Benchtop иммобилизованных металла аффинной хроматографии, воссоздание и меткой, Assay Polyhistidine Metalloenzyme для студентов лаборатории

Biochemistry
 

Summary

Здесь мы представляем протокол benchtop иммобилизованных метал близость хроматографии очистки и последующего воссоздания polyhistidine меткой, не Гем железа привязки dioxygenase подходит для студентов обучения лаборатории.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Colabroy, K. L., Mayer, K. Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory. J. Vis. Exp. (138), e58012, doi:10.3791/58012 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Benchtop иммобилизованных металла аффинной хроматографии (ИАЦ), polyhistidine меткой белков легко освоена студентов и стал наиболее широко используемым белка очистки методом в современной литературе. Но, применение хромотографию сродства к металла связывания белков, особенно с редокс чувствительных металлов, таких как железо, часто ограничивается лаборатории с доступом к бардачок - оборудование, которое обычно не доступен в бакалавриат Лаборатория. В этой статье мы демонстрируем наши benchtop методы для изоляции, очистки и металл Ион воссоздание поли гистидина с тегами IMAC, редокс активный, не Гем железа привязки extradiol dioxygenase и пробирного dioxygenase с разнообразными субстрата концентрации и насыщения кислородом. Эти методы выполняются на студентов и реализованы в Бакалавриат преподавания и научных исследований лаборатории с инструментарием, что является доступным и недорогим, в основном студентов институтов.

Introduction

Первые сообщения о очистки polyhistidine меткой белка из экстрактов организм хозяина, с помощью хелятации гистидина, иммобилизованных металла вступил литературе в 1988 году1,2. С того времени стали практически повсеместно в биохимических литература3,4, добавление тегов polyhistidine рекомбинантных белков и их очистки на иммобилизованных металла аффинной хроматографии (ИАЦ) 5. Методы очистки IMAC может осуществляться на настольные, с помощью автоматизированных хроматографии и в форматах спин столбца. В то время как близость методы очистки, особенно IMAC, широко используются в научно-исследовательской лаборатории, они менее распространены в Бакалавриат преподавания лаборатории. Наиболее широко используемый лабораторией учебников для лаборатории биохимии не регулярно преподавать эти методы, вместо этого выбирают для более традиционных ионообменных или краситель привязки хроматографии6,,78 , 9. Например, очищение лактатдегидрогеназа Андерсон10 использует близость краситель-привязку, и очистки говядину молока Альфа-лактальбумин7,11 , Буайе использует никель nitriloacetic кислота матрицы, но не рекомбинантных поли-гистидина, полагаясь вместо этого на внутренние сродство белков для смолы. Некоторые современные лаборатории студентов учебниками и публикации реализовать иммобилизованных металла аффинной хроматографии на Поли гистидина с тегами белковых мишеней как зеленый или красный флуоресцентные белки12,13, 14,15, антитела16и выбранных ферментов17,18,19,20, даже некоторые из неизвестных функций21. Возможно очистки фермент является предпочтительным в учебные лаборатории, потому что цель может assayed для деятельности на последующих сессиях, обогащать опыт «реальной науки» со стороны студента; действительно эти виды Лабораторные опыты были опубликованы и полезных результатов обучения студентов сообщили17,18,,2021. И тем не менее, приложениям ИМАК фермент очистки в биохимии, учебные лаборатории остаются редкие, и опубликованные методы могут даже предположить, доступ к инструментарию хроматографии, которые обычно недоступны для использования в классе лаборатории 20. Существуют также ограничения в применении IMAC в metalloproteins, особенно те, которые связывают редокс чувствительных двухвалентной металлов, которые необходимы для деятельности22. Часто иона металла потерян или окисляется во время очистки, уступая неактивных ферментов, плохо подходит для студентов лаборатории.

Полный треть ферментов связывают иона металла23, и несмотря на почти всеобщее требование для железа во всех формах жизни23, железо, вероятно, среди наиболее проблематичным ионов металлов в энзимологии. Non Гем Fe2 + привязки ферментов, особенно подвержены потери и/или окисления металла во время IMAC; предположительно из-за отсутствия выделенный органическим лигандом как гема и легкость, с которой Fe2 + может отмежеваться от аминокислотных лигандов24. Кроме того кислорода зависимых окислением Fe2 + Fe3 + спонтанное в водном растворе, из-за изменения негативных свободной энергии и относительная стабильность Fe3 +. Часто эти проблемы будут преодолены путем использования анаэробной атмосфере и/или не IMAC Хроматографические методы22. В этой статье мы продемонстрируем использование benchtop IMAC для очистки Fe2 + зависимые metalloenzyme l-допы dioxygenase с помощью простой, недорогой хроматографии поставок, следуют воссоздания на активном узле Fe2 +, и Ферментативный assay. Эти методы являются стандартными в нашей собственной лаборатории биохимии студентов 6-12 студенческих групп и может использоваться для расширения репертуара фермента расследований на уровне бакалавриата.

Protocol

1. подготовка для очистки

  1. Подготовка клетки бесплатно незрелая выдержка
    1. Получения гранул ~ 9-10 g клеток E. coli (BL21), оверэкспрессировали Металлопротеины polyhistidine меткой25 в 50 мл Конические трубки.
    2. Добавьте 5 мл на грамм номер темп лизис/bind буфера (50 мм фосфат, 300 мм NaCl, имидазола 10 мм при pH 8) ~ 9-10 г гранул ячейки для общего объема ~ 45-50 мл. Периодически вихрь рекомендовать роспуск. Если гранулы был заморожен, оттепель в ванне с теплой водой.
    3. С помощью льда водяной бане, холод суспензию клеток до ~ 3 ° C в рамках подготовки к лизис клеток.
      Примечание: В этот момент возможен лизис клеток sonication, шарик фрезерного или другой метод. Бисер-фрезерный проявляется здесь потому что это быстрое, относительно недороги и не требуют защиты слуха.
    4. Соберите 50 мл шарик, фрезерные палаты согласно инструкциям производителя.
    5. Заполнения палата мельница шарик, наполовину из охлажденной 0,1 мм стеклянные бусины, которые были сохранены при-20 ° C.
    6. Заполните остальные камеры с подвеской охлажденные клеток и использования буфера lysis/bind 4 ° C для заполнения камеры полностью.
    7. Лопаточкой небольшой повернуть вал бисерная мельница и перемешать суспензию клеток с бисером.
    8. Удалите любые большие пузыри с пипетки и затем навинтить крышку.
    9. Вытрите камеру от любой утечки.
    10. Добавить около 1 чашка льда ясно, пластиковые куртки, инвертировать камеры заполнены 50 мл в куртке льда заполнены и винт закрыт.
    11. Закрепите льда рубашкой камеры на мотор.
    12. Бисерная мельница мотор на 15 секунд на 15 800 об/мин, а затем позволяет отдохнуть за 45 секунд. Повторите 8 раз.
    13. После завершения 8 циклов сцеживаться подвеска лизиса всей ячейки в 50 мл или более крупные трубки, оценили для высокая скорость центрифугирования (25 000 x g или выше). Место пару сбалансированного труб в центрифуге и спина на 25000 х g 40-45 минут на 4° C до Пелле ячейки мусор и стеклянные бусины.
      Примечание: Если не доступны 50 мл или больших труб для высокая скорость центрифугирования, удалите стеклянные бусы центрифугированием в 1000-2000 x g для 2-3 мин в 50 мл Конические трубки приносить меньший объем суспензии клеток (~ 25 мл), который может быть сливают в меньших volum e трубы оценили для высокая скорость центрифугирования.
    14. При завершении центрифугирования сцеживаться ясно, желтый, свободных клеток, сырой экстрактов в чистой 50 мл Конические трубки. Заботиться не передавать любой ячейки мусор.
    15. Соберите небольшой образец свободной ячейки сырой экстрактов для последующего анализа очистки SDS-PAGE26.
  2. Подготовка столбце IMAC
    1. Получите 1,5 x 20 см столбец оснащены нижней кровати поддержки удерживать частицы смолы, Luer блокировки розетки и верхнего предела, который также содержит Luer lock штуцер. Подходит к розетке Luer-lock с краном для управления потоком.
    2. Работая на benchtop, надежно монтировать столбце на стенде кольцо.
    3. Получить 50% раствор никель прыгните nitriloacetic кислоты (Ni-НТА) смолы в 20% этанола, который был сохранен при 4 ° C.
    4. Слегка взболтать флакон равномерно вновь приостановить смолы.
    5. Работает при комнатной температуре и настольная, использование окончил накапайте снять 2 мл раствора, который даст 1 мл поселились смолы способны привязки 50-60 мг polyhistidine меткой белка и передачи навозной жижи в столбце.
    6. Откройте кран и позволяют избыточного хранения решение для слива самотеком из смолы.
    7. Закрыть кран надежно
    8. С помощью пипетки Пастера, осторожно добавить охлажденный лизис/bind буфера (50 мм фосфат, 300 мм NaCl, имидазола 10 мм при pH 8) и в столбце смолы – по крайней мере 30 мл. Заботиться, чтобы не мешать поверхность смолы. Запустите буфер вниз стены столбце для предотвращения разбрызгивания.
    9. Сбалансировать смолы, позволяя буфера lysis/bind медленно стечь из столбца самотеком в коллекции стакан.
    10. Когда буфер lysis/bind основном имеет дренируемых, Закройте запорный для остановки потока буфера при ~ 5 мл буфера lysis остается выше смолы и оставьте столбец, монтируется вертикально, до готовности продолжить или на срок до 1 недели.

2. Очистка Polyhistidine тегами цели IMAC

  1. Подготовьте мыть буфера (50 мм фосфат, 300 мм NaCl, 20 мм имидазола рН 8) и Элюирующий буфер (50 мм фосфат, 300 мм NaCl, имидазола 250 мм, pH 10% глицерина 8). Холод на 4° C.
  2. Подготовьте столбце Ni-НТА для добавления экстрактов клетки свободной нефти, открыв кран и позволяя оставшиеся буфера lysis/привязки для слива самотеком через Ni-НТА смолы. Когда все буфер имеет дренируемых, и подвергается поверхность смолы, закрывайте кран.
  3. С помощью пипетки Пастера, тщательно накапайте сотовый бесплатно сырой выдержки на смолы, стараясь не нарушить поверхности. Запустите сырой экстракты вниз стены столбце для предотвращения разбрызгивания. Объем сырой экстрактов применяется зависит от уровня экспрессии белка polyhistidine меткой; обеспечить общий объем сырой экстракт содержит 50-60 мг или меньше целевого белка на мл Ni-НТА смолы (см. шаг 1.2.4).
  4. Когда все сырой экстрактов были переведены в столбце, открыть кран, чтобы столбец можно слива самотеком. Этот поток через состоит из белков, не привязанные к смолы – собрать 100 мкл для последующего анализа очистки на SDS-PAGE. 26
  5. Вязкость экстрактов клетки свободной нефти может значительно замедлить самотечный поток столбца. Чтобы увеличить скорость потока, примените простой «рука насос»:
    1. Возьмите шприц 10 мл Luer-lock и подключить его к крышке столбца с помощью короткая длина пластиковых труб и фитингов Luer-lock между крышку столбца и шприц. Вытянуть поршень шприца, а затем плотно надеть колпачок столбцов вверху столбца.
    2. Аккуратно сжать поршень шприца оценивая скорость потока вручную, собирая элюента в мензурку; Курсы 1-2 мл в минуту, совместимы с смолы и установки. Аккуратно замедляет скорость потока, увеличением сжатия поршень шприца.
    3. Чтобы предотвратить заражение воздуха в смолу, снять крышку столбца и придает ручной насос, когда мениска прикладной жидкости достигает 5-10 мм выше ионита и позволяют оставшийся объем для слива самотеком.
  6. Когда бесплатно сырой выдержек клетки закончили дренирующие и снова подвергается поверхность смолы, используйте Pasteur накапайте тщательно добавить ~ 30 мл охлажденного мыть буфера в столбце – стараясь не нарушить поверхность смолы. Запустите буфер вниз стены столбце для предотвращения разбрызгивания.
  7. Откройте запорный и позволяют мыть буфера для слива через колонку. Этот процесс является удаление слабо связанных белков из смолы. Выбросите элюента.
  8. В то время как мыть буфер слив, подготовить шестнадцать, помечены, microcentrifuge трубы для сбора фракций 1 мл.
  9. Когда буфер мыть имеет дренируемых, и смолы поверхность подвергается снова, закройте кран. Использование пипетки Пастера тщательно добавить ~ 30 мл охлажденного Элюирующий буфер в столбце – стараясь не нарушить поверхность смолы. Запустите буфер вниз стены столбце для предотвращения разбрызгивания.
  10. Медленно откройте запорный и позволяют Элюирующий буфер элюировать polyhistidine меткой белка из столбца. Сбор 1 мл элюента в каждой помеченной microcentrifuge трубок, от 1 до 16.
  11. Протестируйте дроби для протеина используя assay колориметрические протеина как assay Брадфорд или видимой УФ спектроскопия согласно конкретные методы27,28производителей реагентов или инструмента. Как показано здесь, колориметрические assay, используя Кумасси синий масштабируется до 100 мкл тома для того, чтобы пожертвовать только небольшой объем от каждой фракции.
  12. Mix 3 мкл каждой фракции с 100 мкл колориметрические белка анализа реагент и вручную наблюдать формирования любого цвета, указывающий на наличие белка в дроби; обнаружение с помощью спектрометра не является необходимым.
  13. Если белок обнаруживается в фракция 16, продолжают элюирующие дроби 1 мл и assay для белка периодически, до тех пор, пока eluted дроби больше не содержат значительное количество белка.
  14. Объединение-белковые фракции в чистой конические пробки и снять 100 мкл пример для последующего анализа на SDS-PAGE26.
  15. Продолжить восстановление ион металла кофактора или заморозить белка в 3 мл аликвоты-80 ° c. Убедитесь, что 10% глицерина входит в Элюирующий буфер — криопротектора для стабилизации чистого белка при замерзании.
  16. При завершении элюции столбце Ni-НТА, то есть, все белки выключен столбце и собранных в долях, пройти еще 25 мл буфера через колонку и хранить столбца на 4 ° C в ~ 5 мл Элюирующий буфер для кратковременного хранения , или буфера lysis/bind с 20% этанола для долгосрочного хранения.

3. Восстановление целевого белка с Fe2 +

  1. Добавление Fe2 +
    Примечание: Номера Гем железа (II) привязки фермента, такие как l-допы dioxygenase в этом примере, требует Fe2 + ионов для деятельности; Однако железа (II) легко окисляется до железа (III), которая является неактивным, и часть белка, очищает без каких-либо железа на всех.
    1. Чтобы начать восстановление металла, получите 3 мл очищенной фермента, приостановлено в Элюирующий буфер. Если заморожен, оттепель, быстро с помощью ванну теплой водой и один раз таял, положить белка на льду.
    2. Использование тома белка в трубе, подсчитать количество Аскорбат натрия (198.1 g/моль) необходимо сделать окончательный концентрации 12,5 мм в образце. Кроме того Рассчитайте количество Дитиотреитол (DTT, 154.25 г/моль) необходимо сделать окончательный концентрации 12,5 мм в образце.
    3. Добавьте твердые натрия аскорбат и DTT и мягко, но тщательно, перемешать до растворения. Заботиться не причинять осадков белок с чрезмерно агрессивной смешивания. Добавьте небольшое количество гептогидрата сульфата железа (II) (МВт 278.01 г/моль) Образец протеина.
    4. Для того чтобы получить достаточно небольшое количество соли, крана железа несколько 1 мм гранулы FeSO4•7H2O твердых вне на кусок весят бумаги, сложите бумагу над гранул и раздавить его с плоской стороной металлической лопаткой.
    5. Добавьте зерна полученный порошок трубки белка.
    6. Вихревой смешивать и розовый розовый цвет появится в трубе.
    7. Инкубируйте розовый раствор белка, ограничен, за 10-30 минут на льду. Розовый цвет будет постепенно исчезать с течением времени.
  2. Гель для фильтрации
    1. Используйте столбец фильтрации геля, Упакованные с 10 мл сферических геля полиакриламида с молекулярной массой исключение предел приблизительно 6000 и увлажненной размер частиц 90 – 180 мкм в столбец 1.5 x 12 см, который также оснащен 10 мл водохранилище. Обеспечить столбце оснащен Нижняя и верхняя кровать поддерживает в виде 30 мкм пористого полиэтилена дисков сохранить смолы в столбце и предотвратить запуск сухого ионита. Смонтируйте столбце фильтрации геля кольцо стенд.
    2. При использовании фильтрации столбца расфасованных гель, снимите крышку и слить избыток буфера выше поддержки верхней кровати.
    3. Чтобы сбалансировать столбец, начните с заполнения водохранилища с буфером совместим с последующим пробирного и хранения, например, 50 мм NaH2PO4, 200 NaCl, 10% глицерина при pH 8.0.
    4. При использовании фильтрации столбца расфасованных гель, обрывать нижней оконечности гель фильтрации столбца для запуска потока буфера и разоблачить Luer slip фитинга. Подходит кран для Luer slip конца столбца, но оставить его открытым и позволяют столбце капать под действием силы тяжести.
    5. Когда буфер имеет дренируемых из столбца и поддержка верхняя кровать предоставляется, Закройте запорный и добавить ~ 3 мл metalloenzyme Fe (II) преобразован столбец, закупорить раствор на поддержку открытой верхней кровати.
    6. Откройте кран и позволяют всего 3,0 мл образца введите столбец под действием силы тяжести. Отбросить эти первые 3 мл элюента. Розовый цвет, который образуется при обработке решение будет ловушке в верхней части столбца.
    7. Когда столбец перестала капать и поддержка верхняя кровать предоставляется, добавьте 4 мл гель фильтрации буфера (например, 50 мм NaH2PO4, 200 мм NaCl, 10% глицерина при pH 8.0) в столбец. Открыть кран и собирать элюента в microcentrifuge трубы над восемь фракции 0,5 мл.
    8. Протестируйте дроби для протеина используя assay протеина колориметрического или UV-Vis27,28 , как описано выше.
    9. Комбинат-белковые фракции.
    10. Вывод образца для SDS-PAGE анализ26.
    11. Продолжите с Пробирной или хранения образца.

Representative Results

Эти представительные результаты были собраны студентов как они выполнили этот протокол периоды два курса лаборатории BCM 341: экспериментальная биохимии в колледже Мюленберг. Рисунок 1 демонстрирует результаты очистки 20 кДа поли гистидина с тегами metalloenzyme, l-допы dioxygenase, в исполнении двух студентов в период 4-часовой класс лаборатория и анализируемой SDS-PAGE, то же самое Студенты в период последующего лаборатории. Поли гистидина с тегами белок является эффективно очищенный (рис. 1, переулок д. 2). Иммуноблот геля с использованием антител против Поли-гистидина указывает, что небольшое количество целевого белка поли гистидина с тегами теряется в поток через (данные не показаны), вероятно, потому что больше, чем 100 мг количество целевого белка в lysate превысил возможности привязки смолы.

Рисунок 2 демонстрирует деятельности студента собранные данные на ферментативной реакции целевой меткой metalloenzyme поли гистидина, dioxygenase l-допа, после растворения с железа (II) и последующих гель фильтрации, как описано в протоколе в настоящем документе. Пяти второй мертвых время прежде чем сбор данных начинается типичный студентов, выполнив эту технику для в первый раз. Надежные активность metalloenzyme был обнаружен с помощью опубликованных пробирного и принесли установившегося кинетических параметров соответствует опубликованные результаты29. Стационарном кинетические параметры были определены путем установки кривых прогресс30 , показан на рисунке 2; Однако нелинейная наименьших квадратов установка первоначальных ставок, собранные за серию концентрации субстрата является столь же возможно31.

Figure 1
Рисунок 1. SDS-PAGE26 анализ поли гистидина меткой белка до, во время и после очистки. Переулки 1 - молекулярная масса маркеры, 2-очищенный белок (20 кДа) пост Ni-НТА, 3-Ni-НТА потока через, 4 ячейки мусора - бесплатный сырой выдержек клетки до очистки, 5 - Пелле пост лизис. Образцы были подготовлены с использованием 5 x буфера выборки/загрузки и отделить на гелях полиакриламида сборного 4-20%, с использованием системы электрофореза геля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Стационарное состояние пробирного железа (II) Восстановленный metalloenzyme (т.е., dioxygenase л-дофа, 10µM) с субстратом (л-дофа-5 мкм (красный), 25 мкм (зеленый), 50 мкм (синий)) в буфере (50 мм фосфат, 200 мм NaCl, рН 8). Следы изображают формирования продукта на 414nm. Оптической плотности данных непрерывно были приобретены с использованием 1 мл метакрилат кюветы в Сплит луч сканирования видимой УФ спектрометр29. Необработанные данные подходят для модели Михаэлиса-Menten стационарном приближении (KM 30.8 мкм ± 14.4, kкошкаочевидной 2.3 s-1 ± 0,05)30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Хотя добавление тегов polyhistidine рекомбинантных белков и их очищение с IMAC стал практически повсеместно в биохимических литература3,4,5, приложениям ИМАК фермент очистки в биохимии учебные лаборатории остаются редкие, и опубликованные методы не всегда учитывать ограниченность ресурсов обучения лаборатории20. Кроме того использование IMAC в лаборатории обучения является наиболее эффективным в сочетании с экспериментов, которые используются для оценки деятельности и чистоты, что делает IMAC очистки фермента идеальное учебное действие. Для того, чтобы распространить применение IMAC для очистки ферментов, в том числе metalloenzymes, учебные лаборатории, необходимы надежные и недорогие методы. В этом протоколе, мы демонстрируем benchtop IMAC с помощью легко доступных и недорогих лабораторных принадлежностей, решая также ограничения в применении IMAC metalloproteins22, путем воссоздания зависит от железа metalloenzyme, dioxygenase л-дофа, пост очистки. Использование реагентов и материалов описано, мы оцениваем стоимость расходных материалов для восьми групп учащихся находится между $500-600 за семестр для выполнения настоящего Протокола, включая анализ шаги, описанные на рисунке 1 и на рисунке 2.

Из-за легкости, с которой Fe2 + может отмежеваться от аминокислотных лигандов24 и поверхностным окислением Fe2 + O2 Fe3 +, восстановление не Гем, является аминокислота взаимодействующие железа в рекомбинантной metalloenzyme Типичный компонент фермент очистки. Когда используется классический хроматографии, это позволяет избежать полной потери железа в некоторых случаях32, но чаще всего, железа (II) добавляется обратно в присутствии восстановителей33,34,35, 36 , часто под анаэробный atomosphere37,,3839и в некоторых случаях избыток железа не удаляется33,34,36, осложняющих любые последующие assay. Последовательных шагов классической хроматографии и анаэробной атмосфере не являются реалистичными для студентов лаборатории, вызвав в разработке этого протокола.

Хотя ручной подготовки столбце Ni-НТА и обработки образцов значительной степени тяжести дополнительного времени и усилий, когда по сравнению с предварительно упакованных столбцы и автоматизированных хроматографии инструментария, ручной шаги позволяют для руки обучения, студент, который приведет к увеличению понимания науки за этот процесс. Добавление соли железа (II) на условиях, изложенных здесь особенно чувствителен к избыток Дитиотреитол. Если студент ошибочно добавляет избыток Дитиотреитол, скорее всего осадков событие. Мы нашли его полезным требовать студентов для выполнения вычисления количества реагента до прибытия в лаборатории, так что время лаборатории могут наиболее эффективно использоваться на скамейке. Весь benchtop IMAC очистки - от лизис клеток для элюции белка - может осуществляться в одной лаборатории 4-часовой период, после растворения и пробирного в течение последующих лаборатории.

Disclosures

Авторы имеют не раскрытия.

Acknowledgments

Эта публикация основана на работе, поддержке Национального научного фонда под Грант №  ЧЕ 1708237.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
consumables
BeadBeater 0.1mm glass beads BioSpec Products 11079101 1 pound each
50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile VWR 21008-178
Sodium chloride Fisher Bioreagents BP358-1
Potassium phosphate, monobasic Acros (Fisher) AC42420-5000
Sodium Ascorbate Acros (Fisher) AC35268-1000 
DTT (Dithiothreitol) Lab Scientific D-115
Iron(II) sulfate heptahydrate Sigmaaldrich 310077
HisPur NiNTA Resin  Fisher (pierce) PI88221
Econo-Column Chromatography Columns - 1.5 x 20cm Bio-Rad 737-1522  1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea, 
Stopcock Valve, one way, female to male luer Kimble 420163-0000 pack of 50
BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle) VWR 301029
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer Biorad 7318222
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer  Biorad 7318225
Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump) Bio-Rad 7318211 Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling
Glycerol Fisher (Pierce) 17904
Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay Thermo Scientitic 23236
Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL VWR 89000-028
Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets Fisher 13-676-10F
Fiserbrand universal pipet pump Fisher  14-955-110
Fisherbrand Transfer Pipets Fisher  13-711-9AM
Econo-Pac 10DG desalting columns Bio-Rad 732-2010 box of 30
ExpressPlus PAGE 5x sample buffer Genscript MB01015 5mL (Dilute 1:5 with sample)
ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells Genscript M42012 20 gels
Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate Fisher 14-955-128  case of 500
Cuvette Caps Square Disposable Fisher 14-385-999
L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine) Acros D9628-5G
Permanent Equipment: 
BeadBeater 50mL chamber  BioSpec Products 110803-50SS 1 chamber
BeadBeater BioSpec Products 1107900-101 350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.
Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL Fisher 3119-0050PK
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel Bio-Rad 1658004  4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 1645052 100–120/220–240 V, power supply for high-current applications, includes power cord
UV-1800 with UV-Probe Software Shimadzu UV-1800
Kintek Global Kinetic Explorer Kintek Corp version 6 https://www.kintekexplorer.com/downloads/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nature Biotechnology. 6, (11), 1321 (1988).
  2. Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263, (15), 7211-7215 (1988).
  3. Block, H., et al. Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review. Methods in Enzymology. 439-473 (2009).
  4. Derewenda, Z. S. The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization. Methods. 34, (3), 354-363 (2004).
  5. Gräslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5, (2), 135-146 (2008).
  6. Switzer, R. L., Garrity, L. F. Experimental Biochemistry. Macmillan. (1999).
  7. Boyer, R. Modern Experimental Biochemistry, 3rd Edition. (2001).
  8. le Maire, M., Chabaud, R., Hervé, G. Laboratory Guide to Biochemistry, Enzymology, and Protein Physical Chemistry: A Study of Aspartate Transcarbamylase. Springer Science & Business Media. (2012).
  9. Bettelheim, F. A., Landesburg, J. M. Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry. Thomson Brooks/Cole. (2013).
  10. Anderson, A. J. Affinity chromatography of lactate dehydrogenase: An experiment for the undergraduate biochemistry laboratory. Journal of Chemical Education. 65, (10), 901 (1988).
  11. Boyer, R. F. Purification of milk whey α-lactalbumin by immobilized metal-ion affinity chromatography. Journal of Chemical Education. 68, (5), 430 (1991).
  12. Moffet, D. A. From gene mutation to protein characterization. Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, (2), 110-115 (2009).
  13. Sommer, C. A., Silva, F. H., Novo, M. T. M. Teaching molecular biology to undergraduate biology students: An illustration of protein expression and purification*. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32, (1), 7-10 (2004).
  14. Wu, Y., Zhou, Y., Song, J., Hu, X., Ding, Y., Zhang, Z. Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization. Biochemistry and Molecular Biology Education. 36, (1), 43-54 (2008).
  15. Ward, W. W., Swiatek, G. C., Gonzalez, D. G. Green fluorescent protein in biotechnology education. Methods in enzymology. 305, 672-680 (2000).
  16. Kay, B. K., Winter, J., McCafferty, J. Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual. Elsevier. (1996).
  17. Arkus, K. A. J., Jez, J. M. An integrated protein chemistry laboratory. Biochemistry and Molecular Biology Education. 36, (2), 125-128 (2008).
  18. Crowley, T. E. Expression, purification, and characterization of a recombinant flavin reductase from the luminescent marine bacterium Photobacterium leiognathi. Biochemistry and Molecular Biology Education. 38, (3), 151-160 (2010).
  19. Colabroy, K. L. A writing-intensive, methods-based laboratory course for undergraduates. Biochemistry and Molecular Biology Education: A Bimonthly Publication of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 39, (3), 196-203 (2011).
  20. Kreiling, J. L., Brader, K., Kolar, C., Borgstahl, G. E. A real-time and hands-on research course in protein purification and characterization: Purification and crystal growth of human inosine triphosphate pyrophosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 39, (1), 28-37 (2011).
  21. Gray, C., et al. Known structure, unknown function: An inquiry-based undergraduate biochemistry laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 43, (4), 245-262 (2015).
  22. Kocabas, E., Hernick, M. Metalloenzymes: Use of Recombinant Protein Expression and Affinity Tags to Aid Identification of Native Metal Ion Cofactors. Biochemistry & Analytical Biochemistry. 2, (2), 1-3 (2013).
  23. Ellis, W. R. Metalloenzymes. Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine. (2006).
  24. Williams, R. J. P., Begley, T. P. Metallo-Enzymes and Metallo-Proteins, Chemistry of. Wiley Encyclopedia of Chemical Biology. (2007).
  25. Mierendorf, R. C., Morris, B. B., Hammer, B., Novy, R. E. Expression and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. 257-292 (1998).
  26. He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1, (11), (2011).
  27. He, F. Bradford Protein Assay. BIO-PROTOCOL. 1, (6), (2011).
  28. Johnson, M. Protein Quantitation. Materials and Methods. (2017).
  29. Colabroy, K. L., Hackett, W. T., Markham, A. J., Rosenberg, J., Cohen, D. E., Jacobson, A. Biochemical characterization of L-DOPA 2,3-dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from lincomycin biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 479, (2), 131-138 (2008).
  30. Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods in Enzymology. 601-626 (2009).
  31. Kemmer, G., Keller, S. Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets. Nature Protocols. 5, (2), 267-281 (2010).
  32. Wang, Y. Z., Lipscomb, J. D. Cloning, overexpression, and mutagenesis of the gene for homoprotocatechuate 2,3-dioxygenase from Brevibacterium fuscum. Protein Expr Purif. 10, (1), 1-9 (1997).
  33. Amaya, A. A., Brzezinski, K. T., Farrington, N., Moran, G. R. Kinetic analysis of human homogentisate 1,2-dioxygenase. Archives of Biochemistry and Biophysics. 421, (1), 135-142 (2004).
  34. Johnson-Winters, K., Purpero, V. M., Kavana, M., Nelson, T., Moran, G. R. 4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase from Streptomyces avermitilis: The Basis for Ordered Substrate Addition. Biochemistry. 42, (7), 2072-2080 (2003).
  35. Bugg, T. D. H. Overproduction, purification and properties of 2,3-dihydroxyphenylpropionate 1,2-dioxygenase from Escherichiacoli. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Protein Structure and Molecular Enzymology. 1202, (2), 258-264 (1993).
  36. Mendel, S., Arndt, A., Bugg, T. D. H. Acid-Base Catalysis in the Extradiol Catechol Dioxygenase Reaction Mechanism Site-Directed Mutagenesis of His-115 and His-179 in Escherichia coli 2,3-Dihydroxyphenylpropionate 1,2-Dioxygenase (MhpB). Biochemistry. 43, (42), 13390-13396 (2004).
  37. Viggiani, A., Siani, L., Notomista, E., Birolo, L., Pucci, P., Di Donato, A. The Role of the Conserved Residues His-246, His-199, and Tyr-255 in the Catalysis of Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas stutzeri OX1. Journal of Biological Chemistry. 279, (47), 48630-48639 (2004).
  38. Uragami, Y., et al. Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase. Journal of Inorganic Biochemistry. 83, (4), 269-279 (2001).
  39. Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, (Pt 2), 305-314 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics