Толуидиновый синий, окрашивание смолы встроенные разделы для оценки морфологии периферической нерв

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Здесь мы представляем протокол для визуализации тонких структур периферических нервов, получения и окрашивания 1-2 мкм секции с толуидиновый синий

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ghnenis, A. B., Czaikowski, R. E., Zhang, Z. J., Bushman, J. S. Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology. J. Vis. Exp. (137), e58031, doi:10.3791/58031 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

По всему телу, иннервирующих тканях-мишенях с мотором или сенсорные аксоны продлить периферических нервов. Из-за широкого распространения периферических нервов часто повреждены из-за травмы или болезни. Как оценить повреждения периферических нервов в моделях животных, функции и регенерации, были разработаны методы и стратегии анализа морфометрия периферических нервов стала важнейших терминалов результат измерения. Толуидиновый синий, окрашивание нерва крест секций, полученные из смолы встроенных разделов нерва — воспроизводимый метод для качественной и количественной оценки периферических нервов, позволяя визуализации морфологии количество аксонов и степени миелинизации. Этот метод, как и в случае многих других гистологических методов, может быть трудно учиться и мастер, с помощью стандартных письменных протоколов. Поэтому цель данного издания – подчеркнет письменные протоколы для толуидиновый синий, окрашивание периферических нервов с видеосъемка метода, с помощью седалищного нервов заготавливаемым от крыс. В этом протоколе, мы опишем в естественных условиях фиксации периферических нервов и коллекции ткани, и после фиксации с 2% осмия тетраоксид, встраивание нервов в эпоксидной смолы и ultramicrotome секционирование нервов до толщины 1-2μm. Нерва разделы затем передан на стеклянное скольжение и витражи с толуидиновый синий, после чего они количественно и качественно оцениваются. Приведены примеры наиболее распространенных проблем, а также шаги для смягчения этих проблем.

Introduction

Периферические нервы распространяется по всему телу, иннервирующих тканях-мишенях с мотором или сенсорные аксоны1. Периферические нервные дефекты, вызванные медицинских расстройств и травм являются проблемой общественного здравоохранения и имеют большие экономические последствия2,3. Несмотря на успехи в оценке результатов повреждений периферических нервов и пониманию регенерации нервных традиционные методы, такие как нерв гистологии и пятная методы являются важнейшими инструментами качественно и количественно оценить нерва здоровье как терминал результатов измерения в животных моделях или подакцизным тканей человека. Это часто в паре с электрофизиологические измерения функции периферических нервов, где морфометрия может раскрыть почему функциональных нервных регенерации сделал или не происходит.

Толуидиновый синий окрашивание участков смолы встроенных полутонкая периферических нервов — это специальный метод для визуализации Миелинизированные нервные волокна, обеспечивая высокое качество и четкие подробные изображения нервных структур4,5,6 . Толуидиновый синий ацидофильной МЕТАХРОМАТИЧЕСКАЯ пятно, обнаруженный Уильям Перкин в 1856 году7и был использован в нескольких медицинских приложений8. Толуидиновый синий окрашенных периферических нервов секции полученных от смолы встроенный нерв сегментов позволяет четкие визуализации нервных структур. Визуализация Миелиновые оболочки структуры можно повысить путем использования осмия тетраоксид после фиксации4,9. Осмия тетраоксид — токсичных окислителя и липидов фиксирующие агент, который взаимодействует с двойными связями в липидах, что приводит к совершенно определенный липид богатые миелина влагалищ10. Однако осмия тетраоксид токсичных, дорогие, требует больше инкубации нерв сегментов и не всегда используется.

Альтернативные методы обработки и окраски были разработаны для визуализации периферического нерва морфологии; Парафин, криогенные секционирование и эпоксидной смолы встроенный нерва секционирование следуют окрашивание с толуидиновый синий или фенилендиамином решения была использована для количественного определения морфологические изменения периферического нерва регенерации 11,12 . Эти методы имеют свои преимущества и урожайность основных данных о количестве аксоны, толщина миелина, аксон диаметр и аксон диаметром до Миелинизированные волокна диаметром (g коэффициент) 11,13,14,15 .

Основной различие смолы-вложения в этот протокол является, что облегчает получение 1-2 мкм толщина сечения из-за твердости смолы при сохранении гистологические качеств нерва. Эти тонкие, в отличие от 4-5 мкм толщина секций, полученные из парафина встраивание, разделах периферических нервов разделы с более высоким разрешением, позволяющие более точную количественную оценку миелинизации аксона, таких как g коэффициент, который не может быть полученные от толще разделы16. Хотя криогенных секционирование может использоваться для получения разделы 1-2 мкм, это был наш опыт, что это более трудно получить секции без многочисленных крупных трещин. Такие трещины секций может привести к неточной подсчитывая количество аксонов и аспекты миелинизации.

Помимо окрашивания17толуидиновый синий серебряный пятнать метод18 и Массон trichrome окрашивание4 может использоваться также показать нервные аксоны. Однако с помощью смолы встраивание крыса срединного нерва секций витражи с гематоксилином и эозином или Массон в trichrome показал слабый миелиновой оболочки и непризнанных структуры, тогда как окрашивание толуидиновый синий показал ясно Миелиновые оболочки изображения и легко может быть количественных4. Несмотря на некоторые ограничения толуидиновый синий окраски смолы встроенные периферийные нервы это ценный метод, который может использоваться при необходимости изображения с высоким разрешением нерва морфологии.

Основным недостатком для встраивания смола является что это занимает много времени и не позволяет иммуноокрашивания же ткани из-за сложности антигена поиска по сравнению с парафином и замороженных встроенные разделы методов. Таким образом это не возможно использовать же ткани для иммуноокрашивания, который обрабатывается через встраивание смолы для окрашивания толуидиновый синий. Хотя не используется здесь, по желанию иммуногистохимия смолы встроенные разделы, использование гликоля метакрилата, встраивание смолы позволяет для иммуногистохимии выполняется на разделах ткани, но она является относительно дорогим19. Это могут быть несколько смягчены путем разрезания периферических нервов на отдельные сегменты, некоторые для встраивания смолы и другие для иммуноокрашивания сразу после фиксации.

Процесс окрашивания толуидиновый синий смолы встроенных периферических нервов, как с наиболее гистопатологические анализа, могут быть разбиты на пять этапов, включая фиксацию, обезвоживание, встраивание, секционирование и пятнать20. Здесь мы стремимся предоставить протокол и практического руководства для использования смолы окрашенных встраиваемых крыса седалищного нерва разделы с толуидиновый синий получить высокое качество изображения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Взрослый крысах Sprague-Dawley были использованы в этом проекте, и все процедуры были одобрены Университет Вайоминга институционального ухода за животными и использования Комитетом.

1. операции и в Vivo нерва фиксации

Примечание: Поставщиков информации для всех материалов и оборудования, используемых в настоящем Протоколе, перечислены в Таблице материалов.

Примечание: В естественных условиях фиксации нерва используется для сохранения ткани и снижения структурной деградации, которая может возникнуть между коллекции нервы и время смерти. В естественных условиях фиксации ткани является стандартной практикой для подготовки системы нервной ткани гистологии, где перфузии часто является прекурсором для этого. Размещение и размер периферических нервов, допускается для фиксации на месте. Мы не рекомендуем коллекции и фиксации ткани после эвтаназии благодаря возможности деградации ткани.

  1. Готовить крыс для общей анестезии, поместив его в камеру всасывание с изофлюрановая 2-3%, а затем место наркотизированных крыс в лежачем положении на вершине рассечение мат и поддерживать на 1-2% изофлюрановая через обезболивающий носовой конус. Для обеспечения адекватной глубины анестезии, подопытных животных для педали вывода на задние лапы и проверьте отсутствие глазной рефлексы на глаза, прикоснувшись медиального угла глазной щели глаза.
    Примечание: Внутрибрюшинного введения кетамин является часто используемым альтернативой вдыхаемого изофлюрановая.
  2. Подвергать седалищного нерва, брить волосы hind limb(s) и чистые бритые районы с 70% этиловом спирте. С помощью скальпеля или ножницы, сделать 2-3 см разрез в коже вдоль задних конечностей от колена до более вертела, где пальпация бедренной кости с помощью стерильным скальпель обеспечить правильное место разреза. Бедренная кость расположен только проксимальнее наиболее доступный сегмент седалищного нерва. Несмотря на то, что это-выживание хирургии, поддерживать стерильные приемы.
  3. После внесения Кожный разрез, найдите плоскости между двуглавой мышцы бедра мышцы и большая ягодичная мышца и ножницами microdissection отделить основной фасции и разоблачить 2-3 см подчеркивание седалищного нерва. Для предоставления четкой секции седалищного нерва, используйте втягивающего устройства для разрыв между двумя мышцы (рис. 1A). С тонкой щипцы и Ирис ножницы тщательно отдельными нерв от окружающих соединительной ткани, принимая большую осторожность, чтобы не сжать или вырезать нерва.
  4. Добавьте достаточно Трамп фиксатор (4% формальдегида, глютаральдегид 1% в однократном ПБС (-фосфатный буфер) с 1,16 г NaH2PO4· H2O на 100 мл) в полость, содержащая подвергается нерв для того чтобы покрыть нерва и пусть сидят в течение 10 мин. Если необходимо, марлевые место под задние ноги улучшить угол, так что больше фиксатором могут быть добавлены в полость. Снимите фиксатор после 10 минут и повторите этот шаг еще два раза.
  5. Под микроскопом рассечения, сократить нерва с обеих сторон с помощью тонкой Рассечение ножницами, чтобы не растянуть или сжать седалищный нерв и сразу же поставить разделов нерва в 15 мл пробирки, содержащие Трампа фиксатором на 4 ° C на одну неделю, изменяя фиксатор каждые 48 ч.
  6. Не оставляйте животных без присмотра во время любой частью хирургической процедуры. После удаления нерва усыпить животных путем дислокации шейки матки под наркозом.

2. осмия тетраоксид лечение и встраивание смолы

  1. Сообщение фиксации, тщательно удалите оставшиеся жира и соединительной ткани из нерва и использовать острый скальпель нарезать нерв сегментов около 5 мм в длину (воспалении сегменты могут быть разделены и помечены в разных трубок). Подготовьте свежие 2% осмия тетраоксид разводят в Trump фиксирующие решения и хранить в стеклянной трубки. Погружайте нерв сегментов в 2% осмия тетраоксид 2 h, который может быть в пластиковые трубы для этого короткого периода времени.
    Примечание: Некоторые пластиковые трубы реагируют с осмия тетраоксид, вызывая потемнение решения, поэтому не рекомендуется длительное хранение осмия тетраоксид в пластиковых тубах.
  2. С помощью эпоксидных, встраивание Средний комплект, подготовка окончательного внедрения формулы:
    1. Mix эпоксидной, встраивание среднего раствором DDSA (dodecenylsuccinic ангидрид; смесь A) и смеси эпоксидных, встраивание среднего раствором НМА (methylnadic ангидрид; смесь B). Пусть обе смеси, которые A и B mix по крайней мере 20 минут перемешивания с магнитной мешалкой.
    2. Непосредственно перед применением перемешать смесь A и B и добавить ускоритель DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) в соотношении 1,5-2,0% от общего объема смеси. Обратите внимание, что решение DPM-30 должны оцениваться именно для того, чтобы предотвратить превращение темного цвета и хрупкий блок. Все смолы химические вещества, токсичные; принять дополнительные меры для предотвращения контакта с кожей или вдыхания.
  3. Использование 1.5 мл пробирок, мыть нерв сегментов с PBS и начать процесс обезвоживания, поместив нерв сегментов в разных ацетон/дистиллированной воды проходы: 30%, 60%, 90%, концентрации за 10 мин, затем в 100% ацетона 3 раза по 10 мин.  Обратите внимание, что этанол может использоваться вместо ацетона.
  4. Для проникновения смолы место нерв сегментов в смесь 1 часть окончательного внедрения смеси и 1 часть 100% ацетона для 30 мин, затем в смесь из 2 частей окончательного внедрения смеси и 1 часть 100% ацетона для 30 мин , и наконец место нерв сегментов в финале встраивание смесь для 30 мин.
  5. Положите нерв сегментов в Силиконовой резины, встраивание формы (мы использовали длина 106 мм х 71 мм ширина х 7 мм Глубина; заблокировать размер 11 мм длина х 6 мм ширина х 3 мм глубина). Аккуратно добавьте смолы на вершине нервы, убедившись в том охватить весь нерв сегментов и избежать воздушных пузырей. Оставьте плесень, содержащие нерв сегментов смолой для полимеризации при 60 ° C на ночь.

3. секционирование по Ultramicrotome

  1. Подготовка стекла ножи с помощью ножа чайник стекла (рис. 1B) и сделать стекло ножи с лодки (рис. 1 c), которые используются для сбора разделов нерва, плавающей на дистиллированной воде.
  2. Место смолы встроенные блоки нерва в держатель ultramicrotome с трапециевидной стороной вверх. С помощью области ultramicrotome, обрезать любой избыток смолы, окружающие ткани нерва и сделать блок сталкиваются трапециевидную форму и как близко к поверхности продольные нерва как можно с помощью одним краем лезвия, как лезвие бритвы. Не проникают поверхности продольные сегмента нерва, которая распознается по его темный пятнать, осмия тетраоксид.
    Примечание: Обрезки избыточных смолы уменьшит площадь смолы для быть секционного и улучшения производительности лезвие и резки в последующих шагах.
  3. Используя ultramicrotome, сделайте несколько поперечных сечений для выявления форма поперечного сечения поверхности нервных тканей, с использованием простого стекла нож достаточно. Как только это будет сделано, перейдите на нож стекла которых лодка заполнена с дистиллированной водой при комнатной температуре и отрегулировать ultramicrotome до 1-2 мкм для резки тонких секций.
  4. Передать плавающей шлифов из лодки нож стекла капля деионизованной воды на слайде стекла с использованием металлической петлю (рис. 1 d). Сухие слайды, содержащие разделы, передав несколько раз на огне в течение нескольких секунд, убедившись в том, чтобы не перегреть разделы. Пятно сушеные секции сразу с толуидиновый синий, или хранить при комнатной температуре в течение нескольких дней до окрашивания.
    Примечание: Разделы можно также сушат с помощью плиты теплее при 60 ° C 15 мин. Медленный процесс сушки делает разделы гладкой.

4. толуидиновый синий пятнать

  1. Подготовить раствор 1% толуидиновый синий, растворяя 2 g Борат натрия в 100 мл деионизированной воды, затем добавить 1 g толуидиновый синий и размешайте до растворения. Фильтр решения с помощью фильтровальной бумаги (размер пор: 11 мкм) и сохранить решение в непрозрачной бутылке при комнатной температуре до двух недель.
  2. Использование пластиковых дозаторов или микро дозаторов, добавить каплю раствора толуидиновый синий верхней секции нерва и оставить на 20-30 s.
  3. Смыть все избыточные решения толуидиновый синий, осторожно опуская слайды в дейонизированной воде банку и повторить 3 - 4 раза до тех пор, пока разделы ясны. Сухие слайды по крайней мере 15 мин при 60 ° C, или на ночь при комнатной температуре, а затем покрыть разделы с coverslip, с помощью регулярных монтажа средних. Изучить навесные слайды сразу или хранить при комнатной температуре.
  4. Рассмотреть под микроскопом света. Объектив 100 X нефти погружения рекомендуется для подробного изображения, используемые для вычисления g коэффициенты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Смола встроенных периферических нервов, разделы, окрашенных с толуидиновый синий позволяют для точных гистологических данных количественной. Обзор процедуры показан на (рис. 2). Седалищного нервов разделы встроенных в смолы и витражи с толуидиновый синий показали четкие изображения с оптимальным разрешением (3 цифры). Повреждение нерва может привести к много изменений в нерве морфологических структур, например, изменения в нервных волокон, аксон диаметр и толщину Миелиновые оболочки. Этот метод может сохранить нервные структуры в своей естественной форме, которая облегчает измерение нескольких параметров, таких как отношение диаметра аксона всего волокна диаметром (g коэффициент; Рисунок 4). Целый ряд факторов может привести к менее чем оптимальной периферических нервов разделов, включая наличие трещин (Рисунок 5A) в разделе из-за неправильной обработки нерва. Отверстий может также произойти в разделе (Рисунок 5B) из-за недостаточной обезвоживания. Другой возможной ошибки в процедуре складывание секций (рис. 5 c), которые могут быть устранены с помощью пересевать петли для передачи секции на стеклянное скольжение.

Figure 1
Рисунок 1: хирургия и резании. (A) крыса седалищного нерва во время фиксации в естественных условиях . (B) стекла нож чайник (C) стекла ножи с лодки. (D) Металлических петель, используемый для передачи плыли шлифов из стекла Ножи к падению деионизованной воды на стеклянное скольжение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: схема метода, используемого в настоящем Протоколе. (A) взрослых Sprague Dawley, крыса наркоз, следуют в vivo нерва фиксации (B) и нерва коллекции (C). Следующий шаг — после фиксации с 2% осмия тетраоксид (D) и смолы, встраивание (E). Смола встраиваемых нерва, секции, затем обрезаны (F) и секционного (G) с помощью ultramicrotome. Наконец нерв, что разделы на слайде стекло окрашивали толуидиновый синий (H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: поперечного сечения крыса седалищного нерва, окрашенных с толуидиновый синий. Показывает разделы при различных увеличениях (10 X 20 X, 40 X и 60 X) четкие изображения с оптимальным разрешением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: поперечного сечения крыса седалищного нерва, окрашенных с толуидиновый синий. Это изображения с высоким разрешением (100 X) может использоваться для измерения соотношения аксона диаметром до всего волокна (g коэффициент). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: поперечной разделы крыса седалищного нерва, окрашенных с толуидиновый синий при различных увеличениях. Показано aresome проблемы, которые могут возникнуть при исполнении настоящего Протокола. (A) и (B). Наличие трещин и отверстий внутри секции нерва, вызванные неправильной обработки секции и недостаточным обезвоживанием ткани, соответственно. (C). складывание секций, которые могут произойти во время передачи разделы из стекла Ножи к слайду. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Экзаменов морфологических структур, травмы периферических нервов и регенерации являются частые темы исследования13. В этом протоколе мы описывают шаги для получения высокого качества изображений для количественной гистологических данных с использованием крыса седалищного нерва ткани встроенных блоков смолы и витражи с толуидиновый синий. Эта технология обеспечивает изображение нерва морфологии, в котором регенерацию нерва может быть определена количественно измеряя количество аксонов, степени миелинизации, наличие инфильтративный фиброзных тканей и нервов здоровья. В то время как на снимках секционирование и обработка ранен нервы как образцы, же шаги и материалы применимы к потерпевшим нервы и нервы восстановлены трубопроводы или салфеткой графтов, при условии что фиксации ткани является адекватной в20, 21.

Хотя все шаги протокола имеет важное значение, некоторые из этих шагов скорее приведет к секции низкого качества или изображения. Недостаточная ткани обезвоживание может привести к отверстия в разделах нерва (Рисунок 5B). Одно из возможных объяснений несмешиваемость смолы с водой, и избыток воды в ткани предотвращает смолы от проникновения в ткани. Таким образом позволяя достаточно времени и использования абсолютного ацетон необходима для обеспечения надлежащего обезвоживания шаг. Хотя мы использовали ацетона в этом протоколе, может также использоваться этанола. Однако, много смолы, не реактивной с этанолом, поэтому ткани должны обрабатываться с окись пропилена в качестве перехода между дегидратации этанола и встраивание смолы.

Из-за тонкости секций передачи нерва разделы из стекла нож стекла слайд должно быть сделано с большой осторожностью (рис. 5 c). Разделы 1-2 мкм являются очень хрупкими, и неправильного перевода секции может привести к секции сломать. Если раздел взял в центральной части раздела с помощью иглы, Секция подвержен складывания на себя и часто трудно будет разворачиваться при передаче на слайд. Различные инструменты могут использоваться для передачи Секции стеклянное скольжение, включая иглы и петли, и каждый должен испытываться для определенного пользователя определить, которая даст лучшие передачи результатов. Для наших целей используя цикл, который может охватить весь раздел значительно уменьшена, складывание секций, когда они были переданы от ножа стекло микроскопа (рис. 1 d).

В общем надлежащего обращения нервов имеет важное значение, как сжатие нервов может вызвать трещины в разделах нерва (Рисунок 5A). Сжатия нервных тканей может произойти во время передачи нерв сегментов в процессе экспозиции в животное, фиксации, обезвоживания и встраивание смолы. Чтобы избежать сжатия нервных тканей, нерв сегментов должны быть переданы тонкой щипцы и взял на один конец сегмента идеально только epineurial слой, так что весь нерв не будут затронуты. Наличие трещин и линий (нож знаки) в разделах нерва может также произойти из-за ножи скучно или злоупотребляют стекла. Чтобы гарантировать оптимальное секционирование, мы рекомендуем ножи свежие стекла и изменив нож стекла, которую каждый 25-30 режет, меньше, если секционирование через нерв, заключенная в пределах канала.

Смолы может быть довольно дорогим, являются неадекватными, когда продольных нервных секции требуются и может потребовать дорогие инструменты, такие как ultramicrotome и чайник нож стекла. Несмотря на эти ограничения толуидиновый синий, окрашивание смолы встроенных периферийных нервных секции до сих пор считается золотым стандартом для визуализации сечений периферических нервов морфометрия4,5. Продольных секций может также выявить важные функции периферических нервов, например аксональное преемственность и узлы по Ranvier, но наиболее полезным с иммуногистохимия. В таких случаях, это общая практика дифференциально обрабатывать две секции же нерва один для толуидиновый синий сечений и для продольной иммуногистохимия. Благодаря увеличению случаев травмы периферических нервов и травм и потребности лучше оценить морфологические структуры нерва Этот метод может по-прежнему применяться в качестве важнейшего инструмента для получения гистологические данные повреждения нерва и регенерации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они имеют без конфликта интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы thankthe Дженкинс микроскопии объекта в университете штата Вайоминг за их помощь и бушменов лаборатории, Келли Roballo, Хайден True, Wupu Osimanjiang и членов Субаш Dhunghana, для помощи в ухода за животными. Это издание стало возможным благодаря институционального развития Award (IDeA) от национального института Генеральной медицинских наук национальных институтов здоровья под Грант # 2P20GM103432.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline Gibco 14200-075
Glutaraldehyde Solution Sigma-Aldrich G6257
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich T3260
Sodium Tetraborate Decahydrate Acros Organics 205950010
Isoflurane Piramal NDC 66794-013-25
Epoxy Embedding Medium Kit Sigma-Aldrich 45359
Sodium Hydroxide Solution Sigma-Aldrich 72068 To adjust Trump's fixative pH
Acetone Fisher Chemical 170942
Osmium Tetroxide Solution Sigma-Aldrich 75632
VWR Micro Slides, Superfrost Plus VWR 48311-703
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12545102
Pelco Embedding Cast Fisher Scientific NC9671811
Glass Knife Maker RMC Products GKM-2
Ultramicrotome RMC Products MT-XL
15 mL Conical Tube Falcon ISO 9001
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661
4 mL Glass Vial Sigma-Aldrich 854190
Razor Blades VWR 55411-050 For trimming resin block
Perfect Loop Electron Microscopy Sciences 70944 For picking up thin resin sections
Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm Electron Microscopy Sciences 71012
100 Watt Oven Millipore  6350115
Whatman Filter Paper Sigma-Aldrich WHA10010155
3 mL plastic pipette Sigma-Aldrich Z331740
Micro-surgical Kit World precision instruments
Olympus fluorescence microscope Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us. Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).
  2. Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).
  3. Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair. Annals of Plastic Surgery. 57, (4), 462-471 (2006).
  4. Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation. Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).
  5. Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).
  6. Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach. Histochemistry and Cell Biology. 709-717 (2011).
  7. Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).
  8. Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).
  9. Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).
  10. Dykstra, M. J. A manual of applied techniques for biological electron microscopy. Plenum. New York. 257 (1993).
  11. Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review. Journal of Neurosurgery. 107, (6), 1168-1189 (2007).
  12. Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve. Journal of Cell Science. 3, (69), 99-105 (1964).
  13. Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode. Brain research. 65-77 (2008).
  14. Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques. International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).
  15. Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials. 33, (5), 1363-1375 (2012).
  16. Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists. Clinical Neuropathology. 31, (1), 7-23 (2012).
  17. Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration. Microsurgery. 20, (1), 37-41 (2000).
  18. Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve. Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).
  19. Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections. Journal of Histotechnology. 30, (1), 27-33 (2007).
  20. Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: A literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8, (3), 72-79 (2016).
  21. Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety. Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).
  22. Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28, (5), 79 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics