정 맥 및 양수 내 Utero Murine 모델에 이식

Developmental Biology

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Summary

우리는 murine 모델에 주입의 정 맥 및 양수 내 노선을 통해는 utero에 이식 (IUT)을 수행 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 독특한 면역 관용 태아 환경에 셀, 바이러스 성 벡터, 및 다른 물질을 소개 하는 것이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

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Ahn, N. J., Stratigis, J. D., Coons, B. E., Flake, A. W., Nah-Cederquist, H. D., Peranteau, W. H. Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model. J. Vis. Exp. (140), e58047, doi:10.3791/58047 (2018).

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Abstract

이식 (IUT) utero에서 의 치료는 임신 초기에 줄기 세포, 바이러스 성 벡터, 또는 다른 물질을 소개 하는 데 사용할 수 있는 독특하고 다양 한 모드입니다. 치료 목적 IUT 뒤에 근거는 태아, 태아 면역학 미 숙, 접근성 및 태아 줄기 또는 조상 세포 및 질병을 치료 하는 잠재력의 증식 특성 또는 증상의 작은 크기에 따라 이전에 출생. 필요 없이 낫 세포 질병 등 선 천 성 혈액 질환을 치료 하는 한 IUT 태아, 조 혈 줄기 세포 (HSC) 을 통해 전달의 이러한 정상적인 발달 속성의 활용 myeloablative 또는 출생 후 HSC 이식에 필요한 면역 조절. 마찬가지로, 개발 하는 동안 여러 장기에 조상 세포의 접근성은 잠재적으로 줄기/시 조 세포 유전자 치료 또는 게놈 편집과 바이러스 성 벡터의 IUT 다음의 보다 효율적인 타겟팅에 대 한 수 있습니다. 또한, IUT 포함 하 여, 정상적인 발달 과정을 연구 하는 데 사용 수 있지만, 면 역학적 관용의 개발에 국한 되지 않습니다. Murine 모델 잠재력과 전 임상 큰 동물 연구와 최종 임상 응용 프로그램 전에 IUT의 한계를 이해 하는 데 귀중 한 하 고 저렴 한 방법을 제공 합니다. 여기, 우리는 정 맥 및 양수 내 경로 통해 murine 태아의 한 IUT 수행을 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 명료 하 게 하는 필요 조건 및 조 혈 줄기 세포 이식 utero에서 , 관용 유도, 그리고 유전자 치료 utero에서 뒤에 메커니즘을 성공적으로 사용 되었습니다.

Introduction

태아 검사 및 진단의 최근 발전 태아 선 천 성 장애는 적절 한 산 후 치료 옵션 없고 중요 한 병 적 상태와 사망률의 수에 대 한 치료의 가능성을 빛을 가져왔다. 특히, utero에서 조 혈 줄기 세포 이식 (IUHCT) 및 유전자 치료/게놈 편집가지고 혈액, 면역, 그리고 유전자 치료 선 천 성 태아의 정상적인 발달 속성의 활용 가능성 출생 후 HSC 이식 및 유전자 치료/게놈 편집1,2를 할 수 있는 것 보다 더 효율적으로 장애. 특히, 태아의 작은 크기로 인해 기증자 셀 또는 바이러스 성 벡터 복용량 수 극대화 할 받는 사람의 무게 당. 또한, 태아의 면역학 미 숙 기증자 HSCs 없이 myeloablative 및 면역 조절 주사 하 산 후 이식 프로토콜에 필요한 수 있습니다. 마찬가지로, 치료 transgene 또는 게놈 편집 기술 바이러스 성 벡터는 transgene 제품 또는 바이러스 성 벡터에 대 한 제한 면역 응답 없이 주입 수 있습니다. 마지막으로, 접근성 및 태아 줄기/뿌리 세포의 증식 특성 줄 보다 효율적인 변환 대상 조상 세포의 게놈 편집 (homology 감독 수리)의 자전거 필요로 하는 특정 모드의 가능성 효율적으로 발생 하는 셀. Murine 모델 줄기 세포 생물학과 면역학 큰 전 임상 동물 모델에서 실험 이전에 중요 한 질문을 해결 하는 통찰력과 저렴 한 수단으로 제공 하 고, 따라서, IUHCT 및 utero에서 기본 모델 역임 했다 유전자 치료 탐험된1,2,3되었습니다.

많은 변수는 IUHCT 및 utero에서 유전자 치료/게놈 편집 murine 크고 동물 모델에서의 성공에 중요 한 역할을, 비록 주요 변수 HSCs 또는 바이러스 성 벡터의 납품의 방법입니다. 태아 간, IUHCT의 때에 조 혈 기관에에서 발생 하는 1 차 통과 효과 함께 기증자 HSCs의 큰 복용량의 납품 engraftment 마우스 및 큰 동물 모델4 macrochimeric 수준의 달성에 도움이 될 표시 되었습니다. ,5. 이것 달성을 통해 통해 개 모델에서 내 심장 주입 및 기증자 세포를 통해 마우스 모델에서 vitelline 정 맥 주사 했다. 주입의 경로 또한 개발 하는 동안 다른 장기의 조상 세포를 타겟팅에서 근본적인 역할을 하고있다. 예를 들어 한 정 맥 주사 를 통해 vitelline 정 맥 효율적으로 transduce cardiomyocytes와 늦은 임신 주입6,7다음 hepatocytes에 표시 되었습니다. 또는, 바이러스 성 벡터의 양수 내 주사 주입8시간에 배아 접는/개발에 따라 물리적으로 노출 되는 장기를 대상으로 수 있습니다. 이 최고의 활용 운동의 정상적인 태아 "호흡", 바이러스 성 벡터에는 양수를 호흡기 노출 임신에서 양수 내 주입을 통해 호흡기 상피의 대상으로 궁 행 유체9. IUT, 정 맥을 통해 vitelline 정 맥의 이러한 두 가지 모드와 양수 내, 우리의 실험실에서 여러 과거와 지속적인 실험에 대 한 기초가 되었습니다. 이 프로토콜에서 우리가 자세히 murine 모델에 정 맥 및 양수 내 IUT를 수행 하기 위한 방법을 설명 합니다.

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Protocol

실험 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 필라델피아의 아동 병원에 의해 승인 되었다.

1입니다. 사출 펫의 창조

  1. 수직 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 100 µ L microcapillary 피 펫 (그림 1A -1c)을 당겨. 테이퍼 끝입니다 > 1 ㎝ 길이 micropipette 끌어당기는 보정.
    참고: 처음, 끌어당기는의 설정은 조정 해야 최적의 길이. 높은 열 설정 팁, 더 이상 만들고 높은 풀 설정 팁의 직경을 좁은 만들 것입니다.
  2. ≥ 1 ㎝ 길이 테이퍼 끝을 잘라. 그 바늘의 끝에 내부 직경 70 µ m, 100 µ m 사이 이며 테이퍼 끝의 길이에 반비례 하는 것을 확인 하십시오.
    참고: 내부 직경은 또한 micropipette 끌어당기는의 교정에 따라 다릅니다. 수직 micropipette 끌어당기는 사람 또는 선호 micropipette 끌어당기는 종류의 제조업체에서 지침을 참조 하십시오.
  3. 바늘 올바른 내부 직경은 확인 한 후 다이아몬드 휠 (그림 2A -2 C) 선명 micropipette beveller를 사용 하 여 팁을 연마 하 여 15-20도 빗면을 만듭니다. 부드럽게 하거나 팁을 크래킹의 기회를 감소 하, 너무 많은 압력 없이 바퀴에 팁을 확인 하십시오.
    참고: 그림 붓 바늘 팁에 어떤 파편 든 지 멀리 닦기 위하여 사용할 수 있습니다.
  4. 현미경 아래 팁을 평가 하 고 팁이 칩 또는 균열 없이 라운드 합니다. 70 µ m, 100 µ m (그림 2D -2 H) 사이 되도록 내부 직경을 다시 평가 합니다.
  5. 그들 사이의 볼륨의 5 µ L을 지정 하는 바늘의 나머지 부분에 선을 그릴 (예를 들어, 1.3 m m 내부 직경 바늘 있어야 3.77 m m 증가에서 그린 라인).
  6. 압력솥 바늘 이전에 수술에 사용 하 고 멸 균 장갑과 그들을 처리.

2. utero에서 주사

  1. 준비 필요한 계측 압력가 마로 소독 하 여 그들 미리. Microinjector 바늘 홀더, 수술 바늘 드라이버, 한 쌍 Adson 집게, 곡선된 정규 조직 위, 1 mL 인슐린 주사기, 몇 면 끝 도포, 전송 피 펫, 50 mL 원뿔 튜브의 한 쌍의 필수 악기를 포함 한 고 4-0 polyglactin 910 봉합의 팩입니다.
  2. 무 균 기술을 사용 하 여, 바늘 홀더에 바늘을 부착 하 고는 microinjector에 그것을 연결.
    참고: 사용 하는 압축 된 질소의 설정은 뒤: 4-6 psi를 주입, 0 psi를 균형. 무엇은 주입 되 고, 특히, injectate의 점도 물론 micropipette의 크기에 따라 주입 시간 0.3-사이 다 1.5 s.
  3. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 살 균 1의 5-10 µ L을 다음 밖으로 그것을 선택을 취소 하 여 모든 가능한 파편의 바늘 팁을 청소 합니다. 이 2-3 배를 반복 합니다.
  4. 그들의 인체 깎기로 면도 하 여 수술에 대 한 임신 2-6 개월 여성 쥐를 준비 합니다. 수는 젖꼭지를 손상 하지 않도록 주의 하십시오. 구강 진통제 (예를 들어, 1.5 m g/mL meloxicam 구두 현 탁 액의 마우스 당 100 µ L)를 관리 합니다.
  5. 원하는 볼륨에 원하는 자료 (셀/벡터/약)와 바늘을 작성을 시작 합니다. 바늘을 작성 하는 동안 바늘 팁을 깰 조심 해야.
    참고: 태아 당 주입의 볼륨 특정 실험 설계에 따라 다릅니다. 20 µ L 작품 잘 주입 많은 수의 셀 (, vitelline 정 맥으로 107 셀까지. 예를 들어, 우리는 1 x 107 전체 골 수 세포 C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01에서 격리를 전달 ["B6 녹색 형광 단백질 (GFP)"] 생쥐를 통해 임신 하루 14 Balb/c 태아로 vitelline 정 맥. 바이러스 성 벡터 주사, PBS와 1:1 희석된 벡터의 10 µ L의 단일 주사를 잘 작동합니다.
  6. 사출 시간을 보정 하기 위해 다음 단계를 수행 합니다.
    1. 밀어넣기 모드 단추 주입 보정 화면을 microinjector에 3 배. 10의 간격을 추가 하 여 주입 시간을 조정 하거나 100 ms와 푸시 모드 버튼 2 배.
    2. 균형 버튼 하 고 한 번 발 페달을 밀어. 이제 다시 페달을 밀어 하 고 얼마나 많은 볼륨 푸시 당 바늘에서 비운 평가. 원하는 볼륨 페달 푸시 당 5-20 µ L의 보정 하지, 2.6.1과 2.6.2 단계를 반복 합니다.
      참고: 일반적으로, 그것은 한 번에 제공 하는 반 총 대상 볼륨을 각 푸시를 보정 좋은입니다. 30 µ L의 총 볼륨도 40 µ L를 주입 수 있지만 우리가 일반적으로 가지 마세요 정 맥 또는 양수 내 태아 당 20 µ L 이상.
  7. 원하는 수준까지 바늘을 입력 합니다.
  8. 1 L/min에 산소 유량 계 및 isoflurane 기화 기 3%로 조정 하 여 마우스에 마 취를 제공 시작 합니다.
  9. 마우스 페달 반사의 부재에 대 한 확인 하 여 마 취 여부를 확인 합니다. 부정사 위치에 난방 패드를 마우스를 전송 합니다.
  10. 각 막 건조를 피하기 위해 윤활제 아이 젤을 적용 합니다. 패드에 위와 더 낮은 사지를 찍고 여 장소에서 마우스를 보안 합니다.
  11. 뒤에 알코올 액체 스크럽으로 복 부를 준비 하 고 (예를 들어, 0.25 %bupivacaine 100 µ L) 로컬 마 취를 피하 주사 (그림 3A).
  12. 가 위, 낮은 테두리는 더 치; 1 ㎝ 보다 가까이 1-2 cm 피부 절 개를 하 게 아래 근 막이 매우 얇은 하 고 반투명.
  13. 주변 지역 보다 더 투명 하 게 하는 근 막의 중간을 식별 합니다. 수는 midline의 양쪽에는 상 복 부 혈관을 다치게 하지 않도록 주의 하십시오. 상 복 부 혈관 부상을 얻을, 출혈을 멈추게 하 면 끝 도포와 압력을 개최.
  14. 창 자, 방광, 또는 태아 등 내부 장기의 잡는 없이 근 막 꼬집어 Adson 집게를 사용 하 여. 가 위, 장기의 손상 되지 않도록 주의 되 고 근을 엽니다. 일단 안전 하 게 복 부에 확장 fascial 절 개. 피부 절 개 보다 더 이상 그것을 만들.
  15. 따라서 노출 벗 자 궁 복 부의 위쪽 부분에 내장을 이동 면 끝 도포를 사용 합니다. 절 개, 신중 하 게 식별 하는 모든 태아 (그림 3B) 계산 되도록 오른쪽과 왼쪽 난소에서 자 궁을 제공 합니다.
  16. 에 배치 하 왼쪽된 자 궁 복 부에 다시 오른쪽 자 궁만 노출 됩니다. 이 자 궁의 건조를 방지 하 고 따뜻한 비 주입 태아를 유지 합니다.
  17. 엄지 및 집게 손가락의 운영자의 비 지배적인 손 (그림 3C) 사이 가장 측면 태아/양수 sac를 개최. 항상 하지는 태아에 어떠한 손상으로 부드러운 됩니다.
  18. (10 배 확대 이상적입니다) 해 부 현미경 놓고 태아가 보기에 초점을 조정 합니다. 더 나은 시각화에 대 한 조명을 조정 합니다.
  19. 주입 됩니다 부품 파악 (vitelline 정 맥, amnion). 정 맥 주사, 시각화 vitelline 혈관과 문 합 그들의 처음. 양수 내 주사, 보기에 오른쪽으로 태아를 방향을 정하십시오.
  20. 아래 설명 된 대로 바늘 대상 공간에 도달 합니다.
    1. 정 맥 주입, 다음과 같이 할.
      1. 주입 되는 vitelline 정 맥; 바늘의 팁에 평행 되도록 자 궁을 회전 주사의 두 정 맥 문 합으로 만들 수 있어야 합니다 유의 하십시오.
      2. 5 ° 각도에서 자 궁에 바늘을 자 궁 벽을 관통. 이제는 끝 자 궁 벽과 양수 골목 사이, vitelline 정 맥 위에 직접 팁을 놓습니다.
      3. 거의 탄젠트 각도에 날고 바늘 정 맥 경사 pierces; 혈관으로 이동 될 때까지 이것은 바늘 팁 (그림 3D)에서 혈액의 플래시에 의해 분명 하다입니다.
        참고: 바늘 하지 정 맥을 통해 첫 번째 글라이드와 함께 정 맥을 뚫 수 있습니다 대로 몇 가지 시도 걸릴 수 있습니다 액세스 하는 정 맥.
    2. 양수 내 주입, 다음과 같이 할.
      1. Amniotic sac를 피어스 용기 없는 위치를 찾습니다.
      2. 자 궁 벽에 수직으로 바늘을 가리키고 자 궁, 노 른 자 삭 그리고 amniotic sac 통해 피어스. 조심 하지 어떤 태아 조직을 통해 피어스 합니다. 바늘이 바늘 amniotic sac에 인지 확인 하는 대로 사지 사이 통과 했다 다는 것을 확인 하십시오. 주사와 함께 진행 됩니다.
  21. 발 페달을 추진 하 여 자료 원하는 (보통 10-20 µ L)의 적절 한 볼륨을 주입.
    참고: 인젝터를 통해 바늘 팁의 시각화를 유지 해야 하기 때문에 항상, 두 번째 사람이 현미경 하 주입된 양을 계량 인젝터 얼마나 볼륨 삽입 왼쪽 바늘에 읽어야 합니다. 인젝터와 조 수 사이 주입 전에 토론은 어떤 혼란 및 지연을 방지 하기 위해 중요 합니다. 이 지연된 제거는 바늘의 바늘 및 부정확 한 배치에 결과에 정 맥 혈액의 역류를 허락할 것 때문에 정 맥 주사에 대 한 특히 중요 하다.
  22. 일단 원하는 볼륨 배달 됩니다 바늘 주사 사이트에서 철수. 일부에서 출혈이 있을 수 있으므로 배 사이트 정 맥 주사와 펑크, 압력에 대 한 10-15는 출혈을 멈추게 하는 바늘의 측면.
  23. 다음 태아를 진행 합니다. 바로 자 궁 경적의 모든 태아 주입 되어 때까지 계속 합니다.
  24. 복 부에서 왼쪽된 자 궁 경적을 제거 하 고 복 막 구멍 안으로 바로 자 궁 경적을 바꿉니다.
    참고: 때때로, 바늘은 injectant와 리필을 해야 합니다.
  25. 일단 모든 태아 주입 되어, (그림 3E) 복 부에 자 궁을 교체 합니다. 자 궁 또는 장 volvulus를 피하기 위해 되었는지 확인 합니다.
  26. 처분할 수 있는 이동 피 펫 감수성이 손실을 대체 하 복 부에 약 2 mL 1 x PBS의 장소.
  27. 근 막과 연속 레이어 (그림 3 층 -3g) 폐쇄 하는 동안 기본 장기 부상 방지를 4-0 polyglactin 910 봉합을 사용 하 여 복 부를 닫습니다.
  28. 테이프를 제거 하 고 새 장 열 램프 아래에 마우스를 전송. 수 열 램프 마우스에 너무 가까이 배치 하지 않도록 주의 하십시오. 케이지는 침구, 음식, 그리고 물 다는 것을 확인 하십시오.
    참고: 온도 조절 장치로 통제 따뜻한 챔버 사용할 수도 있습니다. 그것은 직 립 하 고 걷는 때 마우스 깨어입니다.
  29. 마우스를 매일 관찰 하 고 필요에 따라 진통제를 주고.
    참고: 우리가 일상적으로 meloxicam 수술 후 일 1과 2, 그리고 3 일에 경우 줄 마우스 통증의 흔적을 보여줍니다.
  30. 동일한 사출 소재 일괄 처리 수술을 하 고, 살 균 PBS와 주사 바늘을 청소 합니다. 다른 재료와 함께 주입, 바늘은 sharps 용기에 폐기 하 고 새 바늘을 사용 하 여.
    참고: 댐 모유를 통해 새끼를 injectant 및 항 체 면역 반응을 거치 하는 경우에 출생 후 즉시 대리 댐과 새끼를 육성 것이 좋습니다.

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Representative Results

생존과 engraftment IUHCT 실험에 대 한 성공의 중요 한 조치는. 실험의 특정 끝점에 따라 태아는 IUHCT를 받은 수 있습니다 분석 prenatally 제왕 절 개 또는 postnatally. 평균, 정 맥 주사 후 생존 율은 75-100%에서 범위. 양수 내 주사 후 생존 율은 약 85-100%에서 정 맥 주사 보다 더 공정한 경향이 있습니다.

우리 실험실에서이 기술에 숙달을 달성 하기 위해 훈련 과정 약 8-12 개월 걸립니다. 재현할 수 패션에이 주사를 수행 하기 위해 필요한 능력의 인수를 평가, 연수생은 IUT 다음 짧은 시간 점에서 태아 생존 및 기증자 세포 engraftment를 위해 모니터링 된다. 이것은 다음과 같은 품질 관리 실험에 의해 증명 됩니다. 특히, 1 x 107 전체 골 수 세포는 격리 C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 ("B6 GFP") 마우스 이전5 설명 및 임신 하루 14 Balb/c 태아로 vitelline 정 맥 주입 을 통해 있다. 한 그룹에는 IUT 노련한 강사, 그리고 다른 그룹에 의해 수행 되었다 위한 기술 연습 했습니다 누가 연수생 ~ 4 개월. 수확된 태아 간은 IUT 후 24 h의 대표적인 형광 현미경 이미지는 그림 4에 나와 있습니다. 연수생에 의해 IUT 받은 태아의 간은 적게 이식된 GFP 셀의 낮은 engraftment 인해 형광. 이 간은 다음 cytometry engraftment 레벨을 계량 하 여 GFP+ 기증자 세포를 위해 분석 되었다. 형광 현미경 검사 법 (그림 4B)에서 본 이미지와 함께 두 개의 주입기 상호 간의 의미 engraftment 레벨에 차이입니다.

배달 루트를 통해 양수 내 transduce 접촉는 양수 세포를 상피의 변환에 의해 exemplified는 바이러스 성 벡터의 기능 세포 48 h 다음 광고-GFP (한 아 데 노 바이러스 벡터의 양수 내 주사 GFP transgene10운반) (그림 5A5B) 임신 하루-12.5 태아에.

Figure 1
그림 1 . Micropipette 끌어당기는 사람와 유리 피 펫 바늘을 만드는 과정. (A) 유리 피 펫을 탑재 하 고 끌어당기는의 양쪽 끝에 다이얼을 강화 하 여 안전. (B) 확보, 일단 당기 스위치 활성화 열. 표시 된 설정이 열 #1: 985 및 풀: 27. 이 과정에서 안전에 대 한 어두운 덮개 유리 닫힙니다. 그것은 촬영을 위해 열렸다. (C)는 micropipette 구분 됩니다. 하단 부분을 삭제 하 고 단계에 대 한 분리 micropipette의 상단 부분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 . 바늘의 팁 모양 micropipette 연마의 과정. (A)이이 패널 연 삭의 일반적인 설정을 보여줍니다. 광원은 현미경 팁을 시각화 하기 위해 필요 합니다. (BC) 15-20 ° 각도로 micropipette를 탑재합니다. 파편의 (D) A 형성 과정에 걸쳐 예정입니다. 과정의 더 나은 시각화를 팁을 취소 하는 붓을 사용 합니다. (E) A 잘 지상된 바늘 팁 식별 칩 또는 가장자리 없이 4 배 확대 아래 표시 됩니다. (F, GH) 다시 검사를 10 배 확대 아래 지상 바늘의 날카로운 팁 및 팁 주위에 매끄러운 가장자리가 잘 지상된 바늘을 보여줍니다. 다른 각도에서 바늘을 확인 있는지 확인 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 . 개복 술 및 utero에서 이식. (A) 면도, anesthetize, 및 임신 댐 테이프와 그녀의 복 부를 준비. (B)는 개복 술 후 모든 태아의 id에 대 한 복 부 이상으로 자 궁의 전체 전달. (C) 위치 외과 의사의 비 지배적인 검지와 엄지는 세 번째 손가락으로 긴장을 유지 하면서 태아. 태아에 관하여 현미경 바늘의 끝을 식별 합니다. Micropipette 바늘으로 혈액 다시 흐르는의 (D) A 플래시 vitelline 정 맥 cannulation 따라 볼 수 있어야 합니다. (E) 모든 주사의 완료 후에 태아 복 부에 다시 모든 장소. (F)는 4-0 polygalactin 910 봉합을 사용 하 여 단일 레이어 실행 스티치와 복 부를 닫습니다. (G) 복 부 완전히 닫으면 댐 열 램프 아래 복구 하자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 . Vitelline 정 맥 주입 후 기증자 전체 골 단 세포의 engraftment. (A) (연수생)와 engraftment의 정도에 차이, 셀의 누설 형광 현미경 검사 법에서 명확 하 게 표시 됩니다 (강사) 없이. (B) %chimerism 또한 교류 cytometry 분석에 의해 표시 된 동일한 찾는 반영. 각 데이터 요소에서 다른 주입된 태아 간을 나타냅니다. 실험 한 연수생과 한 강사에 의해 수행 되었다. 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 . 태아 태아 광고 GFP의 양수 내 주사 후 48 h에에서 녹색 형광 단백질의 표정 패턴. 각 막 (빨간 화살표)과 피부 광고-GFP E12.5 (E12.5/E14.5)에서 양수 내 주사 후 E14.5에서 GFP 물 (A)이이 패널 표시 합니다. 높은 확대에 태아 (밝은 파란색 상자는 패널에 표시)의 백의 (B) A cryosection 바이러스 성 변환 제한 표면 peridermal 셀 레이어 (빨간색 화살표)을 하지 표 피 (epi)을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이식 utero에서 임신 초기에 진단 될 수 있는 많은 선 천 성 질환에 대 한 잠재적인 치료 이다. IUT는 murine 모델 연구를 태아 환경을 탐구 하 또는 다른 치료와 함께 실험을 수 있습니다. 주입 되 고 타겟이 되 고에 따라 정 맥 또는 양수 내 utero에 이식 원하는 공간으로는 injectant의 안정적인 납품을 제공할 수 있습니다.

특정 장기를 대상으로, 그것은 주입 기술 뿐 아니라 태아의 적절 한 embryological 나이 선택 하는 것이 중요입니다. E14에서 세포의 정 맥 주입은 혈액 틈새 타겟팅 E16에서 양수 내 주입 폐 타겟팅에 이상적입니다 하는 동안 이러한 사용할 수 있는 유일한 옵션 하지 않습니다. 예를 들어 양수 내 주사 수행할 수 있습니다 태아에 대 한 일찍 E8 초음파 안내8. 조직 배달 가능한 E14 전에 E9-E1011에서 심장 내 주사 초음파 유도 이기도합니다. 안전 및 유전자 전송 효율을 조사 하는 실험에 큰 잠재력을 제공 하는 태아의 개발의 다양 한 단계에서 주사를 수행의 타당성 및 발달의 기본적인 질문을 조사 뿐만 아니라 세포 이식 생물학입니다.

또한, 정 맥 및 양수 내 배달 이외에 다른 사이트는 치료 또는 추진 되 고 과학적 질문의 목적에 따라 대상에 대 한 사용할 수 있습니다. utero에 근육 근육 dystrophies12, 척수의 운동 뉴런13, 변환에 대 한 intraspinal 접근에 대 한 유전자 이동에 대 한 접근 사용 되었습니다 그리고 유전자 intracranial 접근 대상에 전송 중앙 신경 조직 질병14. 배달의 각 경로 궁극적으로15조 혈 틈새 대상으로 조 혈 모 세포 이식 utero에 대 한 intrahepatic 및 복 노선 추가 가능한 옵션을 있습니다. 그러나, 정 맥 이식 경로 조 혈 틈새에 기증자 세포의 효율적 추적 및 따라서 결과 없이 안정적인 장기 기증자 세포 engraftment의 전반적으로 높은 수준에 기증자 세포의 큰 주입에 대 한 수 있습니다. 태아 사망률1추가.

줄기 세포 생물학, 발달 면역학 및 면 역학적 관용 유도, 개발 생물학을 공부 하 고 독특한 비보에 접근을 허용 하는 강력 하 고 다재 다능 한 도구는 수행 IUT 우리 위에 상세한 프로토콜 및 태아 유전자 치료/게놈 편집입니다. 또한 이러한 전달 방법 관련 임상 의미 있고 송곳 니 등 양 모델4,16큰 전 임상 동물 모델에서 IUHCT 및 utero에서 유전자 치료의 연구에 대 한 기초 되었습니다. 개발 생물학에서 새로운 아이디어를 테스트 하 고 치명적인 선 천 성 유전, 혈액, 면역, 그리고 신진 대사 장애에 대 한 새로운 치료법을 탐구 하는 유용한 도구 역할을 계속 됩니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gloves Cardinal Health 2D73DP65
Adson Forceps w/ teeth Fine Science Tools 11027-12
Adson Forceps w/o teeth Fine Science Tools 11006-12
Curved scissors Fine Science Tools 14075-11
Heavy Scissors Fine Science Tools 14002-13
Needle Driver Fine Science Tools 12005-15
Vicryl 2.0 Ethicon JB945
Transfer Pipette Medline GSI135010
Cotton Tipped Applicators Medline MDS202000
50 mL Conical tube Fischer Scientific 14-432-22
Tape 3M 1527-1
Eye lubricant Major LubriFresh 0904-6488
Heating Pad K&H 3060
Stereomicroscope Leica MZ16
Injector Narishige HI01PK01
Glass Capillary tubes Kimble 71900-100
Vertical Micropipette Puller Sutter Instruments P-30
Microelectrode Beveler Sutter Instruments BV-10
IM-300 Pneumatic Microinjector Narishige IM-300
Insulin Syringe  BD  305935
Filter Genesee Scientific 25-244
Compac5 Anesthesia Machine VetEquip Compac5 901812 
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 66794-017-25
N2 gas Airgas NI 125
O2 gas Airgas OX 125
Ad-GFP viral vector Penn Vector Core H5'.040.CMV.eGFP

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References

  1. Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
  2. Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
  3. Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126, (10), 1245-1254 (2015).
  4. Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124, (12), 1987-1995 (2014).
  5. Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108, (13), 4268-4274 (2006).
  6. Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101, (4), 1359-1366 (2003).
  7. Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 1, 14040 (2014).
  8. Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15, (3), 579-587 (2007).
  9. Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, (6), 991-999 (2016).
  10. Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
  11. Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18, (7), 719-726 (2011).
  12. Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15, (7), 531-536 (2008).
  13. Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
  14. Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).
  15. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).
  16. Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19, (2), 201-209 (2011).

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