벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피, 재구성 및 학부 실험실의 분석 결과 Polyhistidine의 태그 Metalloenzyme

Biochemistry
 

Summary

여기 우리가 현재 벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피 정화 태그 polyhistidine의 후속 재구성에 대 한 프로토콜, 비 heme 철 바인딩 dioxygenase 학부 교육 실험실에 적합.

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Colabroy, K. L., Mayer, K. Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory. J. Vis. Exp. (138), e58012, doi:10.3791/58012 (2018).

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Abstract

벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC), 태그 polyhistidine 단백질의 학부 학생 들에 의해 쉽게 마스터 그리고 현대 문학에서 가장 널리 사용 되 단백질 정화 방법 되고있다. 하지만, 산화 철, 민감한 금속에 특히 그들 금속 바인딩 단백질 친화성 크로마토그래피의 응용 프로그램은 종종 실험실 글러브 박스-일상적으로 학부에서 사용할 수 있는 장비에 대 한 액세스 제한 실험실입니다. 이 문서에서 설명 하는 절연, 아이맥 폴 리 히스티딘 태그의 정화 및 금속 이온 재구성, 산화 환 원 활성, 비 heme 철 바인딩 extradiol dioxygenase 및 다양 한 기판으로 dioxygenase의 분석 결과 대 한 우리의 벤치탑 메서드 농도 그리고 산소를 흠뻑 젖 게입니다. 이러한 메서드는 학부 학생 들에 의해 실행 되 고 액세스할 수 있고 주로 학부 기관에서 저렴 한 계측과 학부 교육 및 연구 실험실에서 구현.

Introduction

고정된 금속에 의해 히스티딘 태그의 chelation를 사용 하 여 호스트 유기 체의 추출 물에서 태그 polyhistidine 단백질의 정화의 첫 번째 보고서는 문학 19881,2입력. 그때 이후로, 재조합 단백질 및 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 의해 그들의 정화 태그 polyhistidine 추가 되었다 생 화 확 적인 문학3,4,에에서 거의 유비 쿼터 스 5. 아이맥 정화 방법 자동된 크로마토그래피를 사용 하 여 벤치탑 및 스핀 열 형식을 구현할 수 있습니다. 친 화력 정화 방법, 특히 아이맥, 연구 실험실에서 널리 이용 된다, 그러나 그들은 보다 적게 일반적 학부 교육 연구소. 생화학 실험실에 대 한 가장 널리 사용 되는 실험실 교과서 정기적으로 치지 않는다 이러한 방법, 대신 더 전통적인 이온 교환 또는 염료 바인딩 크로마토그래피6,,78 선택 , 9. 예를 들어 앤더슨10 젖 산 효소의 정화 염료 바인딩에서 선호도 사용 하 고 소 우유 α-lactalbumin7,11 Boyer에 의해 정화 사용 니켈 nitriloacetic 산 행렬, 하지만 아무 재조합 폴 리 히스티딘 태그, 수 지에 대 한 단백질의 본질적인 선호도에 대신 의존. 일부 현대 학부 실험실 교과서 및 출판물 녹색 또는 빨간색 형광 단백질12,13와 같은 폴 리 히스티딘은 단백질 목표에 고정된 금속 친화성 크로마토그래피를 구현 14,15,16, 항 체 및 선택한 효소17,18,,1920, 심지어 알 수 없는 함수21일부. 확실 하 게, 효소의 정화는 교육 연구소에서 바람직 대상 수 수 분석 활동에 대 한 후속 세션에서 학생; 편에서 "진짜 과학"의 경험을 풍부 하 게 하기 때문에 사실, 실험실 경험의이 종류는 출판 하 고 학생 들의 학습에 도움이 결과 보고17,18,,2021. 생화학 실험실 스파스, 유지 및 게시 방법 일반적으로 사용할 수 있는 크로마토그래피 계측에 대 한 액세스를 감히 심지어 수 있습니다 효소 정화를 아이맥의 애플 리 케이 션 교실 실험실에서 사용 하는 아직, 그리고 20. metalloproteins, 특히 그 활동22에 필수적인 산화 환 원에 민감한 divalent 금속 묶는 아이맥의 응용 프로그램에 제한이 있다. 자주, 금속 이온은 분실 또는 정화 저조한 학부 실험실에 어울리지 비활성 효소 중 산화.

효소의 전체 1/3 바인딩 금속 이온23, 그리고 모든 형태의 생활23에 대 한 거의 보편적인 요구에도 불구 하 고 철 틀림 없이 enzymology에서 가장 금속 이온 중. 비 헤 Fe2 + 바인딩 효소는 아이맥; 중 특히 손실 및 금속의 산화 하는 경향이 heme는 Fe와2 + 수에서 해리 아미노산 ligands24용이성 같은 전용된 유기 ligand의 결여 때문에 아마도 또한, Fe2 + Fe3 + 산소 의존 산화 용액, 부정적인 자유 에너지 변화와 Fe3 +의 상대적인 안정성 때문에 자연입니다. 종종, 이러한 과제는 혐 기성 분위기 및/또는 비-아이맥 컬럼에 방법22의 사용에 의해 극복 된다. 이 문서에서는, 우리 벤치탑 정화는 Fe2 + 종속 metalloenzyme l 아미노산의 일종 dioxygenase 사용 하 여 간단 하 고 저렴 한 크로마토그래피 소모품, Fe2 +, 활성 사이트의 재구성에 의해 다음 아이맥의 사용을 시연할 예정 이다 하 고 효소 분석 실험입니다. 이러한 방법 6-12 학생 그룹의 우리의 자신의 학부 생화학 실험실에 있는 표준 및 효소 조사 학부 수준에서의 레 퍼 토리를 확장 하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

1입니다. 정화에 대 한 준비

  1. 셀 무료 원유 추출의 준비
    1. 대장균 (BL21) overexpressed 태그 polyhistidine metalloprotein25 50 mL 원뿔 튜브에 그의 9 ~ 10 g 셀 펠 렛을 얻습니다.
    2. 셀 펠 릿 총 볼륨 ~ 45-50 ml의 9 ~ 10 g을 방 임시 세포/바인딩 버퍼 (50 m m 인산 염, 300 m m NaCl, pH 8에서 10 mM 이미)의 그램 당 5 mL를 추가 합니다. 해산을 장려 하기 위해 주기적으로 소용돌이입니다. 펠 릿, 냉동 면 미지근한 물 욕조에 녹여.
    3. 얼음 물 목욕을 사용 하 여, 진정 세포 세포의 용 해에 대 한 준비에 ~ 3 ° C에 세포 현 탁 액.
      참고:이 시점에서 세포 세포의 용 해 쥡니다, 비드 밀링 또는 다른 방법에 의해 가능 하다. 비드 밀링 때문에 급속 한, 상대적으로 저렴 한, 그리고 귀 보호를 필요 하지 않습니다 여기 증명 됩니다.
    4. 제조업체의 지침에 따라 챔버 밀링 50ml 비드 조립.
    5. 채우기의 전체 절반 비드 밀 챔버 냉장-20 ° c.에 저장 된 0.1 m m 유리 구슬
    6. 냉장된 셀 서 스 펜 션 챔버의 나머지와 4 ° C 세포/바인딩 버퍼를 사용 하 여 챔버를 완전히 채우기.
    7. 비드 밀의 샤프트를 회전 하는 구슬 세포 현 탁 액을 혼합 작은 주걱을 사용 합니다.
    8. 피펫으로와 모든 큰 거품을 제거 하 고에 뚜껑을 나사.
    9. 어떤 누설에서 챔버 드라이.
    10. 명확 하 고, 플라스틱 자 켓에 얼음의 약 1 컵, 얼음 가득 재킷과 나사 폐쇄로 채워진된 50 mL 챔버를 반전.
    11. 모터에 얼음 외피 챔버를 보호 합니다.
    12. 비드 밀 15,800 rpm에서 15 초 동안에 모터 설정 후 45 초 동안 휴식을 허용. 8 회 반복 한다.
    13. 8 주기 완료 되 면 50 mL 또는 더 큰 튜브 고속 원심 분리 (25000 g x 이상)에 대 한 평가로 전체 세포 세포 현 탁 액을 가만히 따르다. 작은 세포 파편과 유리 구슬에 4 ° C에서 40 ~ 45 분 스핀 25000 x g에서 원심 분리기에 균형된 관의 쌍을 놓습니다.
      참고: 50 mL 또는 고속 원심 분리에 대 한 평가 큰 튜브 사용할 수 없는 경우에서 centrifuging 여 유리 구슬 제거 작은 양의 세포 현 탁 액 (25 mL) 작은 volum에 decanted 수 있는 수익률 50 mL 원뿔 튜브에 2-3 분 동안 g x 1000-2000 e 튜브 고속 원심 분리에 대 한 평가.
    14. 원심 분리가 완료 되 면 가만히 따르다, 노란색 셀 무료, 원유 추출 물 깨끗 한 50 mL 원뿔 튜브로. 알아서 하지 어떤 세포 파편을 전송.
    15. SDS 페이지26에 의해 정화의 나중에 분석 셀 무료 원유 추출의 작은 샘플을 수집 합니다.
  2. 아이맥 칼럼의 준비
    1. 수 지 입자, Luer 잠금 콘센트 및 Luer 잠금 피팅을 포함 하는 상위 모자를 유지 하기 위해 낮은 침대 지원을 갖춘 1.5 x 20 cm 열을 가져옵니다. 흐름을 제어 하는 자 지와 Luer 잠금 콘센트에 맞게.
    2. 안전 하 게 벤치탑에서 working, 링 스탠드에는 열을 탑재 합니다.
    3. 4 ° c.에 저장 된 20% 에탄올에 니켈 바인딩된 nitriloacetic 산 (Ni-NTA) 수 지의 50% 슬러리를 얻기
    4. 부드럽게 균등 하 게 다시 중단 수 지 병을 소용돌이 친다.
    5. 실내 온도에 및 벤치탑, 사용의 1 mL을 보장할 슬러리의 2 개 mL를 철회 졸업된 피펫으로 정착 수 지 바인딩 polyhistidine의 50-60 밀리 그램의 단백질, 태그와 열에 슬러리 전송에 작업.
    6. 자 지를 열고 수 지에서 중력에 의해 배수 하는 과잉 스토리지 솔루션을 허용 합니다.
    7. 자 지를 안전 하 게 닫으십시오
    8. 파스퇴르 피펫으로 사용 하 여 신중 하 게 냉장된 세포/바인딩 버퍼 (50 m m 인산 염, 300 m m NaCl, pH 8에서 10 mM 이미) 추가 수 지-적어도 30 mL의 열. 알아서 하지 방해 수 지 표면. 튀는 것을 방지 하려면 열 벽 아래로 버퍼를 실행 합니다.
    9. 세포/바인딩 버퍼 컬렉션 비 커에 중력에 의해 열에서 천천히 배출 함으로써 수 지 equilibrate.
    10. 세포/바인딩 버퍼는 대부분 물기를 때 세포의 용 해 버퍼의 ~ 5 mL 수 지 위에 때 버퍼의 흐름을 중지 하려면 자 지 닫고 열, 직 립, 진행 준비가 될 때까지 또는 최대 1 주에 대 한 탑재를 두고.

2. 정화 태그 Polyhistidine 아이맥으로 대상의

  1. 워시 버퍼 (50 m m 인산 염, 300 mM NaCl, 20mm 이미 pH 8) 및 차입 버퍼 (인산 염, 300 mM NaCl, 250 m m 이미 10% 글리세롤 pH 8 m 50 m)를 준비 합니다. 4 ° c.에 진정
  2. 자 지를 열고 남은 세포/바인딩 버퍼 Ni NTA 수 지를 통해 중력에 의해 배수를 허용 하 여 Ni NTA 열 셀 무료 원유 추출의 추가 대 한 준비. 모든 버퍼는 물기와 수 지 표면 노출는 자 지를 닫습니다.
  3. 파스퇴르 피펫으로, 신중 하 게 피펫으로 사용 하 여 셀 무료 원유 표면을 방해 하지 않도록 주의 복용 수 지에 추출 합니다. 원유 추출 물 튀는 것을 방지 하려면 열 벽을 아래로 실행 합니다. 원유 추출 물 적용의 볼륨은 polyhistidine 태그 단백질;의 표현 수준에 따라 원유 추출의 총 볼륨 포함 50-60 밀리 그램 이하의 Ni NTA 수 지의 mL 당 대상 단백질의 (1.2.4 단계 참조).
  4. 때 모든 원유 추출의 열으로 전송 되었습니다, 그래서 열이 중력에 의해 배수 할 수 있다는 자 지를 엽니다. 이 흐름을 통해 수 지-SDS 페이지에 의해 정화의 향후 분석을 위해 수집 100 μ에 바인딩되지 않은 단백질으로 구성 된다. 26
  5. 셀 무료 원유 추출의 점성 열의 중력 흐름을 상당히 느려질 수 있습니다. 흐름의 속도 높이려면 간단한 "손 펌프"를 적용:
    1. 10 mL Luer 잠금 주사기를가지고 하 고 플라스틱 튜브 및 열 모자와 주사기 Luer 잠금 피팅 사이 짧은 길이 사용 하 여 열의의 모자를 연결 합니다. 주사기 플런저 밖으로 그리고 단단히 적합 열 상단 열 모자.
    2. 부드럽게 수동으로 졸업된 실린더;에 eluent 수집 하 여 흐름 속도 평가 하는 동안 주사기의 플런저를 압축 분 당 1-2 mL의 수 지 및이 설치와 호환 됩니다. 부드럽게 유량으로 주사기 플런저의 압축을 증가.
    3. 수 지에 공기의 도입을 방지 하려면 열 뚜껑을 제거 적용된 액체의 초승달 모양에 도달 하면 수 지 침대 위에 5-10 m m 손 펌프를 연결 및 중력에 의해 배수 하는 나머지 볼륨을 허용.
  6. 셀 무료 원유 추출 물 배출 완료 하 고 수 지 표면에 다시 노출, 파스퇴르 피펫으로 사용 하 여 신중 하 게 열-수 지의 표면을 방해 하지 않도록 주의 복용에 냉장된 워시 버퍼의 ~ 30 mL를 추가. 튀는 것을 방지 하려면 열 벽 아래로 버퍼를 실행 합니다.
  7. 자 지를 열고 워시 버퍼 열을 통해 배수를 허용 합니다. 이 프로세스는 수 지에서 약하게 바인딩된 단백질을 제거 합니다. Eluent는 삭제 합니다.
  8. 워시 버퍼를 배출 하는 동안 준비 16, 표시, 1 mL 분수를 수집 하기 위해 microcentrifuge 튜브.
  9. 워시 버퍼는 물기, 수 지 표면에 다시 노출 되는 자 지를 닫습니다. 파스퇴르 피펫으로 사용 하 여 신중 하 게 열-수 지의 표면을 방해 하지 않도록 주의 복용에 냉장된 차입 버퍼의 ~ 30 mL를 추가. 튀는 것을 방지 하려면 열 벽 아래로 버퍼를 실행 합니다.
  10. 자 지를 천천히 열고 열에서 태그 polyhistidine 단백질을 elute 차입 버퍼를 허용 합니다. 각 표시 된 microcentrifuge 튜브, 1 16-eluent의 1 mL를 수집 합니다.
  11. 단백질 시 약 또는 악기 제조 업체27,28여 Bradford 분석 실험 또는 특정 방법에 따라 UV 보이는 분광학 등 색도계 단백질 분석 결과 사용 하 여 분수를 테스트 합니다. 같이, 색도계 분석 결과 Coomassie blue를 사용 하 여이를 축소 100 μ 볼륨 각 분수에서만 작은 볼륨을 희생 하기 위하여.
  12. 색도계의 100 µ L 각 분수의 혼합 3 μ 시 약을 시험 하 고 수동으로 분수; 단백질의 존재를 나타내기 위해 어떤 색깔 든 지의 형성 탐지는 분석기와 필요 하지 않습니다.
  13. 단백질 분수 16에에서 있으면 1 mL 분수와 단백질에 대 한 분석 결과 정기적으로, 방출까지 계속 eluted 분수 이상 단백질의 상당한 금액을 포함.
  14. 깨끗 한 원뿔 관으로 포함 하는 단백질 분수를 결합 하 고 나중에 분석 100 μ 샘플 SDS 페이지26에 의해 철회.
  15. 금속 이온 공동 인자의 재구성으로 진행 하거나 3 mL aliquots-80 ° c.에 있는 단백질을 고정 그 10% 글리세롤 포함 한지는 차입에 버퍼가 cryoprotectant 동결 동안 순수 단백질을 안정.
  16. Ni NTA 열의 차입 완료 되 면, 즉, 모든 단백질은 열에서 고 분수에서 수집, 전달 열을 통해 차입 버퍼의 또 다른 25 mL 단기 저장을 위해 차입 버퍼의 ~ 5 mL에 4 ° C에 열을 저장 또는 장기 저장을 위한 20% 에탄올과 세포/바인딩 버퍼.

3. Fe2 + 대상 단백질의 재구성

  1. Fe2 + 의 추가
    참고:이 예제에서 아미노산의 일종 dioxygenase 같은 효소 바인딩 비 heme 철 (II) 필요는 Fe2 + 이온 활동; 그러나, 철 (II)는, 철 (III), 쉽게 산화 하 고 전혀 어떤 철 없이 정화 단백질의 일부분.
    1. 금속의 재구성을 시작 하려면 차입 버퍼에 순화 된 효소의 3 mL을 구하십시오. 냉동, 미지근한 물 목욕을 사용 하 여 빠르게 해 동 하 고 한 번 해 동, 얼음에 단백질을 넣어.
    2. 튜브에 단백질의 볼륨을 사용 하 여, 나트륨 하는데 (198.1 g/mol) 샘플에서 최종 농도 12.5 m m를 만들기 위해 필요한 금액을 계산 합니다. 또한, dithiothreitol (DTT, 154.25 g/mol) 샘플에서 최종 농도 12.5 m m를 만들기 위해 필요한 금액을 계산 합니다.
    3. 단단한 나트륨 하는데 및 DTT 추가 하 고 부드럽게, 그러나 철저 하 게, 완전히 분해를 혼합. 알아서 하지 지나치게 공격적 혼합 단백질 강 수 발생할. 단백질 견본을 철 (II) 황산 염 heptahydrate (MW 278.01 g/mol)의 작은 금액을 추가 합니다.
    4. 몇 가지 1 철 소금, 수돗물의 충분히 작은 수량을 얻기 위하여 mm FeSO4•7H2O 밖으로 단단한 조각에의 립 종이 무게과 립, 종이 접고 고 금속 주걱의 편평한 측으로 그것을 분쇄.
    5. 단백질의 튜브를 결과 분말의 입자를 추가 합니다.
    6. 혼합 하는 소용돌이 장미빛 핑크 색 튜브에 표시 됩니다.
    7. 단백질, 얼음에 10-30 분 출장의 분홍색 솔루션을 품 어. 핑크 색상 천천히 시간이 지남에 사라질 것 이다.
  2. 젤 여과
    1. 약 6, 000의 분자량 제외 제한와 10 mL 저수지도 갖춘 1.5 x 12 cm 열 µ m 90-180의 수 화 입자 크기 범위 구형 polyacrylamide 젤 10 mL 포장 젤 여과 열을 사용 합니다. 열은 낮은 갖추고 상단 침대 지원 열에 수 지를 유지 하 고 수 지 침대 건조 실행에서 방지 30 um 다공성 폴 리 에틸렌 디스크의 형태로 확인 합니다. 젤 여과 열 링 스탠드를 탑재 합니다.
    2. 사전 패키지 된 젤 여과 열을 사용 하는 경우 뚜껑을 제거 하 고 상단 침대 지원 위에 초과 버퍼에서 부 어.
    3. 열, equilibrate에 버퍼 후속 분석 결과 및 저장, 예를 들어 50mm NaH24, 200 m m NaCl, pH 8.0에서 10% 글리세롤과 호환 되는 저수지를 작성 하 여 시작 합니다.
    4. 사전 패키지 된 젤 여과 열을 사용 하는 경우 버퍼의 흐름을 시작 하 여 노출 Luer 슬립 피팅 젤 여과 열의 아래쪽 끝에서 스냅. 열, Luer 슬립 끝에 자 지를 맞게 하지만 고 열 중력 드립에 허용.
    5. 버퍼 열에서 뽑아가 고 상단 침대 지원 노출, 자 지, 닫고 노출된 상단 침대 지원에 솔루션 pipetting으로 열에 Fe (II) 재구성 metalloenzyme ~ 3 mL를 추가 합니다.
    6. 자 지를 열고 전체 3.0 mL 샘플 중력에 의해 열을 입력을 허용 합니다. Eluent의이 첫 3 mL을 삭제 합니다. 솔루션을 처리 하는 동안 형성 된 핑크 색상 열의 상단에 갇혀 있을 것입니다.
    7. 열 물이 뚝뚝 떨어지는 중지 하 고 상단 침대 지원 노출, 열에 젤 여과 버퍼 (예를 들어, 50mm NaH24, 200 m m NaCl, pH 8.0에서 10% 글리세롤)의 4 개 mL를 추가 합니다. 자 지를 열고 microcentrifuge 튜브 8 0.5 mL 분수는 eluent 수집 합니다.
    8. 앞에서 설명한 대로 색도계 단백질 분석 결과 또는 UV 마주27,28 를 사용 하 여 단백질에 대 한 분수를 테스트 합니다.
    9. 결합 단백질이 포함 된 분수.
    10. SDS 페이지 분석26에 대 한 샘플을 철회 한다.
    11. 분석 결과 또는 샘플의 스토리지와 함께 진행 합니다.

Representative Results

이러한 대표적인 결과 BCM 341의 2 개의 과정 실험실 기간 동안이 프로토콜을 실행 그들은 학부 학생 들에 의해 수집 된: Muhlenberg 대학에서 실험 생화학. 그림 1 보여줍니다 20 kDa 폴 리 히스티딘의 정화의 결과 4 시간 교실 실험실 기간 동안 두 학부 학생에 의해 수행으로 metalloenzyme, l 아미노산의 일종 dioxygenase 태그와 같은 SDS 페이지 분석 후속 실험 기간 동안 학생입니다. 폴 리 히스티딘은 단백질이 효과적으로 정화 (그림 1, 2 차선). 폴 리 히스티딘 태그에 대 한 항 체를 사용 하 여 젤의 immunoblot 나타냅니다는 흐름-를 통해 (데이터 표시 되지 않음), 폴 리 히스티딘 태그 대상 단백질의 작은 금액을 손실 됩니다 가능성이 있기 때문에 대상 단백질에의 100 밀리 그램 양 보다 큰에 수 지의 바인딩 용량 초과 lysate.

그림 2 에서는 철 (II)와 여과 젤-후속 프로토콜에서 설명 된 대로 재구성 후 폴 리 히스티딘 태그 metalloenzyme 대상, l 아미노산의 일종 dioxygenase의 효소 반응에 학생 수집 활동 데이터를 보여 줍니다. 여기. 데드 타임 데이터 수집 전에 시작 5 초 처음으로이 기술을 실행 하는 학생 들의 전형 이다. metalloenzyme의 강력한 활동 게시 된 분석 결과 사용 하 고 정상 상태 운동 매개 변수 게시 결과29일치를 굴복 발견 되었습니다. 정상 운동 매개 변수 피팅 그림 2에 표시 된 진행률 곡선30 에 의해 결정 되었다 그러나, 기질 농도의 시리즈를 통해 수집 하는 초기 속도의 비 선형 최소 제곱법 피팅 가능한31똑같이 이다.

Figure 1
그림 1입니다. 폴 리 히스티딘의 SDS 페이지26 분석 하기 전에, 동안과 정화 후 단백질을 태그. 레인 1-분자량 마커, 2 순화 단백질 (20 kDa) 게시물 Ni NTA, 4-셀 무료 원유 추출 물 정화, 5 이전-세포 파편 펠 릿 게시물 세포 '를 통해 3-Ni-NTA 흐름. 샘플 샘플/로딩 버퍼 x 5를 사용 하 여 준비 하 고 프리 카스트 4-20 %polyacrylamide 젤 젤 전기 이동 법 체계를 사용 하 여에 분리 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. 정상 상태 분석 결과 철 (II)의 버퍼 (인산 50 mM, 200 mM NaCl, pH 8) 기판 (l 아미노산의 일종-5 µ M (빨강), 25 µ M (녹색), 50 µ M (블루))와 metalloenzyme를 (즉, l 아미노산의 일종 dioxygenase, 10µM)를 재구성 된다. 흔적 묘사 414nm에서 제품 형성. 흡 광도 데이터 지속적으로 분할 빔 스캐닝 자외선 보이는 분 광 계29에 1 mL 메타 크 릴 산 큐 벳을 사용 하 여 인수 했다. 원시 데이터는 Michaelis-Menten 정상 상태 근사 (KM 30.8 µ M ± 14.4, k고양이명백한 2.3-1 ± 0.05)30의 모델에 맞게 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

재조합 형 단백질을 아이맥에 의해 그들의 정화 polyhistidine 태그의 추가 생 화 확 적인 문학3,4,5, 효소 정화를 아이맥의 애플 리 케이 션에에서 거의 유비 쿼터 스 되는 생화학에 스파스, 남아 가르치는 실험실 및 게시 방법을 항상 교육의 자원 한계를 고려 하지 않습니다 연구소20. 또한, 교육 연구소에 아이맥의 사용 평가 활동 및 순수성, 효소는 이상적인 교육 활동의 아이맥 정화를 만드는 실험에 결합 될 때 가장 효과적입니다. 아이맥의 효소, metalloenzymes를 포함 하 여 교육 실험실에서의 정화에 응용 프로그램을 확장 하기 위해 안정적이 고 저렴 한 방법 필요 합니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 벤치탑 아이맥 또한 종속 iron(II)를 재구성 하 여 metalloproteins22아이맥의 응용 프로그램에서 한계를 해결 하는 동안 쉽게 구할 수 있고 저렴 한 실험실 공급을 사용 하 여 metalloenzyme, l 아미노산의 일종 dioxygenase 정화 게시. 8 학생 그룹에 대 한 소모품의 비용입니다 $500-600 그림 1그림 2에서 설명 하는 분석 단계를 포함 하 여이 프로토콜을 실행 하는 학기 당 사이 예상 시 약 및 자료를 사용 하 여.

용이성은 Fe2 + 수에서 해리 아미노산 ligands24 와 Fe2 + 의 손쉬운 산화 O2 Fe3 +, 비-헤의 재구성으로 인해 재조합 metalloenzyme에 iron(II) 아미노산 킬레이트 화 되는 효소 정화의 일반적인 구성 요소입니다. 클래식 크로마토그래피를 사용 하면 일부 경우32, 철 분의 총 손실을 방지 하기 위해 가능 하다 그러나 철 (II)를 추가 하 여 다시 감소 시키는 대리인33,,3435, 의 존재는 더 자주, 36 및 과잉 철은 어떤 경우에는 혐 기성 분위기가37,,3839, 아래 자주 제거33,,3436, 복잡 모든 후속 분석 결과입니다. 클래식 크로마토그래피와 혐 기성 분위기의 연속 단계 학부 실험실,이 프로토콜의 개발을 자극에 대 한 현실 되지 않습니다.

동안 Ni NTA 열의 수동 준비 및 중력에 의해 크게 샘플의 처리는 추가 시간 및 노력 때 사전 패키지 된 열에 비해 크로마토그래피 계측 자동화, 수동 단계 허용에 대 한 실습 학습 과정의 뒤에 과학의 증가 이해에서 발생 하는 학생에 의해. 여기에 설명 된 조건 하에서 철 (II) 소금의 추가 초과 dithiothreitol에 특히 민감합니다. 학생 dithiothreitol의 과잉, 실수로 추가 강수량 이벤트가 높습니다. 우리는 도움이 필요 시 수량 계산 실험실 시간 벤치에 가장 효과적으로 사용할 수 있도록 실험실에 도착 하기 전에 수행 하는 학생을 발견 했다. 세포-세포 단백질 차입-하에서 전체 벤치탑 아이맥 정화-재구성 및 이후 실험실 기간 분석 결과 1 4 시간 실험 기간에 수행할 수 있습니다.

Disclosures

저자 아무 공개 있다.

Acknowledgments

이 간행물은 부여 번호 아래 국립 과학 재단에서 지 원하는 작업 기반  체 1708237입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
consumables
BeadBeater 0.1mm glass beads BioSpec Products 11079101 1 pound each
50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile VWR 21008-178
Sodium chloride Fisher Bioreagents BP358-1
Potassium phosphate, monobasic Acros (Fisher) AC42420-5000
Sodium Ascorbate Acros (Fisher) AC35268-1000 
DTT (Dithiothreitol) Lab Scientific D-115
Iron(II) sulfate heptahydrate Sigmaaldrich 310077
HisPur NiNTA Resin  Fisher (pierce) PI88221
Econo-Column Chromatography Columns - 1.5 x 20cm Bio-Rad 737-1522  1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea, 
Stopcock Valve, one way, female to male luer Kimble 420163-0000 pack of 50
BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle) VWR 301029
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer Biorad 7318222
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer  Biorad 7318225
Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump) Bio-Rad 7318211 Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling
Glycerol Fisher (Pierce) 17904
Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay Thermo Scientitic 23236
Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL VWR 89000-028
Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets Fisher 13-676-10F
Fiserbrand universal pipet pump Fisher  14-955-110
Fisherbrand Transfer Pipets Fisher  13-711-9AM
Econo-Pac 10DG desalting columns Bio-Rad 732-2010 box of 30
ExpressPlus PAGE 5x sample buffer Genscript MB01015 5mL (Dilute 1:5 with sample)
ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells Genscript M42012 20 gels
Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate Fisher 14-955-128  case of 500
Cuvette Caps Square Disposable Fisher 14-385-999
L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine) Acros D9628-5G
Permanent Equipment: 
BeadBeater 50mL chamber  BioSpec Products 110803-50SS 1 chamber
BeadBeater BioSpec Products 1107900-101 350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.
Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL Fisher 3119-0050PK
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel Bio-Rad 1658004  4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 1645052 100–120/220–240 V, power supply for high-current applications, includes power cord
UV-1800 with UV-Probe Software Shimadzu UV-1800
Kintek Global Kinetic Explorer Kintek Corp version 6 https://www.kintekexplorer.com/downloads/

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References

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