: DNA arıtma boncuk oda sıcaklığına 15dk ve girdap kullanmadan önce iyice Equilibrate.
    2. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
    3. Yer tüp veya uygun bir manyetik plaka kadar çözüm açıktır stand sonra dikkatle kaldırmak ve süpernatant.
    4. Manyetik standında ise boncuk yıkamak için taze hazırlanmış %80 etanol 200 μL eklemek, 30 için kuluçkaya s, o zaman dikkatle kaldırmak ve etanol çözüm.
      Not: %80 (vol/vol) etanol çözüm her zaman taze hazırlanmalıdır.
    5. 5.3.4 iki yıkar toplam için yineleyin.
    6. Dikkatle kaldırmak ve kalan etanol çözüm ve hava kuru ise tüp boncuk veya manyetik kürsüye plakadır.
      Not: en fazla elüsyon verimliliği sağlamak için boncuk aşırı kurutma önlemek.
    7. 11 μL nükleaz ücretsiz su boncuk DNA hedef elute ve de gönderen vortex karışımı ekleyin. Hızlı bir şekilde, tüp veya plaka spin ve kadar çözüm açıktır manyetik bir stand üzerine koyun. 10 μL örnek için yeni bir PCR tüp aktarın.
      Not: dimer arınma cDNA boyutu dağıtım algılamayı dayalı tek bir turdan sonra varsa tekrar dimer tamamen kaldırmak için arındırmak. Dimer cDNA verim hesaplaması örnek kalmasına izin verirseniz etkileyebilir.
  4. CDNA kalite kontrol.
    1. Rastgele bir yer kullanarak cDNA toplam verim algılamaya örnekleri seç.
    2. Gerçek zamanlı PCR (qPCR) (Şekil 4E) tarafından marker gen ifade düzeyini değerlendirin. 1 μL örnek 40 kez sulandırmak ve qPCR 384-şey plaka kullanarak gerçekleştirmek için kaldırın. QPCR mix Tablo 3' te açıklandığı şekilde hazırlayın. Bisiklet koşullarını: 10 min, 45 devir için 95 ° C (95 ° C 10 s, 60 ° C 15 s, 72 ° C 15 s).
    3. Rastgele bir paralel kapiler Elektroforez enstrüman kullanarak boyutu dağıtım algılamaya örnekleri seç.

6. cDNA Kütüphanesi İnşaat

  1. Tn5 transposase ile Tagmentation tepki.
    1. QPCR seçili hücrelerden adım bir yer kullanarak 5.4.2 cDNA toplam verimi algılamak. CDNA Başlangıç materyali olarak kullanımı 2 ng.
    2. Buz tagmentation reaksiyon reaktifleri (Tablo 4) çözülme.
    3. Tagmentation reaksiyon 0.2 mL ince duvar 8-şerit PCR tüp içinde Tablo 4, açıklandığı gibi hazırlamak ve girdap tarafından dikkatlice karıştırın. Sonra hızlı bir şekilde çözüm oda sıcaklığında aşağı spin.
    4. Örnekleri 10 dk 55 ° C'de kuluçkaya ve 4 ° C'de tutun
    5. Hemen 5 x TS 2 μL tagmented reaksiyonu durdurmak için DNA içeren her örnek ekleyin. Gönderen vortex dikkatlice karıştırın ve sonra hızlı bir şekilde çözüm oda sıcaklığında aşağı spin.
    6. Karışımı oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. DNA PCR son zenginleştirme için hemen işlenebilir.
  2. Bağdaştırıcı bakmaksızın parçaları amplifikasyon.
    1. PCR reaktif (Tablo 5) buz çözme.
    2. Tablo 5, açıklandığı gibi zenginleştirme PCR karışımı hazırlamak ve girdap tarafından dikkatlice karıştırın. Sonra hızlı bir şekilde çözüm oda sıcaklığında aşağı spin.
    3. PCR aşağıdaki program kullanarak gerçekleştirme: 10 min, 30 98 ° C için 72 ° C s, 8 döngüsü (98 ° C 15 s, 30 60 ° C s, 3 dk 72 ° C), 5 min ve tutun 4 ° C'de 72 ° C
      Not: Devir sayısı beklenen Kütüphane DNA miktarına bağlıdır.
  3. PCR arıtma ile boyutu seçme.
    1. Yeniden askıya alınmış DNA arıtma boncuk (0.7 x) 14 μL her örnek için önceki adımı ve de tarafından girdap karışımı ekleyin. Sonra hızlı bir şekilde tüp sıvı toplamak ama boncuk yerleşim önlemek için oda sıcaklığında spin.
      Not: DNA arıtma boncuk oda sıcaklığına 15dk ve girdap kullanmadan önce iyice Equilibrate.
    2. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
    3. Kadar çözüm açıktır tüp uygun bir manyetik sandalyesine koyun, dikkatle süpernatant yeni bir tüp striptiz kulübüne transfer ve önceki tüp şerit.
    4. 3 μL yeniden askıya alınmış DNA arıtma boncuk ekleyin (0.15 x) tüp şerit ve karması girdap göre de her örnek için. Sonra hızlı bir şekilde oda sıcaklığında tüpü çevir.
    5. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
    6. Yer tüp veya uygun bir manyetik plaka kadar çözüm açıktır stand sonra dikkatle kaldırmak ve süpernatant.
    7. Manyetik standında ise boncuk yıkamak için taze hazırlanmış %80 etanol 200 μL eklemek, 30 için kuluçkaya s, o zaman dikkatle kaldırmak ve etanol çözüm.
      Not: %80 (vol/vol) etanol çözüm her zaman taze hazırlanmalıdır.
    8. 6.3.7 iki yıkar toplam için yineleyin.
    9. Dikkatle kaldırmak ve kalan etanol çözüm ve hava kuru ise tüp boncuk veya manyetik kürsüye plakadır.
      Not: en fazla elüsyon verimliliği sağlamak için boncuk aşırı kurutma önlemek.
    10. 11 μL nükleaz ücretsiz su boncuk DNA hedef elute ve de gönderen vortex karışımı ekleyin. Hızlı bir şekilde, tüp veya plaka spin ve kadar çözüm açıktır manyetik bir stand üzerine koyun. 10 μL örnek için yeni bir tüp şerit aktarın.
  4. Kalite kontrol son cDNA Kütüphanesi.
    1. Her kitaplık bir yer kullanarak konsantrasyonu ölçmek ve paralel kapiler Elektroforez enstrüman kullanarak boyutu dağıtım kontrol edin.
      Not: DNA verim her kitaplık için 15-25 ng genellikle arasındadır. 250 arasında değişen parçaları 450 bp bp görülmektedir. 1 x DNA arıtma boncuk dimer boyutu dağıtım denetimi tarafından onaylandı olarak arıtma sonra kalırsa, bir kez daha arındırmak.
  5. Kütüphane havuzu oluşturma
    1. Yaklaşık parçası, DNA havuzu eşit miktarda hiç biri N6XX ve N8XX bağdaştırıcıları aynı kombinasyonları içeren sağlamak her örnekten temel.

7. DNA sıralama

  1. Konu barkodlu kütüphaneleri yüksek üretilen iş sıralama sistemi kullanılarak 51 bp tek taraflı kenar sıralama için. Üreticinin iletişim kuralı aşağıdaki sıralama gerçekleştirir. Sıralama her hücrenin yaklaşık 1 milyon Ortalama8, en az 0,5 milyon hücre14başı okur okur derinliğidir.

8. Biyoinformatik Analizi

  1. Kalite değerlendirme ve hizalama sıralanıyor.
    1. FastQC (v0.11.3)15 kullanarak aşağıdaki parametreleri ile sıralı okuma kalitesini değerlendirmek: "fastqc--özü -o output_dir input_fastq".
    2. Fare genom komutunu kullanarak ERCC dizileri ile birleştirme "mm10.fa ERCC.fa kedi > mm10_ERCC.fa".
    3. Bowtie2 yapı (v2.2.5)16 dizin aşağıdaki parametrelerle: "bowtie2-yapı mm10_ERCC.fa mm10_ERCC".
    4. Tophat2 kullanarak okuma hizalamak (v2.1.0)17 aşağıdaki parametrelerle: "tophat2 -o output_dir -G gene.gtf--transcriptome-index trans_index mm10_ERCC input_fastq".
  2. Gen ifade düzeylerini ölçmek.
    1. Eşlenen sayısı okur HTSeq (v 0.6.0)18 ile aşağıdaki parametreleri kullanarak her gen için: '' htseq-saymak - f bam - r pos -s - bir 30 accepted_hits.bam gene.gtf > read_count.txt''.
    2. Transkript milyon (TPM)19başına gen ifade düzeylere normalleştirmek.
  3. Kalite kontrol hücre.
    1. Az 0.5 milyon eşlenen okuma veya daha az 4.000 genleri içeren hücreleri dışlamak (TPM > 1).
      Not: hücre tipleri ve sıra derinliği dışlama ölçütü bağlıdır.
    2. Endokrin işaretleri (Örneğin, Ins1 β hücrelerinin, Gcg α hücreler için) ifade hücreleri korumak ve endokrin işaretleri (Örneğin, Spi1 için lökosit) ifade hücreleri hariç.
  4. Asıl bileşen analizi (PCA)
    1. Son derece değişken gen ERCC spike-ins göre yukarıda açıklanan20tanımlayın.
    2. PCA r "PCA" ile FactoMineR (v1.31.4)21, paket işlevini kullanarak gerçekleştirmek log2(TPM + 0.1) son derece değişken gen.
    3. Ggplot2 PCA sonuçlarla görselleştirmek (v2.0.0)22.
  5. Hiyerarşik kümeleme.
    1. Genler "dimdesc" işlevi FactoMineR (v1.31.4)21kullanılarak en yüksek temel bileşeni (PC) yükleri ile tanımlayın.
    2. Hiyerarşik kümeleme işlevi "heatmap.2" R paket gplots (v3.0.1)23, log2 ile kullanarak gerçekleştirmek (TPM + 1) göreli değerler yüksek PC genler yükleniyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pancreases embriyonik, yenidoğan ve postnatal fareler disseke (Şekil 2A ve 2B). Doğum sonrası gün 18 büyük fareler için sindirim etkisi perfüzyon derecesine bağlıdır; Bu nedenle, enjeksiyon adacık yalıtım için en önemli adımdır (Şekil 2C-2E ve Tablo 6). Kadar collagenase pankreas bu adımı sırasında doldurmak mümkün olduğu kadar enjekte ettiler. Tam şişirilmiş pankreas Şekil 2Bolarak gösterilir. Perfüzyon başarılı (Şekil 2E) değil, ancak örnek değerli ise, pankreas için yeterli sindirim daha sonra küçük parçalar halinde parçalanmış.

Perfüzyon sonra pankreas dokusu adacıkları (Şekil 2F) serbest bırakmak için küçük parçalar halinde sindirilmiş. FACS sıralama süresini kısaltmak için biz adacıkları önceden seçerek endokrin hücreleri zenginleştirilmiş. Adacıkları boyutunu fare yaş ve sindirim yoğunluğu göre değişiklik gösterebilir. Zaman zaman, adacıkları şeklinde yuvarlak değildir. Adacıkları renk ve kompakt devlet (Şekil 2 g ve Tablo 6) göre seçilmelidir. Transgenik fare zorlanma GFP veya RFP endokrin hücreler için gibi bir muhabir gen varsa adacıkları de floresan mikroskop altında aldı.

Ins1-RFP+ hücreleri (Şekil 3A-3 C) sıralama FACS tarafından saf ve tek hücreleri kılcal bir pipet tek hücreli RNA-seq (şekil 3D) kullanarak tutuklandılar. Başarıyla yükseltilmiş cDNA-meli-si olmak bir tam uzunlukta yukarıda 500 bp ve 1,5 kb 2 kb ile zenginleştirilmiş. Ayrıca, genellikle insülin transkript (Şekil 4A) temsil edebilir Ins1-RFP+ hücrelerde gözlenen cDNA bir 500-600 bp zenginlik olduğunu. Ancak, bazı olağan dışı durumlar gözlenen10 (Tablo 6) olmuştur. Örneğin, 100 cDNA parçaları yakınındaki bp vardır astar dimer (Şekil 4B), genellikle DNA arıtma adımı yineleyerek kaldırılması gereken aşırı astar tarafından kaynaklanır. Astar dimer varlığını aşağıdaki Kütüphane yapımı için kullanılan toplam cDNA verim hesaplamaları etkileyebilir. CDNA parçaları arasında 100 bp ve 500 bp genellikle temsil bozulmuş cDNA (Şekil 4 c), hangi RNase kirlenme gibi kötü hücre durumu veya reaktif sorunları nedeniyle oluşur. Bu durum altında biz DNA bozulma nedenini belirlemek ve rahatsızlık hariç. Örneğin, iyi hücre durum emin olmak için doku sindirmek ve hücreleri hızlı bir şekilde ve yavaşça sıralanması gerektiğini ve işlemleri kirleticiler, her türlü önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.

CDNA kitaplıkları sıralama için arıtma sonra biz cDNA parçaları farklı boyutlarda farklı oranlara DNA arıtma boncuk için örnek ekleme talimatları takip ederek elde. Örneğin, 250 kadar cDNA elde edebilirsiniz bp 450 bp tarafından ekleyerek 0.7 x ve DNA arıtma boncuk ilk x 0,15 ve ikinci tur arıtma, sırasıyla (Şekil 4 d). Bu adım bir yüksek başarı oranına sahip. Ancak, Eğer parçaları yaklaşık 100 bp, 1 x DNA arıtma boncuk dimer (Tablo 6) kaldırmak için tekrar kitaplıklarıyla arındırmak için önerilmektedir. Unremoved dimer DNA miktar çarpık ve her örnekten eşit olmayan veri toplama sonuçları örnek sonuçları, havuzu etkileyecektir.

Sıralama veri (Şekil 5A) Biyoinformatik yaklaşımlarla analiz ettik. Sıralama Kalite Puanlarını kalite değerlendirme (Şekil 5B) sıralama sırasında 30'dan büyük olmalıdır. Hizalama sonra okuma sayısı % 80-90 başvuru genom eşlenmiş olması bekleniyor. Yüksek kaliteli hücreleri aşağı akım analizleri için elde etmek için biz veya az 0.5 milyon eşlenen okuma içeren hücreleri hariç genler (Şekil 5C ve 5 D) daha az 4.000 ile tespit. Sonra PCA ve hiyerarşik kümeleme, farklı hücre grupları ile karakterize ve heterogeneously farklı gruplar8' ifade edildi genleri tespit.

Figure 1
Şekil 1: tek hücreli RNA-seq fare pankreatik endokrin hücre için şematik genel bakış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: pankreas diseksiyon, perfüzyon ve adacık malzeme çekme. (A)diseksiyon embriyonik pankreas dokusu (alt) bir E17.5 embriyo (üst). Sarı noktalı çizgi pankreas dokusu demarcates. Ölçek çubuğu 1000 µm. (B) = diseksiyon postnatal pankreas dokusu (sağda) bir P10 fareden (solda). Ölçek çubuğu 1000 µm. (C-B) (C) önce P60 fare pankreas dokusunun = ve (D) perfüzyon sonra. Sarı noktalı çizgi pankreas dokusu demarcates. Beyaz ok safra kesesi gösterir. (E) P60 fare kısmen perfused pankreas dokusunun. Kırmızı ok pankreas de perfused alanı gösterir. Mavi oklar pankreas kötü perfused alanları gösterir. (F) pankreas dokusu daha önce (üst) ve sonra (alt) collagenase sindirim. (G) okları sindirilmiş collagenase pankreas dokudan yayımlanan adacıkları üzerine gelin. Ölçek çubuğu 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: el ile bir mikroskop altında bir 30-40 µm kapiller pipet içeren hücreleri seçmek. (A-C) Step-Wise FACS Ins1-RFP+ hücreleri sıralamak için geçişi. (D) parlak daireler hücreleri belirtmek ve tüp kılcal bir pipet olduğunu. Daha iyi morfoloji (ok) içeren hücreleri seçin ve kümelenmiş hücreleri (ok ucu) göz ardı. Ölçek çubuğu 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Kalite algılama Ins1-RFP+ hücreleri tarafından bir paralel kapiler Elektroforez enstrüman cDNA ve Kütüphane boyutu dağılımı. (A) temsilcisi başarıyla önceden güçlendirilmiş cDNA sonucu. Normalde, cDNA profil 500 olması gereken bir ~1.5–2 kb tepe ile bp. (B) bir astar dimer tepe ile önceden güçlendirilmiş cDNA temsilcisi sonucu. Yaklaşık 100 astar dimer tepedir bp. (C) parçalar ile önceden güçlendirilmiş cDNA profil arasında 100 bp ve 500 bp cDNA bozulma olasılığını gösterir. (D) cDNA boyutu dağılımı Kütüphane 250 arasında değişen bp ve 450 bp aşağıda belirtilen bu protokol için arıtma adımları. Ins2 qPCR (solda) ve akrabası tarafından cDNA kitaplıklarındaki (E) ifade düzeyde sıralama veri (sağda). X-axes temsil farklı 8 tek hücre örnek. Y ekseni (solda) Gapdh (CtGapdh- CtIns2 + 6) göre normalleştirilmiş ΔCt ve y ekseni (sağda) Ins2 Gapdh (günlük2(TPM göre normalleştirilmiş ifade düzeyini temsil eder. Ins2 / TPMGapdh)). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: tek hücreli transcriptome veri Biyoinformatik analizlerini. (A)boru hattının Biyoinformatik analizleri. (B) Kalite Puanlarını okuma tüm üsleri arasında sıralama. (C) dağıtım eşlenen okuma sayısı. (D) tespit edilen gen sayısı dağılımı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bileşen Birim (µL)
Ters transkriptaz (200 U/µL) 0,5
RNase inhibitörü 0,25
İlk-strand arabellek (5 x) 2
DTT (100 mM) 0,5
Betan (5 M) 2
MgCl2 (1 M) 0,06
TEKNİK DESTEK (100 ΜM) 0,1
Nükleaz ücretsiz su 0,29
Toplam 5,7

Tablo 1: RT reaktif bileşenleri 5.7 µL tepki her örnek için karıştırın.

Bileşen Birim (µL)
İlk-strand tepki 10
DNA polimeraz (2 x ReadyMix) 12,5
PCR astar (10 µM) olduğunu 0,25
Nükleaz ücretsiz su 2.25
Toplam 25

Tablo 2: PCR öncesi amplifikasyon reaktif karıştırın her örnek için bir 25 µL reaksiyon bileşenleri

Bileşen Birim (µL)
SYBR yeşil Master Mix 5
Astar (5 mikron) 0,5
Nükleaz ücretsiz su 2.5
cDNA 2
Toplam 10

Tablo 3: qPCR reaktif bir standart 384-şey plaka kullanarak 10 µL tepki bileşenlerinde karıştırın.

Bileşen Birim (µL)
5 x TTBL 1.6
2 ng cDNA Değişken
GKD2O Değişken
TTE Mix V5 2
Toplam 8

Tablo 4: Tagmentation reaktif her örnek için bir 8 µL reaksiyon bileşenleri karıştırmak.

Bileşen Birim (µL)
GKD2O 1.6
Önceki adımda ürün 10
5 x sekmesi 4
N6XX 2
N8XX 2
TAE 0,4
Toplam 20

Tablo 5: Zenginleştirme PCR reaktif mix bileşenler her örnek için bir 20 µL tepki.

Adım Sorun Olasılık Çözüm
1.3.4 Kelepçeler kayma Bağırsak dış yüzey ıslak interstisyel sıvı ve collegenase leakness az miktarda varlığını tarafından kaynaklanır Yavaşça oniki parmak bağırsağı duvar ve diğer organ duvarlar pamuk temizleme bezi ile karın boşluğunda takas
1.3.6 Bağırsak patlama Sıvı basıncı bağırsaklarda çok yüksektir Enjeksiyon hızı yavaş
2.6 Adacıkları adacıkları seçilmesinde ekzokrin dokusu ile sopa Yetersiz sindirim Sindirim süresi ve gücü sallayarak uzatmak
5.3 PCR güçlendirme sonra cDNA verim düşüktür Kötü durumdadır hücreleri Hücreler taze ve iyi durumda tutmak
5.4 veya 6.4 Astar dimer görülebilir Aşırı astar CDNA DNA arıtma boncuk (0.8:1 veya 1:1 oran) ile bir kez daha arındırmak
5.4 PCR güçlendirme sonra bozulmuş cDNA Kalitesiz hücreleri veya kontamine reaktifler Hücreleri iyi durumda tutmak veya reaktifler değiştirme
6.3 Kütüphane inşaat sonra DNA miktarı düşüktür Çok az PCR döngüleri veya cDNA kalitesi iyi değil Devir sayısını artırmak veya cDNA Kütüphanesi inşaat önce bir kalite

Tablo 6: sorun giderme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol için tek hücreli ifade profilleri pankreas β hücrelerinin eğitim için etkili ve kullanımı kolay bir yöntemi gösterdi. Bu yöntem embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases endokrin hücrelerden izole etmek ve tek hücreli transcriptomic analizleri gerçekleştirmek için kullanılabilir.

En önemli adım tek β hücrelerinin yalıtım iyi durumda değil. Tam derin pancreases daha iyi sonraki sindirim için cevap. Genellikle dorsal pankreasta oluşur, yetersiz perfüzyon bir düşük adacık verim neden olur. Perfüzyon sonra sindirim süresi ve yoğunluğu sallayarak özel dikkat gerektirir. Aşırı sindirim, uzun bir kuluçka döneminden elde edilen ve dinç sallayarak, parçalar halinde adacıkları zarar verebilir. Yetersiz sindirim tamamen adacıkları bitişik dokulardan ayrılacak değil. Sonra sindirim pankreas adacıkları el malzeme çekme yerine göre yoğunluk gradient Santrifüjü saf. Yoğunluk gradient Santrifüjü adacıkları zenginleştirebilirsiniz rağmen birçok küçük adacıklar veya acinar doku ile bağlı adacıkları yanlışlıkla atılır. Verimsiz tripsin sindirim neden olabilir ve saflık β hücrelerinin azaltmak acinar doku toplama önlemek için deneyin.

Bağımsız biyolojik çoğaltır biyolojik değişkenlik ve toplu iş etkileri ayırt için gereklidir. PCA içinde benzer bir yol varsa iki biyolojik çoğaltır ve sonuçları Kümelemede benzer alt gruplar dahil, bu örnekler güvenilir biyolojik değişkenlik açığa çıkarabilir. Aksi takdirde, ek biyolojik çoğaltır görüntülenen sonuçları onaylamak için gereklidir. Pankreas gibi metabolik organ için sirkadiyen saat24 ile ilişkili hücre durumu toplu farkları için sorumlu olabilir. Bu sorunu çözmek için tüm örnekler gün aynı anda toplama öneririz.

Çünkü biz her hücre için bir kütüphane oluşturmak bu yaklaşımın iş hızı düşük kısıtlamadır. Tepki aşırı astar nedeniyle önce ve sonra kütüphane inşaat cDNA genellikle iki kez astar dimer tamamen kaldırmak için saf. Bu zaman alıcı bir işlemlerdir. Son zamanlarda, değiştirilmiş Protokolü25 bu bir dereceye kadar bu problemi olabilir bildirildi. Bu protokol için hücre özgü barkod cDNA parçaları Ters transkripsiyon adımı sırasında Etiketler. Bu nedenle, her hücrenin cDNA birlikte havuza ve daha sonra saf, Kütüphane İnşaat tarafından takip. Bu değişiklik Kütüphane inşaat-den geçerek önemli ölçüde artırır. Ancak, değiştirilmiş bu yöntem daha az duyarlıdır ve hücre başına daha az genler algılar. Buna ek olarak, bu yöntem bir 3 sayma yöntemi ile sınırlı okuma örtmek ' olur. Bu nedenle, akıllı-seq2 hala pankreas gelişimi için en uygun yöntemdir.

Pankreas hazırlık diğer türlerden farklı olabilir. İnsan pankreas için adacıkları önceki iletişim kuralları26,27aşağıdaki ayrılmış olabilir. Daha sonra izole adacıkları tek hücreleri28 ayrışmış ve bu yöntemi kullanarak tek hücreli çözümlemesi. Bu yöntem yaygın araştırma memeli pankreas geliştirme, hastalıklar ve yenilenme uygulanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

Biz Ulusal Merkezi Protein Bilimler, Pekin (Pekin Üniversitesi) ve Pekin-Tsinghua Merkezi için hayat bilgisi Computing Platform için teşekkür ederim. Bu eser Bakanlığı Bilim ve teknoloji Çin (2015CB942800), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31521004, 31471358 ve 31522036) ve Pekin-Tsinghua Merkezi'nden Yaşam Bilimleri için c-R.X. için finansman tarafından desteklenen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase P Roche 11213873001
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200114
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30071.03
Dumont #4 Forceps Roboz RS-4904
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5058
30 G BD Needle 1/2" Length BD 305106
Stereo Microscope Zeiss Stemi DV4
Stereo Fluorescence microscope Zeiss Stereo Lumar V12
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5424R
Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap BD-Falcon 352235
96-Well PCR Microplate Axygen PCR-96-C
Silicone Sealing Mat Axygen AM-96-PCR-RD
Thin Well PCR Tube Extragene P-02X8-CF
Cell sorter BD Biosciences BD FACSAria
Capillary pipette Sutter B100-58-10
RNaseZap Ambion AM9780
ERCC RNA Spike-In Mix Life Technologies 4456740
Distilled water Gibco 10977
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
dNTP mix New England Biolabs N0447
Recombinant RNase Inhibitor Takara 2313
Superscript II reverse transcriptase Invitrogen 18064-014
First-strand buffer (5x) Invitrogen 18064-014
DTT Invitrogen 18064-014
Betaine Sigma-Aldrich 107-43-7
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Nuclease-free water Invitrogen AM9932
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) KAPA Biosystems KK2601
VAHTS DNA Clean Beads XP beads Vazyme N411-03
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32854
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix Vazyme Q121-02
TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina Vazyme TD502 Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE
TruePrep Index Kit V3 for Illumina Vazyme TD203 Include 16 N6XX and 24 N8XX
High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit Advanced Analytical Technologies DNF-474
1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl
4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4
0.44 mM KH2PO4
Isolation buffer 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4
FACS buffer 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4
NaCl Sigma-Aldrich S5886
KCl Sigma-Aldrich P9541
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6297
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S5136
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
HEPES Sigma-Aldrich H4034
MgCl2 Sigma-Aldrich M2393
Oligo-dT30VN primer 5'-AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGTACT30VN-3'
TSO 5'-AAGCAGTGGTATCAAC
GCAGAGTACATrGrG+G-3'
ISPCR primers 5'-AAGCAGTGGTAT
CAACGCAGAGT-3'
Gapdh Forward primer 5'-ATGGTGAAGGTC
GGTGTGAAC-3'
Gapdh Reverse primer 5'-GCCTTGACT
GTGCCGTTGAAT-3'
Ins2 Forward primer 5'-TGGCTTCTTC
TACACACCCA-3'
Ins2 Reverse primer 5'-TCTAGTTGCA
GTAGTTCTCCA-3'

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129, (10), 2447-2457 (2002).
  2. Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. On the origin of the beta cell. Genes & Development. 22, (15), 1998-2021 (1998).
  3. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429, (6987), 41-46 (2004).
  4. Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8, (3), 281-293 (2011).
  5. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
  6. Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535, (7612), 430-434 (2016).
  7. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42, (14), 8845-8860 (2014).
  8. Qiu, W. L., et al. Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level. Cell Metabolism. 25, (5), 1194-1205 (2017).
  9. Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, (11), 1096-1098 (2013).
  10. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9, (1), 171-181 (2014).
  11. Piccand, J., et al. Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice. Diabetes. 63, (1), 203-215 (2014).
  12. Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
  13. Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single cell isolation and analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
  14. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9, (1), 75 (2017).
  15. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  16. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, (4), 357-359 (2012).
  17. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, (4), (2013).
  18. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31, (2), Oxford, England. 166-169 (2015).
  19. Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences. 131, (4), 281-285 (2012).
  20. Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10, (11), 1093-1095 (2013).
  21. Le, S., Josse, J., Husson, F. FactoMineR: An R package for multivariate analysis. Journal of Statistical Software. 25, (1), (2008).
  22. Hadley, W. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. Springer Science & Business Media. (2009).
  23. Warnes, G., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Huber, W., Liaw, A., Lumley, T., Mächler, M., Magnusson, A., Möller, S. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data. Available from: https://cran.r-project.org/package=gplots (2016).
  24. Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466, (7306), 627-631 (2010).
  25. Li, L., et al. Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions. Cell Stem Cell. (2017).
  26. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  27. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  28. Teo, A. K. K., et al. Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures. Cell Death Discovery. 4, (14), (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics