다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

Genetics
 

Summary

전체 길이 개별 proviral 시퀀싱 (뒤집기) 증폭 및 단일 전체 길이 (손상 및 결함) HIV-1 proviruses 근처의 시퀀싱에 대 한 효율적이 고 높은 처리량 방법 제공 하 고 그들의 잠재력의 결정에 대 한 허용 복제-역량입니다. 튀기기 잠재 HIV-1 저수지 시퀀싱 하도록 분석 하는 이전 실험의 한계를 극복 한다.

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Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh, B. A., Palmer, S. Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58016, doi:10.3791/58016 (2018).

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Abstract

Full-Length 개별 Proviral 시퀀싱 (뒤집기) 분석 결과 증폭 및 단일 전체 길이 (손상 및 결함), 에이즈-1 proviruses 근처 시퀀싱 하도록 설계 된 효율적이 고 높은 처리량 방법입니다. 넘겼습니다 셀 인구 내의 통합된 에이즈-1의 유전자 구성의 결심을 허용 한다. 반전 녹음 방송, 큰 내부 삭제, 같은 기간 동안 발생 하는 에이즈-1 proviral 시퀀스 내에서 결함 식별을 통해 해로운 정지 codons/hypermutation, frameshift 돌연변이 및 cis 요소 행동 돌연변이/삭제 필요 virion 성숙에 대 한 뒤집기 통합된 proviruses 복제의를 식별할 수 있습니다. 에이즈-1 proviruses는 이러한 결함을 부족 하 고 따라서 잠재적으로 복제 유능한 식별을 넘겼습니다 분석 결과 활용할 수 있습니다. 넘겼습니다 프로토콜 포함: 에이즈-1 감염 된 세포의 세포 전체 길이 HIV-1 proviruses 근처의 PCR 중첩 (에이즈-1 5를 타겟으로 하는 뇌관을 사용 하 여 ' 3 ' LTR), DNA 정제, 정량화, 도서관 준비 위한 차세대 시퀀싱 (NGS), NGS, 드 노 보 조립 proviral contigs 및 복제 유능한 proviruses 식별에 대 한 철폐의 간단한 과정. 뒤집기 순서를 설계 하는 전통적인 방법에 비해 장점이 통합 단일 proviral 시퀀싱 등 에이즈-1 proviruses을 제공 합니다. 넘겼습니다 증폭 및 결정, 되도록 복제 능력을 사용 하는 전체 길이 proviruses 근처 시퀀스 고 또한 적은 증폭 뇌관, 뇌관 불일치의 결과 방지를 사용 합니다. 그러나 튀기기 잠재 저수지 내 특히 통합된 HIV-1 proviruses의 유전 프리를 이해 하기 위한 유용한 도구입니다, 그리고, 그것의 사용 있는 통합된 에이즈-1의 유전자 조성은 필요한 모든 응용 프로그램을 확장할 수 있습니다.

Introduction

장기 투여 치료 (미술)에 개인에 속하는 잠재 HIV-1 저수지의 유전 특성 이해는 통합된 proviruses의 대부분은 결함이 있는 복제 무능1 에 중요 한 되었습니다. , 2. 반전 녹음 방송 과정에서 오류 통합된 proviral 시퀀스에 소개 된다. 결함이 proviral 시퀀스를 생성 하는 몇 가지 메커니즘 등 오류 발생 hiv-1 역전사 효소3,4및 APOBEC 유도 hypermutation5,6스위칭 템플릿. 두 개의 최근 연구 에이즈-1 proviruses 장기 예술에 개인에서 고립의 약 5% 유전자 그대로, 그리고 잠재적으로 복제 유능한, 그리고 예술의 정지시 에이즈-1 플라스마 수준에 빠른 리바운드에 기여할 수 있습니다 나타났습니다. 1 , 2 , 7. 이전 연구 복제 유능한 HIV-1 proviruses 순진한 및 메모리 CD4 휴식 유지 확인+ T 세포 부분 집합 (를 포함 하 여 중앙, 전환 및 효과 기 기억 T 세포)의 중요성을 나타내는 이 대상으로 미래에 박멸 전략2,,89세포.

배포, 역학 및 잠재 HIV-1 저수지의 유지 보수에 초기 통찰력 유전자 hiv-1 게놈10 의 하위 게놈 영역을 특징 짓는 단일 proviral 시퀀싱 (SPS) 방법의 활용을 통해 달성 했다 11,,1213. SPS는 단일 감염 된 세포 내에서 단일 HIV-1 provirus 시퀀싱 수 다재 다능 한 도구입니다. 그러나, SPS는 그것만 뇌관 바인딩 사이트 내의 큰 삭제를 포함 하는 하위 게놈 영역 및 누락 proviruses 시퀀스 이후 proviruses의 복제 능력을 확인할 수 없습니다. 이전 연구는 SPS에 의해 복제 유능한 저수지의 크기를과 대 평가 설명 했다 13-에 17 배 그대로 하위 게놈 영역2를 선택적으로 시퀀싱을 통해.

SPS, 호 외. 의 한계를 해결 하기 위해 4 와 브루 너 외. 1 전장 HIV-1 proviruses 근처 시퀀스 분석 실험을 개발 했다. 이 결정 장기 예술에 개인 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한, 에이즈-1 proviruses의 주파수를 허용. 이 분석 실험 증폭 및 시퀀싱 (통해 생어 시퀀싱) 하위 게놈 영역을 다음 순서는 그대로 (결함)의 HIV-1 provirus를 조립 했다. 이 방법의 세 가지 한계는: 1) 여러 시퀀싱 뇌관의 사용 실수로 proviral 시퀀스에 결함을 도입의 위험을 증가, 2) 뇌관 불일치 증폭 되지 않을 수 있습니다 특정 proviruses의 그리고 3) 자주는 이러한 방법 전문적으로 전체 proviral 시퀀스를 확인할 수 없습니다.

기존 전장 HIV-1 proviral 시퀀싱 분석 실험의 한계를 극복 하기 위해 우리는 F펼-Length ndividual P Sroviral equencing (뒤집기) 분석 결과를 개발 했다. 튀기기는 차세대 시퀀싱 (NGS)-증폭 하 고 높은 처리량 및 효율적인 방식으로 전체 길이 (그대로 또는 결함) HIV-1 proviruses 근처 시퀀스 기반된 분석 결과. 넘겼습니다 활용; 뇌관의 수를 제한 하는 그것으로 이전 분석 실험, 이점을 제공 한다. 따라서, 그것은 불일치, proviruses의 인구를 제한할 수 있습니다 캡처 또는 실수로 바이러스 시퀀스에 결함을 소개 하는 뇌관의 기회를 줄인다. 군요 이전 분석 보다 적게 기술적으로 도전적인 또한 및 6 단계를 포함 한다: 1) 에이즈-1 감염의 세포 세포, 2) 증폭 중첩된 PCR 뇌관 특정 높은 보존에 대 한 사용 하 여 희석을 제한에서 수행을 통해 단일 HIV-1 proviruses HIV-1 5'과 3' U5 LTR 영역 (그림 1A), 3) 정화 및 증폭된 제품, 4의 정량화) NGS, 5에 대 한 증폭 된 proviruses의 도서관 준비) NGS, 6) 각 contigs를 시퀀스 proviruses의 드 노 보 조립 개별 provirus입니다.

튀기기에 의해 생성 된 시퀀스 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한 (그림 1C)2인 그들을 식별 하는 제거의 엄격한 과정을 받을 수 있습니다. 유전자 그대로 proviruses 복제 무능 provirus의 세대에서 발생 하는 모든 알려진된 결함 부족 합니다. 이러한 결함 포함: 반전 시퀀스, 대형 내부 삭제, hypermutation/해로운 정지 codons, frameshifts, 또는 변이 5' 신호 또는 포장 결합 기증자 (MSD) 사이트.

Figure 1
그림 1: 전체 길이 개별 proviral 시퀀싱 (뒤집기) 분석 결과에 중요 한 단계. (A) 5' 그리고 3' U5 LTR 지역 중첩된 PCR 통해 전체 길이 (불완전 하 고 그대로) HIV-1 proviruses 근처 증폭 튀기기에서 사용 뇌관 바인딩 사이트와 에이즈-1 DNA 게놈. (B) 레이아웃 잘 80 샘플 웰 스 (각 희석에 대 한 20 웰 스), 4 부정적인 제어 우물, 그리고 1 긍정적인 통제를 포함 하는 96-잘 PCR 격판덮개의. (C) 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한, 에이즈-1 proviruses를 식별 하는 데 사용 하는 제거의 과정. 이 그림 Hiener 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 2 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드는 제도적 검토 보드 캘리포니아 대학 샌 프란 시스 코와 웨스턴 시드니 지역 건강 지구 의료 연구를 위한 웨스트 미드 연구소를 포함 하 여 승인 되었습니다.

1. 에이즈-1 감염 된 세포의 세포의 용 해

참고: 셀 주변 혈액, leukapheresis 샘플, 골 수 생 검 또는 조직 생 검에서 격리 된 수 있습니다. 세포 인구 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 사용 하 여 정렬할 수 있습니다.

  1. 준비 10 mM Tris HCl, 0.5%를 포함 하는 세포의 용 해 버퍼 Nonidet P-, 40 0.5% 트윈-20, 그리고 0.3 mg/mL 가수분해 공화국 셀 펠 릿을 1 x 106 셀 당 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다. 아래로 혼합 플라스틱. 1 시간 15 분 PCR 확대를 위한 게놈 DNA를 세포를 lyse 눌렀다가 85 ° c에 55 ° C에서 품 어.
    참고: 셀 세포 확대를 위한 게놈 DNA를 얻기에 충분 하다. DNA 분리 또는 정화가 필요 합니다. 프로토콜은이 시점에서 일시 중지할 수 있습니다 그리고 genomic DNA-20 ° C에 무기한으로 저장 될 수 있다.

2. 중첩 된 PCR 통해 단일 HIV-1 DNA Proviruses의 확대

  1. 표 1 에 나열 된 첫 번째 라운드 PCR (PCR1)에 대 한 시 약을 혼합 ( 재료의 표참조). 96-잘 PCR 플레이트 ( 그림 1B에서레이아웃에 따라)의 85 우물 (80 샘플, 4 부정적인 컨트롤, 1 긍정적인 제어)를 마스터 믹스의 38 µ L를 추가 합니다. 이 플레이트 'PCR1'를 지정 합니다.
시 약 최종 농도 PCR1 플레이트 (µ L)에 대 한 볼륨 PCR2 플레이트 (µ L)에 대 한 볼륨
앞으로 뇌관 1 Μ M 32.3 23.8
반전 뇌관 1 Μ M 32.3 23.8
버퍼 (10 배) 1 x 323 238
MgSO4 (50 mM) 2 mM 129.2 95.2
dNTP (10 mM) 0.2 m m 64.6 47.6
Dna 중 합 효소 (5 U / µ L) 0.025 U/Μ L 16.2 11.9
초순 H2O 2632.5 1939.7

표 1: 시 약 및 PCR 위한 볼륨 믹스 마스터.

참고: 뇌관 PCR1 사용 됩니다.
BLOuterF: 5'-AAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3' (HXB2 위치 623-649)
BLOuterR: 5'-TGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTC-3' (HXB2 위치 9662-9686)

  1. 마스터 믹스를 준비, 후 PCR1 플레이트 genomic DNA의 추가 대 한 지정 된 깨끗 한 지역으로 이동 합니다.
    1. Tris HCl (5mm, pH 8)와 함께 1:81에 1: 3에서 순차적으로 희석 게놈 DNA 45 µ L를 준비 하 고 각 희석 (각 희석에 대 한 20 웰 스에 대 한 충분 한)에 대 한. 트리 스-HCl (5 m m, pH 8) 각 부정적인 컨트롤 잘 (따라 그림 1B에서 레이아웃)의 각 샘플 잘와 2 µ L를 희석된 genomic DNA의 2 µ L를 추가 합니다. 명확한 접착제 인감 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 모든 긍정적인 제외 PCR1 격판덮개의 우물, 제어 인감.
      참고: 위의 권장된 희석 끝점 희석을 결정 하기 위한 시작 가이드로만 제공 합니다. 희석 샘플 내에서 통합된 HIV-1 DNA의 농도에 따라 달라 집니다.
  2. 긍정적인 통제의 추가 대 한 지정 된 영역으로 이동 합니다. PCR1 플레이트의 긍정적인 통제에 긍정적인 컨트롤 (pNL4-3 105 복사본 / µ L 희석)의 2 µ L을 추가 하 고 접시를 봉인. 짧게 PCR1 접시 PCR 플레이트 회전자 또는 원심 분리기에서 회전 (400 x g 10에 대 한 실 온에서 s) 우물의 측면에서 어떤 잔여 내용을 아래로 끌어.
  3. thermocycler PCR1 접시 실행: 94 ° C 2 분; 다음 94 ° C 30에 대 한 s, 64 ° C 30에 대 한 s, 3 사이클; 10 분 동안 68 ° C 94 ° C 30에 대 한 s, 61 ° C 30에 대 한 s, 3 사이클; 10 분 동안 68 ° C 94 ° C 30에 대 한 s, 58 ° C 30 초, 3 사이클; 10 분 동안 68 ° C 94 ° C 30에 대 한 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 21 사이클; 10 분 동안 68 ° C 다음 68 ° C 10 분 (총 30 주기). 4 ° c.에서 개최
    참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다와 PCR1 접시 최대 2 일 동안 4 ° C에서 보관.
  4. 표 1에 나열 된 PCR (PCR2)의 두 번째 라운드에 대 한 시 약을 혼합. 새로운 96-잘 PCR 플레이트 ( 그림 1B에서레이아웃 따라) 85 웰 스 (80 샘플, 4 부정적인 컨트롤, 1 긍정적인 통제)에 28 µ L를 추가 합니다. 이 플레이트 'PCR2'를 지정 합니다.

참고: 프라이 머 PCR2에 사용 되는:
275F: 5'-ACAGGGACCTGAAAGCGAAAG-3' (HXB2 위치 646-666)
280R: 5'-CTAGTTACCAGAGTCACACAACAGACG-3' (HXB2 위치 9650-9676)

  1. 짧게 PCR1 접시 PCR 플레이트 회전자 또는 원심 분리기에서 회전 (400 x g 10에 대 한 실 온에서 s) 우물의 측면에서 어떤 잔여 내용을 아래로 끌어. PCR1 플레이트의 각 음에 Tris HCl (5 m m, pH 8)의 80 µ L를 추가 합니다.
    1. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 PCR2 플레이트 PCR1 판의 2 µ L를 전송 합니다. 샘플 (잘 A1의 PCR1 접시 잘 PCR2 A1 격판덮개 전송에서즉, 2 µ L) 잘 잘 전송 됩니다 확인 하십시오. 명확한 접착제 인감 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 PCR2 접시를 봉인.
    2. 짧게 PCR 플레이트 회전자 또는 원심 분리기 PCR2 접시를 회전 (400 x g 10에 대 한 실 온에서 s) 우물의 측면에서 어떤 잔여 내용을 아래로 끌어. 열 씰링-20 ° C에서 장기 저장을 위한 영화와 PCR1 플레이트 인감 ( 재료의 표참조).
  2. PCR2 플레이트는 thermocycler 실행: 94 ° C 2 분; 다음 94 ° C 30에 대 한 s, 64 ° C 30에 대 한 s, 3 사이클; 10 분 동안 68 ° C 94 ° C 30에 대 한 s, 61 ° C 30에 대 한 s, 3 사이클; 10 분 동안 68 ° C 94 ° C 30에 대 한 s, 58 ° C 30 초, 3 사이클; 10 분 동안 68 ° C 94 ° C 30에 대 한 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 31 주기;에 대 일 분 동안 68 ° C 다음 68 ° C 10 분 (총 40 주기). 4 ° c.에서 개최
    참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다 그리고 PCR2 격판덮개 최대 2 일 동안 4 ° C에서 보관.
  3. 짧게 PCR2 격판덮개 우물의 측면에서 어떤 잔여 내용을 아래로 당겨 PCR 플레이트 회전자 또는 원심 분리기에서 회전 합니다. 잘 사용 하 여 각 멀티 채널 피 펫에 Tris HCl (5 m m, pH 8)의 60 µ L를 추가 합니다.
    1. Ethidium 평범한 사람을 포함 하는 agarose 젤 2 x 48-잘 캐스트 1%에 각의 15 µ L를 실행 (0.1\u20120.3 µ g/mL, 재료의 표참조). 사다리를 사용 하 여 범위 최대 10 kb ( 재료의 표참조). 증폭된 제품 및 그들의 대략적인 크기를 포함 하는 우물을 식별을 시각화 합니다. 젤 이미지를 저장 합니다.
      참고: 긍정적인 통제는 잘 증폭된 제품을 포함 해야 합니다. 경우 부정적인 제어 우물 증폭된 제품, 오염 고려 하 고 격판덮개를 무시.
  4. 우물의 30% 더 이상으로 보다는 증폭 된 제품에 대 한 긍정적인 희석을 결정 합니다.
    참고: 이것은 우물의 대부분 (80%)가 증폭된 제품 하나의 서식 파일에서를 포함 하는 끝점 희석 이다. 이 희석 준비 하 고 이후의 PCRs에 proviral amplicons 추가를 사용 해야 합니다. 각 증폭된 제품의 대략적인 크기를 기록 합니다.

3. DNA 정화 및 정량화

  1. 짧게 PCR2 격판덮개 우물의 측면에서 어떤 잔여 내용을 아래로 당겨 PCR 플레이트 회전자 또는 원심 분리기에서 회전 합니다. 새 midi 96 잘 접시를 증폭된 제품 (또는 끝점 희석 아래)를 포함 하는 우물에서 40 µ L를 전송 (0.8 mL의 잘 볼륨 테이블의 자료를 참조 하십시오).
    참고: 원래 및 새로운 잘 위치 각 증폭된 제품의 스프레드시트에 시퀀싱 할 각 증폭된 제품의 기록으로 기록 합니다.
  2. 정화는 증폭 된 DNA 제품 기반 자석 구슬 PCR 정화를 사용 하 여 뇌관, 뉴클레오티드, 효소, 오일과 소금 제거 (재료의 표 참조) 키트. 시작 하기 전에, 실내 온도에 자석 구슬을 하 고 신선한 80% 에탄올을 준비 합니다. DNA 샘플의 교차 오염을 방지 하는 적절 한 새로운 피 펫 팁을 사용 합니다.
    1. 그들은 철저 하 게 resuspended는 되도록 소용돌이 자석 구슬. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 0.8 mL midi 96 잘 접시에 증폭된 제품의 40 µ L를 구슬의 40 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 10 번 위아래 플라스틱. 또는, 다음 5 분 동안 실내 온도에 2 분 품에 대 한 1800 rpm에서 microplate 셰이 커에 흔들어 접시를 씰링 하 여 솔루션을 혼합.
    2. 장소에는 자기 접시 스탠드 ( 재료의 표참조) 2 분 제거 및 삭제에 대 한 표면에 뜨는.
    3. 스탠드에 접시와 함께 각 잘을 80% 에탄올의 200 µ L을 추가 하 여 구슬을 씻어. 30 미 제거에 대 한 실 온에서 incubate 고는 상쾌한 삭제. 한 번 반복 합니다. 좋은 팁 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 두 번째 세척에 따라 모든 초과 에탄올을 제거 합니다. 스탠드에 접시와 15 분 동안 건조 공기를 구슬 수 있습니다.
    4. 받침대에서 접시를 제거 합니다. 차입 버퍼의 30 µ L 추가 ( 재료의 표참조) 각 잘 하. 부드럽게 혼합 10 번 위아래 플라스틱. 또는, 다음 2 분 동안 실내 온도에 2 분 품에 대 한 1800 rpm에서 microplate 셰이 커에 흔들어 접시를 씰링 하 여 솔루션을 혼합.
    5. 새로운 96-잘 PCR 접시에 상쾌한 (순화 된 DNA)의 25 µ L를 전송, 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 2 분에 대 한 마그네틱 스탠드에 접시를 놓습니다. 샘플 잘-투-잘 전송 됩니다 확인 하십시오 (즉, 0.8 mL 접시에 잘 A1의 상쾌한 새로운 96 잘 접시의 우물 A1 전송 됩니다).
      참고: eluted 샘플의 5 uL 남아 뒤에 잔여 정화 구슬의 아무 전달 되도록 하십시오.
  3. 결정 하 고 정화를 분 광 광도 계를 사용 하 여 다음 각 증폭된 DNA 제품의 대략적인 농도 기록 (260의 파장에서 흡 광도 nm).
    주: 각 증폭된 제품의 대략적인 농도 측정 하는 필요 없음 샘플 정화 단계 동안 손실 됩니다 하 고 다음 단계 (에 사용 되는 표준 곡선의 범위에 대략 농도이 단계에서 0.001-1 볼륨의 100 µ L에서 DNA ng / µ L). 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다 그리고 청소 샘플-20 ° C에서 최대 6 개월까지 저장할 수 있습니다.
  4. 각 정제 제품을 사용 하 여 dsDNA의 부 량의 DNA의 농도 정량 키트 (재료의 표 참조).
    참고:이 샘플에서 dsDNA의 농도 결정 하는 표준 곡선을 사용 하 여 포함 한다. 이 킷에 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), lamda dsDNA 표준, 및 형광 성 염료. 얼음에 모든 시 약을 보관. 빛에 노출을 피하기 위해 호 염료를 포함 하는 튜브를 커버. 3 중에서 각 증폭된 제품의 농도 측정 합니다.
    1. 살 균 DNase 무료 H2o. 추가 99 µ L의 버퍼를 빈 우물 (수 측정 증폭된 제품의 3 배는 예를 들어 레이아웃 표 2 참조)의 적절 한 수에 1 x 희석 버퍼 플랫 바닥 조직 배양 플레이트의. 3 빈 우물에 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다.
    2. 측정 각 증폭된 제품에 대 한 추가 (3.2.5 단계)에서 순화 된 DNA의 1 µ L 3 중에서 각각 잘 포함 하는 버퍼 (예를 들어 레이아웃에 대 한 표 2 참조).
    3. 표준 준비를 10 배 희석 lamda dsDNA에 0.002 µ 2 ng/L에서 ng / µ L. 3 웰 스를 100 µ L 각 dsDNA 표준의 추가.
      참고: 단계 3.4.4, 기준의 최종 농도에서 배열할 것 이다 1 0.001 ng / µ L
    4. 버퍼와 형광 염료 1: 200을 희석. 신속 하 게 각 잘 샘플, 공백, 및 표준을 100 µ L를 추가 합니다. 아래로 피 펫 믹스. 빛과 접촉을 피하기 위해 호 일 접시 커버.
    5. 읽기 microplate 리더에 형광 방출 (여기에서 480 nm, 520에서 방출 nm). 스프레드시트에 결과 기록입니다.
    6. DsDNA 기록 형광 측정을 사용 하 여 각 샘플에서의 농도 결정 합니다. 샘플 및 표준에서 빈 우물에서 측정 하는 형광을 뺍니다. 각 샘플 및는 triplicates에서 표준에 대 한 평균 형광을 확인 합니다. 표준의 형광 측정에 따라 표준 곡선을 그립니다. 표준 기준으로 샘플의 농도 결정 합니다.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 표준 (1 ng/mL) 표준 (0.1 ng/mL) 표준 (0.01 ng/mL) 표준 (0.001 ng/mL)
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 버퍼
B 표준 (1 ng/mL) 표준 (0.1 ng/mL) 표준 (0.01 ng/mL) 표준 (0.001 ng/mL)
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 버퍼
C 표준 (1 ng/mL) 표준 (0.1 ng/mL) 표준 (0.01 ng/mL) 표준 (0.001 ng/mL)
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 버퍼
D 예제 1: 예제 2: 샘플 3: 샘플 4: 예제 5: 예제 6: 7 샘플: 예제 8: 예제 9: 10 샘플: 예제 11: 샘플 12:
1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼
E 예제 1: 예제 2: 샘플 3: 샘플 4: 예제 5: 예제 6: 7 샘플: 예제 8: 예제 9: 10 샘플: 예제 11: 샘플 12:
1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼
F 예제 1: 예제 2: 샘플 3: 샘플 4: 예제 5: 예제 6: 7 샘플: 예제 8: 예제 9: 10 샘플: 예제 11: 샘플 12:
1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼 1 mL DNA + 99 mL 버퍼
G
H

표 2: dsDNA의 부 량에 대 한 96 잘 접시의 예제 레이아웃입니다.

  1. H2O 0.2 ng / µ L (3.2.5 단계에서 얻은) 각 정제 제품을 희석.

4. 시퀀싱 라이브러리 준비

  1. NGS는 NGS DNA 도서관 준비를 사용 하 여 증폭 하 고 순화 proviral DNA 준비 키트 ( 재료의 표참조). [제외 하 고 (3.5 단계)에서 입력된 DNA를 포함 하 여 반응 볼륨 확장 라이브러리 준비 시 약의 사용을 절반 수] 모든 tagmentation, PCR 확대, 그리고 정리 단계에 대 한 제조업체의 지침을 따릅니다.
  2. 정량 Pcr 기반으로 NGS 라이브러리 정량화를 사용 하 여 수동으로 라이브러리 표준화 provirus의 개별 농도 결정 하기 위해 ( 재료의 표참조) 키트. 4의 최종 농도에 아데닌 금액 개별 provirus 라이브러리 결합 nM, 또는 시퀀싱 서비스 공급자에 의해 지정 된 대로.
    참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 하 고 풀링된 라이브러리-20 ° c.에 저장
  3. 3.4 단계에서 사용한 동일한 dsDNA 정량화 키트를 사용 하 여 최종 풀링된 라이브러리 계량. 제조업체의 지침을 따릅니다. 적절 한 사용 하 여 자동된 전기 영동 시스템에 풀링된 도서관의 1 µ L을 실행 하 여 평균 조각 길이 결정 키트 ( 재료의 표참조). 농도 및 평균 조각 길이 사용 하 여 풀링된 라이브러리의 몰 확인 하.
  4. 라이브러리를 변성을 0.2 N NaOH의 5 µ L에 5 µ L 풀링된 라이브러리의 결합. 200 mm Tris HCl를 중화 하 5 µ L를 추가 합니다. 오후 12 시 5 시퀀싱 직전 냉장된 교 잡 버퍼 (DNA 도서관 준비 키트와 함께 사용 가능)을 최종 라이브러리를 희석.
  5. 적절 한 NGS 플랫폼에 2 x 150 (nt) 뉴클레오티드 쌍-엔드 시퀀싱을 수행 ( 재료의 표참조).
    참고: 실행 당 96 proviral 라이브러리를 인덱스 하는 경우이 실행 당 약 20 백만 쌍 간 읽기 또는 다음 멀티플렉싱 분석에 대 한 개별 provirus 라이브러리 당 200000 읽기를 생성 합니다. 4.4-4.5 단계 시퀀싱 시설에 의해 일반적으로 수행 됩니다.

5. 시퀀스 HIV-1 Proviruses의 드 노 보 조립

참고: 각 증폭된 provirus의 유전 순서를, contigs 조립된 드 노 보 에서 쌍 간 읽기 있습니다. 여러 플랫폼 (예를 들어, CLC 유전체학 워크 벤치14), 노 보 드 어셈블리에 대 한 사용자 지정 워크플로 디자인을 수 있습니다. FastQC15, Trimmomatic16,17, Cutadapt 및 플래시18 같은 다른 오픈 소스 소프트웨어 또한 Bowtie219 스페이드20 읽기 매핑 및 같은 툴으로 서 처리 읽기, 이용 될 수 있다 데 노 보 어셈블리. 에이즈-1 contigs 사용 하 여 특정 상업 플랫폼 (그림 2) 아래에 개설 된다 ( 테이블의 자료를 참조)의 드 노 보 어셈블리에 대 한 단계. 사용자 지정된 워크플로 파일은 요청 시 이용 가능.

  1. 시퀀스 가져오기 및 품질 검사: 가져오기 짝된 시퀀스 다음 짝된 읽기의 하나의 집합으로 결합 됩니다 소프트웨어 (fastq.gz 형식)에 읽습니다. 시퀀스 QC 보고서를 생성 하 고 데이터 품질을 검토.
  2. 품질 관리
    1. 품질 관리 보고서 읽기 트리밍을 수행 합니다. 모든 어댑터 시퀀스 및 모호한 뉴클레오티드를 제거 합니다. 15 트림 5'와 2 3' 터미널 뉴클레오티드. 삭제 길이 50 미만 뉴클레오티드를 읽습니다. 30의 QC phred 점수에 해당 하는 0.001의 엄격한 품질 제한을 사용 합니다.
  3. 겹치는 쌍을 병합
    1. 앞으로 쌍을 병합 하 여 단일 확장된 읽기를 형성 하 고 겹치는 영역 읽기를 역방향.
  4. 드 노 보 조립
    1. 30의 단어 (또는 k-메 르) 크기와 네이티브 CLC 유전체학 드 노 보 어셈블러를 사용 하 여 nt 및 65의 최대 거품 크기 10000 겹치지 짝된 읽기의 임의의 subsample 조립 nt. 드 노 보 조립 contig 예상된 범위 ~ 200 배 ~ 9 kb 시퀀스입니다.
      참고:이 서브 줄일 수 계산 부담 대부분의 표준 데스크톱 컴퓨터 조립 및 분석, 처리할 수 있는 그런 고 각 provirus의 clonality (한 라이브러리는 하나의 provirus),이 다양성을 제한 하지 않습니다.
  5. 다시 매핑 contigs 모든 읽기
    1. 각 provirus의 최종 대부분 합의 순서를, 드 노 보 조립 contig 설정 전체 읽기를 매핑하십시오. 1000 x의 최소 평균 보도 contigs 수락 고 최종 contig 길이 원래 agarose 젤 (단계 2.8.1)에서 밴드의 크기에 해당 합니다. .Fasta 파일로 최종 대다수 일치 시퀀스를 저장 합니다.
      참고: 대부분 contigs 조립 수 있다 수 위의 단계를 사용 하 여. 그러나, 경우에 따라 단일 provirus에 대 한 비슷한 보도 여러 contigs 조립 된다. 이러한 상황에서 contigs는 근처 전체 길이 (~ 9 kb) 정렬 참가자 및 단일 contig에 수동으로 조립 같은 합의 순서. 모든 읽기는 다음 수동으로 조립된 contig 매핑되고 최종 합의 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp) > 40% 존재 하는 경우 읽기 범위 어셈블리에 걸쳐도 아니 단일 허용.
  6. 추가 품질 관리
    1. 되도록 각 contig 단일 provirus 나타내고 단일 잘 내 여러 proviruses의 증폭 때문만 아니다, 화면 읽기 및 최종 contig의 변형 전화.
    2. PCR 동안 여러 proviral 서식 파일은 매우 고르지 읽기 범위 (다양 한 크기의 proviruses의 공동 증폭) 때문으로 때 식별 종종 동일한 참가자, 또는 Snp와의 존재에 의해 전체 길이 일치에 매핑 한 주파수 > 40% (대표 결과, 그림 4참조). 이후 분석에서 혼합된 인구를 무시 했다.
  7. 맞춤
    1. 시퀀스 분자 진화 유전학 분석 (메가) 721같은 소프트웨어를 볼로 각 proviral 시퀀스의 최종 합의 가져옵니다. 각 시퀀스 HXB2 참조 순서를 수동으로 맞춥니다. 트림 5' 그리고 3' 위치 666-9650 뇌관 시퀀스를 제거 하는 HXB2의 끝.
    2. Fasta 형태로 시퀀스 목록을 내보내고 최종 정렬을 적절 한 수동 편집 MAFFT 버전 722를 사용 하 여 정렬.
      참고: 어떤 시퀀스는 정렬 되지 않습니다, 경우 첫 번째 역방향 시퀀스를 보완 합니다. 시퀀스는 여전히 정렬 되지 않는 경우 HIV-1 순서가 확인을 폭발 검색을 수행. 에이즈-1 서식 파일을 증폭 하 고이이 단계에서 확인할 수 있습니다. 시퀀스 HIV-1 하지만 정렬 되지 않습니다, 뒤집어 (단계 6.1 참조)의 존재를 고려 하십시오.

6. 에이즈-1 Proviral 시퀀스의 잠재적인 복제 능력을 결정

참고: 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한의 시퀀스를 식별 하려면 HIV-1 proviruses 제거의 엄격한 과정은 (그림 1C) 뒤. 뒤집어 부족 proviral 시퀀스, 대형 내부 삭제, 해로운 정지 codons/hypermutation, frameshift 돌연변이 및 엠 사이트 또는 패킹 신호에서 결함 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한 간주 됩니다.

  1. 뒤집어
    1. 정렬 단계 뒤집어 식별 합니다. 여 지역 어디 시퀀스는 정렬 되지 않을 참조 HXB2에 지역 보충 역은 제외입니다.
      참고: 데이터 응용 프로그램에 따라 시퀀스를 포함 하 여 추가 분석에서 생략 할 수 있습니다.
  2. 큰 내부 삭제
    1. 큰 내부 삭제 contigs 식별 (> 600 bp) 맞춤 단계에. 않는 삭제 nef안에 앉아, 시퀀스 결함으로 정의할 수 있습니다.
      참고: 내부 삭제 모든 시퀀스 < 600 bp 불완전 한 유전자 순서 데로 유전자 커터 (6.3.1 단계)에 의해 식별 됩니다.
  3. 해로운 정지 codons, frameshift 돌연변이 및 삭제
    1. 길이의 모든 contigs 확인 > 해로운 정지 codons, frameshifts 및 로스 알라모 스 국립 연구소 에이즈 시퀀스 데이터베이스 유전자 커터를 사용 하 여 불완전 한 유전자 시퀀스의 존재에 대 한 8400 뉴클레오티드 도구23.
      참고: 유전자 커터 도구 유전자 개 그, 폴, vif, vpr, 문신, 레 브, vpu, 환경을, nef에 proviral 시퀀스를 분할 하 고 아미노산으로 그들을 변환 합니다. 유전자 커터 다음 정지 codons 그리고 (때문에 삽입 또는 삭제) frameshift 돌연변이의 존재에 대 한 화면. Contigs 정지 codons 또는 frameshifts 어떤 유전자에 들어 있는 nef24를 제외 하 고는 결함으로 분류 됩니다. 유전자 커터는 또한 삭제와 불완전 한 유전자 시퀀스 및 어떤 proviruses를 식별 < 600 혈압 이외의 nef 유전자에 큰 내부 삭제 인해 결함으로 재분류 될 수 있습니다.
  4. Hypermutation
    1. 로스 알라모 스 국립 연구소 에이즈 시퀀스 데이터베이스 일치 메이커 도구 (간단한 합의 메이커)25를 사용 하 여 나머지 전체 길이 proviral 시퀀스의 일치를 생성 합니다. 만 나머지 전체 길이 proviral 시퀀스를 포함 하는 정렬의 상단에 합의 시퀀스를 추가 합니다. 사용 하 여이 정렬 및 로스 알라모 스 국립 연구소 에이즈 시퀀스 데이터베이스 Hypermut 도구26 나머지 전체 길이 proviral 시퀀스에서 G-A hypermutation APOBEC 유도 식별.
  5. MSD 및 포장 신호 결함
    1. 각 렌더링 proviral 시퀀스 결함이4는 MSD와 포장 신호 (HXB2 지역 670-810)에 결함에 대 한 나머지 contigs 검사 합니다. 엠 사이트 (시퀀스 GT, HXB2 744 745)에 점 돌연변이 대 한 보고 또는 4에서 모든 삭제 줄기 루프 포장 신호 (SL1 (691-734 HXB2), SL2 (HXB2 736-754), SL3 (766-779 HXB2), 그리고 SL4 (HXB2 790-810)).

Representative Results

튀기기 분석 결과 증폭 하 고 전장 HIV-1 proviruses 근처, 단일 시퀀스. 프로토콜 전체 길이 proviral 시퀀스 근처를 6 단계를 포함 한다. 이러한 단계를 포함: 세포의 용 해 감염 세포, 전체 길이 (손상 및 결함) HIV-1 proviruses, DNA 정제 및 정량화, 라이브러리 준비, NGS, 시퀀싱의 중첩 된 PCR 및 드 노 보 의 조립 순서가 proviruses. 각 단계의 최종 검사점 전에 다음 단계 (예: 증폭 DNA, 순화 된 DNA, 시퀀싱 라이브러리 또는 시퀀스) 제품의 품질 평가 수 있다 여겨질 수 있다. 각 단계의 끝에서 수행 평가의 개요 그리고 예상된 된 결과 아래에 설명 된.

다음 중첩 된 PCR 증폭된 제품 1 %agarose 젤 (그림 3)에 실행 됩니다. PCR의 초기 품질은 부정적이 고 긍정적인 컨트롤의 검사에 의해 확인할 수 있습니다. 증폭된 제품을 포함 하는 부정적인 제어 우물 오염 나타내고 증폭된 제품의 결 석 긍정적인 제어 우물 부족 확대 표시 합니다. 다음, 웰 스 증폭된 제품을 포함 하는 시퀀싱에 대 한 선택 됩니다. 여러 증폭 된 proviruses의 혼합물을 포함 하는 우물을 피하기 위해, 웰 스만 증폭된 제품 끝점 희석에 실행을 포함 하는 시퀀싱에 대 한 간주 됩니다. 포아송 분포에 따라 끝점 희석 우물의 30%는 증폭 된 제품에 대 한 긍정적인 발견 된다. 이 희석, 80%는 이러한 웰 스 포함 단일 증폭된 provirus 기회. 여러 밴드 젤에 표시 됩니다 또한, 서로 다른 길이의 여러 증폭 된 proviruses를 포함 하는 우물이이 단계에서 구상 수 있다. 이 우물 (그림 3)을 시퀀싱 하지 선택 합니다.

증폭된 proviruses 시퀀싱에 대 한 선택의 정화, 따라 정량화 아무 proviral DNA 정화 단계 손실 됩니다 보장 합니다. 증폭된 provirus의 DNA 농도 경우 < 0.2 ng / µ L, 접시는 순화 될 수 있다 PCR2에 나머지 샘플. 유사한 검사점 라이브러리 준비, 각 개별 라이브러리 계량은 다음 발생 합니다. 이렇게 하면 개별 proviruses 적절 하 게 조각, 태그 되었고 시퀀싱 전에 증폭. 개별 proviral 라이브러리는 4의 마지막 라이브러리 농도에 아데닌 금액에 풀링된 nM (또는 시퀀싱 공급자에 의해 지정 된 대로). 개별 proviral 라이브러리의 농도가 너무 낮은 경우, 시퀀싱 라이브러리 풀에서 제외 될 수 있습니다 또는 개별 라이브러리 다시 준비. 풀링된 라이브러리의 농도 대 한 최종 검사 확인 평균 조각 길이 함께 시퀀싱 전에 수행 됩니다.

품질 관리 단계 드 노 보 어셈블리 단계 최종 proviral contig을 조립 하는 데 사용 하는 읽기의 품질을 보장 하기 전에. 이러한 단계를 포함: 어댑터 시퀀스, 5'과 3' 뉴클레오티드, 엄격한 품질 제한, 정돈 하 고 무시 하는 짧은 읽기의 제거. CLC 유전체학 워크 벤치는 트리밍 낮은 품질 영역을 제거 하는 충분 한 결정 하 읽기 및 가이드 트리밍 설정, 그리고 후 초기 품질을 평가 하기 전에 사용할 수 있는 품질 관리 보고서를 제공할 수 있습니다. 또한, 노 보 드 어셈블리 조립된 contigs의 품질 평가 될 수 있다 충분 한 깊이 (> 1000 X) 및 범위 (그림 4A)의 균일성. 혼합된 인구는 또한이 단계에서 확인할 수 있습니다. 반면 짧은 (큰 내부 삭제 포함)와 전체 길이 proviruses의 혼합물 고르지 의해 확인 될 수 있다 여러 전장 (~ 9 kb) proviruses의 혼합물의 40%, 보다 큰 주파수와 함께 여러 개의 Snp의 존재를 통해 식별 됩니다. 읽기 범위 (그림 4B) 같은 참가자에서 매핑 전체 참조를 다음.

응용 프로그램에 따라 최종 정렬 "r A: 언어 및 통계 컴퓨팅 환경"27패키지로 ggtree 사용할 수 있는 같은 도구를 사용 하 여 시각화 수 있습니다. 최근 연구에 넘겼습니다 순진한, 중앙, 과도, 및 이펙터 메모리 CD4에서에서 시퀀스 HIV-1 proviruses+ T 활용 세포 특정 하위 집합 높은 면을 식별 하는 목적으로 장기 예술에서 개인에서 분리 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한 HIV-12비율 여기, 한 참가자 (참가자 2026)이이 연구의에서 고립 된 시퀀스의 시각적 표현 (그림 5) 제공 됩니다. 이 참가자 시퀀스의 대부분 (97%) 했다 결함, 이펙터 및 과도 메모리 CD4 그대로 시퀀스+ T 세포. 이 시각화 도구는 큰 내부 삭제 시퀀스 수와 게놈에 있는 그들의 위치를 표시 하는 데 유용 합니다. 그것은 수 있습니다 해로운 정지 codons, frameshift 돌연변이 및 삭제/돌연변이 엠 사이트 및/또는 포장 신호에는 시퀀스를 나타내기 위해 추가 주석을 답니다.

넘겼습니다 분석 실험의 한 응용 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한 HIV-1 proviruses의 신분증입니다. 531 시퀀스 CD4에서 고립의 최근 연구에서+ T 세포 6 참가자 장기 예술에 26 (5%) 유전자 그대로 HIV-1 proviruses 했다 확인된2. 나머지 결함이 proviruses 포장 신호 또는 엠 사이트 (11%)에서 돌연변이에 그 반전 시퀀스 (6%), 대형 내부 삭제 (68%), 해로운 정지 codons/hypermutation (9%), frameshift 돌연변이 (1%), 및 결함을 포함 .

Figure 2
그림 2: 에이즈-1 proviruses의 de novo 어셈블리에 대 한 워크플로 개요. 워크플로의 주요 단계를 포함: 1) 시퀀스 읽기 2) 병합 겹치는 쌍, 3 품질 관리) 노 보 드 어셈블리 및 4) 매핑 되었으며 일치 건물 색된 빨강, 파랑, 녹색, 오렌지, 각각. 이 그림 Hiener 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 2 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 예제 agarose 젤 PCR의 증폭 HIV-1 proviruses. 웰 스 1, 2, 3, 6, 9 및 10 증폭된 HIV-1 proviruses 포함 되어 있습니다. 잘 10 포함 provirus 큰 내부 삭제와, 잘 2 포함 (혼합물), 다른 길이의 두 에이즈-1 proviruses의 공동 증폭 하 고 잘 12 긍정적인 컨트롤이 포함 되어 있습니다. 참고 % 증폭된 제품을 포함 하는 웰 스의 60%, 단일 서식 파일을 분리 하는 데 필요한 비율 위에 있는입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 읽기 매핑 출력 예. (A) 예를 들어 단일 전체 길이 HIV-1 provirus의 증폭 때문도 보험 혜택을 보여주는. 드 노 보 어셈블리, 다음 모든 읽기 합의 시퀀스 조립된 contig에 매핑됩니다. 소프트웨어 플랫폼에는 충분 하 고도 범위에 대 한 검사 매핑된 읽기 수 있습니다. (B) 예를 들어 서로 다른 길이 (혼합물)의 두 에이즈-1 proviruses의 공동 확대를 보여주는. 혼합물을 확인 하려면 읽기는 전체 길이 (~ 9 kb) 참조 시퀀스 같은 참가자 로부터 매핑되고 매핑 검사를 읽고. 고르지 못한 보도의 혼합물을 나타냅니다. 이 그림은 Qiagen14에서 허가로 재생 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 예제 시각화 에이즈-1 proviral 시퀀스 CD4에서 격리의+ T 세포 장기 예술에 개인에서 하위 집합. 개별 HIV-1 proviral 시퀀스 가로선으로 표시 됩니다. 이 그림 Hiener 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 2 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

튀기기 분석 결과 증폭 및 시퀀싱 단일, 전체 길이 HIV-1 proviruses 근처에 대 한 효율적이 고 높은 처리량 방법입니다. 여러 요소 및 프로토콜에서 번호와 얻은 시퀀스의 품질에 영향을 주는 중요 한 단계 확인 되었습니다. 첫째, 세포 수와 세포 인구의 에이즈-1 감염 주파수 증폭 하는 proviruses의 수에 영향. 예를 들어 이전 간행물에서 약 절반 만큼 시퀀스는 같은 수의 순진한 CD4+ T에서 입수 했다 effector 메모리 CD4에 비해 셀+ T 세포. 이것은 순진한 세포는 일반적으로 이펙터 메모리 셀2보다는 낮은 감염 주파수를가지고 있기 때문 에입니다. 둘째, 세포 세포 DNA 추출 과정에서 손실의 아무 위험으로 게놈 DNA를 얻기 위해 열 기반 추출 방법 바람직합니다. 마지막으로, 어떤 PCR 기반 분석 결과와 마찬가지로 오염 예방이 중요 합니다. 분리 된 깨끗 한 영역 마스터 믹스, genomic DNA, 긍정적인 컨트롤, DNA 정제, 정량화, 및 라이브러리 준비 추가 처리를 준비 하기 위한 지정 해야 합니다. 이것은 여기에 제시 된 것과 같은 단일-사본을 분석 실험을 위해 특히 중요 하다입니다.

튀기기 분석 결과의 구현 처음 참가자 샘플 보다는 pNL4 3 플라스 미드와 같은 긍정적인 컨트롤 실행 포함 해야 합니다. 얻은 시퀀스가 플라스이 미드에 대 한 사용 가능한 참조 시퀀스에 비해 수 있습니다 이것은 모든 문제 해결 이전에 에이즈-1 긍정적인 세포의 사용에 대 한 허용 됩니다. 에이즈-1 긍정적인 세포를 사용 하는 경우 그것은 거의 아무 proviruses 증폭 됩니다 경우 에이즈-1 subtype (뇌관 넘겼습니다 하위 B에 대 한 설계) 및 세포 인구의 감염 빈도 고려 하는 것이 중요. 뇌관 시퀀스 수정/다른 하위에 맞게 재설계 될 수 있습니다. 또한, 긍정적인 통제를 포함 하는 잘 모든 PCR 수행에 포함 되어야 합니다.

튀기기는 SPS를 포함 하 여 이전 시퀀싱 분석의 한계를 극복 했다. 증폭 및 전체 길이 HIV-1 proviruses 근처 시퀀싱을 통해 넘겼습니다 에이즈-1 proviruses의 잠재적인 복제 역량을 확인할 수 있습니다. 이것은 SPS 하위 게놈 영역만을 시퀀싱 하 고 따라서 시퀀스를 그대로 뇌관 바인딩 사이트 선택을 사용 하 여 이었다. 또한, 넘겼습니다 활용 하 여 여러 증폭 및 시퀀싱 뇌관, 이전 전장 시퀀싱 분석1,4에 의해 고용 되었다와 관련 된 한계 극복. NGS와 함께 HIV-1 LTR 영역을 대상으로 하는 PCR의 2 라운드를 통해 넘겼습니다 수와 필요한 뇌관의 복잡성을 줄입니다. 튀기기 적습니다 뇌관 불일치, 즉 결함이 있는 proviruses의 잘못 된 식별 및 인구 내의 몇 가지 proviruses을 증폭 하는 무 능력의 결과에 따라서 이다. 넘겼습니다 프로토콜 더 효율적 이며 또한 이전 방법 보다 시퀀싱의 높은 처리량에 대 한 수 있습니다.

결국, 화나게 하다 에이즈-1 proviruses의 유전적 구성을 결정 하는 기존 방법에 비해 이점이 있습니다. 그러나, 그것은 튀기기의 한계를 인정 하는 것이 중요입니다. 첫째, 넘겼습니다 분석 결과 하지 개발 되었습니다 잠재 HIV-1 저수지의 크기를 측정 하기 위한 도구로 넘겼습니다 세포 인구에 있는 모든 HIV-1 provirus 증폭 여부를 결정 하는 분석 완료 하지 않은. 튀기기는 대신 다른 세포 인구2사이 저수지의 구성의 상대 비교를 만들기 위한 유용 합니다. 둘째, 그대로 HIV-1 proviruses의 복제 능력 vivo에서 , 같은 분석 호 외. 수행 없이 확실 하 게 확인할 수 없는 4. 셋째, 화나게 하다 에이즈-1 proviruses의 통합 사이트를 확인 하도록 설계 되지 않았습니다.

넘겼습니다 프로토콜에 작은 변이 응용 프로그램을 늘릴 수 있습니다. 예를 들어 시퀀스 다른 수 뇌관 및 증폭 하 여 시퀀싱 여러 에이즈-1 하위에서 변경 합니다. 플라즈마 1 HIV virions의 시퀀싱 중첩된 PCR 이전 cDNA 합성의 추가 통해 가능 하다. 단일 분자 시퀀싱 방법의 미래 활용 드 노 보 어셈블리에 대 한 필요성을 제거 합니다.

통합된 HIV-1 proviruses의 유전자 시퀀싱 잠재 HIV-1 저수지의 우리의 이해를 증가 했다. 튀기기 elucidating 구성과 잠재 저수지의 미래 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 그러나, 뒤집기의 응용 프로그램은 저수지 넘어 확장할 수 있습니다. 미래 연구 넘겼습니다 CRISPR Cas 기술에 대 한 특정 목표를 결정 하거나 코딩의 식별에 사용할 수 및 비 코딩 영역 바이러스를 에이전트를 반전 하는 대기 시간을 더 응답 하 게 만들기. 바이러스 성 재결합 큰 내부 삭제의 접합 사이트를 보면 더 이해 될 수 있습니다.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작업을 지원 했다 (1U19AI096109와 1UM1AI126611-01); 치료법을 찾을 Delaney 에이즈 연구 기업 (감히) 자선단체 에이즈 연구 (amfAR 108074-50-RGRL);는 재단에서 에이즈 퇴치 (ARCHE) 공동 연구 그랜트에 연구 컨소시엄 호주 센터 에이즈 및 간염 바이러스학 연구 (ACH2); UCSF GIVI 센터 에이즈 연구 (P30 AI027763); 그리고 호주 국가 건강과 의료 연구 위원회 (AAP1061681). 우리 박사 조이 라이, 웨스트 미드 연구소 도서관 준비 및 그의 시설 사용에 그의 훈련에 대 한 의학 연구에 대 한 게놈 시설 관리자와 Ramaciotti 센터 유전체학 (대학의 뉴 사우스 웨일즈, 시드니, 호주)에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 시퀀싱을 진행 하는 방법에 대 한 우리는 감사와 함께이 연구에 대 한 샘플을 기증 참가자 인정.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 Invitrogen 15568025 Dilute to 5 mM for nested PCR
Nonidet P 40 Substitute solution Sigma 98379
Tween-20 Sigma P9416
Proteinase K Solution (20 mg/mL) Promega AM2548
96 well thermocycler Any 96 well thermocycler can be used
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen 11304011
10x High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] Invitrogen 11304011
50 mM MgSO4 Invitrogen 11304011
PCR Nucleotide Mix, 10 mM Promega C1141
Ultrapure H2O Invitrogen 10977023
PCR1 and PCR2 Primers Desalted. Dilute to (100 µM) with H2O
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear Axygen PCR-96M2-HS-C
Microseal 'B' Adhesive Seals BioRad MSB1001 Required to seal 96 well PCR plates
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). Diluted to 105 copies/mL and used as positive control
PCR plate spinner or benchtop centrifuge
E-GEL 48 1% Agarose Invitrogen G800801 Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide.
DirectLoad Wide Range DNA Marker Sigma D7058 Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Mother E-Base device Invitrogen EBM03 Required for running precast 48 well 1% agarose gels
Gel Doc EZ Gel Documentation System BioRad 1708270 Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used
PlateMax Peelable Heat Sealing Axygen HS-200 Heat sealing film for long term storage
96 Well 0.8 mL Storage Plate ThermoFisher Scientific AB0765 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) Beckman Coulter A63880 Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106)
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology Sigma E7023
Magnetic Stand-96 Invitrogen AM10027
Microplate shaker Optional
Buffer EB Qiagen 19086 Elution buffer
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496 A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
Microplate reader
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-2001
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Biorad HSP9601 Required for Nextera XT DNA library preparation kit
Library Quantification Kit - Illumina/Universal Kapa Biosystems KK4824 Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029)
2100 Bioanalyzer Agilent Technology Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit
High Sensistivty DNA kit Agilent Technology 5067-4626
Illumina MiSeq Platform Illumina

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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