Benchtop मैटीरियल मेटल संबध क्रोमैटोग्राफी, पुनर्गठन और एक Polyhistidine की परख स्नातक प्रयोगशाला के लिए Metalloenzyme टैग

Biochemistry
 

Summary

यहां हम benchtop मैटीरियल मेटल संबध क्रोमैटोग्राफी शुद्धिकरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और बाद में एक polyhistidine टैग की गई, गैर षयवस्तु लौह बंधन स्नातक शिक्षण प्रयोगशाला के लिए उपयुक्त dioxygenase ।

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Colabroy, K. L., Mayer, K. Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory. J. Vis. Exp. (138), e58012, doi:10.3791/58012 (2018).

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Abstract

Benchtop मैटीरियल मेटल संबध क्रोमैटोग्राफी (IMAC), के polyhistidine टैग प्रोटीन आसानी से स्नातक छात्रों द्वारा महारत हासिल है और आधुनिक साहित्य में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रोटीन शोधन पद्धति बन गया है । लेकिन, धातु बंधन प्रोटीन के लिए अपनत्व क्रोमैटोग्राफी के आवेदन, विशेष रूप से ऐसे आयरन के रूप में redox संवेदनशील धातुओं के साथ उन, अक्सर एक दस्ताने बॉक्स-उपकरण है कि स्नातक में नियमित रूप से उपलब्ध नहीं है के लिए उपयोग के साथ प्रयोगशालाओं तक ही सीमित है प्रयोगशाला. इस अनुच्छेद में, हम अलगाव के लिए हमारे benchtop तरीकों का प्रदर्शन, IMAC शुद्धि और धातु-आयन एक पाली के पुनर्गठन-histidine टैग, redox सक्रिय, गैर षयवस्तु लौह बंधन extradiol dioxygenase और विभिंन सब्सट्रेट के साथ dioxygenase की परख सांद्रता और संतृप्ति ऑक्सीजन । इन तरीकों स्नातक छात्रों द्वारा क्रियान्वित कर रहे है और उपकरण के साथ स्नातक अध्यापन और अनुसंधान प्रयोगशाला में कार्यांवित किया है कि सुलभ और सस्ती है मुख्य रूप से स्नातक संस्थानों में ।

Introduction

एक polyhistidine की शुद्धि की पहली रिपोर्ट एक मेजबान जीव के अर्क से एक केलेशनथेरेपी histidine टैग का उपयोग कर एक मैटीरियल धातु के द्वारा टैग की गईं साहित्य में प्रवेश किया १९८८1,2। उस समय के बाद से polyhistidine टैग के अलावा रिकॉमबिनेंट प्रोटीन और उनके शोधन द्वारा मैटीरियल धातु संबध क्रोमैटोग्राफी (IMAC) जैव रासायनिक साहित्य में वस्तुतः सर्वव्यापी हो गए हैं3,4, 5. IMAC शुद्धि विधियों benchtop पर लागू किया जा सकता है, स्वचालित क्रोमैटोग्राफी और स्पिन में उपयोग-कॉलम प्रारूपों । जबकि समानता शोधन विधियों, विशेष रूप से IMAC, व्यापक रूप से अनुसंधान प्रयोगशाला में उपयोग किया जाता है, वे स्नातक शिक्षण प्रयोगशाला में कम आम हैं । जैव रसायन प्रयोगशाला के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रयोगशाला पाठ्यपुस्तकों नियमित रूप से इन तरीकों सिखाने नहीं है, बजाय अधिक पारंपरिक आयन के लिए चुनने-विनिमय या डाई-क्रोमैटोग्राफी6,7,8 बंधन , 9. उदाहरण के लिए, एंडरसन द्वारा स्तनपान डिहाइड्रोजनेज की शुद्धि10 डाई-बाध्यकारी द्वारा संबध का उपयोग करता है, और गोजातीय दूध α की शुद्धि-lactalbumin7,11 बोयर द्वारा एक निकल-nitriloacetic का उपयोग करता है एसिड मैट्रिक्स, लेकिन कोई रिकॉमबिनेंट पाली-histidine टैग, बजाय राल के लिए प्रोटीन का आंतरिक संबंध पर भरोसा । कुछ आधुनिक स्नातक प्रयोगशाला की पाठ्यपुस्तकों और प्रकाशनों पाली पर मैटीरियल धातु संबध क्रोमैटोग्राफी लागू करना-histidine जैसे हरे या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में चिह्नित प्रोटीन लक्ष्य12,13, 14,15, एंटीबॉडी16, और चयनित एंजाइमों17,18,19,20, यहां तक कि कुछ अज्ञात समारोह21. यकीनन, एक एंजाइम की शुद्धि शिक्षण प्रयोगशाला में बेहतर है, क्योंकि लक्ष्य अनुवर्ती सत्रों में गतिविधि के लिए परख किया जा सकता है, छात्र की ओर से "वास्तविक विज्ञान" के अनुभव को समृद्ध; दरअसल, प्रयोगशाला के अनुभवों के इन प्रकार प्रकाशित किया गया है और छात्र सीखने पर लाभकारी परिणाम17,18,20,21की सूचना दी । और अभी तक, जैव रसायन शिक्षण प्रयोगशाला में एंजाइम शुद्धि के लिए IMAC के आवेदन विरल रह, और प्रकाशित तरीकों भी क्रोमैटोग्राफी इंस्ट्रूमेंटेशन कि कक्षा प्रयोगशाला में उपयोग के लिए आम तौर पर उपलब्ध है करने के लिए उपयोग अनुमान हो सकता है 20. वहां भी metalloproteins के लिए IMAC के आवेदन में सीमाएं हैं, विशेष रूप से उन जो redox-संवेदनशील divalent धातुओं कि22गतिविधि के लिए आवश्यक है बांध । अक्सर, धातु आयन खो दिया है या एक निष्क्रिय एंजाइम बीमार स्नातक प्रयोगशाला के लिए अनुकूल उपज शुद्धिकरण के दौरान ऑक्सीकरण हो जाता है ।

एंजाइमों की एक पूरी एक तिहाई एक धातु आयन23बांध, और23जीवन के सभी रूपों में लोहे के लिए एक लगभग सार्वभौमिक आवश्यकता के बावजूद, आयरन enzymology में सबसे समस्याग्रस्त धातु आयनों के बीच यकीनन है । गैर षयवस्तु Fe2 + binding एंजाइमों विशेष रूप से IMAC के दौरान नुकसान और/ संभवतः षयवस्तु की तरह एक समर्पित कार्बनिक ligand की कमी के कारण और आसानी जिसके साथ2 Fe + एमिनो एसिड24लाइगैंडों से अलग कर देना कर सकते हैं । इसके अलावा, ऑक्सीजन के आश्रित ऑक्सीकरण2 fe + करने के लिए3 + + को जलीय समाधान में सहज है, नकारात्मक मुक्त ऊर्जा परिवर्तन के कारण और Fe 3 के सापेक्ष स्थिरता+। अक्सर, इन चुनौतियों anaerobic वातावरण और/या गैर IMAC क्रोमेटोग्राफिक तरीकों22के उपयोग से दूर कर रहे हैं । इस अनुच्छेद में, हम benchtop IMAC के उपयोग के लिए Fe2 + निर्भर metalloenzyme एल शुद्ध-डोपा सरल, सस्ती क्रोमैटोग्राफी आपूर्ति, सक्रिय साइट Fe2 +के पुनर्गठन के बाद का उपयोग कर dioxygenase, और प्रदर्शन करेंगे एंजाइमी परख । इन तरीकों को 6-12 छात्र समूहों की हमारी खुद की स्नातक जैव रसायन प्रयोगशाला में मानक है और स्नातक स्तर पर एंजाइम जांच के प्रदर्शनों की प्रक्रिया का विस्तार किया जा सकता है ।

Protocol

1. शुद्धिकरण के लिए तैयारी

  1. सेल फ्री क्रूड निकालने की तैयारी
    1. प्राप्त एक ~ 9-10 ई. कोलाई (BL21) के जी सेल गोली है कि एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में25 metalloprotein टैग polyhistidine व्यक्त ।
    2. कक्ष temp lysis/bind बफ़र (५० mm फॉस्फेट, ३०० mm NaCl, 10 mm imidazole पर पीएच 8) के प्रति ग्राम 5 मिलीलीटर जोड़ें ~ 9-10 एक कुल मात्रा ~ 45-50 एमएल के लिए सेल गोली की जी । आवधिक रूप से विघटन को प्रोत्साहित करने के लिए भंवर । अगर गोली जमी थी, एक गुनगुना पानी स्नान में गल ।
    3. बर्फ जल स्नान का प्रयोग, सेल lysis के लिए तैयार करने में ~ 3 ° c करने के लिए सेल निलंबन चिल ।
      नोट: इस बिंदु पर, sonication, मनका मिलिंग या किसी अंय विधि द्वारा सेल lysis संभव है । मनका मिलिंग यहां का प्रदर्शन किया है, क्योंकि यह तेजी से है, अपेक्षाकृत सस्ती है, और कान संरक्षण की आवश्यकता नहीं है ।
    4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक ५० मिलीलीटर मनका मिलिंग चैंबर इकट्ठा ।
    5. मनका मिल चैंबर ठंडा ०.१ mm ग्लास मोती है कि-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया है से भरा आधा भरें ।
    6. ठंडा सेल निलंबन के साथ चैंबर के बाकी भरें और 4 ° c lysis/बाइंड बफर चैंबर पूरी तरह से भरने के लिए उपयोग करें ।
    7. मनका मिल के शाफ्ट को घुमाने के लिए एक छोटे से रंग का प्रयोग करें और मोतियों के साथ सेल सस्पेंशन मिलाएं ।
    8. एक प्लास्टिक के साथ किसी भी बड़े बुलबुले निकालें, और फिर पर ढक्कन पेंच ।
    9. किसी भी रिसाव से चैंबर सूख ।
    10. साफ करने के लिए बर्फ के बारे में 1 कप जोड़ें, प्लास्टिक की जैकेट, बर्फ भरा जैकेट में भरा ५० एमएल चैंबर पलटना, और पेंच बंद कर दिया ।
    11. मोटर पर बर्फ जैकेट चैंबर सुरक्षित ।
    12. १५,८०० rpm पर 15 सेकंड के लिए मनका मिल मोटर बारी है, तो ४५ सेकंड के लिए आराम करने की अनुमति । 8 बार दोहराएं ।
    13. जब 8 चक्र पूरा कर रहे हैं, एक ५० मिलीलीटर या बड़ा ट्यूब उच्च गति केंद्रापसारक के लिए रेटेड (२५,००० x g या उच्चतर) में पूरे सेल lysis निलंबन नहीं कर रहे हैं । में संतुलित ट्यूबों की एक जोड़ी प्लेस केंद्रापसारक और 40-45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर २५,००० एक्स जी में स्पिन करने के लिए गोली सेल मलबे और कांच मोती ।
      नोट: यदि ५० मिलीलीटर या बड़ा ट्यूबों उच्च गति केंद्रापसारक के लिए रेटेड उपलब्ध नहीं हैं, एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 2-3 मिनट के लिए १०००-२००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कांच मोती निकालें कोशिका निलंबन (~ 25 एमएल) है कि एक छोटे वोल्यम में नहीं किया जा सकता है की एक छोटी मात्रा उपज के लिए ई ट्यूब उच्च गति केंद्रापसारक के लिए रेटेड ।
    14. जब केंद्रापसारक पूरा हो गया है, स्पष्ट, पीले, सेल मुक्त, कच्चे तेल के अर्क में एक साफ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब । ध्यान रखना किसी भी सेल मलबे हस्तांतरण नहीं है ।
    15. एसडीएस द्वारा शुद्धि के बाद विश्लेषण के लिए सेल मुक्त क्रूड अर्क का एक छोटा सा नमूना-पृष्ठ26लीजिए ।
  2. IMAC स्तंभ की तैयारी
    1. एक १.५ x 20 सेमी एक कम बिस्तर का समर्थन राल कणों, एक Luer ताला आउटलेट और एक ऊपरी टोपी है कि यह भी एक Luer ताला फिटिंग शामिल बनाए रखने के साथ सुसज्जित कॉलम प्राप्त करें । प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए एक टोंटी के साथ Luer-lock आउटलेट को फ़िट करें ।
    2. benchtop पर कार्य करना, सुरक्षित रूप से एक अंगूठी पर कॉलम माउंट खड़े हो जाओ ।
    3. 20% इथेनॉल है कि 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया है में निकल बंधे nitriloacetic एसिड (Ni-ंत्) राल का एक ५०% घोल प्राप्त करें ।
    4. धीरे से बोतल भंवर को समान रूप से फिर से राल निलंबित ।
    5. कमरे में कार्य-तापमान और benchtop पर, एक एेसे प्लास्टिक का उपयोग करने के लिए घोल की 2 मिलीलीटर, जो बाध्यकारी में सक्षम राल के 1 मिलीलीटर निकलेगा 50-60 मिलीग्राम polyhistidine टैग की गईं प्रोटीन, और कॉलम को घोल हस्तांतरण ।
    6. टोंटी खोलें और अतिरिक्त भंडारण समाधान राल से गुरुत्वाकर्षण द्वारा नाली के लिए अनुमति देते हैं ।
    7. टोंटी को सुरक्षित रूप से बंद करें
    8. एक पाश्चर प्लास्टिक का प्रयोग, ध्यान से ठंडा lysis/बांध बफर (५० mm फॉस्फेट, ३०० mm NaCl, 10 मिमी imidazole पीएच 8 में) और राल के कॉलम के लिए-कम से कम 30 मिलीलीटर जोड़ें । राल सतह को परेशान करने के लिए नहीं ध्यान रखना । छप रोकने के लिए स्तंभ की दीवारों के नीचे बफर चलाएँ.
    9. lysis/बाइंड बफर एक संग्रह चोंच में गुरुत्वाकर्षण द्वारा स्तंभ से धीरे नाली के लिए अनुमति देकर राल Equilibrate ।
    10. जब lysis/बाइंड बफर ज्यादातर सूखा है, टोंटी के प्रवाह को रोकने के लिए बंद करो जब ~ lysis बफर के 5 मिलीलीटर राल के ऊपर रहता है और कॉलम छोड़, ईमानदार घुड़सवार, जब तक तैयार करने के लिए आगे बढ़ना या 1 सप्ताह के लिए ।

2. Polyhistidine की शुद्धि-IMAC द्वारा लक्ष्य चिह्नित

  1. धो बफर तैयार (५० mm फॉस्फेट, ३०० mm NaCl, 20 मिमी imidazole पीएच 8) और रेफरेंस बफर (५० mm फॉस्फेट, ३०० mm NaCl, २५० mm imidazole, 10% ग्लिसरॉल पीएच 8) । 4 ° c पर चिल ।
  2. नी-ंत् राल के माध्यम से गुरुत्वाकर्षण से पलायन करने के लिए टोंटी को खोलने और शेष lysis/बाध्यकारी बफर अनुमति देने के द्वारा सेल मुक्त कच्चे तेल के अर्क के अलावा के लिए ni-ंत् स्तंभ तैयार करें । जब सभी बफर सूखा है, और राल सतह उजागर है, टोंटी बंद करें ।
  3. एक पाश्चर प्लास्टिक का प्रयोग, ध्यान से राल पर सेल मुक्त क्रूड निष्कर्षों प्लास्टिक, ध्यान नहीं सतह परेशान करने के लिए ले । कच्चे कॉलम की दीवारों के नीचे अर्क रन छप रोकने के लिए । कच्चे तेल के अर्क की मात्रा polyhistidine-टैग किए गए प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर है; सुनिश्चित करें कि क्रूड के अर्क की कुल मात्रा 50-60 मिलीग्राम या नी-ंत् राल के प्रति मिलीलीटर लक्ष्य प्रोटीन का कम होता है (चरण 1.2.4 देखें) ।
  4. जब सभी कच्चे अर्क के कॉलम को स्थानांतरित कर दिया गया है, टोंटी खुला तो कॉलम गुरुत्वाकर्षण द्वारा पलायन कर सकते हैं । इस प्रवाह के माध्यम से प्रोटीन है कि राल को बांध नहीं था से बना है-एसडीएस द्वारा शुद्धि के बाद विश्लेषण के लिए १०० μL इकट्ठा-पृष्ठ । 26
  5. सेल मुक्त कच्चे तेल के अर्क की चिपचिपाहट काफी कॉलम के गुरुत्वाकर्षण प्रवाह को धीमा कर सकती है । प्रवाह की दर बढ़ाने के लिए, एक सरल "हाथ पंप" लागू करें:
    1. एक 10 मिलीलीटर Luer-लॉक सिरिंज ले लो और स्तंभ कैप और सिरिंज के बीच प्लास्टिक टयूबिंग और Luer-ताला फिटिंग की एक छोटी लंबाई का उपयोग कर स्तंभ की टोपी से कनेक्ट । बाहर सिरिंज गोताख़ोर ड्रा, और फिर कसकर कॉलम के शीर्ष पर स्तंभ टोपी फिट ।
    2. धीरे से एक एेसे सिलेंडर में eluent इकट्ठा करके प्रवाह की दर का आकलन करते हुए सिरिंज के गोताख़ोर सेक; 1-2 मिलीलीटर प्रति मिनट की दर राल और इस स्थापना के साथ संगत कर रहे हैं । धीरे प्रवाह की दर के रूप में सिरिंज गोताख़ोर के संपीड़न में वृद्धि धीमी हो जाती है ।
    3. राल में हवा का परिचय रोकने के लिए, स्तंभ कैप और संलग्न हाथ-पंप को हटाने जब एप्लाइड लिक्विड की meniscus राल बिस्तर के ऊपर 5-10 मिमी तक पहुँच जाता है, और शेष मात्रा गुरुत्वाकर्षण द्वारा पलायन करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  6. जब सेल मुक्त क्रूड निष्कर्षों draining समाप्त कर दिया है और राल सतह फिर से उजागर किया है, एक पाश्चर प्लास्टिक का उपयोग करने के लिए ध्यान से जोड़ने ~ ठंडा धोने बफर की 30 एमएल कॉलम को-ध्यान नहीं राल की सतह को परेशान करने के लिए ले । छप रोकने के लिए स्तंभ की दीवारों के नीचे बफर चलाएँ.
  7. टोंटी खोलें और वाश बफ़र स्तंभ के माध्यम से ड्रेन करने के लिए अनुमति दें । इस प्रक्रिया को राल से कमजोर बाध्य प्रोटीन निकाल रहा है । eluent को त्यागें ।
  8. जबकि धोने बफर draining है, तैयार सोलह, लेबल, 1 मिलीलीटर अंशों को इकट्ठा करने के लिए microcentrifuge ट्यूबों ।
  9. जब धोने बफर सूखा है, और राल सतह फिर से उजागर है, बंद टोंटी । एक पाश्चर प्लास्टिक का प्रयोग करें ध्यान से जोड़ने के लिए ~ ठंडा रेफरेंस बफर के स्तंभ के लिए 30 मिलीलीटर-राल की सतह को परेशान करने के लिए ध्यान नहीं ले रही । छप रोकने के लिए स्तंभ की दीवारों के नीचे बफर चलाएँ.
  10. टोंटी को धीरे से खोलें और रेफरेंस बफ़र को कॉलम से polyhistidine टैग किए गए प्रोटीन को elute करने दें । प्रत्येक चिह्नित microcentrifuge ट्यूबों, 1 के माध्यम से 16 में eluent के 1 मिलीलीटर लीजिए ।
  11. परीक्षण प्रोटीन के लिए अंशों ऐसे ब्रैडफोर्ड परख या यूवी के रूप में दिखाई स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में एक वर्णमिति प्रोटीन परख का उपयोग कर-एजेंट द्वारा विशिष्ट तरीकों के अनुसार और/ के रूप में यहां दिखाया गया है, वर्णमिति Coomassie नीले रंग का उपयोग कर परख नीचे एक १०० μL मात्रा के लिए स्केल है ताकि प्रत्येक अंश से केवल एक छोटी सी मात्रा बलिदान ।
  12. एक वर्णमिति प्रोटीन परख रिएजेंट के १०० µ एल के साथ प्रत्येक अंश के 3 μL मिश्रण और मैंयुअल रूप से किसी भी रंग के गठन का पालन करने के लिए अंश में प्रोटीन की उपस्थिति का संकेत; एक स्पेक्ट्रोमीटर के साथ पता लगाना आवश्यक नहीं है ।
  13. यदि प्रोटीन अंश 16 में पाया जाता है, eluting जारी रखें 1 मिलीलीटर भिन्न और परख प्रोटीन के लिए समय पर, जब तक eluted अंश अब प्रोटीन की एक महत्वपूर्ण मात्रा में होते हैं.
  14. एक स्वच्छ शंकु ट्यूब में प्रोटीन युक्त अंश का मिश्रण है, और बाद में विश्लेषण के लिए एक १०० μL नमूना वापस लेने के द्वारा एसडीएस-पृष्ठ26
  15. धातु आयन cofactor के पुनर्गठन के साथ आगे बढ़ें या-80 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिलीलीटर aliquots में प्रोटीन फ्रीज । सुनिश्चित करें कि 10% ग्लिसरॉल रेफरेंस बफर में शामिल है एक cryoprotectant ठंड के दौरान शुद्ध प्रोटीन को स्थिर करने के लिए है ।
  16. जब नी-ंत् कॉलम का रेफरेंस पूरा हो जाता है, अर्थात, सभी प्रोटीन कॉलम से दूर हो जाते हैं और अंशों में एकत्र हो जाते हैं, कॉलम के माध्यम से एक और 25 एमएल का रेफरेंस बफर पास होता है, और 4 डिग्री सेल्सियस पर कॉलम को स्टोर करते हैं, जिसमें शॉर्ट-टर्म स्टोरेज के लिए रेफरेंस बफर की 5 मिलीलीटर , या lysis/बाइंड बफ़र के साथ 20% इथेनॉल के लिए लंबी अवधि के संग्रह ।

3.2 Fe के साथ लक्ष्य प्रोटीन का पुनर्गठन+

  1. Fe के अलावा2 +
    नोट: एक गैर षयवस्तु आयरन (II) बाध्यकारी एंजाइम, इस उदाहरण में एल-डोपा dioxygenase के रूप में, एक Fe की आवश्यकता है2 + गतिविधि के लिए आयन; हालांकि, लौह (द्वितीय) आसानी से लोहे के ऑक्सीकरण (III), जो निष्क्रिय है, और प्रोटीन का एक अंश बिल्कुल भी लोहे के बिना शुद्ध ।
    1. के लिए धातु का पुनर्गठन शुरू, शुद्ध के रेफरेंस बफर में निलंबित एंजाइम के 3 मिलीलीटर प्राप्त करते हैं । यदि जमे हुए, गल तेजी से एक गुनगुना पानी स्नान का उपयोग कर, और एक बार गल, बर्फ पर प्रोटीन डाल दिया ।
    2. ट्यूब में प्रोटीन की मात्रा का उपयोग करना, नमूने में अंतिम एकाग्रता १२.५ mM बनाने के लिए आवश्यक सोडियम ascorbate (१९८.१ g/) की मात्रा की गणना करें । इसके अलावा, नमूना में अंतिम एकाग्रता १२.५ मिमी बनाने के लिए आवश्यक dithiothreitol की मात्रा (डीटीटी, १५४.२५ g/
    3. ठोस सोडियम ascorbate और डीटीटी और धीरे जोड़ें, लेकिन पूरी तरह से भंग करने के लिए अच्छी तरह से, मिश्रण. पीढ़ी आक्रामक मिश्रण के साथ प्रोटीन वर्षा का कारण नहीं ध्यान रखना । आयरन की एक छोटी राशि में जोड़ें (II) सल्फेट heptahydrate (मेगावाट २७८.०१ ग्राम/
    4. आदेश में लौह नमक की एक छोटी सी पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए, FeSO4• 7H2के कुछ 1 मिमी granules नल बाहर वजन कागज का एक टुकड़ा पर ठोस, दाना पर कागज गुना, और यह एक धातु रंग के फ्लैट की ओर से कुचलने ।
    5. परिणामस्वरूप पाउडर का एक अनाज प्रोटीन की ट्यूब को जोड़ें ।
    6. मिश्रण करने के लिए भंवर और एक गुलाबी पिंक रंग ट्यूब में दिखाई देगा ।
    7. बर्फ पर 10-30 मिनट के लिए छाया हुआ, प्रोटीन के गुलाबी समाधान की मशीन । गुलाबी रंग धीरे समय के साथ फीका होगा ।
  2. जेल निस्पंदन
    1. एक जेल निस्पंदन कॉलम का प्रयोग एक आणविक वजन बहिष्करण सीमा के साथ गोलाकार polyacrylamide जेल के 10 मिलीलीटर के लगभग ६,००० और एक हाइड्रेटेड कण आकार रेंज के 90 – 180 µm में एक १.५ x 12 सेमी कॉलम में, जो भी एक 10 मिलीलीटर जलाशय से सुसज्जित है । सुनिश्चित कॉलम कम और ऊपरी बिस्तर के साथ सुसज्जित है 30 उम छिद्र पॉलीथीन डिस्क के रूप में समर्थन करता है कॉलम में राल बनाए रखने और सूखी चलने से राल बिस्तर को रोकने के । एक अंगूठी खड़े करने के लिए जेल निस्पंदन कॉलम माउंट ।
    2. एक पूर्व पैक जेल निस्पंदन कॉलम का उपयोग कर, टोपी हटाने और ऊपरी बिस्तर समर्थन के ऊपर अतिरिक्त बफर बंद डालो ।
    3. कॉलम equilibrate करने के लिए, बाद परख और भंडारण के साथ संगत बफर के साथ जलाशय भरने से शुरू, उदाहरण के लिए, ५० mm णः2PO4, २०० mm NaCl, 10% ग्लिसरॉल पर पीएच ८.० ।
    4. एक पूर्व पैक जेल निस्पंदन कॉलम का उपयोग कर, बफर के प्रवाह को शुरू करने और Luer पर्ची फिटिंग बेनकाब करने के लिए जेल निस्पंदन स्तंभ के नीचे टिप बंद तस्वीर । स्तंभ के Luer स्लिप अंत करने के लिए एक टोंटी फिट है, लेकिन यह खुला छोड़ और कॉलम गुरुत्वाकर्षण द्वारा ड्रिप करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    5. जब बफर कॉलम से सूखा पड़ा है और ऊपरी बिस्तर का समर्थन उजागर है, टोंटी बंद है, और Fe के ~ 3 मिलीलीटर (II) का पुनर्गठन metalloenzyme स्तंभ को उजागर ऊपरी बिस्तर समर्थन पर समाधान pipetting द्वारा जोड़ें ।
    6. टोंटी खोलें और पूरे ३.० एमएल नमूना गुरुत्वाकर्षण द्वारा कॉलम में प्रवेश करने के लिए अनुमति देते हैं । eluent के इन पहले 3 मिलीलीटर त्यागें । किसी भी गुलाबी रंग है कि रूपों जबकि समाधान हैंडलिंग कॉलम के शीर्ष पर फंस जाएगा ।
    7. जब कॉलम टपकता बंद कर दिया है और ऊपरी बिस्तर समर्थन उजागर होता है, तो स्तंभ के लिए जेल-निस्पंदन बफर (जैसे, ५० मिमी णः2PO4, २०० mm NaCl, 10% ग्लिसरॉल पीएच ८.०) के 4 मिलीलीटर जोड़ें । टोंटी खोलें और आठ ०.५ मिलीलीटर अंशों पर microcentrifuge ट्यूबों में eluent एकत्र करें ।
    8. परीक्षण प्रोटीन के लिए अंशों का उपयोग कर एक वर्णमिति प्रोटीन परख या यूवी-तुलना27,28 के रूप में पहले वर्णित है ।
    9. प्रोटीन युक्त अंशों का मिश्रण ।
    10. एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण26के लिए एक नमूना निकालें ।
    11. परख या नमूने के भंडारण के साथ आगे बढ़ें ।

Representative Results

ये प्रतिनिधि परिणाम स्नातक छात्रों द्वारा एकत्र के रूप में वे बीसीएम ३४१ के दो पाठ्यक्रम प्रयोगशाला अवधि के दौरान इस प्रोटोकॉल को मार डाला: Muhlenberg कॉलेज में प्रयोगात्मक जैव रसायन थे । चित्रा 1 एक 20 केडीए पाली-histidine टैग metalloenzyme, एल-डोपा dioxygenase की शुद्धि के परिणामों को दर्शाता है, के रूप में एक 4 घंटे कक्षा प्रयोगशाला अवधि के दौरान दो स्नातक छात्रों द्वारा प्रदर्शन किया और एसडीएस द्वारा विश्लेषण-पृष्ठ उसी के द्वारा अनुवर्ती प्रयोगशाला अवधि के दौरान छात्र । पाली-histidine टैग प्रोटीन प्रभावी ढंग से शुद्ध (चित्रा 1, लेन 2) है । पाली-histidine टैग के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर जेल का एक immunoblot इंगित करता है कि पाली-histidine लक्ष्य प्रोटीन की एक छोटी राशि प्रवाह में खो दिया है के माध्यम से (डेटा नहीं दिखाया गया है), की संभावना है क्योंकि अधिक से अधिक १०० मिलीग्राम लक्ष्य प्रोटीन की मात्रा में lysate राल की बाध्यकारी क्षमता से अधिक है ।

चित्रा 2 प्रदर्शित करता है कि पाली के एंजाइमी प्रतिक्रिया पर छात्र एकत्र गतिविधि डेटा-histidine टैग metalloenzyme लक्ष्य, एल डोपा dioxygenase, लौह के साथ पुनर्गठन के बाद (द्वितीय) और बाद में जेल-निस्पंदन के रूप में प्रोटोकॉल द्वारा वर्णित इस. पांच सेकंड मृत समय से पहले एकत्र डेटा शुरू होता है पहली बार के लिए इस तकनीक का निष्पादन छात्रों की खासियत है । metalloenzyme की मजबूत गतिविधि एक प्रकाशित परख का उपयोग कर पाया गया था, और स्थिर राज्य काइनेटिक पैरामीटर प्रकाशित परिणामों के अनुरूप29उपज । संभल-राज्य काइनेटिक मापदंडों30 चित्रा 2में दिखाया प्रगति घटता द्वारा निर्धारित किया गया; हालांकि, गैर रेखीय कम प्रारंभिक दरों की फिटिंग सब्सट्रेट सांद्रता की एक श्रृंखला पर एकत्र की एक समान रूप से संभव है31

Figure 1
चित्र 1. एसडीएस-पृष्ठ26 पाली के विश्लेषण-histidine से पहले प्रोटीन टैग, के दौरान और शुद्धि के बाद । गलियाँ 1-आणविक वजन मार्करों, 2-शुद्ध प्रोटीन (20 केडीए) पोस्ट नी-ंत्, 3-ni-ंत् प्रवाह के माध्यम से, 4 सेल मुक्त क्रूड अर्क शुद्धि से पहले, 5 सेल मलबे गोली पोस्ट lysis । नमूने 5x नमूना/लोडिंग बफर का उपयोग कर तैयार किया गया था और एक जेल ट्रो प्रणाली का उपयोग कर पूर्व कास्ट 4-20% polyacrylamide जैल पर अलग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. स्थिर लोहे के राज्य परख (द्वितीय) पुनर्गठन metalloenzyme (यानी, एल-डोपा dioxygenase, 10 µ एम) सब्सट्रेट के साथ (एल-डोपा-5 µ मीटर (लाल), 25 µ मीटर (ग्रीन), ५० µ मीटर (नीला)) बफर में (५० mm फास्फेट, २०० mm NaCl, पीएच 8). निशान 414nm में उत्पाद के गठन का चित्रण । अवशोषित डेटा लगातार एक विभाजन-बीम स्कैनिंग यूवी दिखाई स्पेक्ट्रोमीटर29में 1 मिलीलीटर methacrylate cuvettes का उपयोग कर अधिग्रहीत किया गया । कच्चे डेटा Michaelis-मेनटेन स्थिर राज्य सन्निकटन (kएम ३०.८ µ एम ± १४.४, कश्मीरकैटस्पष्ट २.३ एस-1 ± ०.०५)30के एक मॉडल के लिए फिट कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

जबकि रिकॉमबिनेंट प्रोटीन और imac द्वारा उनकी शुद्धि के लिए polyhistidine टैग के अलावा जैव रासायनिक साहित्य में वस्तुतः सर्वव्यापी हो गया है3,4,5, एंजाइम शुद्धि के लिए IMAC के आवेदन जैव रसायन शिक्षण प्रयोगशाला में विरल रहना, और प्रकाशित तरीकों हमेशा शिक्षण प्रयोगशाला20के संसाधन सीमाओं पर विचार नहीं है । इसके अलावा, शिक्षण प्रयोगशाला में IMAC का उपयोग सबसे प्रभावी है जब प्रयोगों के लिए युग्मित है कि गतिविधि और पवित्रता का आकलन, एक एंजाइम एक आदर्श अनुदेशात्मक गतिविधि के IMAC शोधन कर । आदेश में metalloenzymes सहित एंजाइमों की शुद्धि के लिए IMAC के आवेदन का विस्तार करने के लिए, शिक्षण प्रयोगशाला में, विश्वसनीय और सस्ती तरीकों की जरूरत है । इस प्रोटोकॉल में, हम प्रदर्शित benchtop imac आसानी से उपलब्ध है और सस्ती प्रयोगशाला की आपूर्ति का उपयोग करते हुए भी22metalloproteins को imac के आवेदन में सीमाओं को संबोधित करते हुए आयरन (द्वितीय) निर्भर पुनर्गठन द्वारा metalloenzyme, L-डोपा dioxygenase, पद शुद्धि । रिएजेंट और सामग्री का उपयोग करते हुए वर्णित है, हम आठ छात्र समूहों के लिए उपभोग्य सामग्रियों की लागत का अनुमान $500-600 प्रति सेमेस्टर के बीच इस प्रोटोकॉल, विश्लेषण चित्रा 1 और चित्रा 2में उल्लिखित चरणों सहित चलाने के लिए है ।

कारण आसानी से जो fe2 + एमिनो एसिड लाइगैंडों24 और 2 fe के सतही ऑक्सीकरण से अलग कर देना कर सकते है+ 2 से fe 3 +, गैर के पुनर्गठन-षयवस्तु, एमिनो एसिड-chelated आयरन (द्वितीय) एक रिकॉमबिनेंट metalloenzyme में है एंजाइम शुद्धि का एक विशिष्ट घटक । जब शास्त्रीय क्रोमैटोग्राफी प्रयोग किया जाता है, यह कुछ मामलों३२में लोहे के कुल नुकसान से बचने के लिए संभव है, लेकिन अधिक बार, आयरन (द्वितीय) एजेंटों को कम करने की उपस्थिति में वापस जोड़ा जाता है३३,३४,३५, ३६ अक्सर एक anaerobicatomosphere३७,३८,३९के तहत, और कुछ मामलों में अतिरिक्त लोहा नहीं निकाला जाताहै ३३, ३४,३६, उलझी किसी भी बाद परख । शास्त्रीय क्रोमैटोग्राफी और एक anaerobic वातावरण के लगातार कदम स्नातक प्रयोगशाला के लिए यथार्थवादी नहीं हैं, इस प्रोटोकॉल के विकास को उत्साह ।

जबकि नी-ंत् कॉलम और नमूनों के प्रसंस्करण के लिए काफी हद तक गुरुत्वाकर्षण द्वारा मैनुअल तैयारी अतिरिक्त समय और प्रयास जब पूर्व पैक कॉलम और स्वचालित क्रोमैटोग्राफी इंस्ट्रूमेंटेशन की तुलना में ले करता है, मैनुअल कदम हाथ पर अनुमति देने के लिए इस प्रक्रिया के पीछे विज्ञान की वृद्धि हुई समझ में परिणाम है कि छात्र द्वारा सीखना । एक लोहे के अलावा (द्वितीय) यहां उल्लिखित शर्तों के तहत नमक विशेष रूप से अतिरिक्त dithiothreitol के प्रति संवेदनशील है । यदि एक छात्र गलती से dithiothreitol की एक अतिरिक्त कहते हैं, एक वर्षण घटना की संभावना है । हम इसे प्रयोगशाला में पहुंचने से पहले छात्रों को एजेंट मात्रा की गणना करने के लिए की आवश्यकता करने के लिए उपयोगी पाया है, तो लेबोरेटरी समय बेंच पर सबसे प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया जा सकता है । पूरे benchtop IMAC शुद्धि-सेल से प्रोटीन रेफरेंस के लिए lysis-एक 4 घंटे की प्रयोगशाला अवधि में पूरा किया जा सकता है, पुनर्गठन और बाद में एक प्रयोगशाला अवधि में परख के बाद ।

Disclosures

लेखकों ने कोई खुलासे नहीं किए हैं ।

Acknowledgments

यह प्रकाशन अनुदान सं के अंतर्गत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित काम पर आधारित है ।  चे १७०८२३७.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
consumables
BeadBeater 0.1mm glass beads BioSpec Products 11079101 1 pound each
50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile VWR 21008-178
Sodium chloride Fisher Bioreagents BP358-1
Potassium phosphate, monobasic Acros (Fisher) AC42420-5000
Sodium Ascorbate Acros (Fisher) AC35268-1000 
DTT (Dithiothreitol) Lab Scientific D-115
Iron(II) sulfate heptahydrate Sigmaaldrich 310077
HisPur NiNTA Resin  Fisher (pierce) PI88221
Econo-Column Chromatography Columns - 1.5 x 20cm Bio-Rad 737-1522  1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea, 
Stopcock Valve, one way, female to male luer Kimble 420163-0000 pack of 50
BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle) VWR 301029
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer Biorad 7318222
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer  Biorad 7318225
Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump) Bio-Rad 7318211 Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling
Glycerol Fisher (Pierce) 17904
Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay Thermo Scientitic 23236
Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL VWR 89000-028
Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets Fisher 13-676-10F
Fiserbrand universal pipet pump Fisher  14-955-110
Fisherbrand Transfer Pipets Fisher  13-711-9AM
Econo-Pac 10DG desalting columns Bio-Rad 732-2010 box of 30
ExpressPlus PAGE 5x sample buffer Genscript MB01015 5mL (Dilute 1:5 with sample)
ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells Genscript M42012 20 gels
Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate Fisher 14-955-128  case of 500
Cuvette Caps Square Disposable Fisher 14-385-999
L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine) Acros D9628-5G
Permanent Equipment: 
BeadBeater 50mL chamber  BioSpec Products 110803-50SS 1 chamber
BeadBeater BioSpec Products 1107900-101 350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.
Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL Fisher 3119-0050PK
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel Bio-Rad 1658004  4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 1645052 100–120/220–240 V, power supply for high-current applications, includes power cord
UV-1800 with UV-Probe Software Shimadzu UV-1800
Kintek Global Kinetic Explorer Kintek Corp version 6 https://www.kintekexplorer.com/downloads/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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