טולדין כחול מכתים סעיפים שרף-מוטבע להערכת המורפולוגיה במערכת העצבים ההיקפית

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול להמחיש ומבנים של העצבים ההיקפיים על ידי קבלת מכתימה את סעיפים 1-2 מיקרומטר עם טולדין כחול

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ghnenis, A. B., Czaikowski, R. E., Zhang, Z. J., Bushman, J. S. Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology. J. Vis. Exp. (137), e58031, doi:10.3791/58031 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

העצבים ההיקפיים להרחיב בכל הגוף, innervating ברקמות היעד עם אקסונים מוטוריים או חושית. עקב הפצה נרחבת, העצבים ההיקפיים נפגעים לעתים קרובות בגלל טראומה או מחלה. כמו שיטות ואסטרטגיות פותחו כדי להעריך את הפגיעה במערכת העצבים ההיקפית במודלים של בעלי חיים, הפונקציה והתחדשות, לנתח את morphometry של עצב היקפי הפך מדידה תוצאה מסוף חיוני. מקטעים טולדין כחול צביעה של עצב קרוס שהושג ממקטעים עצב שרף מוטבע הוא שיטה ישימה עבור הערכות כמותיים של העצבים ההיקפיים, המאפשר ויזואליזציה של מורפולוגיה מספר אקסונים ומידת myelination. טכניקה זו, כמו עם שיטות היסטולוגית רבות אחרות, יכול להיות קשה כדי ללמוד ולעבוד באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים בכתב. הכוונה של פרסום זה לכן כדי להדגיש פרוטוקולים בכתב עבור טולדין כחול צביעה של העצבים ההיקפיים עם צילום וידאו של השיטה, באמצעות העצבים ממוגלה שנקטפו חולדות. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים ויוו עצבים היקפית קיבוע ואוסף של רקמות, וכן קיבוע שאחרי עם 2% אוסמיום ארבע-חמצני, הטבעה של עצבים שרף אפוקסי, ultramicrotome חלוקתה של עצבים עד עובי 1-2μm. עצב חלקים לאחר מכן הועבר זכוכית, מוכתם כחול טולדין, אחרי אשר הם נמצאים באופן כמותי ובאופיו העריך. דוגמאות הבעיות הנפוצות ביותר מוצגות, כמו גם צעדים להקלת בנושאים אלה.

Introduction

העצבים ההיקפיים להרחיב בכל הגוף, innervating ברקמות היעד עם אקסונים מוטוריים או חושי1. ליקויים במערכת העצבים ההיקפית הנגרמת על ידי הפרעות רפואיות, טראומה מייצגים בעיה מרכזית בבריאות הציבור ויש השפעות כלכליות גדולות2,3. למרות ההתקדמות הערכת התוצאות של פגיעות במערכת העצבים ההיקפית והבנה התחדשות עצבים, שיטות מסורתיות כגון עצב היסטולוגיה וצביעת טכניקות הן כלי חשוב להעריך איכותית, באופן כמותי עצב בריאות כמידה התוצאה מסוף חייתיים או רקמה אנושית נכרת. זה לעתים קרובות מזווג עם מדידות אלקטרופיזיולוגיות של פונקציה במערכת העצבים ההיקפית, איפה morphometry יכול לגלות למה עצב פונקציונליים התחדשות עשה או לא התרחשה.

טולדין כחול מכתים סעיפים שרף מוטבע למחצה דק במערכת העצבים ההיקפית היא שיטה מיוחדת הדמיה סיבי העצב סיבי עצב, אספקת באיכות גבוהה ונקה תמונות מפורט של עצב מבנים4,5,6 . טולדין הכחולה הכתם metachromatic acidophilic, התגלה על ידי ויליאם הנרי מין הולל ב- 1856-7, כבר בשימוש ביישומים רפואיים מספר8. טולדין blue מוכתמת במערכת העצבים ההיקפית מקטעים המתקבל מקטעי עצב שרף-מוטבע מאפשר הדמיה ברורה של עצב מבנים. הדמיה של מבנה המיאלין יכול להיות מוגברת על ידי השימוש אוסמיום ארבע-חמצני קיבוע שאחרי4,9. אוסמיום ארבע-חמצני הוא רעיל חמצון של שומנים בדם מקבע סוכן המקיים אינטראקציה עם קשרים כפולים בשומנים, וכתוצאה מכך וליישובים מוגדר השומנים-עשיר המיאלין מעילי פרווה10 עם זאת, אוסמיום ארבע-חמצני רעיל, יקר, דורש של דגירה ארוך יותר של מקטעים עצב, הוא לא תמיד.

שיטות אלטרנטיביות של עיבוד, צביעת פותחו עבור ויזואליזציה של מורפולוגיה במערכת העצבים ההיקפית; פרפין חלוקתה קריוגני, אפוקסי שרף-מוטבע עצב חלוקתה ואחריו מכתים עם טולדין כחול או פתרון phenylenediamine שימש לכמת שינויים מורפולוגיים במערכת העצבים ההיקפית התחדשות 11,12 . שיטות אלה כל יש יתרונות שלהם ועל הנתונים החיוניים התשואה על מספר אקסונים, עובי המיאלין, קוטר האקסון, קוטר האקסון סיבים סיבי העצב קוטר (g-יחס) 11,13,14,15 .

ההבחנה העיקרית שרף-הטבעה של פרוטוקול זה הוא כי הוא מקל קבלת חתכים עובי של 1-2 μm בשל הקושי של השרף תוך שמירה על התכונות היסטולוגית של העצב. סעיפים אלה דק, בניגוד הסעיפים עובי μm 4-5 המתקבל פרפין הטבעה, לספק במערכת העצבים ההיקפית מקטעים עם רזולוציה גבוהה יותר, ומאפשר כימות מדויקת יותר של האקסון myelination, כגון g-היחס, זה לא יכול להיות להשיג חלקים עבה16. בזמן ההקפאה חלוקתה יכול לשמש כדי להשיג את סעיפים 1-2 מיקרומטר, עברו את החוויה שלנו כי קשה יותר להשיג חלקים ללא סדקים גדולים רבים. קטעים סדוק כאלה יכולים לגרום ספירה מדויקת של המספר של אקסונים והיבטים של myelination.

בנוסף טולדין כחול מכתים17, כסף מכתים שיטת18 ומאסון מוכתמים trichrome4 יכול לשמש גם להראות אומץ אקסונים. עם זאת, באמצעות שרף הטמעת סעיפים עצב התווך עכברוש מוכתם או hematoxylin אאוזין או מאסון trichrome עטיפות המיאלין הראה חלש ו מבנים לא מזוהה, ואילו טולדין כחול מכתים הראו תמונה ברורה מעטפת המיאלין והוא יכול בקלות להיות כימות4. למרות מספר מגבלות, העצבים טולדין כחול מכתים של שרף מוטבע היקפית היא טכניקה יקר יכול לשמש כאשר תמונות ברזולוציה גבוהה של עצב מורפולוגיה נדרשים.

החיסרון העיקרי להטבעת שרף הוא כי זה זמן רב, אינו מאפשר immunostaining של הרקמה אותו בשל הקושי של אנטיגן אחזור בהשוואה פרפין וטכניקות מקטעים מוטבע קפוא. לכן לא לרוב ניתן לנצל את הרקמה זהה עבור immunostaining שמעובד באמצעות שרף-הטבעה על צביעת טולדין כחול. אמנם לא היה כאן, אם אימונוהיסטוכימיה רצוי שרף מקטעים מוטבע, השימוש methacrylate גליקול הטבעה שרפים מאפשר אימונוהיסטוכימיה להתבצע על מקטעי רקמת, אבל זה יקרה יחסית19. זה יכול להיות מעט חמאני חיתוך העצב ההיקפי לתוך מקטעים נפרדים, חלקם להטבעת שרף ואחרים עבור immunostaining ישירות לאחר קיבוע.

התהליך של טולדין כחול צביעה של שרף מוטבע העצבים ההיקפיים, כמו עם ניתוח histopathological ביותר, יכול להיות שבור לתוך חמישה שלבים, כולל קיבוע, התייבשות, הטבעה, חלוקתה, צביעת20. אנו שואפים כאן מספקים פרוטוקול ו מנחה מעשית לשימוש בשרף עכברוש מוטבע בעצב סעיפים מוכתמים טולדין כחול לרכוש תמונות באיכות גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

חולדות ספראג Dawley למבוגרים שימשו בפרויקט זה, כל הפרוצדורות אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת ויומינג ועל שימוש הוועדה.

1. הניתוח ותוך קיבוע עצב Vivo

הערה: מידע הספק עבור כל חומרים וציוד המשמשים פרוטוקול זה מפורטים בטבלה של חומרים.

הערה: In vivo עצב קיבוע משמש כדי לשמר את הרקמות ולהפחית השפלה מבניות העלולות לנבוע בין שעת המוות אוסף של העצבים. In vivo קיבוע הרקמה אימון רגיל עבור הכנה של רקמת מערכת העצבים היסטולוגיה, שם נמצא זלוף לעיתים קרובות הקדמה זו. המיקום והגודל של העצבים ההיקפיים המותר עבור קיבוע באתרו. לא מומלץ איסוף של קיבעון של רקמות לאחר המתת חסד בגלל האפשרות של רקמות השפלה.

  1. להתכונן העכברוש הרדמה כללית על-ידי הצבתו בתא אינדוקציה עם 2-3% איזופלוריין, ולאחר מכן למקם את העכברוש anesthetized במצב שכיבה על מזרון לנתיחה ולתחזק לפחות 1-2% של איזופלוריין באמצעות הרדמה חרוט האף. כדי להבטיח עומק נאותה של הרדמה, בדיקת חיות לנסיגה פדלים ליד הרגליים האחוריות ואיתור העדר רפלקסים palpebral בעיניים על-ידי נגיעה של canthus המדיאלי של העין.
    הערה: הזרקת בקרום הבטן של קטמין הוא חלופה נפוץ לאיזופלוריין הנשאף.
  2. כדי לחשוף בעצב, לגלח את השיער של hind limb(s) ולנקות את האזורים מגולח עם 70% אתנול. עם סכין או מספריים, עושים חתך 2-3 ס מ של העור לאורך האיבר הינד מן הברך עד הירך, איפה מישוש של עצם הירך באמצעות את האזמל סטרילי כדי להבטיח את המיקום הנכון של החתך. עצם הירך ממוקם רק מקורב את פלח הנגיש ביותר של בעצב. אף-על-פי זה ניתוח ההישרדות, לשמור על טכניקות סטרילי.
  3. לאחר ביצוע החתך בעור, לאתר את המטוס בין השריר הדו-ראשי לשריר העכוז, באמצעות מספריים microdissection נפרדים fascia כבסיס ולחשוף 2-3 ס מ קו תחתון בעצב. כדי לחשוף קטע ברור בעצב, השתמש מפסק כדי להרחיב את הפער בין שני השרירים (איור 1 א'). עם בסדר. מלקחיים ומספריים איריס, הפרד בזהירות את העצב שבסביבה רקמת חיבור, לוקח לא כדי לדחוס או לחתוך את העצב.
  4. הוסף מקבע מספיק של דונלד טראמפ (4% פורמלדהיד, גלוטראלדהיד 1% ב- PBS 1 x (buffered פוספט תמיסת מלח) עם טאו 1.16 גר' NaH2PO4· H2O לכל 100 מ ל) לתוך חלל המכיל העצב חשוף לכסות את העצב ולתת לשבת במשך 10 דקות. אם נחוץ, גאזה המקום תחת האחוריות רגל כדי לשפר את הזווית כך מקבע יותר ניתן להוסיף לתוך החלל. הסרת מקבע את לאחר 10 דקות, חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
  5. באמצעות מיקרוסקופ ויבתר, העצב משני הצדדים באמצעות מספריים לנתיחה בסדר, מקפיד לא למתוח או לצבוט בעצב, גזורה מיד לשים את הסעיפים עצב צינורות 15 מ"ל המכיל מקבע של דונלד טראמפ ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע, שינוי מקבע כל 48 שעות.
  6. אין להשאיר בעלי חיים ללא התערבות במהלך כל חלק של הליך כירורגי. לאחר ההסרה של העצב, המתת חסד בבעלי חיים על ידי נקע בצוואר הרחם תחת הרדמה.

2. אוסמיום ארבע-חמצני טיפול והטבעה שרף

  1. פוסט קיבעון, בזהירות הסר כל שומן הנותרים ואת רקמות החיבור העצב, השימוש באזמל חד לחתוך את העצב למקטעים כ 5 מ מ אורך (עצב מקטעים יכולים להיות מופרדים ומתויגים צינורות שונים). להכין טרי 2% אוסמיום ארבע-חמצני מדולל בפתרון לשבועיים של דונלד טראמפ ולשמור שפופרת זכוכית. לטבול עצב קטעים ב- 2% אוסמיום ארבע-חמצני כבר שעתיים, אשר יכול להיות צינורות פלסטיק עבור פרק זמן קצר זה.
    הערה: צינורות פלסטיק מסוימים מגיבים עם אוסמיום ארבע-חמצני, גורם הכהיה של הפתרון, אז אחסון ממושך של אוסמיום ארבע-חמצני צינורות פלסטיק אינו מומלץ.
  2. באמצעות אפוקסי של הטמעת ערכת בינוני, להכין את הנוסחה ההטבעה הסופי:
    1. לערבב את אפוקסי הטבעה בינוני עם פתרון DDSA (אנהידריד dodecenylsuccinic; תערובת A) ומערבבים את אפוקסי הטבעה בינוני עם פתרון NMA (אנהידריד methylnadic; תערובת B). תן שתי תערובות A ו- B לערבב לפחות 20 דקות על ידי ערבוב עם פגים.
    2. מיד לפני השימוש, לערבב תערובת A ו- B, להוסיף את המאיץ DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) ביחס של 1.5 על 2.0% מהנפח הכולל של התערובת. שימו לב כי הפתרון DPM-30 יש למדוד בדיוק כדי למנוע את הבלוק צבע כהה ופריך. שרף כל כימיקלים רעילים; תשמרי תוספת למניעת מגע עם העור או באינהלציה.
  3. באמצעות צינורות 1.5 mL, לשטוף את העצב מקטעים עם PBS ולהתחיל את תהליך התייבשות על-ידי הצבת את מקטעי עצב שונים של אצטון/מזוקקים קטעים מים: 30%, 60%, 90%, ריכוז למשך 10 דקות ולאחר מכן ב- 100% אצטון 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחד.  הערה שאתנול זה יכול לשמש במקום אצטון.
  4. חדירה שרף, למקם את מקטעי עצב בתערובת של 1 חלק התערובת הסופית ההטבעה, אצטון 100% חלק 1 במשך 30 דקות, ואז ב תערובת של 2 חלקי התערובת הסופית ההטבעה ו 1 חלק אצטון 100% למשך 30 דקות , סוף סוף מקום העצב מגזרים בגמר והטבעה התערובת במשך 30 דקות של.
  5. מכניסים את מקטעי עצב גומי סיליקון, בהטבעה בתבניות (אנחנו השתמשו 106 מ"מ אורך x 71 מ מ רוחב x 7 מ מ עומק; לחסום בגודל 11 מ"מ אורך x רוחב 6 מ מ x 3 מ מ עומק). להוסיף בעדינות את השרף על העצבים, מקפיד מכסה את מקטעי כל עצב, להימנע מביצוע בועות אוויר. להשאיר את התבנית המכילה עצב מקטעים לשרף פולימריזציה ב 60 מעלות צלזיוס במשך הלילה.

3. חלוקתה על ידי Ultramicrotome

  1. להכין סכינים זכוכית באמצעות מכונת הסכין זכוכית (איור 1B) ולעשות זכוכית סכינים עם סירות (איור 1C), אשר משמשות לאיסוף מקטעים עצב מרחפת על פני המים מזוקקים.
  2. המקום שרף מוטבע העצב בלוקים בעל ultramicrotome עם הצד הבסיסי פונה כלפי מעלה. באמצעות היקף ultramicrotome, לקצץ שרף עודף המקיפים את רקמת עצב, ולעשות את הבלוק מול צורה טרפז ובאשר קרוב לפני השטח האורך של עצב ככל האפשר באמצעות להב עם קצוות יחיד, כגון סכין גילוח. המיושמת על פני השטח האורך של המקטע עצב, אשר מוכרת על ידי שלה כתמים כהים מאת אוסמיום ארבע-חמצני.
    הערה: זמירה של שרף עודף יקטין את האזור של שרף להיות למחלקה ולשפר ביצועים להב, חיתוך בשלבים הבאים.
  3. שימוש של ultramicrotome, גורם חתכי רוחב במספר מספיק כדי לחשוף את משטח אחיד חתך של רקמת עצב באמצעות סכין זכוכית פשוטה. ברגע זה נעשה, לעבור סכין זכוכית שסירתו מתמלא מים מזוקקים בטמפרטורת החדר והתאימו את ultramicrotome ל- 1-2 μm לחתוך קטעים דק.
  4. להעביר חלקים דקים הצפים מהסירה הסכין זכוכית טיפת מים יונים בשקופית זכוכית באמצעות לולאה מתכת (איור 1D). יבש שקופיות המכילה סעיפים על-ידי העברת מספר פעמים מעל להבה לכמה שניות, מקפיד לא לחמם יותר מדי את המקטעים. כתם סעיפים יבשים מיד עם טולדין כחול או לאחסן בטמפרטורת החדר במשך מספר ימים לפני צביעת.
    הערה: סעיפים גם ניתן לייבש בעזרת צלחת חמה ב 60 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. תהליך ייבוש איטי הופך את הסעיפים חלקה.

4. טולדין כחול מכתים

  1. להכין 1% פתרון של טולדין כחול על ידי המסת 2 גר' נתרן בוראט ב- 100 מ של מים יונים, ואז מוסיפים 1 גר' טולדין כחול ומערבבים עד התפרקה. לסנן את הפתרון באמצעות נייר סינון (גודל הנקבוביות: 11 מיקרומטר) לשמור את הפתרון בבקבוק אטום בטמפרטורת החדר עד שבועיים.
  2. באמצעות פיפטה פלסטיק או pipettor מיקרו, להוסיף טיפה של פתרון טולדין כחול על הסעיפים עצב ולהשאיר עבור s 20-30.
  3. לשטוף כל פתרון טולדין כחול עודף בטבילת בעדינות את השקופיות לתוך צנצנת של מים יונים וחזור 3 - 4 פעמים עד סעיפים ברורים. יבש את שקופיות לפחות 15 דקות ב 60 מעלות צלזיוס, או למשך הלילה בטמפרטורת החדר, ואז מכסים את הסעיפים עם coverslip שימוש קבוע הרכבה בינונית. לבחון את השקופית הממוסגרת מיד או לאחסן בטמפרטורת החדר.
  4. לבדוק תחת מיקרוסקופ אור. עדשה טבילה 100 X שמן מומלץ תמונות מפורט המשמש לחישוב g-יחסי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שרף מוטבע במערכת העצבים ההיקפית סעיפים מוכתמים טולדין כחול לאפשר נתונים מדויקים היסטולוגית quantifications. סקירה כללית של התהליך מוצג (איור 2). סעיפים ממוגלה העצבים נעוץ שרף בינוני ו מוכתם טולדין כחול הראה ברור תמונות ברזולוציה אופטימלית (3 ספרות). נזק עצבי יכול לגרום שינויים רבים עצב מבנים מורפולוגיים, לדוגמה, שינויים סיבי עצב, קוטר האקסון ואת עובי מעטפת המיאלין. בשיטה זו ניתן לשמור על מבנה העצב בצורתו הטבעית, אשר מקלה על המידה של מספר פרמטרים כמו היחס בין קוטר האקסון עד לקוטר סיבים הכולל (g-היחס; איור 4). מגוון גורמים יכול להוביל מקטעים אופטימליות במערכת העצבים ההיקפית, כולל הנוכחות של סדקים (איור 5A) במקטע עקב טיפול לקוי של העצב. חורים יכול להתרחש גם בסעיף (איור 5B) עקב התייבשות לא מספיקות. שגיאה אפשרית נוספת בהליך זה מתקפל הסעיפים (איור 5C), אשר ניתן לתקן באמצעות לולאות לחסן עבור סעיף העברת אותן לשקופית זכוכית.

Figure 1
איור 1: ניתוח ואת חלוקתה. (א) תאים עכברוש בעצב במהלך ויוו קיבעון. (B) זכוכית הסכין maker (ג) זכוכית סכינים עם הסירה. (ד) לולאות מתכת המשמש להעברת צף מקטעים דק של הסכינים זכוכית על טיפה של מים יונים על זכוכית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: סכימטי של השיטה שבה נעשה שימוש בפרוטוקול זה. (א) למבוגרים Dawley ספראג עכברוש הוא מורדם, ואחריו ויוו עצב קיבעון (B) , עצבים אוסף (C). השלב הבא הוא קיבוע שאחרי עם 2% אוסמיום ארבע-חמצני (ד) ושרף הטבעה (E). שרף עצב מוטבע שמקטעים הם גזוז (נ) ואז המחולקת למקטעים (G) באמצעות ultramicrotome של. לבסוף, עצב חלקים בשקופית זכוכית מוכתמים טולדין כחול (H). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: סעיף רוחבי עכברוש בעצב מוכתם טולדין הכחול. מראה המקטעים תחת הגדלה שונים (10 X 20 X, 40 X, 60 X) של תמונה ברורה עם רזולוציה מיטבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: סעיף רוחבי עכברוש בעצב מוכתם טולדין הכחול. זו התמונה ברזולוציה גבוהה (100 X) יכול לשמש כדי למדוד את היחס בין קוטר האקסון עד לקוטר סיבים הכולל (g-היחס). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: קטעי רוחבי עכברוש בעצב מוכתם טולדין כחול תחת הגדלה שונות. הראו העברינים הבעיות ייתכן נתקל במהלך הביצוע של פרוטוקול זה. (א) ו- (B). הנוכחות של סדקים וחורים בתוך המקטע עצב הנגרמת על ידי טיפול לקוי של המקטע והתייבשות לא מספיקות של הרקמה, בהתאמה. (ג)-הרמוניקה המקטעים, אשר עלול לקרות במהלך העברת הסעיפים הסכינים זכוכית לשקופית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בדיקות של המבנים מורפולוגי של פגיעה במערכת העצבים ההיקפית והתחדשות הינם נושאים תכופים של המחקר13. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השלבים כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה עבור נתונים היסטולוגית quantifications באמצעות רקמות בעצב חולדה בתוך גושי שרף, מוכתם טולדין כחול. טכניקה זו מספקת תמונה של עצב מורפולוגיה שבו ניתן לכמת את התחדשות עצבים על ידי מדידת מספר אקסונים, מידת myelination, נוכחות של רקמת שהותירה infiltrative ואת העצבים בריאות. בעוד התמונות להראות חלוקתה, עיבוד של עצבים שציווית דגימות, אותם צעדים וחומרים החלות על העצבים הפצועים ואת העצבים מחדש עם תעלות או רקמות השתלים, בתנאי באותו הקיבעון של הרקמה היא נאותה20, 21.

בעוד כל השלבים של הפרוטוקול הם חיוניים, כמה שלבים אלה נוטים יותר להוביל מקטעים באיכות ירודה או תמונות. לא מספיק רקמות התייבשות עלולה להוביל חורים הסעיפים חוצפה (איור 5B). הסבר אפשרי אחד הוא immiscibility של שרף עם מים, המים העודפים ברקמה מונעת שרף שחדר הרקמה. לכן, המאפשר מספיק זמן השימוש של אצטון המוחלט הוא הכרחי כדי להבטיח צעד ראוי התייבשות. למרות שאנחנו בשימוש אצטון פרוטוקול זה, גם ניתן להשתמש אתנול. שרפים רבים, עם זאת, הם לא תגובתי עם אתנול, כך הרקמה חייבים להיות מטופלים עם פרופילן אוקסיד כדי לשמש מעבר בין התייבשות אתנול והטבעה שרף.

בשל עוביו הדק של הסעיפים, העברת עצב חלקים מהסכין זכוכית השקופית זכוכית צריך להיעשות בזהירות גדולה (איור 5C). 1-2 מקטעים μm הם מאוד שבירים, העברה לא תקין של הסעיף עלול לגרום המקטע לשבור. אם המקטע נאסף בחלק המרכזי של המקטע עם מחט, המקטע נוטה מתקפל לתוך עצמו, לעתים קרובות יהיה קשה להתגלות בעת העברת לשקופית. ניתן להשתמש בכלים שונים להעברה של המקטע לשקופית זכוכית, כולל מחטים ולולאות, כל אחד צריך להיבדק למשתמש ספציפי לקבוע אשר תניב ההעברה הטובה ביותר תוצאות. למטרות שלנו, באמצעות לולאה זה יכול להקיף את כל האגף מאוד מופחת קיפול של מקטעים כאשר הם הועברו מכלא הסכין זכוכית השקופית מיקרוסקופ (איור 1D).

באופן כללי, טיפול נאות של העצבים חיוני כמו דחיסה של העצבים יכול לגרום סדקים להתרחש בסעיפים עצב (איור 5A). דחיסת רקמת עצב יכול להתרחש במהלך העברה של עצב מקטעים בתהליכי חשיפה חיה, קיבוע, התייבשות, שרף הטבעה. כדי למנוע דחיסת רקמת עצב, העצב מקטעי יועברו על ידי מלקחיים בסדר, עליתי על קצה אחד של המקטע באופן אידיאלי על ידי רק את השכבה epineurial, אז העצב כולו לא יושפעו. הנוכחות של סדקים וקווים (סימני הסכין) בסעיפים עצב עלול להתרחש גם בשל הזכוכית משעמם או שימוש מופרז סכינים. כדי להבטיח חלוקתה אופטימלית, אנו ממליצים על ביצוע זכוכית טריים סכינים ולשנות את הסכין זכוכית ש-25-30 כל הקיצוצים, פחות אם חלוקתה דרך עצב עטוף בתוך צינור.

שרפים יכולה להיות יקרה יחסית, אינם הולמים כאשר סעיפים האורך עצב נדרשים, באפשרותך לדרוש בכלים יקרים כגון ultramicrotome ומכונת הסכין זכוכית. למרות מגבלות אלו, טולדין כחול צביעה של שרף מוטבע היקפיים עצב חלקים עדיין נחשב את תקן זהב עבור ויזואליזציה של חתכי רוחב של העצבים ההיקפית morphometry4,5. סעיפים האורך גם יכול לחשוף את התכונות החשובות של העצבים ההיקפיים, כגון המשכיות עצב Ranvier של צמתים, אך שימושית ביותר עם אימונוהיסטוכימיה. במקרים כאלה זה הנוהג הכללי לעבד באופן שונה שני מקטעים של אותו עצב, אחד עבור טולדין כחול חתכי רוחב והשני עבור אימונוהיסטוכימיה האורך. בשל מקרים מוגברת של העצבים ההיקפית טראומה ופגיעות ואת הצרכים של דרך טובה יותר להעריך מבנים מורפולוגיים עצב, שיטה זו תוכל להמשיך להיות מיושם ככלי חיוני כדי לקבל נתונים היסטולוגית של נזק עצבי והתחדשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

המחברים רוצה thankthe ג'נקינס מיקרוסקופ מתקן אוניברסיטת ויומינג לעזרתם, חברי המעבדה הבושמנית, קלי Roballo, נכון היידן, Wupu Osimanjiang, וסובאש Dhunghana, סיוע בטיפול בבעלי חיים. פרסום זה התאפשרה על ידי פרס פיתוח מוסדיים (מושג) מ הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת גרנט # 2P20GM103432.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline Gibco 14200-075
Glutaraldehyde Solution Sigma-Aldrich G6257
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich T3260
Sodium Tetraborate Decahydrate Acros Organics 205950010
Isoflurane Piramal NDC 66794-013-25
Epoxy Embedding Medium Kit Sigma-Aldrich 45359
Sodium Hydroxide Solution Sigma-Aldrich 72068 To adjust Trump's fixative pH
Acetone Fisher Chemical 170942
Osmium Tetroxide Solution Sigma-Aldrich 75632
VWR Micro Slides, Superfrost Plus VWR 48311-703
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12545102
Pelco Embedding Cast Fisher Scientific NC9671811
Glass Knife Maker RMC Products GKM-2
Ultramicrotome RMC Products MT-XL
15 mL Conical Tube Falcon ISO 9001
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661
4 mL Glass Vial Sigma-Aldrich 854190
Razor Blades VWR 55411-050 For trimming resin block
Perfect Loop Electron Microscopy Sciences 70944 For picking up thin resin sections
Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm Electron Microscopy Sciences 71012
100 Watt Oven Millipore  6350115
Whatman Filter Paper Sigma-Aldrich WHA10010155
3 mL plastic pipette Sigma-Aldrich Z331740
Micro-surgical Kit World precision instruments
Olympus fluorescence microscope Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us. Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).
  2. Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).
  3. Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair. Annals of Plastic Surgery. 57, (4), 462-471 (2006).
  4. Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation. Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).
  5. Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).
  6. Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach. Histochemistry and Cell Biology. 709-717 (2011).
  7. Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).
  8. Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).
  9. Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).
  10. Dykstra, M. J. A manual of applied techniques for biological electron microscopy. Plenum. New York. 257 (1993).
  11. Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review. Journal of Neurosurgery. 107, (6), 1168-1189 (2007).
  12. Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve. Journal of Cell Science. 3, (69), 99-105 (1964).
  13. Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode. Brain research. 65-77 (2008).
  14. Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques. International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).
  15. Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials. 33, (5), 1363-1375 (2012).
  16. Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists. Clinical Neuropathology. 31, (1), 7-23 (2012).
  17. Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration. Microsurgery. 20, (1), 37-41 (2000).
  18. Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve. Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).
  19. Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections. Journal of Histotechnology. 30, (1), 27-33 (2007).
  20. Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: A literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8, (3), 72-79 (2016).
  21. Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety. Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).
  22. Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28, (5), 79 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics