Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse

Neuroscience

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Summary

Aqui descrevemos um procedimento para tecido limpando, etiquetando fluorescente e imagens em grande escala do tecido de cérebro de rato que, desse modo, permite a visualização da organização tridimensional de tipos de células no neocórtex.

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Yoneda, T., Sakai, S., Maruoka, H., Hosoya, T. Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex. J. Vis. Exp. (139), e58027, doi:10.3791/58027 (2018).

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Abstract

O neocórtex dos mamíferos é composto de muitos tipos de neurônios excitatórios e inibitórios, cada um com propriedades específicas eletrofisiológicas e bioquímicas, conexões sinápticas, e na vivo de funções, mas sua basic funcional e anatômica organização de celular para escala de rede é mal compreendida. Aqui nós descrevemos um método para a imagem tridimensional de neurônios fluorescente-etiquetadas em grandes áreas do cérebro para a investigação da organização celular cortical. Tipos específicos de neurônios são rotulados por injeção de traçadores neuronais retrógrados fluorescentes ou expressão de proteínas fluorescentes em ratos transgénicos. Amostras de cérebro de bloco, por exemplo, um hemisfério, são preparadas após a fixação, transparentes com tecido métodos de compensação e submetidas a fluorescente immunolabeling os tipos de células específicas. Grandes áreas são verificadas usando microscópios confocal ou dois fotões equipados com grandes objectivos de distância de trabalho e estágios motorizados. Esse método pode resolver a organização periódica dos módulos funcionais específicas do tipo microcolumn célula no neocórtex do mouse. O procedimento pode ser útil para o estudo da arquitetura celular tridimensional nas áreas diversas do cérebro e outros tecidos complexos.

Introduction

O neocórtex dos mamíferos é composto por um grande número de tipos de células, cada uma com os padrões de expressão de genes específicos, propriedades bioquímicas e eletrofisiológicas, conexões sinápticas, e na vivo funções1,2 ,3,4,5,6,7. Se estes tipos de células são organizados em estruturas repetidas tem sido pouco claras. Colunas corticais, incluindo colunas de orientação visual e somatossensorial barris, repetiram-se estruturas, mas sua organização celular permanece incerto8,9. Estas estão presentes nas áreas corticais específicas e não são um sistema de todo o cérebro.

Na camada neocortical 5, a grande maioria dos neurônios é classificada em quatro tipos principais. Um tipo importante de neurônios excitatórios, neurônios de projeção sub cerebral, projeta axônios para alvos subcorticais, incluindo o pons, medula espinhal e colículo superior e, portanto, representa a principal saída cortical via10. Neurônios de projeção cortical, um outro tipo importante de neurônios excitatórios, inervam o córtex10. Os neurônios inibitórios também contém duas classes principais: células parvalbumin-expressando e somatostatina-expressando11.

Análises recentes indicam que os tipos de quatro célula são organizados em estruturas repetidas12,13,14. Tanto os neurônios de projeção cerebral secundário a12,13,14 e de neurônios de projeção cortical14 organizam em célula-tipo específico microcolumns com um diâmetro de 1 – 2 células. Células Parvalbumin-expressando e somatostatina-expressando alinham especificamente com microcolumns de neurônios de projeção sub cerebral, mas não com microcolumns de neurônios de projeção cortical14. Microcolumns se alinhar periodicamente para formar um hexagonal lattice de matriz14 e estão presentes em múltiplas áreas corticais incluindo áreas visuais, somatossensorial e motor em cérebro de rato,12,14 e na língua áreas do cérebro humano13. Neurônios no microcolumn individual apresentam atividade sincronizada e ter respostas sensoriais semelhantes14. Estas observações indicam que tipos de células da camada 5 organizam em uma estrutura de treliça de microcolumn que representa a primeira organização de todo o cérebro conhecida de repetir módulos funcionais.

Microcolumns ter um raio de aproximadamente 10 µm e têm uma periodicidade espacial de aproximadamente 40 µm. Além disso, a orientação do microcolumns é paralela às suas dendrites apicais e alterações dependendo de sua posição no córtex14. Portanto, o sistema microcolumn é difícil de analisar usando fatias corticais convencionais com uma espessura típica de algumas dezenas de micrômetros. Além disso, a análise de periodicidade requer dados tridimensionais de uma vasta gama de áreas do cérebro e, portanto, a área de imagem típica de microscopia confocal ou na vivo imagem 2-fóton é muito estreita.

Recentemente, técnicas têm sido desenvolvidas para limpar tecidos grossos15,16. Aqui descrevemos a aplicação desses métodos para obter imagens tridimensionais, em grande escala os tipos de células principais na camada neocortical do rato 5 que compõem o sistema de microcolumn. Neurônios de projeção subcerebral são rotulados pela rotulagem retrógrada ou a expressão da proteína fluorescente verde reforçada em Crym-egfp ratos transgénicos12e projeção cortical neurônios são rotulados por ambos o retrógrado rotulagem ou pela expressão tdTomato em Tlx3-cre/Ai9 ratos17. Parvalbumin-expressando e somatostatina-expressando células são rotuladas por imuno-histoquímica. O método de (anticorpo escala S) AbScale18 é usado para o anticorpo que mancha experimentos, enquanto o método de SeeDB (ver profunda do cérebro)19 é usado para outras experiências. Esses métodos de superassem as dificuldades acima referidas dos métodos convencionais de imagem e revelam a organização celular exata da camada 514.

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Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comité de segurança do RIKEN genética recombinante experimento e RIKEN Wako Animal experimentos Comité e executados de acordo com as orientações institucionais das instalações da RIKEN cérebro ciência animais Instituto.

1. preparação de câmaras de imagem

  1. Câmara de imagem19
    1. Folhas de borracha de silicone, prepare uma câmara com uma espessura de aproximadamente 5 mm e piso chapas de várias espessuras. Além disso, prepare caixas de Petri com e sem um fundo de vidro (figura 1A).
  2. Espaçador de fatia
    1. Prepare os espaçadores para manter as amostras, usando folhas de borracha de silicone com uma espessura de 0.5 mm (Figura 1).

2. tracer injeção

Nota: Fazer injeções no pons (2.1) ou no colículo superior (2.2). Injeção para os neurônios de projeção sub cerebral do rótulo de pons em uma região de cérebro grande, incluindo as áreas visuais e motoras, enquanto a injeção para os neurônios de projeção sub cerebral de rótulos colículo superior na área de visual. Para controle de experimentos, injetar soro, em vez de subunidade de toxina da cólera fluorescente-etiquetadas B. Para a manutenção da condição estéril use equipamento esterilizado e luvas de plástico limpadas com álcool etílico.

  1. Fazer injecções na ponte de ratos adultos.
    1. Desenhar 1 µ l de subunidade de toxina da cólera fluorescente-etiquetadas B (25 µ g / µ l de PBS) uma seringa Hamilton G 26.
    2. Coloque uma bomba injetora na seringa.
    3. Coloque a seringa e a bomba no suporte de um manipulador colocado num instrumento estereotáxica. Incline o manipulador 12° posteriormente de eixo vertical.
    4. Anestesiar um rato adulto masculino ou feminino (C57BL/6J ou Tlx3-cre/Ai9) através da injeção de sódio pentobarbital intraperitonealmente (60 mg/kg de peso corporal) ou através da administração de isoflurano (2-3%). Espere até que o rato faz sem resposta quando a cauda é comprimida com fórceps, indicando que o mouse é totalmente anestesiado.
    5. Coloque o mouse sobre o instrumento estereotáxica.
    6. Remova cuidadosamente o cabelo usando uma lâmina de barbear para prevenir a infecção e cortar 10mm do couro cabeludo, para que o bregma e o lambda são visíveis. Administre 0,1 mL de lidocaína a 1% usando uma pipeta. Defina o ângulo da cabeça, ajustando a posição vertical do bocal do instrumento estereotáxica para que o bregma e o lambda têm o mesmo nível de z.
    7. Ajuste a posição do manipulator deslizando-o no instrumento estereotáxica para que a ponta da seringa é perto o bregma e gravar a posição do manipulator. Retire a seringa movendo o suporte da ferramenta sobre o manipulador.
    8. Mover o manipulador 5,4 mm posterior e 0,4 mm lateralmente. Avança a seringa para que a ponta está perto de ponto de entrada no crânio. Retire a seringa e marcar o ponto de entrada.
    9. Posição do marcado, faça um furo com um diâmetro de aproximadamente 1 mm.
    10. Inserir a ponta da seringa no orifício para que a profundidade de ponta é 6,9 mm mais do que a que medida no bregma.
    11. Injete 1 µ l dos marcadores usando a bomba em 0,2 µ l/min.
    12. Retire a seringa do cérebro.
    13. Se necessário, cubra o cérebro exposto com pequenos fragmentos de pinça hemostática microfibrilar e adesivo instantâneo.
    14. Lave o cérebro exposto utilizando soro fisiológico entregado com uma pipeta para prevenir a infecção e suturar o couro cabeludo.
    15. Remova o mouse do instrumento estereotáxica. Permitir que o mouse para recuperar da anestesia em uma incubadora a 30 ˚ c, normalmente por 1h. Não deixe o mouse sem vigilância até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Retorne o mouse para a companhia de outros animais depois que ele se recuperou totalmente.
    16. Manter o mouse por 3 a 7 dias.
  2. Fazer injeções para o colículo superior de ratos adultos.
    1. Prepare uma pipeta de vidro com um diâmetro de ponta de 30 – 50 µm.
    2. Conectar-se a pipeta de vidro para uma seringa Hamilton através de um tubo de plástico (Figura 2A).
    3. Encha a pipeta de vidro, tubo de plástico e Hamilton seringa com o líquido de parafina.
    4. Coloque uma bomba injetora na seringa.
    5. Coloque a pipeta de vidro sobre o manipulador e incline o manipulador 60° posteriormente de eixo vertical (Figura 2B).
    6. Execute 2.1.4–2.1.9. A posição do manipulator é 1,4 mm posterior, lateral de 0,5 mm para o lambda.
    7. Coloque uma película de parafina de plástico pequena no crânio e, em seguida, coloque aproximadamente 1 µ l da solução de rastreamento nele. Rapidamente avançar a pipeta de vidro e encha-o com pelo menos 0,5 µ l da solução de rastreamento.
    8. Introduza a pipeta de vidro para que a profundidade da ponta é de 3,0 mm da superfície do cérebro.
    9. Injete 0,5 µ l dos marcadores usando a bomba em 0,2 µ l/min.
    10. Retire a pipeta de vidro do cérebro.
    11. Execute 2.1.13–2.1.16.

3. fixação e remoção

  1. Injectar intraperitonealmente pentobarbital de sódio (60 mg/kg de peso corporal) por um mouse (C57BL/6J ou Tlx3-cre/Ai9, com ou sem a injeção do traçador conforme descrito na etapa 2. Espere até que o rato faz sem resposta quando a cauda é comprimida com fórceps, indicando que o mouse é totalmente anestesiado.
  2. Eutanásia o mouse humanamente pelo perfusing o rato transcardially20 com soro fisiológico a 0,9%.
  3. Corrigir o rato20 por perfusing paraformaldeído 4% (PFA) em tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,5).
  4. Corte o couro cabeludo usando um par de tesouras para expor o crânio como descrito20.
    1. Corte a linha média do crânio exposta usando um par de tesouras. Remova o crânio usando fórceps.
    2. Se marcar a posição do bregma e o lambda é necessário, primeiro remova um hemisfério do crânio. Inserir agulhas de tungstênio fina do cérebro nas posições do bregma e o lambda no crânio que permaneçam no cérebro e, em seguida, remover o restante do crânio.
      Nota: O cérebro pode ser armazenado em PBS em 4 ˚ c.
  5. Para executar a mancha do anticorpo de neurônios inibitórios, corte as amostras de cérebro em fatias.
    1. Coloque a amostra do cérebro em um vibratome.
    2. Corte as fatias até 500 µm de espessura em PBS na temperatura ambiente e vá para a etapa 5 (AbScale método).
  6. Se a mancha do anticorpo é desnecessário, aparar a amostra do cérebro para bloqueia (até 3 mm de espessura) usando uma lâmina de barbear (Figura 3) e avance para o passo 4 (o método de SeeDB).
    Nota: O cérebro pode ser armazenado em PBS a 4 ° C após cortar ou aparar. O método SeeDB é preferível ao anticorpo coloração não é necessário, porque ele requer menos tempo do que o método de elAbSca.

4. limpar sem anticorpo que mancha (o método de SeeDB)

  1. Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 20% (p/v) de frutose e incube-4 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  2. Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 40% (p/v) de frutose e incube-4 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  3. Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 60% (p/v) de frutose e incube-4 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  4. Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 80% (p/v) de frutose e incube-lo por 12 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  5. Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 100% (p/v) de frutose e incube-lo por 12 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  6. Transferir a amostra usando uma espátula para um tubo de plástico de 50 mL contendo 20 mL de 0.5% α-thioglycerol e 80,2% (w/w) frutose e incube-lo por 24 h com agitação suave na temperatura de quarto.
    Nota: Manipular a amostra cuidadosamente para manter deformações tão pequena quanto possível. Não Incube as amostras mais tempo do que o indicado, como amostras podem rapidamente se tornar opacas.
  7. Incorpore a amostra em uma câmara de imagem preenchida com solução de frutose a 80,2% (figura 1B). Se necessário, corrigi a amostra, colocando pequenos pedaços de adesivo de borracha ao redor. Se a câmara for muito profunda, coloquei uma placa de piso na câmara antes de colocar as amostras.
  8. Coloque a placa de Petri com uma tampa de vidro sobre a câmara de imagem e colocar água no prato e imagem utilizando microscopia confocal ou dois fotões com uma água-imersão tempo trabalhando o objetivo de distância. Comprimentos de onda de excitação e filtros de emissão são descritos na tabela 1. Se necessário, utilize um palco motorizado.

5. compensação com anticorpo que mancha (o AbScale método)

  1. Prepare reagentes, conforme descrito na tabela 2.
  2. Transfira as fatias com uma espátula para um tubo de plástico de 5 mL contendo 4 mL de solução de Sca/eS0 e incube-os por 12 h com agitação suave a 37 ° C (Figura 4B).
  3. Remover a solução do tubo com uma pipeta adicione 4 mL de solução de Sca/eA2 e incubar as fatias para 36 h com agitação suave a 37 ° C.
  4. Remover a solução do tubo com uma pipeta adicione 4 mL de solução de Sca/eB4 e incubar as fatias para 24 h com agitação suave a 37 ° C.
  5. Remover a solução do tubo com uma pipeta adicione 4 mL de solução de Sca/eA2 e incubar as fatias para 12 h com agitação suave a 37 ° C.
  6. Remover a solução do tubo com uma pipeta e adicionar 4 mL de PBS e incubar as fatias para 6 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  7. Retire cuidadosamente as fatias para um tubo plástico de 2 mL, usando uma espátula.
  8. Incube com anticorpos primários (tabela 3) em 1 mL de solução de AbScale para 48-72 h a 37 ° C (Figura 4), com agitação suave.
  9. Retire cuidadosamente as fatias para um tubo de plástico de 5 mL com uma espátula.
  10. Incube em 4 mL de solução de AbScale para 2 h à temperatura ambiente com agitação suave em 2 vezes.
  11. Retire cuidadosamente as fatias para um tubo plástico de 2 mL, usando uma espátula.
  12. Incube com fluorescente etiquetado anticorpos secundários (Tabela de materiais, 1: 100) em 1 mL de solução de AbScale por 48 h a 37 ° C, com agitação suave.
  13. Retire as fatias com uma espátula para um tubo de plástico de 5 mL contendo 4 mL da solução AbScale cuidadosamente e incubar as fatias para 6 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  14. Remover a solução do tubo com uma pipeta e adicione 4 mL da solução e AbScale incubar as fatias por 2 h 2 vezes com agitação suave na temperatura de quarto.
  15. Remover a solução do tubo com uma pipeta e adicionar 4 mL de 4% PFA e incubar as fatias para 1 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  16. Remover a solução do tubo com uma pipeta e adicionar 4 mL de PBS e incubar as fatias para 1 h com agitação suave na temperatura de quarto.
  17. Remover a solução do tubo com uma pipeta adicione 4 mL da solução de Sca/eS4 e incubar as fatias para 12 h com agitação suave a 37 ° C.
  18. Coloque o espaçador sobre uma lâmina de vidro e coloque as fatias no espaçador e mergulhe as fatias com solução Sca/eS4. Sele o espaçador com um tampa de vidro (Figura 1).
  19. Ponha água no vidro de tampa e imagem utilizando microscopia confocal ou dois fotões com uma água-imersão tempo trabalhando o objetivo de distância. Se necessário, utilize um palco motorizado.
    Nota: Verifique se as partes profundas da amostra são etiquetadas similarmente às partes superficiais para confirmar a ausência de um significativo viés de rotulagem.
    Nota: A penetração dos anticorpos testados é descrita na tabela 3.

6. determinação de posição de célula

  1. Para cada posição em imagens digitalizadas, calcule os valores de correlação usando um filtro de imagem tridimensional14 (Figura 5A-5D).
  2. Determine as posições dos picos do valor de correlação (Figura 5).
  3. Investiga imagens em torno dos picos para localizar as células (Figura 5E).

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Representative Results

Nós rotulados de neurônios de projeção cortical pela expressão de tdTomato em Tlx3-cre/Ai9 ratos transgénicos e visualizado neurônios de projeção sub cerebral através da injeção do traçador retrógrado CTB488 em ponte. O hemisfério esquerdo do cérebro foi submetido ao método SeeDB e digitalizados usando um microscópio de dois fotões equipado com uma água-imersão tempo trabalhando o objetivo de distância (25 X, N.A. 1.1, distância de trabalho 2 mm) e um palco motorizado. Uma pilha de 401 imagens (512 x 512 pixels; tamanho de pixel = 0.99 µm) no z-passo = 2,8 µm em cada uma das 30 posições de digitalização foi obtido. Os corpos celulares dos tipos de dois célula eram visíveis ao longo de uma vasta gama de áreas do cérebro (Figura 6) e seções óticas mostrou microcolumns periódica (Figura 7A). Além disso, os cérebros dos ratos Crym-egfp (mantidos como heterozigotos com um fundo C57BL/6J) foram limpos pelo método de SeeDB e fotografados como acima. Os corpos celulares e dendritos apicais de neurônios de projeção sub cerebral EGFP-expressando eram visíveis em seções óticas (Figura 7B).

Também realizamos rotulagem retrógrada de neurônios de projeção sub cerebral em camundongos C57BL/6J, usando CTB488. O cérebro fixo foi cortado em fatias coronais com uma espessura de cerca de 500 µm e submetido ao método AbScale rotular parvalbumin-expressando células (Anti-parvalbumin, 1: 1000; Anti-mouse IgG-fluorescente etiquetado,). Empilhar imagens (512 x 512 pixels, tamanho de pixel = 1,24 µm; z-passo = 2,17 µm, imagens/pilha 268) foram obtidas utilizando microscopia confocal com uma água-imersão tempo trabalhando o objetivo de distância (20 X, N.A. 1.0, distância de trabalho 2 mm). Neurônios de projeção sub cerebral e células parvalbumin-expressando estavam visíveis nas fatias (Figura 7).

Figure 1
Figura 1: imagem chambers e espaçadores. (A) Top: Handmade com fundo de vidro placa de Petri (à direita) e um prato de Petri sem um fundo de vidro (à esquerda). Fundo: Uma câmara (à direita) e placas de assoalho (à esquerda) feito de folhas de silicone. (B) um hemisfério de rato submetido ao método SeeDB após injeção de CTB555 para o colículo superior é definida para a câmara. A amostra é fixada com um pedaço de adesivo reutilizável. (C), A lâmina de vidro (topo) e um espaçador, feita de uma folha de silicone, com uma espessura de 0.5 mm (parte inferior). (D) duas fatias coronais do cérebro do rato foram definidas para o espaçador e cobertas com um tampa de vidro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: injeção do traçador. (A) A pipeta de vidro ligada a uma seringa Hamilton através de um tubo de plástico. (B), um rato é colocado sobre um instrumento estereotáxica. A pipeta de vidro é inclinada aproximadamente 60° posteriormente de eixo vertical para a injeção para o colículo superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: corte de amostras de cérebro. (A) amostra de cérebro inteiro após injeção de CTB555 para o colículo superior e fixação. O bregma e o lambda foram marcados com agulhas de tungstênio (setas). (B), a mesma amostra aparadas para obter um hemisfério. Observe que as agulhas de tungstênio permanecem (setas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Imersão das amostras de cérebro em soluções para os métodos de elSeeDB e AbSca. (A) uma amostra de hemisfério imergida em 0,5% α-thioglycerol e 20% (p/v) de frutose para o método de SeeDB. (B) fatias coronais imergidas em solução de Sca/eA2 para o método de elAbSca. (C) fatias coronais imergidas em solução de elAbSca contendo anticorpos para o método de elAbSca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: determinação de posições célula. Neurônios de projeção sub cerebral foram rotulados através da injeção do traçador retrógrado CTB488 em ponte em 5 semanas de idade. O hemisfério esquerdo foi submetido ao método SeeDB e examinado com microscopia de dois fotões (512 x 512 pixels, tamanho de pixel = 0.99 µm; z-passo = 2,8 µm, imagens/pilha 601). (A), A única imagem. (B) cinco imagens de uma pilha de imagem única. (C) a imagem filtro usado para detectar os neurônios de projeção sub cerebral CTB-rotulados. (D) valores de correlação calculado para as cinco imagens em (B) usando o filtro em (C). (E) exemplos de neurônios de projeção sub cerebral detectada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: resultados representativos de imagem em grande escala. Neurônios de projeção cortical (verdes) foram rotulados pela expressão-tdTomato em Tlx3-cre/Ai9 ratos transgénicos, e neurônios de projeção sub cerebral (magenta) foram visualizados por injetando o traçador retrógrado CTB488 na ponte de 7 semanas de idade. O hemisfério esquerdo foi submetido ao método de SeeDB e a área 1.250 µm para 2.690 µm lateral e-3,400 µm ao µm 1.230 anterior o bregma foi digitalizados usando microscopia de dois fotões. (A) vista superior. Posições aproximadas de áreas corticais foram mostradas. (BD) Vista oblíqua da CTB 488 fluorescência mostrando neurônios de projeção sub cerebral (B), tdTomato fluorescência mostrando neurônios de projeção cortical (C) e a imagem mesclada (D). R: Anterior; P: posterior; M: medial; D: Dorsal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: fotografias de alta magnificação de resultados representativos. (A) uma secção óptica da imagem na Figura 6. Espessura da imagem = 20 µm. (B) neurônios de projeção sub cerebral EGFP-etiquetadas em um rato Crym-egfp heterozigoto com 6 semanas de idade. Espessura da imagem = 30 µm. (C) Subcerebral projeção neurônios (magenta) foram rotulados por injectar o pons de camundongos C57BL/6J em dia pós-natal, 49 e parvalbumin-expressando células (verdes) foram visualizadas pelo método AbScale CTB488. Espessura da imagem = 55 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fluoróforo Ex. (nm) Filtro (nm)
EGFP 910 500-550 (525-25/50-FF03, Semrock)
tdTomato 1.000 578-633 (D605 / 55m, Chroma)
Alexa Fluor 488 750 500-550 (525-25/50-FF03, Semrock)
Alexa Fluor 555 750 563-588 (FF03-575/25-25, Semrock)
Alexa Fluor 594 750 601-657 (FF01-629/56, Semrock)
DAPI 700 400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock)

Tabela 1: Comprimentos de onda de excitação e filtros para microscopia de dois fotões.

Tabela 2: reagentes para o método de e AbScal. Clique aqui para baixar este arquivo.

Antigénio Animal imunizado ID de produto Concentração bloco de 3 mm Fatia de 500 μm
NeuN Mouse MAB377 1: 500 ND +
NeuN Coelho ABN78 1: 500 ND +
CTIP2 Rato ab18465 1: 100 L1-L6 +
Statb2 Mouse ab51502 1: 100 - -
GAD67 Mouse MAB5406 1: 200 ND +
GABA Coelho A2052 1: 100 - -
Parvalbumin Mouse 235 1: 1000 ND +
Parvalbumin Cabra PV-Go-Af460 1: 100 L1-L2/3 +
Parvalbumin Mouse P3088 1: 1000 ND +
Parvalbumin Coelho ab11427 1: 500 ND -
Somatostatina Coelho T-4103 1: 1000 L1-L2/3 +
c-Fos Coelho PC38 1: 1000 ND +

Tabela 3: penetração dos anticorpos testados. Resultados para blocos de 3 mm de espessura é mostrado como se segue; L1-L6: penetração na espessura cortical toda; L1-L2/3: penetração até a camada 2/3; -: sem rotulagem; ND: não determinado. Resultados para 500 µm de espessura fatias é mostrado como se segue; +: rotulagem uniforme; -: nenhum ou limitado a rotulagem.

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Discussion

Apresentamos os procedimentos para obter imagens tridimensionais em grande escala da organização de tipo específico de célula a tipos de grandes células na camada neocortical do rato 5. Em comparação com a coloração da fatia convencional, o método é mais útil na determinação da organização tridimensional do neocórtex. O método permite a aquisição de imagens do mais amplo e as mais profundas regiões do cérebro em comparação com o típico na vivo microscopia 2-fóton ou microscopia confocal convencional e, assim, podem permitir a análise abrangente do celular neocortical organização.

Uma etapa fundamental do método é a penetração do anticorpo. Um subconjunto de anticorpos mostra pobre penetração na espessura espécimes (tabela 3) e, portanto, não pode ser usado para o método de elAbSca. Para obter a rotulagem uniforme com os anticorpos utilizados neste estudo, foi necessário cortar o cérebro em 500 µm de fatias. O uso de menores fragmentos de anticorpos, por exemplo, Fab ou fragmentos de F(ab') 2, e/ou outros métodos21,22,23,24,25,26, de compensação de 27,28 pode melhorar os resultados.

Especificidade do anticorpo antígeno-ligando normalmente caracteriza-se em fatias finas de tecido, mas pode ser diferente em tecidos grossos processados para compensação. Para controlar para a especificidade do anticorpo, nós rotulados co tecidos com expressão de gene injeção e marcador marcador em animais transgénicos e também realizou bloqueio experimentos utilizando antígeno proteínas e peptídeos14. Estes procedimentos e experimentos de controle usando animais mutantes, faltando os antígenos alvo deve ser útil para confirmar a especificidade dos anticorpos.

Uma limitação do método é que alguns deformação da amostra é inevitável devido a manipulação de amostras em massa macia. Obtenção de imagens na vivo antes da fixação e usando essas imagens como referências ajudará a corrigir tais deformações.

Os presentes procedimentos foram projetados para a análise da camada neocortical 5. Análises recentes identificaram muitos marcadores moleculares que tipos de célula neuronal de rótulo em outras camadas4,5,6,7, e a aplicação desses fabricantes para o método atual pode permitir identificação da organização celular importante em outras camadas. Além disso, é possível realizar análises semelhantes em regiões do cérebro que não seja o neocórtex e em órgãos que não o cérebro, para investigar se uma organização precisa de celular semelhante ao microcolumns está presente.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos Atsushi Miyawaki e Hiroshi Hama seus conselhos sobre as experiências de elAbSca, Charles Yokoyama para edição do manuscrito, Eriko Ohshima e Miyuki Kishino para sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado por fundos de pesquisa de RIKEN T.H. e Grants-in-Aid para a investigação científica do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT) do Japão para T.H. (áreas inovadoras "Neurocircuitos mesoscópica"; 22115004) e S.S. (25890023).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crym-egfp transgenic mice MMRRC 012003-UCD
Tlx3-cre transgenic mice MMRRC 36547-UCD
ROSA-CAG-flox-tdTomato mice Jackson Laboratory JAX #7909
Silicone rubber sheet AS ONE 6-611-01 0.5 mm thickness
Silicone rubber sheet AS ONE 6-611-02 1.0 mm thickness
Silicone rubber sheet AS ONE 6-611-05 3.0 mm thickness
Petri dishes Falcon 351008
Cover glass Matsunami C022241
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen C22841
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate Invitrogen C22843
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen C22842
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate Invitrogen C34778
26 G Hamilton syringe Hamilton 701N
Injector pump KD Scientific KDS 310 Pons injection
Injector pump KD Scientific KDS 100 Superior colliculus injection
Manipulator Narishige SM-15
Sodium pentobarbital Kyoritsu Seiyaku Somnopentyl
Isoflurane Pfizer
Lidocaine AstraZeneca Xylocaine injection 1% with epinephrine
Drill Toyo Associates HP-200
Avitene microfibrillar hemostat Davol Inc 1010090
Alonalfa Daiichi-Sankyo Alonalpha A
Surgical silk Ethicon K881H
Incubator UVP HB-1000 Hybridizer
Glass pipette Drummond Scientific Company 2-000-075
Electrode puller Sutter Instrument Company P-97
Paraffin Liquid, light Nacalai tesque 26132-35
Saline Otsuka 1326
Paraformaldehyde Nacalai tesque 26126-54
Tungsten needle Inter medical Φ0.1 *L200 mm
Vibratome Leica VT1000S
50 mL plastic tube Falcon 352070
α-thioglycerol Nacalai tesque 33709-62
D(-) Fructose Nacalai tesque 16315-55
BluTack Bostik CKBT-450000
Two-photon microscope Nikon A1RMP
Water-immersion long working distance objectives Nikon CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm
Water-immersion long working distance objectives Nikon CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm
Motorized stage COMS PT100C-50XY
Filter Semrock FF01-492/SP-25
Filter Semrock FF03-525/50-25
Filter Semrock FF03-575/25-25
Filter Semrock FF01-629/56
Filter Chroma D605/55m
5 mL plastic tube AS ONE VIO-5B
2 mL plastic tube Eppendorf  0030120094
Urea Nacalai tesque 35905-35
Triton X-100 Nacalai tesque 35501-15
Glyserol Sigma-aldrich 191612
D(-)-sorbitol Wako 191-14735
Methyl-β-cyclodextrin Tokyo chemical industry M1356
γ-Cyclodextrin Wako 037-10643
N-acetyl-L-hydroxyproline Skin Essential Actives 33996-33-7
DMSO Nacalai tesque 13445-45
Bovine Serum Albumin Sigma-aldrich A7906
Tween-20 (1.1 g/mL) Nacalai tesque 35624-15
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21422
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21428
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A21235
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11029
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206
Confocal microscope Olympus FV1000
Water-immersion long working distance objectives Olympus XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm
Anti-NeuN Millipore MAB377
Anti-NeuN Millipore ABN78
Anti-CTIP2 Abcam ab18465
Anti-Statb2 Abcam ab51502
Anti-GAD67 Millipore MAB5406
Anti-GABA Sigma A2052
Anti-Parvalbumin Swant 235
Anti-Parvalbumin Frontier Institute PV-Go-Af460
Anti-Parvalbumin Sigma P3088
Anti-Parvalbumin Abcam ab11427
Anti-Somatostatin Peninsula Laboratories T-4103
Anti-c-Fos CalbioChem PC38

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References

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