Spruta-injicerbara Mesh elektronik för stabil kronisk gnagare elektrofysiologi

Bioengineering
 

Summary

Mesh elektronik sonder sömlöst integrera och ger stabila, långsiktiga, singel-neuron inspelning i hjärnan. Detta protokoll använder mesh elektronik för i vivo experiment, som innefattar tillverkning av mesh elektronik, laddar in nålar, stereotaxic injektion, ingång/utgång gränssnitt, inspelning experiment och histologi av vävnad som innehåller mesh sonder.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schuhmann Jr., T. G., Zhou, T., Hong, G., Lee, J. M., Fu, T. M., Park, H. G., Lieber, C. M. Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology. J. Vis. Exp. (137), e58003, doi:10.3791/58003 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Implanterbara hjärnan elektrofysiologi sonder är värdefulla verktyg i neurovetenskap på grund av deras förmåga att registrera neural aktivitet spatiotemporal med hög upplösning från ytliga och djupa hjärnregioner. Deras användning har hindrats, dock genom mekaniska och strukturella skillnader mellan sonder och hjärnan vävnad som ofta leder till mikrorörelse och gliosis med leder signal instabilitet i kronisk inspelning experiment. I kontrast, efter implantation av ultraflexible mesh elektronik via spruta injektion, sonder mesh form en sömlös, gliosis-fri gränssnitt med omgivande hjärnvävnad som möjliggör stabil spårning av enskilda nervceller på minst ett år tidsskalan. Detta protokolldetaljer de viktigaste stegen i en typisk mus neurala inspelning experiment med spruta-injicerbara mesh elektronik, inklusive tillverkning av mesh elektronik i en standard photolithography-baserad process möjliga vid många universitet, lastning Mesh elektronik till standard kapillär nålar, stereotaxic injektion i vivo, anslutning av mesh indata/utdata till standard instrumentation gränssnitt, återhållsam eller fritt rörliga inspelningen och histologiska snittning av hjärnan vävnad som innehåller mesh elektronik. Representativa neurala inspelningar och histologi data presenteras. Utredarna bekant med detta protokoll kommer att ha kunskapen som krävs för att införliva mesh elektronik i egna experiment och dra nytta av de unika möjligheter som långsiktigt stabil neurala gränssnitt, såsom studier av åldrande processer, hjärnans utveckling och patogenesen av hjärnsjukdom.

Introduction

Utveckling av verktyg kan kartlägga hjärnan med singel-neuron upplösning är av central betydelse att neurovetenskap och neurologi. Icke-invasiv teknik för neurala studier såsom elektroencefalografi (EEG), Magnetencefalografi (MEG) och funktionell magnetresonanstomografi (fMRI) har visat sig vara värdefull för korrelering hjärnaktivitet med beteende i människor1, 2, men de saknar spatiotemporal resolutionen nödvändig för studera strukturen och dynamiken i neurala nätverk på sin grundläggande mikrometer och millisekund skalor, respektive3,4. Vissa electrocorticography (ECoG) sonder och optisk imaging metoder med spänningskänsliga färgämnen har lyckats spela in enstaka tillsatta verksamhet i vivo5,6, men de är i allmänhet effektiva bara nära den hjärnans yta, begränsa tillämpligheten till studier av grunt hjärnregioner. Däremot implanterbara elektriska sonder kan mäta singel-neuron elektrofysiologi i fritt rörliga djur från praktiskt taget alla hjärnregionen utan behov av fluorescerande etiketter, vilket gör dem oumbärliga för system-nivå neurovetenskap, särskilt som mikrofabrikation tekniker från halvledarindustrin har drivit räknas kanalen i hundratusentals3,7,8,9. Grund av dessa funktioner, har implanterbara elektriska sonder gjort många viktiga bidrag till neurovetenskap och neurologi, inklusive grundläggande studier av informationsbehandling i det visuella systemet10, behandling av neurologiska sjukdomar som Parkinsons sjukdom11och demonstration av hjärnan-maskin-gränssnitt (BMIs) för avancerad protetik12,13.

Ändå, långsiktig instabilitet manifesteras som minskar spike amplituder och instabila signaler på tidsskalor av veckor till månader14,15 har begränsad tillämpligheten av implanterbara sonder till studien av relativt kortsiktiga fenomen, lämnar frågor såsom hjärnans åldrande och utveckling till stor del obesvarade. Begränsningarna i långsiktig instabilitet är ett resultat av en obalans mellan konventionella sonder och hjärnvävnad i storlek, mekanik och topologi14,15,16,17,18. Vad gäller storlek, medan nervcellernas synapser och somata är ungefärligt tiotals nanometer till tiotals mikrometer i diameter19, respektive, traditionella sonder är ofta betydligt större, när det gäller kisel mikroelektrod matriser > 4 gånger storleken på en enda neuron cellkroppen7,8. Den relativt stora storleken på dessa sonder kan störa den naturliga struktur och anslutning av tät nervvävnad, därmed bidra till kronisk immunrespons och störande neurala kretsarna som studeras. När det gäller mekaniska egenskaper är traditionella sonder drastiskt styvare än den extremt mjuka nervvävnad där de implanteras; även ”flexibel” sonder gjorda av 10 – 20 µm tjocka skivor av polyimid är minst 100.000 gånger styvare än hjärnan vävnad20,21. Denna obalans i böjstyvhet orsakar relativa skjuvning rörelse mellan sonden och hjärnan vävnaden, vilket leder till otillförlitliga single-unit spårning under längre inspelningar och förmå kronisk gliosis vid implanteringsstället. Slutligen, konventionella brain sonder topologisk struktur nödvändigtvis utesluter en solid volym av vävnaden. Sådan obalans i topologin stör uppkopplingen av neurala kretsar, utgör hinder för den naturliga tredimensionella (3D) interpenetrated fördelningen av nervceller, gliaceller och blodkärlen i hjärnan vävnad22och hindrar 3D transport av Signaling molekyler23. Tillsammans, har dessa brister av konventionella sonder gjort dem understiger den långsiktiga kompatibilitet begärs för kliniska tillämpningar och längsgående neurovetenskap studier på singel-neuron nivå.

För att övervinna dessa brister, försökte vi sudda ut gränsen mellan de neurala och elektroniska system genom att utveckla ett nytt paradigm av ”vävnad-liknande” neurala sonder kallas mesh elektronik16,21,24. Mesh elektronik behandlar ovanstående matchande frågor i storlek, mekanik och topologi genom att införliva (1) strukturella drag hos samma nanometer till mikrometer storlek skala av nervvävnad, (2) mekaniska egenskaper liknar dem i hjärnvävnad, och (3) en 3D avdunsta topologi som är > 90% öppet utrymme och därmed rymmer sammanflätningen av nervceller och diffusionshastighet för molekyler genom den extracellulära miljön. Mesh elektronik sonder kan levereras just till delar av hjärnan genom en spruta och en kanyl, orsakar minimal akuta skador medan implantera även i djupa hjärnan regioner21,25. Neuronala soma och axoner har visat sig interpenetrate öppna 3D mesh elektronik probe strukturen inom veckor efter injektion, och skapar därmed en sömlös, gliosis-fri gränssnitt mellan inspelning elektronik och omgivande hjärnan vävnad21 , 26 , 27. dessa unika funktioner har aktiverat mesh elektronik sonder till stabilt spåra tillsatta aktivitet från samma enskilda nervceller under minst ett år tidsskalan27. Dessutom ger tillverkning av mesh elektroniken baserat på photolithography (PL) hög skalbarhet av antalet elektroder som kan införlivas, med påvisad kanal räknas upp till 128 elektroder per sonden med hjälp av enkel kontakt mask litografi 28 och en plug-and-play indata/utdata (I/O) design som möjliggör snabb elektrisk anslutning till perifera elektronik utan specialutrustning29.

Ett brett spektrum av studier får införliva mesh elektronik i mätning protokoll. De flesta intracortical inspelning experiment kunde dra nytta av mesh electronics minimalinvasiv implantation förfarande via spruta injektion, drastiskt minskad immunsvaret efter implantation, och möjligheten att lämna mesh elektronik i den vävnaden under efterföljande histologi och immunfärgning för exakt analys av biologiska miljön kring varje inspelning webbplats. Kronisk inspelning experiment kommer särskilt härleda värdet från mesh elektronik unika förmåga att spåra ett stort antal enskilda nervceller för månader och år. Den här funktionen skapar möjligheter för studier med singel-neuron upplösning som var tidigare opraktiskt, såsom längsgående åldrande studier av neurala kretsar, utredningar av utveckla hjärnan och förfrågningar i patogenesen av encefalopati16.

I detta protokoll beskriver vi alla nyckeln steg i en typisk mus neurala inspelning experiment med spruta-injicerbara mesh elektronik (se figur 1). Anvisningarna omfattar tillverkning av mesh elektronik i en standard PL-baserad process som möjligt vid många universitet, laddar mesh elektronik i standard kapillär nålar, stereotaxic injektion av mesh elektronik i vivo, anslutning av den Mesh I/O standard instrumentation gränssnitt, återhållen eller fritt rörliga inspelningarna och histologiska snittning av hjärnvävnaden som innehåller mesh elektronik. Vissa forskare använder mesh elektronik bara för histologi studier får inte kräva elektriska gränssnitt och inspelning, i vilket fall kan de hoppa över dessa steg. Efter att bekanta sig med detta protokoll, bör utredare ha all kunskapen som krävs för att använda mesh elektronik i sina egna experiment.

Protocol

Alla procedurer utförs på ryggradsdjur animaliska ämnen godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) från Harvard University.

1. tillverkning av Mesh elektronik

Obs: Det förfarande som beskrivs i detta avsnitt är avsett för användning inuti en standard universitet renrum anläggning, såsom centrum för nanoskala system (CNS) vid Harvard University. Denna anläggning samt liknande faciliteter är tillgängliga för externa användare runt USA, till exempel som en del av den nationella nanoteknik infrastruktur nätverk (NNIN) stöds av National Science Foundation (NSF). I dessa lokaler, många av verktyg, utrustning och material som beskrivs i detta avsnitt tillhandahålls tillsammans med tillgång till funktionen rena rum och skulle inte kräva separat köp.

Varning: Många av de kemikalier som används vid tillverkning av mesh elektronik är farliga, inklusive motstår, CD-26, remover PG, SU-8 utvecklare och Ni etsning lösning. Rådfråga de material säkerhetsdatablad (MSDS) för dessa kemikalier innan användning och genomföra och följa lämpliga säkerhetsåtgärder vid alla tidpunkter.

  1. Termiskt avdunsta 100 nm av Ni på en ren Si-wafer.
    Obs: Typiska nedfall parametrar är bastrycket av 5 x 10-7 T och hastighet på 1 – 2 Å/s. Det tunna lagret av Ni fungerar som ett uppoffrande lager som senare kommer att upplösas för att släppa mesh elektronik från rånet.
  2. Använd den första PL masken (PL mask-1) för att definiera botten passivering lager av mesh elektronik med SU-8 negativa fotoresist (figur 2A).
    Obs: PL är en standard mikrofabrikation teknik där är ultraviolett (UV) ljus lyste på en mask som hålls över ett ljuskänsliga substrat. Ljus gör antingen olösliga (negativa motstår) eller lösliga (positiv motstår) utsatta områdena på substratet. Maskerna är dras i datorstödd konstruktion (CAD) programvara och sedan vanligtvis beställs från en leverantör. En mask-aligner används för att justera masker till befintliga mönster på ett substrat och utsätta dem för UV-ljus. Tillverkning av mesh elektronik kräver fyra olika masker (PL mask-1 genom PL mask-4). Vår mask design är tillgängliga på begäran eller från resurs webbplats, meshelectronics.org.
    1. Spin-coat SU-8 2000.5 negativa fotoresist på rånet vid 4000 rpm för en ungefärlig SU-8 tjockleken på 400 – 500 nm.
    2. Mjuk baka rånet på en värmeplatta för 1 min vid 65 ° C följt av 1 min på 95 ° C.
    3. Läsa in rånet i en mask aligner att exponera de SU-8 med PL mask-1 motsvarar mesh SU-8 bottenlagret. Exponera en i-line (365 nm våglängd) dos på 100 mJ/cm2.
    4. Inlägget baka rånet på en värmeplatta för 1 min vid 65 ° C följt av 1 min på 95 ° C.
    5. Fördjupa rånet i ett fack av SU-8 utvecklare. Blanda försiktigt lösningen för 2 min tills nätmönster i SU-8 har utvecklats helt. Skölj i en bricka med isopropylalkohol för 1 min och föna.
    6. Grädda hårt rånet på en värmeplatta vid 180 ° C i 1 h.
      Obs: SU-8 är normalt hårt bakade mellan 150 ° C och 250 ° C efter utveckling. Den hårda baka anneals ytan sprickor som kan bilda under utveckling och ytterligare antipyridinantikropp den SU-8 för att säkerställa mekanisk stabilitet. Hårt baka vid 180 ° C för SU-8 bottenlagret och 190 ° C för toppen SU-8 skikt ger bra resultat för mesh elektronik.
  3. Användning PL mask-2 att definiera metall interconnects och I/O pads (figur 2B).
    1. Spin-coat LOR3A på rånet vid 4000 rpm för en ungefärlig tjocklek 300 nm.
      Obs: LOR3A är en polydimethylglutarimide-baserad motstå vilka hastigheter prisunderskridande under förfarandet för efterföljande metallisering.
    2. Grädda rånet på en värmeplatta vid 180 ° C i 5 min.
    3. Spin-coat S1805 positiv fotoresist vid 4000 rpm för en ungefärlig tjocklek på 500 nm.
    4. Grädda rånet på en värmeplatta vid 115 ° C i 1 min.
    5. Läsa in rånet i en mask aligner att exponera S1805 med PL mask-2 motsvarar metallen interconnects och I/O kuddar. Exponera en h-linje (405 nm våglängd) dos på 40 mJ/cm2.
    6. Fördjupa rånet i ett fack för CD-26 fotoresist utvecklare. Blanda försiktigt lösningen för 1 min tills metallen interconnects mönster har varit fullt utvecklade. Skölj i en bricka med avjoniserat vatten (DI) i 1 min och föna.
    7. Termiskt avdunsta 3 nm av Cr följt av 80 nm au.
      Obs: En bastrycket av högst 5 x 10-7 T och beläggningshastighet på 1 Å/s vanligtvis ger den bästa filmkvalitet.
    8. Fördjupa rånet i en platt bägare remover PG för cirka 3 h tills metallen har fullt underskred, lämnar metallen endast i önskad interconnect och I/O pad regioner av mesh elektronik. Skölj i isopropylalkohol och föna.
  4. Använd PL mask-3 för att definiera Pt elektroder (figur 2 c).
    1. Upprepa steg 1.3.1 genom 1.3.4.
    2. Läsa in rånet i den mask aligner att exponera S1805 med PL mask-3 motsvarar Pt elektroderna. Exponera en h-line dos på 40 mJ/cm2.
    3. Fördjupa rånet i ett fack för CD-26 fotoresist utvecklare. Blanda försiktigt lösningen för 1 min tills Pt elektroder mönstret har utvecklats helt. Skölj i en bricka med DI för 1 min och föna.
    4. Använda electron beam förångare till insättning 3 nm av Cr följt av 50 nm för Pt.
      Obs: Typiska nedfall parametrar är 5 x 10-7 T bas trycket och andelen 2 Å / s.
    5. Fördjupa rånet i en platt bägare remover PG för cirka 3 h tills metallen har fullt underskred, lämnar Pt bara på önskad elektrod platser av mesh elektronik. Skölj i isopropylalkohol och föna.
  5. Använd PL mask-4 för att definiera toppen passivering lager av mesh elektronik med SU-8 negativa fotoresist (figur 2D).
    1. Upprepa steg 1.2.1 genom 1.2.5, utom utsätta med PL mask-4 motsvarar passivt mesh toppskiktet av SU-8.
    2. Grädda hårt rånet på en värmeplatta vid 190 ° C i 1 h.
      Obs: Denna temperatur är 10 ° C högre än för den hårda baka av botten SU-8 (steg 1.2.6). Detta förhöjd temperatur flödar lite botten SU-8, orsakar det att gå ihop med SU-8 toppskiktet och således bildar en enda, kontinuerlig SU-8 struktur.
  6. Mesh elektronik är nu komplett (figur 2E och figur 3); befria dem från Si rånet genom upplösning Ni uppoffrande lagret.
    1. Behandla rånet med syre plasma på 50 W i 1 min. Detta oxiderar SU-8 ytan, vilket gör det hydrofila och låta mesh skjutas lätt i vattenlösning.
    2. I en platt bägare, kombinera saltsyra järnklorid och DI på volymetriska förhållandet 1:1:20, respektive, att göra en lösning av Ni etsmedlet.
    3. Fördjupa rånet i en platt bägare av Ni etsmedlet lösningen för cirka 3 h tills mesh elektroniken har helt släppts från Si rånet.
    4. Använd en Pasteur-pipett överföra släppta maskor elektronik sonder från Ni etsmedlet till en 100 mL-bägare av DI. Överföra mesh elektronik till en färska bägare av DI minst 3 gånger för sköljning.
    5. Använd en Pasteur-pipett överföra mesh elektronik till en 70/30% etanol/vatten-lösning för desinfektion och sedan använda pipetten för att överföra mesh elektroniken till sterilt vatten för sköljning.
      Obs: Efter sterilisering-mesh elektroniken kan överföras till andra lösningar för funktionalisering. Till exempel för att främja cellulär adhesion, kan mesh elektroniken överföras till en vattenlösning av poly-D-lysin (1 mg/mL) för 24 h.
    6. Använd en Pasteur-pipett att överföra mesh elektroniken sonder till en 100 mL-bägare av sterila 1 x fosfat buffrad saltlösning (PBS) före injektion i vivo.

2. fyllning av Mesh elektronik i nålar

  1. Pipett innehavaren som köpt är öppet för flöde i båda ändar. Försegla slutet mittemot cirkulär skruv fästanordningen med epoxi, så det finns inget läckage under injektion (figur 4A). Låt epoxin härda innan du fortsätter.
  2. Sätt en glas kapillär nål i pipett hållaren. Fäst den på plats med hjälp av cirkulär åtstramning skruv och kon bricka (figur 4B). En 400 µm innerdiameter (650 µm ytterdiameter) glas kapillär nål användes för detta protokoll. Andra kapillär nål material (t.ex., metall) och diametrar kan användas men kan kräva ändringar i utformningen av mesh elektronik att säkerställa inmatningskapacitet.
    Obs: Kapillär nålar alltifrån 150 µm till 1,17 mm innerdiameter (250 µm till 1,5 mm ytterdiameter) har använts i vårt laboratorium. Injektion genom mindre nålar kan främjas genom att göra vinkeln i skärningspunkten mellan de tvärgående och längsgående SU-8 mesh element mer akut, minskar bredden på SU-8 mesh elementen, med tunnare SU-8 och använda en grövre (dvs., större enhet cell) mesh struktur. Fotomasker för maskor utformad för mindre kapillär nålar är tillgängliga på begäran eller från resurs webbplats, meshelectronics.org. Kommersiellt finns också glas kapillär nålar med en inre diameter av 400 µm och yttre diameter 550 µm. Dessa minska akut vävnadsskador som orsakats av injektion medan att upprätthålla kompatibilitet med maskor som kräver en 400 µm inre diameter, men de användes inte för de studier som beskrivs här.
  3. Bifoga en 1 mL spruta till sida utlopp pipett innehavaren med en 2 – 4 cm längd på kapillär slang.
  4. Sätt glas kapillär nålen i 100 mL bägaren PBS med mesh elektroniken. Placera den nålen nära I/O kuddar av en maska elektronik probe och manuellt återkalla sprutan för att rita en mesh elektronik sond in nålen (figur 5 och kompletterande Video 1).
    Obs: De I/O kuddar, stem interconnect regionen och mesh enheten region är lätt identifierbara för blotta ögat när mesh elektronik sonderna svävande i lösningen. Detta möjliggör entydig lastning av mesh elektronik in nålar med rätt orientering.
  5. Push/pull sprutkolven medan fortfarande nedsänkt i saltlösning för att justera positionen av mesh elektronik inom nålen.
    Obs: Perfekt positionering är med regionen ultraflexible mesh enhet som nära slutet av nålen som möjligt. Denna konfiguration minimerar volymen av vätska som kommer att injiceras in i hjärnan samtidigt säkerställa regionen enhet injiceras först och I/O kuddar senast.
  6. Försiktigt loss kapillär slangen från utloppet sida av innehavaren av pipetten. Lossa den långsamt för att undvika att skapa ett sug kraft som kan förändra positionen för mesh elektroniken i nålen.

3. stereotaxic injektion av Mesh elektronik i levande mus hjärnan

Obs: Möss var bedövas av intraperitoneal injektion med en blandning av 75 mg/kg ketamin och 1 mg/kg dexdomitor. Graden av anestesi verifierades med metoden tå nypa före början kirurgi. Kroppstemperatur underhölls genom att placera musen på en 37 ° C homeothermic filt medan under narkos. Rätt sterila teknik genomfördes för operationen, inklusive men inte begränsat till autoklavering alla metall kirurgiska instrument för 1 h före användning, använder steriliserad handskar, med en varm pärla sterilizer under hela operationen, underhåll av ett sterilt fält runt operationsområdet, desinfektion av plast instrument med 70% etanol och avhårats hårbotten var huden förberedd med iodophor före snittet. För överlevnad operationer, efter ingåendet av operationen, antiobiotic salva tillämpades runt såret och musen återlämnades till en bur som är utrustade med en 37 ° C värmedyna. Möss var inte lämnas utan uppsikt tills de hade återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning. Möss fick buprenorfin smärtlindring via intraperitoneal injektion med en dos på 0,05 mg/kg kroppsvikt varje 12 h för upp till 72 h efter operationen. Möss var isolerade från andra djur som efter operation. Möss var euthanized via antingen intraperitoneal injektion av pentobarbital vid en dos på 270 mg/kg kroppsvikt eller via transcardial perfusion (se steg 6.1). Utredarna kan avse Geiger, o.a. 30, Kirby, o.a. 31och Gage, et al. 32 för information om gnagare stereotaxic kirurgi.

  1. Söva musen och fixa det i en stereotaxic ram.
  2. Gäller okulär smörjmedel för musens ögon att förhindra torrhet under anestesi.
  3. Använd en dental borr och stereotaxic ram för att öppna en kraniotomi på önskade koordinater på skallen. Öppna en andra kraniotomi från injektionsstället för införande av rostfritt stål jordning skruv- eller tråd.
  4. Fixa en fastspänning substrat till skallen med dentala cement. Klipp ett ca 1 mm brett gap i substratet att förbättra tillförlitligheten hos de fällbara steget senare under proceduren.
    Obs: En flat flexibel kabel (FFC) klipp till ett ”L” form fungerar bra (figur 7A), även om många material skulle fungera så länge de är av rätt tjocklek för 32-kanalen noll insertion force (ZIF) kontakt (avsedd för 0,18 ± 0,05 mm tjocka kablar).
  5. Montera hållaren för pipetten med nålen som innehåller mesh elektronik på stereotaxic ramen med en rät vinkel slut klämma (figur 4 c och figur 6A).
  6. Fäst sida utloppet av innehavaren av pipett en 5 mL sprutan fäst i en spruta pumpen (figur 6 d) med en ca 0,5 – 1 m längd på kapillär slang.
    Obs: Se till att det finns inga bubblor i kapillär slangen innan du ansluter den till innehavaren pipett. Bubblor kan avbryta flödet under injektion och förhindra en smidig, kontrollerad leverans av mesh elektronik.
  7. Använda den stereotaxic ram för att placera spetsen på nålen på önskad start plats i hjärnan.
    Obs: Mesh elektronik sonderna används här är utformade med inspelning elektroder spridda över en längd av ca. 2 mm och med den första elektroden ligger ca. 0,5 mm från start kanten av mesh elektronik (vänster kanten i figur 3A). Av denna anledning bör de stereotaxic koordinaterna väljas så att startplatsen är 0,5 mm djupare än hjärnregionen av intresse. Spridning och läge av inspelning elektroderna inom mesh elektronik kan väljas fritt under mask designprocessen och bör väljas så att inspelningen elektroderna span hjärnan regionerna av intresse som de injiceras längs deras stereotaxic bollbana.
  8. Placera kameran (figur 6B) för att visa upp i mesh elektronik sonden inom glas nålen. Vissa program tillåter användaren att rita en linje på skärmen för att markera den ursprungliga positionen av mesh elektronik.
  9. Starta flödet genom att ställa in sprutpumpen på en låg hastighet och trycka på Start. 10 mL/h är en typisk start flödeshastighet för en 400 µm innerdiameter kapillär nål. Långsamt öka flödet om mesh elektronik sonden inte rör sig inom nålen.
    Obs: Det är viktigt att minimera volymen av vätska injiceras in i hjärnan eftersom det kan skada vävnaden som omger injektionsstället. Bästa resultat uppnås med injektionsvolymer mindre än 25 µL per 1 mm av injicerade mesh längd. Ideala värden är mindre än hälften av denna volym; i vårt laboratorium injicera vi vanligtvis 10-50 µL per en 4 mm injiceras mesh längd.
  10. Som mesh elektronik sonden börjar röra nålen, använda den stereotaxic ram att dra tillbaka nålen i samma takt som mesh elektronik sonden är som injiceras, med markerade ursprungsläget mesh elektronik som en guide.
    Obs: Detta förfarande, kallas de synfält (FoV) injektion metod25, möjliggör exakt leverans av mesh elektronik till en riktad hjärnregionen utan att skrynkla eller störningen. Flödet kan ofta minskas när mesh elektronik sonden börjar flyttar inom nålen. I vårt laboratorium, flöden av 20 – 30 mL/h krävs ofta att övervinna den statiska friktionen mellan mesh och kapillär nål väggar, men priset kan då minskas till 10 mL/h när den injektionsprocessen har inletts. Flöden och injektionsvolymer är oftast mindre för mindre diameter kapillär nålar.
  11. Fortsätt flöda saltlösning och infällbara nålen tills nålen har avslutat skallen. Stoppa flödet från sprutpumpen.

4. ingång/utgång gränssnitt

Obs: vid denna punkt, mesh elektronik sonden har injicerats från önskad startpunkt inom hjärnan längs den valda banan. Nålen har återkallats och precis ovanför kraniotomi med mesh elektronik interconnects som spänner från hjärnan till nålen och den i/o kuddar fortfarande inuti nålen (figur 7B). I detta avsnitt används ett tryckt kretskort (PCB; Figur 7, figur 8) gränssnittet till mesh elektronik sonden. Kretskortet ansluts en ZIF-kontakt till en 32-kanals standard förstärkare kontakt genom en isolerande substrat som blir huvud-scenen för neurala inspelning experiment. PCB är anpassningsbar för att rymma olika huvud-scenen konfigurationer. Vår designfiler är tillgängliga på begäran eller från den resurs webbplats, meshelectronics.org och kan användas till att köpa PCB billigt från leverantörer av PCB tillverkning och montering tjänster.

  1. Använda den stereotaxic ram att noggrant styra nålen till den FFC fastspänning substrat och över gapet, flyter lösningen med sprutpumpen att generera slack i mesh elektronik interconnects (figur 7 c).
  2. När nålen är ovanför fastspänning substratet och över gapet, återuppta flödet i snabb takt att mata ut mesh elektroniken I/O pads på fastspänning substratet (figur 7 d).
  3. Använda pincett och en pipett för DI, böj de I/O kuddar till ca. 90° vinkel som nära den första I/O pad som möjligt.
    Obs: Böjning är nödvändigt att tillåta kuddar ska infogas i ZIF-kontakten på en PCB i ett efterföljande steg. ZOm kontakten är exakt samma bredd som de 32 I/O kuddar av mesh elektronik sonden, så en ofullkomlig 90° böj, eller en böj inte inträffar precis innan den första I/O pad, kommer att resultera i behöva skära av I/O pads (vänster mest kuddar i figur 7E).
  4. När I/O kuddar är justerade, Övik, och i 90° vinkel mot mesh stjälken, torr dem på plats med försiktigt rinner tryckluft.
    Obs: Mesh elektronik sonder med färre än 32 kanaler kan vara gränssnitt till med samma 32-kanals gränssnittskortet. Vårt labb använder till exempel ofta 16-kanals mesh elektronik sonder med 32-kanals PCB. Detta ger extra utrymme inom ZIF kontakten, att göra gränssnitt enklare, och de extra isolerade kanalerna identifieras enkelt öppna kretsar genom impedans testning under inspelningarna.
  5. Skär fastspänning underlaget vid en rak kant cirka 0,5 – 1 mm från kanten av I/O kuddar. Skär även bort ovidkommande delar av fastspänning substratet som hindrar införandet i PCB-monterad 32-kanals ZIF-kontakten (figur 7F).
  6. Sätt de I/O kuddar i ZIF kontakten på Kretskortet och nära spärren (figur 7 g). Användning mätning elektronik att mäta impedansen mellan kanalerna och marken skruven att bekräfta lyckad gränssnitt. Om impedans värdena är för höga, frigöra ZIF kontakten, justera insättningspunkten och testa igen förrän anslutningen har bekräftats.
  7. Täcka kopplingen ZIF och exponerade mesh elektronik interconnects med dentala cement för skydd. Vänd PCB vid gap i substratet, och åtgärda PCB med cement på mus skallen (figur 7 H).
    Obs: Böjning i FFC på mellanrummet minskar den mekaniska påfrestningar som kan ibland bryta mesh elektronik interconnects.
  8. Låt cementen hårdnar, förvandlas en robust, kompakt huvud-scen för gränssnitt under efterföljande inspelningarna (figur 7I) PCB.

5. neurala inspelning experiment

  1. Placera musen i en tailveiner eller andra fasthållning33. Sätt förförstärkare PCB i standard förstärkare kontakten på huvudet-stegs Kretskortet. Använd en separat kabel till marken referens skruven.
  2. För återhållsamma inspelningar, lämna musen i fasthållning. Spela in data med hjälp av datainsamlingssystemet för önskad tidsperiod (figur 8A).
  3. För fritt rörliga inspelningar, släppa musen från fasthållning efter att infoga förförstärkare PCB och jordning referens skruven. Rekord för önskad längd av tid använda datainsamlingssystemet medan musen beter sig fritt (figur 8B).
  4. I slutet av inspelningen, sätt musen tillbaka fasthållning, om det behövs. Ta bort jordning tråd och förförstärkare, sedan släppa musen tillbaka till sin bur och returnera den till djuranläggningen till nästa inspelningssession.

6. histologiska snittning, färgning och Imaging

  1. Vänta tills önskad tid efter injektionen, då söva musen och transcardially BEGJUTA med formaldehyd. Ta bort, frysa och cryosection hjärnan i 10 µm tjocka skivor. Ett detaljerat protokoll på immunohistokemi och kryosnitt av gnagare hjärnvävnad kan hittas i Evilsizor, et al. 34.
    Obs: Hjärnvävnad som innehåller mesh elektronik kan fastställas och sektioneras normalt, även om den övervakning elektroniken är kvar inuti. Detta är en unik förmåga jämfört med konventionella neurala sonder, som måste tas bort innan snittning och därför kan ändra vävnaden eller göra det svårt att analysera gränssnittet sond-vävnad.
  2. Skölj de frusna hjärna vävnadssnitt 3 gånger i 1 x PBS.
  3. Blockera avsnitten i en lösning av 0,3% Triton x-100 och 5% get serum i 1 x PBS. Låt stå i rumstemperatur 1 h.
  4. Inkubera i avsnitt med lösningen av primära antikroppar. Primär antikropp lösningarna används här var kanin anti-NeuN (spädning 1: 200), musen anti Neurofilament (1: 400 spädning) och råtta anti-Fredsgenomförande (1: 500 utspädning) med 0,3% Triton x-100 och 3% get serum. Inkubera över natten vid 4 ° C.
  5. Skölj i avsnitt 9 gånger för totalt 40 min med 1 x PBS.
  6. Inkubera i hjärnan avsnitt med lösningen av sekundära antikroppar. De sekundära antikroppar lösningar används här var Alexa Fluor 488 get anti-kanin (spädning 1: 200), Alexa Fluor 568 get antimus (spädning 1: 200) och Alexa Fluor 647 get anti råtta (spädning 1: 200). Inkubera i avsnitt 1 h i rumstemperatur.
  7. Skölj i avsnitt 9 gånger för totalt 30 min med 1 x PBS.
  8. Montera avsnitten på glasskivor med coverslips använder antifade monteringsmedel. Lämna bilder i mörkret under minst 24 h innan imaging.
  9. Bild bilder med en confocal Mikroskop med 488 nm, 561 nm, och 633 nm lasrar som magnetisering källorna för Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 och Alexa Fluor 647, respektive. Använda differential störningar kontrast (DIC) till bild mesh elektroniken på mikroskopet samma för efterföljande överdra av bilderna och analys.

Representative Results

Resultaten kommer att variera beroende på djurarterna i studien, riktade hjärnregionen, förfluten tid sedan injektionen, mängden akut skada under injektion, och framgången för I/O gränssnitt förfarandet, bland andra faktorer. Enstaka tillsatta aktivitet kan inte visas förrän 1 dag (vid 150 µm innerdiameter nålar) till 1 vecka efter injektion och spike amplituderna kan variera upp till 4 – 6 veckor. Figur 9 visar representativa elektrofysiologiska data från en 32-kanalers mesh elektronik probe injiceras i hippocampus och primära somatosensoriska cortex av en vuxen hane C57BL/6J mus. Cirka 300-µV amplitud lokala fältet potentialer (LFPs) spelades på alla 32 kanaler och enstaka tillsatta aktivitet spelades på 26 kanaler. De LFPs och isolerade spikar var liknande mellan 2 och 4 månader, vilket tyder på en mycket stabil gränssnitt mellan inspelning elektronik och nervceller under denna förlängda period. Figur 10 visar representativa resultat av histologiska snittning och immunfärgning av hjärnvävnaden som innehåller mesh elektronik 1 år efter injektionen. Färgning för NeuN, en markör för neurala somata och neurofilament, en markör för neurala axoner, avslöjar lite till ingen förlust av vävnad densitet vid injektionsstället, vilket innebär sömlös samverkan mellan mesh elektronik och hjärnan vävnaden. Färgning för Fredsgenomförande (en markör för astrocyter) ytterligare avslöjar nära-bakgrundsnivåer av astrocyter runt mesh elektronik, som anger att dess närvaro framkallar lite kronisk immunsvar.

Figure 1
Figur 1: steg i en spruta-injicerbara mesh elektronik experiment. Det här protokollet beskriver alla viktiga steg i en typisk gnagare neurala inspelning experiment med mesh elektronik. Experiment brukar medföra, i ordning efter genomförandet, (1) tillverkning av mesh elektronik, (2) påfyllning av mesh elektronik i kapillär nålar, (3) stereotaxic injektion av mesh elektronik i hjärnan, (4) elektrisk I/O gränssnitt om maskstorlek elektronik, (5) återhållsam eller fritt rörliga inspelningar och (6) mesh/vävnad snittning och färgning för histologi. I några studier, kan endast histologi data önska, i vilket fall steg (4) och (5) kanna bli hoppat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk föreställande fabrication förfarandet för plug-and-play mesh elektronik i regionen ultraflexible enhet (översta raden), stem interconnects region (mellersta raden) och I/O regionen (nedersta raden). (A) SU-8 negativa fotoresist (röd) är mönstrade med PL mask-1 att definiera botten passivering lager av varje plug-and-play mesh elektronik sond. (B) mönster med PL mask-2 termiska avdunstning och metall lyft definiera Au interconnects och I/O pads (guld). (C) mönster med PL mask-3, electron beam avdunstning och metall lyft definiera Pt elektroder (blå). (D) SU-8 negativa fotoresist (röd) är mönstrade med PL mask-4 att definiera passivt toppskiktet. Öppningar i SU-8 lämnas varje Pt elektrod och I/O pad. (E) en klar mesh elektronik probe med streckad rutor som anger de platser som förstoras i toppen, mitten och botten rader. Photomasken designfiler är tillgängliga genom en begäran från författarna eller från resurs webbplats, meshelectronics.org. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: fotografier och optiska mikroskopbilder av plug-and-play mesh elektronik. (A) klinkergolv optiska mikroskopbilder av en spruta-injicerbara mesh elektronik probe med plug-and-play i/o. Sonden fotograferades efter slutförandet av tillverkning kliver i figur 2 men före utgivningen från Ni-belagd underlaget. Streckad rutorna motsvarar från vänster till höger till delar av den ultraflexible enheten region, stam och I/O region förstorat i C, D och E, respektive. Skalstapeln = 1 mm. (B) fotografi av en 3 tums Si wafer innehållande 20 avslutade mesh elektronik sonder. Skalstapeln = 20 mm. (C) optiska mikroskop bild av 20 µm diameter Pt inspelning elektroder i regionen ultraflexible enhet. Skalstapeln = 100 µm. (D) optiska mikroskop bild av högdensitets Au interconnects i regionen stam. Varje Au interconnect är elektriskt isolerad och ansluter en enda Pt-elektrod till en enda I/O-pad. Skalstapeln = 100 µm. (E) optiska mikroskop bild av I/O kuddar. Varje pad består av en hopfällbar mesh och en kontinuerlig tunnfilms-region ligger på stammen. Icke-ledande SU-8 band ansluta mesh portionr av kuddar tillsammans för att bibehålla anpassningen. Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: montering av apparater för att hålla kapillär nålar under injektion. (A) fotografi av komponenter i apparaten. Komponenterna inkluderar (1) en glas kapillär nål, (2) en pipett hållare, (3) ett cirkulär skruv-fästelement för innehavaren av en pipett, och (4) en kon bricka för innehavaren av en pipett. Artiklar (2) genom (4) ingår med köpet av en pipett hållare. Pilen markerar utloppet av innehavaren pipett som behöver limmas stängd med epoxi. (B) fotografi av innehavaren pipetten efter montering och införande av en glas kapillär nål. Tillsatt epoxi är synlig vid övre utlopp av innehavaren pipett (markerad med pil) och kapillär slangen ansluter pipett innehavaren till en spruta (visas inte). (C) fotografi av innehavaren av pipetten och kapillär nålen efter den bifogade filen till stereotaxic ram med en rät vinkel slut klämma. Skala barer är 1 cm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: fyllning av mesh elektronik i glas nålar. (A) Schematisk illustration av det Ladda tillvägagångssättet för plug-and-play mesh elektronik. En glas-nål är placerad nära I/O slutet av en mesh elektronik probe medan den är upphängd i lösning. Sprutkolven är sedan manuellt indraget för att rita i mesh elektronik sonden. Idealisk placering är med regionen ultraflexible enhet precis innanför slutet av nålen. (B) fotografier motsvarar (A) för en mesh elektronik probe laddas i en glas-nål. Skala barer = 2 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Schematisk av stereotaxic kirurgi stationen. En motordriven stereotaxic ram (A) med tillhörande pipett hållare används för att placera nålen till önskad hjärnregionen. Placeringen av nålen och laddade mesh elektronik övervakas med en objektiv och Fäst kameran (B) och visas på en dator (C). En sprutpump (D) flödar exakta mängder saltlösning genom nålen, vilket möjliggör korrekt, kontrollerade injektion av mesh elektronik i önskad hjärnregionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Plug-and-play I/O gränssnitt förfarande. (A) en FFC fastspänning substrat är säkrad med dentala cement intill kraniotomi. (B) Plug-and-play mesh elektronik stereotaxically injiceras i önskad hjärnregionen med metoden FoV. (C), nålen, med I/O kuddar av mesh elektronik probe fortfarande inne, flyttas över till FFC fastspänning substrat. (D) flöde återupptas genom nålen att mata ut de I/O kuddar på de FFC fastspänning substrat. (E) de I/O kuddar är böjd 90 ° i förhållande till stammen, ovikt med den ledande uppåt och torkade på plats. (F) FFC substrat är putsade med sax till en straight-line ca. 0,5 mm från kanten av I/O kuddar. Överskjutande substrat skärs bort för att tillåta införande i ett 32-kanals ZIF-kontakten. (G), I/O pads infogas i en 32-kanalers ZIF-kontakt monterad på en anpassad PCB. ZOm kontakten är låst stängd att göra kontakt med I/O pads. (H), spärren är cementerade stängd, PCB är vänt på kraniet, och PCB är fast på plats med dentala cement. (jag) The PCB bildar en kompakt headstage med en vanlig förstärkare-kontakt för enkel gränssnitt under inspelningarna. Skala barer = 1 cm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: återhållsamma och fritt rörliga inspelningar. (A) fotografi av en manlig C57BL/6J mus i en fasthållning under en inspelning. En 32-kanalers förförstärkare PCB har satts in kopplingen standard förstärkare. (B) fotografi av samma mus med 32-kanalers förförstärkare PCB under ett fritt rörliga inspelning experiment. Skala barer = 1 cm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: representativa neurala inspelning resultat. (A) representant LFP värmekartor från 32-kanals mesh elektronik sonder injiceras i mus hippocampus och somatosensoriska cortex. Data registrerades medan musen fritt utforskade sin bur på 2 månader (överst) och 4 månader (nederst) efter injektion. LFP amplituden är färgkodade enligt på färgremsan längst till höger. Hög-pass filtrerad spår (svart) visar tillsatta aktivitet överdras på spektrogram för var och en av de 32 kanalerna. (B) spikar isolerad efter sortering data plottas i (A). Enstaka tillsatta aktivitet identifierades på 26 32 kanaler både 2 månader efter injektion (överst) och 4 månader efter injektion (nederst). Siffrorna ovan varje kluster av spikar motsvarar kanalnummer (a). Denna siffra har ändrats från Fu, o.a. 28. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10: representativa histologi resultat. (A) Schematisk bild som illustrerar inriktningen av mesh elektronik vågrätt (mellersta panelen) och sagittal (nedre panelen) hjärnan skivor. (B) fluorescens Mikroskop bild 10 µm tjock kortikala hjärnan bitens året efter injektion av en 16-kanal mesh elektronik probe. Segmentet har varit immunostained för NeuN (grön). (C) samma hjärnan segment immunostained för neurofilament (röd). (D) den samma hjärnan slice immunostained för Fredsgenomförande (cyan). (E) A sammansatt bild av (B) genom (D) visar mesh elektronik/vävnaden gränssnitt med märkta NeuN (grön), neurofilament (röd), Fredsgenomförande (cyan), och mesh elektronik (blå). Skala barer = 100 µm. Denna siffra har ändrats från Fu o.a. 27. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Kompletterande Video 1: upprepade lastning och injektion av mesh elektronik i lösning. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

Alla steg i tillverkningen och användningen av mesh elektronik är viktiga, men några är särskilt kritisk. Innan du släpper mesh elektroniken från deras wafer, är det viktigt att oxidera ytan för att göra maskorna lätt svävande i vattenlösning (steg 1.6.1). Om detta steg hoppas över, maskorna brukar flyta på ytan av vattnet, vilket gör dem svåra att läsa in i nålar, och om de kan vara laddade, de ofta håller sig till sidorna av glas nålar, som kräver stora volymer (> 100 µL) för injektion. Underlåtenhet att oxidera ytan innan release, därför vanligtvis innebär att maskorna inte kan användas och tillverkning måste åter utförd från början. Ett annat viktigt steg bockning mesh elektroniken ”hejda” till ~ 90° under I/O gränssnitt (steg 4,3). Om vinkeln är mindre än 90°, sedan passar alla 32 I/O kuddar inte till ZIF kontakten; några har blir avskurna i slutet att tillåta införande, att minska antalet anslutna elektroder. Processen måste också göras försiktigt för att förhindra att stjälken bryts.

Utformningen av mesh elektronik kan anpassas för olika tillämpningar genom att ändra fotomasker och använder samma fabrication förfarande som beskrivs i figur 2. Till exempel, medan mesh elektronik sonderna används för att registrera data i figur 9 var avsedda att ha 32 inspelning elektroder span mus hippocampus och primära somatosensoriska cortex, kan elektrodplacering inom den ultraflexible mesh vara valt för att inrikta sig på praktiskt taget alla regioner i hjärnan, eller större elektroder för stimulering kan vara bolagiserade27. Samma grundläggande mesh struktur och fabrication förfarande bevaras, men elektrodplacering och utformning är justerade för att tillgodose behovet av studien. Utredare ska försiktig, dock, och alltid testa att modifierade konstruktioner kan injiceras enkelt genom de avsedda nålarna. Små förändringar till böjande mekanik av mesh elektronik kan ha betydande effekter på inmatningskapacitet. Ett sådant exempel är att en 45° vinkel mellan tvärgående och längsgående SU-8 band ger en mesh elektronik probe som kan injiceras facilely men 90° vinkel resulterar i en som crumples och träskor nålar21.

Mäta impedansen hos inspelning elektroderna är användbart för felsökning. En 20 µm diameter cirkulär Pt elektrod bör ha en impedans magnitud nära 1 MΩ mätt vid en frekvens på 1 kHz i vivo eller 1 x PBS29. En impedans som är betydligt större än detta innebär att elektroden är inte utsatt, vilket kan hända om det är förorenat med fotoresist rester, eller inte elektriskt ansluten. Den senare kan uppstå om det exempelvis finns damm på foto masken under PL som resulterar i en koppla i Au interconnects, eller om en av mesh I/O kuddar inte är kontaktats av de ZIF kontaktstift under I/O gränssnitt. En impedans storlek ungefär hälften det förväntade värdet antyder att kanalen kan vara kortsluten till den intilliggande, skapa en krets av två elektrod impedanser parallellt till varandra. Värdena uppmätta impedansen fungera som en guide under felsökning; kombinerat med optisk mikroskopi av mesh elektronik sonderna, källan till problemet kan vanligtvis identifieras och rättade i nästa fabrication kör eller I/O gränssnitt försök.

Användning av sprutan-injicerbara mesh elektronik för akuta studier är begränsat i det enstaka tillsatta aktivitet vanligtvis inte observeras förrän 1 vecka post injektion27, även senaste arbete (opublicerade) visar att problemet är lätt att övervinna. Avgörande faktorer för den tid som krävs att se tillsatta aktivitet är mesh design, volymen av vätska injiceras i hjärnan tillsammans med mesh elektronik och diametern på nålen används för injektion, eftersom dessa påverkar graden av vävnadsskada under den injektion och graden av healing. Stora injektionsvolymer kan krävas om mesh elektroniken inte behandlas med syrgas plasma före utgivningen i Ni etsmedlet; det vill säga om maskorna inte är hydrofil, kan den följa glas nålen. Ibland, har maskorna defekter som leder till böjning mekanik vilket gör dem svåra att injicera. Under lastning av mesh elektronik är det viktigt att kontrollera att maskorna går enkelt och smidigt inom nålen (som visas i kompletterande Video 1). Om så inte är fallet, en elektronisk sond med olika maskstorlek bör användas. Bästa resultat för sömlös neurala gränssnitt kommer att uppnås med de idealiska injektionsvolymer på 10 – 50 µL per 4 mm av injicerade mesh längd. Nyare resultat med finare mesh elektronik sonder injiceras eller mindre diameter kapillär nålar (så liten som 150 µm innerdiameter, 250 µm ytterdiameter) Visa att enhet tillsatta kan observeras från strax efter injektionen (akut mätningar) genom längre tider. Masken designfiler för dessa finare mesh strukturer finns genom begäran eller från resurs webbplats, meshelectronics.org. Vi uppskattar den totala avkastningen av våra i vivo mesh injektion förfaranden med 400 µm innerdiameter (650 µm ytterdiameter) nålar till omkring 70%, även om avkastningen är närmare 80-90% för våra nyare arbete med 150 µm innerdiameter (250 µm ytterdiameter ) nålar. De vanligaste felorsakerna är (1) att inte injicera mesh smidigt, vilket resulterar i hjärnan ödem från oväntat stora injektionsvolymer in i hjärnan, (2) mesh brott under den manuella manipulation som krävs i I/O gränssnitt förfarande, och (3) blödning från skadar ett blodkärl under injektionen. Skadar ett blodkärl under injektion är sällsynt (orsaken till mindre än 10% av misslyckanden) och kan minskas ytterligare med hjälp av bild-guidad kirurgi. Vi noterar också att skador av blodkärl är en vanlig begränsning av alla förfaranden som rör penetration av hjärnvävnaden, inklusive injektion av viruspartiklar för transfection, implantation av styv brain sonder, och injektion av mesh elektronik.

Mesh elektronik sonder är stabilt spela in från och spåra samma enskilda nervceller på minst månader till år tidsskalor och framkalla nästan ingen kronisk immunrespons, som visas i figur 9 och figur 10, respektive. Detta utgör en betydande fördel jämfört med konventionen djup elektroder, som ofta lider av minskande spike amplituder, instabil signaler och kronisk inflammation under loppet av långsiktiga inspelning experiment14, 15. Dessutom mesh elektroniken har fördelen att de kan lämnas i vävnaden vid histologiska snittning, färgning, och imaging, i motsats till konventionella sonder, som är alltför stelbenta och måste därför avlägsnas före histologi analyser. Mesh elektronik möjliggör därför en unik förmåga att använda immunhistokemisk analys för att studera just den cellulära miljön som omger varje inspelning webbplats.

Det protokoll som presenteras här öppnar upp spännande nya möjligheter i neurovetenskap. Minimalt invasiva leveransmetod och sömlös integrering av mesh elektronik med hjärnvävnad minimerar störningar i neurala kretsar och undviker kroniska immunsvar, som skulle kunna gynna de flesta typer av kronisk neurala inspelning experiment. Förmågan av mesh elektronik vid rekordet och spårar samma enda nervceller för långa perioder blir särskilt intressanta för utredarna försöka korrelera millisekund-skala tillsatta aktivitet med månad till år långa processer såsom åldrande, den patogenesen av hjärnsjukdom eller hjärna utveckling16,18. Dessutom finns det stora möjligheter att utöka och anpassa detta protokoll, till exempel lägga till aktiv elektronik till PCB huvud-scenen för att implementera funktioner som digital multiplexing8,35, trådlös kommunikation35,36,37och signalbehandling35, Co injicera stamceller eller polymerer med mesh elektronik till stöd i vävnad förnyelse18,38, 39, och införliva nanotråd field - effecttransistorer (NW-fETsna) i mesh elektronik för mycket lokaliserad och multifunktionella brain sonder24,29,40,41 ,42.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgements

C.M.L. erkänner stöd av detta arbete genom av Air Force Office för vetenskaplig forskning (FA9550-14-1-0136), en Harvard University Physical Sciences och Engineering Accelerator award och nationella institut för hälsa regissörens Pioneer Award ( 1DP1EB025835-01). T.G.S. erkänner stöd av Department of Defense (DoD) genom programmet National Defense Science & Engineering Graduate Fellowship (NDSEG). G.H. erkänner gemenskap stöd från American Heart Association (16POST27250219) och vägen till självständighet Award (överordnade K99/R00) från National Institute on Aging av National Institutes of Health. Detta arbete utfördes delvis vid Harvard University Center för nanoskala system (CNS), en medlem av den nationella nanoteknik samordnad infrastruktur Network (NNCI), som stöds av National Science Foundation under NSF ECCS Award nr 1541959.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Motorized stereotaxic frame World Precision Instruments MTM-3 For mouse stereotaxic surgery
512-channel recording controller Intan Technologies C3004 A component of the neural recording system
RHD2132 amplifier board Intan Technologies C3314 A component of the neural recording system
RHD2000 3 feet ultra thin SPI interface cable Intan Technologies C3213 A component of the neural recording system
Mouse restrainer Braintree Scientific TV-150 STD Standard 1.25 inch inner diameter; used to restrain the mouse during restrained recording sessions.
Si wafers Nova Electronic Materials 3" P <100> .001-.005 ohm-cm 356-406 μm Thick
Prime Grade SSP Si wafers w/2 Semi-Std. Flats &
6,000 A°±5% Wet Thermal Oxide on both sides.
Photomasks (chrome on soda lime glass) Advance Reproductions Advance Reproductions and other vendors manufacture photomasks from provided design files. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. Alternatively, some university clean rooms have mask writers for making photomasks on site.
AutoCAD software Autodesk Inc. Design software for drawing photomasks. A free alternative is LayoutEditor. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org.
Thermal evaporator Sharon Vacuum Used to evaporate Ni, Cr, and Au onto mesh electronics during fabrication. Many university clean rooms have this or a similar tool.
SU-8 2000.5 negative photoresist MicroChem Corp. Negative photoresist used to define the bottom and top passivating layers of mesh electronics.
MA6 mask aligner Karl Suss Microtec AG Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool.
SU-8 developer MicroChem Corp. Used to develop SU-8 negative photoresist following exposure to UV light.
LOR3A lift-off resist MicroChem Corp. Used with Shipley 1805 photoresist to promote undercutting during metal lift-off processes
Shipley 1805 positive photoresist Microposit, The Dow Chemical Company Positive photoresist used to define metal interconnects and Pt electrodes in mesh electronics
MF-CD-26 positive photoresist developer Microposit, The Dow Chemical Company To develop S1805 positive photoresist after exposure in a mask aligner. Many university clean rooms stock this chemical.
Spin coater Reynolds Tech For coating wafers with positive and negative resists. Most university clean rooms have spin coaters.
PJ plasma surface treatment system AST Products, Inc. Used to oxidize the surface of mesh electronics prior to release into aqueous solution. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Electron beam evaporator Denton Vacuum For evaporating Cr and Pt during fabrication of mesh electronics. Many university clean rooms have this or a similar tool.
Remover PG MicroChem Corp. Used to dissolve LOR3A and Shipley S1805 resists during metal lift-off
Ferric chloride solution MG Chemicals 415-1L A component of Ni etching solution
36% hydrochloric acid solution Kanto Corp. A component of Ni etching solution
Glass capillary needles Drummond Scientific Co. Inner diameter 0.40 mm, outer diameter 0.65 mm. Other diameters are available.
Micropipette holder U-type Molecular Devices, LLC 1-HL-U Used to hold the glass capillary needles during stereotaxic injection
1 mL syringe NORM-JECT®, Henke Sass Wolf Used for manual loading of mesh electronics into capillary needles
Polyethylene intrademic catheter tubing Becton Dickinson and Company Inner diameter 1.19 mm, outer diameter 1.70 mm
5 mL syringe Becton Dickinson and Company Used in the syringe pump for injection of mesh electronics in vivo
Eyepiece camera Thorlabs Inc. DCC1240C Used to view mesh electronics within capillary needles during injection
ThorCam uc480 image acquisition software for USB cameras Thorlabs Inc. Used to view mesh electronics within capillary needles during injection
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000 Used to flow precise volumes of solution through capillary needles during injection of mesh electronics
EXL-M40 dental drill Osada 3144-830 For drilling the craniotomy
0.9 mm drill burr Fine Science Tools 19007-09 For drilling the craniotomy
Hot bead sterilizer 14 cm Fine Science Tools 18000-50 Used to sterlize surgical instruments
CM1950 cryosectioning instrument Leica Microsystems Used to slice frozen tissue into sections. Many universities have this or a similar tool available in a shared facility.
0.3% Triton x-100 Life Technologies Used for histology
5% goat serum Life Technologies Used for histology
3% goat serum Life Technologies Used for histology
Rabbit anti-NeuN Abcam ab177487 Used for histology
Mouse anti-Neurofilament Abcam ab8135 Used for histology
Rat anti-GFAP Thermo Fisher Scientific Inc. PA516291 Used for histology
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific Inc. P36930 Used for histology
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich Corp. P6407-5MG Molecular weight = 70-150 kDA
Right-angle end clamp Thorlabs Inc. RA180/M Used to attach the pipette holder to the stereotaxic frame
Printed circuit board (PCB) Advanced Circuits Used to interface between mesh electronics and peripheral measurement electronics such as the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on provided design files. Our PCB design files are available by request or at the resource site meshelectronics.org
32-channel standard amplifier connector Omnetics Connector Corp. A79024-001 Component assembled onto the PCB
32-channel flat flexible cable (FFC) Molex, LLC 152660339 Used as a clamping substrate when interfacing to mesh electronics I/O pads with the PCB-mounted ZIF connector
32-channel zero insertion force (ZIF) connector Hirose Electric Co., LTD FH12A-32S-0.5SH(55) Component assembled onto the PCB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopes da Silva, F. EEG and MEG: relevance to neuroscience. Neuron. 80, (5), 1112-1128 (2013).
  2. Logothetis, N. K. What we can do and what we cannot do with fMRI. Nature. 453, (7197), 869-878 (2008).
  3. Seymour, J. P., Wu, F., Wise, K. D., Yoon, E. State-of-the-art MEMS and microsystem tools for brain research. Microsystems & Nanoengineering. 3, 16066 (2017).
  4. Buzsaki, G. Rhythms of the Brain. Oxford University Press. (2006).
  5. Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nature Neuroscience. (2014).
  6. Hamel, E. J., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: an engineering approach. Neuron. 86, (1), 140-159 (2015).
  7. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, (7679), 232-236 (2017).
  8. Berenyi, A., et al. Large-scale, high-density (up to 512 channels) recording of local circuits in behaving animals. Journal of Neurophysiology. 111, (5), 1132-1149 (2014).
  9. Scholvin, J., et al. Close-Packed Silicon Microelectrodes for Scalable Spatially Oversampled Neural Recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 63, (1), 120-130 (2016).
  10. Schiller, P. H. The Central Visual System. Vision Research. 26, (9), 1351-1386 (1986).
  11. Benabid, A. L., Chabardes, S., Mitrofanis, J., Pollak, P. Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus for the treatment of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 8, (1), 67-81 (2009).
  12. Hochberg, L. R., et al. Reach and grasp by people with tetraplegia using a neurally controlled robotic arm. Nature. 485, (7398), 372-375 (2012).
  13. Lebedev, M. A., Nicolelis, M. A. Brain-Machine Interfaces: From Basic Science to Neuroprostheses and Neurorehabilitation. Physiological Reviews. 97, (2), 767-837 (2017).
  14. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148, (1), 1-18 (2005).
  15. Perge, J. A., et al. Intra-day signal instabilities affect decoding performance in an intracortical neural interface system. Journal of Neural Engineering. 10, (3), 036004 (2013).
  16. Hong, G., Yang, X., Zhou, T., Lieber, C. M. Mesh electronics: a new paradigm for tissue-like brain probes. Current Opinion in Neurobiology. 50, 33-41 (2017).
  17. Dai, X., Hong, G., Gao, T., Lieber, C. M. Mesh Nanoelectronics: Seamless Integration of Electronics with Tissues. Accounts of Chemical Research. 51, (2), 309-318 (2018).
  18. Feiner, R., Dvir, T. Tissue-electronics interfaces: from implantable devices to engineered tissues. Nature Reviews Materials. 3, (1), 17076 (2017).
  19. Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M., Siegelbaum, S. A., Hudspeth, A. J. Principles of Neural Science. McFraw-Hill. (2013).
  20. Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 48, (3), 361-371 (2001).
  21. Liu, J., et al. Syringe-injectable electronics. Nature Nanotechnology. 10, (7), 629-636 (2015).
  22. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, (3), 648-661 (2015).
  23. Saxena, T., Bellamkonda, R. V. A sensor web for neurons. Nature Materials. 14, 1190-1191 (2015).
  24. Xie, C., et al. Three-dimensional macroporous nanoelectronic networks as minimally invasive brain probes. Nature Materials. 14, (12), 1286-1292 (2015).
  25. Hong, G., et al. Syringe Injectable Electronics: Precise Targeted Delivery with Quantitative Input/Output Connectivity. Nano Letters. 15, (10), 6979-6984 (2015).
  26. Zhou, T., et al. Syringe-injectable mesh electronics integrate seamlessly with minimal chronic immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114, (23), 5894-5899 (2017).
  27. Fu, T. M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, (10), 875-882 (2016).
  28. Fu, T. M., Hong, G., Viveros, R. D., Zhou, T., Lieber, C. M. Highly scalable multichannel mesh electronics for stable chronic brain electrophysiology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114, (47), E10046-E10055 (2017).
  29. Schuhmann, T. G. Jr, Yao, J., Hong, G., Fu, T. M., Lieber, C. M. Syringe-Injectable Electronics with a Plug-and-Play Input/Output Interface. Nano Letters. 17, (9), 5836-5842 (2017).
  30. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  31. Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. Journal of Visualized Experiments. (65), e4079 (2012).
  32. Gage, G. J., et al. Surgical implantation of chronic neural electrodes for recording single unit activity and electrocorticographic signals. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
  33. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018).
  34. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. 10, (99), e52293 (2015).
  35. Sodagar, A. M., Perlin, G. E., Yao, Y., Najafi, K., Wise, K. D. An Implantable 64-Channel Wireless Microsystem for Single-Unit Neural Recording. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 44, (9), 2591-2604 (2009).
  36. Wentz, C. T., et al. A wirelessly powered and controlled device for optical neural control of freely-behaving animals. Journal of Neural Engineering. 8, (4), 046021 (2011).
  37. Harrison, R. R., et al. Wireless neural recording with single low-power integrated circuit. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 17, (4), 322-329 (2009).
  38. Landa, N., et al. Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat. Circulation. 117, (11), 1388-1396 (2008).
  39. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14, (7), 737-744 (2015).
  40. Zhang, A., Lieber, C. M. Nano-Bioelectronics. Chemical Reviews. 116, (1), 215-257 (2016).
  41. Zhou, W., Dai, X., Lieber, C. M. Advances in nanowire bioelectronics. Reports on Progress in Physics. 80, (1), 016701 (2017).
  42. Dai, X., Zhou, W., Gao, T., Liu, J., Lieber, C. M. Three-dimensional mapping and regulation of action potential propagation in nanoelectronics-innervated tissues. Nature Nanotechnology. 11, (9), 776-782 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics