Intraveneuze en Intra-vruchtwater In Utero transplantatie in het lymfkliertest Model

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van een transplantatie in utero (IUT) via intraveneuze en intra-vruchtwater routes van injectie in het lymfkliertest model. Dit protocol kan worden gebruikt om cellen, virale vectoren en andere stoffen in het unieke immuun-tolerante foetale milieu.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ahn, N. J., Stratigis, J. D., Coons, B. E., Flake, A. W., Nah-Cederquist, H. D., Peranteau, W. H. Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model. J. Vis. Exp. (140), e58047, doi:10.3791/58047 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In utero transplantatie (IUT) is een unieke en veelzijdige vorm van therapie die kan worden gebruikt om stamcellen, virale vectoren of andere stoffen in het begin van de dracht. De grondgedachte achter IUT voor therapeutische doeleinden is gebaseerd op de geringe omvang van de foetus, de foetale immunologische onvolwassenheid, de toegankelijkheid en proliferatieve aard van de foetale cellen van de stam of voorlopercellen, en het potentieel voor de behandeling van een ziekte of het begin van de symptomen voorafgaand aan de geboorte. Profiteren van deze normale developmental eigenschappen van de foetus, de levering van hematopoietische stamcellen (HSC) via een IUT heeft het potentieel voor de behandeling van aangeboren hematologic aandoeningen zoals sikkelcelziekte, zonder de vereiste myeloablative of immunosuppressieve conditionering vereist voor postnatale HSC-transplantatie. Ook voorziet de toegankelijkheid van voorlopercellen van meerdere organen tijdens de ontwikkeling mogelijk efficiënter richten van stam/voorlopercellen na een IUT van virale vectoren voor gentherapie of het bewerken van het genoom. Daarnaast, kan IUT worden gebruikt bij het bestuderen van normale ontwikkelings processen, met inbegrip van, maar niet beperkt tot, de ontwikkeling van immunologische tolerantie. Het lymfkliertest model levert een waardevolle en betaalbare methode om inzicht in de mogelijkheden en beperkingen van de IUT voorafgaand aan pre-klinische grote dierlijke studies en een uiteindelijke klinische toepassing. Hier beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van een IUT in het lymfkliertest foetus via intraveneuze en intra-vruchtwater routes. Dit protocol heeft met succes gebruikt om het verhelderen van de noodzakelijke voorwaarden en mechanismen achter in utero hematopoietische stamceltransplantatie, inductie van de tolerantie en in utero gentherapie.

Introduction

Recente vooruitgang in de prenatale screening en diagnose hebben gebracht aan het licht van de mogelijkheid om de foetus voor een aantal aangeboren aandoeningen die niet beschikt over voldoende postnatale behandelingsopties en leiden tot significante morbiditeit en mortaliteit te behandelen. In het bijzonder hebben in utero hematopoietische stamceltransplantatie (IUHCT) en bewerken van gen-therapie/genoom het potentieel om te profiteren van normale developmental eigenschappen van de foetus te behandelen aangeboren hematologic, immuun en genetische stoornissen efficiënter dan postnatale HSC-transplantatie en bewerken van gen-therapie/genoom1,2 doen kunnen. In het bijzonder als gevolg van de geringe omvang van de foetus, kan de donor cel of virale vector dosis worden gemaximaliseerd per het gewicht van de ontvanger. Bovendien kunt het immunologische onvolgroeidheid van de foetus donor HSCs te worden geïnjecteerd zonder de myeloablative en immunosuppressieve conditionering die is vereist in de postnatale transplantatie protocollen. Ook kunnen virale vectoren met een therapeutische transgenic of genoom bewerken technologie worden geïnjecteerd zonder een beperkende immune reactie op het transgenic product of de virale vector. Tot slot, de toegankelijkheid en proliferatieve aard van foetale stamcellen/voorlopercellen de mogelijkheid van een meer efficiënte transductie van voorlopercellen van het doel, evenals bepaalde vervoerswijzen genoom bewerken (homologie geleide reparatie) waarvoor fietsen cellen efficiënt optreden. De lymfkliertest model fungeert als een inzichtelijke en betaalbare manier inspelen op belangrijke vragen in stamcelbiologie en immunologie voorafgaand aan experimenteren in pre-klinische grote diermodellen en als zodanig heeft gediend als de primaire model waarin IUHCT en in de baarmoeder gentherapie geweest onderzocht1,2,3.

Hoewel veel variabelen een belangrijke rol in het succes van de IUHCT en in utero gene therapie/genoom bewerken in lymfkliertest en grote diermodellen spelen, is een belangrijke variabele de methode van levering van het HSCs of virale vector. De levering van grote doses van donor HSCs met een first-pass-effect optreedt in de foetale lever, het hematopoietische orgaan ten tijde van de IUHCT, is aangetoond dat bijdragen aan het bereiken van engraftment in muizen en grote diermodellen4 macrochimeric ,5. Dit werd bereikt via een injectie van donor cellen via de vitelline ader in de muismodel en via een intra cardiale injectie in het canine model. De route van injectie speelt ook een fundamentele rol in doelgerichtheid voorlopercellen van verschillende organen tijdens de ontwikkeling. Bijvoorbeeld, een intraveneuze injectie via de vitelline ader heeft aangetoond dat efficiënt transduce cardiomyocytes en hepatocyten na een late zwangerschap injectie6,7. U kunt ook kunt een intra-vruchtwater injectie van virale vectoren de doelgerichtheid van organen die fysiek zijn blootgesteld op basis van de embryonale vouwen/ontwikkeling ten tijde van de injectie-8. Dit is best geïllustreerd door de doelgerichtheid van het respiratoire epitheel via een intra-vruchtwater injectie laat in de dracht om te profiteren van normale foetale "ademen" bewegingen, die de luchtwegen naar de virale vector in het vruchtwater bloot vloeibare9. Deze twee modi van IUT, intraveneuze via de vitelline ader en intra-vruchtwater, zijn de basis voor meerdere afgelopen en lopende experimenten in ons laboratorium. In dit protocol beschrijven we in detail de methoden voor het uitvoeren van intraveneuze en intra-vruchtwater IUT in het lymfkliertest model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De experimentele protocollen werden goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij The Children's Hospital of Philadelphia.

1. verwezenlijking van injectie pipetten

  1. Met behulp van een verticale micropipet trekker, trek Pipetteer 100 µL microcapillary (figuur 1A - 1 C). Kalibreer de trekker van de micropipet zodat de taps toelopende einde > 1 cm lang.
    Opmerking: In eerste instantie, de instellingen van de trekker moeten worden aangepast voor een optimale lengte. Een hogere warmte-instelling zal de tip langer, en een hogere pull-instelling zal de diameter van het uiteinde smaller te maken.
  2. Snijd de taps toelopende einde zodat er ≥ 1 cm lang. Ervoor zorgen dat de interne diameter aan het uiteinde van de naald tussen 70 µm en 100 µm is en dat het is omgekeerd evenredig met de lengte van het tapse einde.
    Opmerking: De interne diameter hangt ook de kalibratie van de trekker van de micropipet. Raadpleeg de instructies van de fabrikant van de trekker van de verticale micropipet of een voorkeur micropipet trekker type.
  3. Als u zeker bent dat de naald de juiste binnendiameter heeft, maken de schuine kant van 15-20 graden verscherping van het uiteinde met behulp van een micropipet beveller met een diamant slijpen wiel (figuur 2A - 2 C). Zorg ervoor dat het puntje voorzichtig op het wiel zonder teveel druk te verlagen van de kans op breken of barsten van het uiteinde rusten.
    Opmerking: Een verfkwast kan worden gebruikt om te vegen weg puin dat op de punt van de naald opbouwt.
  4. Evalueren van de tip onder een microscoop en ervoor zorgen dat het uiteinde ronde zonder chips of scheuren. De inwendige diameter om ervoor te zorgen dat er tussen 70 µm en 100 µm (figuur 2D - 2 H) opnieuw te beoordelen.
  5. Lijnen tekenen in de rest van de naald te wijzen 5 µL van volume tussen hen (bijvoorbeeldnaalden met een inwendige diameter van 1.3 mm moeten lijnen getrokken op 3,77 mm stappen).
  6. Autoclaaf voorafgaande naalden te gebruiken in de chirurgie en hen behandelen met steriele handschoenen.

2. in utero injecties

  1. Voorbereiding van de noodzakelijke instrumenten in autoclaaf hen tevoren. Omvatten essentiële instrumenten zoals microinjector naald houder, een chirurgische naald driver, een paar Adson pincet, een paar gebogen regelmatige weefsel schaar met een insuline spuit van 1 mL, een paar van katoen-tip applicator, een transfer pipette, een conische buis van 50 mL, en een Pack van 4-0 polyglactin 910 hechtingen.
  2. Met behulp van een steriele techniek, hechten de naald aan de houder van de naald en steek de stekker in de microinjector.
    Opmerking: De instellingen van de gecomprimeerde stikstof die gebruikt zijn als volgt: 4-6 psi injecteren, balans 0 psi. Afhankelijk van wat wordt wordt geïnjecteerd, in het bijzonder de viscositeit van het injectate, evenals de grootte van de micropipet, de injectie-tijden variëren tussen 0,3 - 1,5 s.
  3. Reinig de naald Tip van elke mogelijke puin door opstelling van 5-10 µL van steriele 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en vervolgens het selectievakje uit. Herhaal dit 2-3 x.
  4. Zwangere 2 - tot 6-maand-oude vrouwelijke muizen voorbereiden door chirurgie door scheren hun buikjes met een clipper. Wees voorzichtig niet te beschadigen de tepels. Orale pijn medicatie (bijvoorbeeld, 100 µL van 1,5 mg/mL meloxicam orale suspensie per muis) beheren.
  5. Beginnen met het vullen van de naald met het gewenste materiaal (cellen/vector/drugs) bij het gewenste volume. Wees voorzichtig niet te breken de naald tip tijdens het vullen van de naald.
    Opmerking: Het volume van de injectie per foetus varieert afhankelijk van de specifieke proefopzet. 20 µL werken goed voor het injecteren van een groot aantal cellen (dat wil zeggen, tot 107 cellen in de vitelline ader. Bijvoorbeeld, we verlost 1 x 107 hele beenmergcellen geïsoleerd van C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 ["B6 Green Fluorescent Protein (GFP)"] muizen via de vitelline ader in zwangerschapsduur dag-14 Balb/c foetussen. Voor virale vector injecties, een enkele injectie van 10 µL van een 1:1 verdunde vector met PBS werkt goed.
  6. Als u wilt kalibreren de injectie tijd, door de volgende stappen te ondernemen.
    1. Druk op de Mode knop 3 x op de microinjector om naar de injectie calibratie scherm. De injectie tijd aanpassen door het toevoegen van intervallen van 10 of 100 ms en druk op de Mode knop 2 x.
    2. Druk op de knop saldo en druk op het voetpedaal eens. Nu druk op de pedaal opnieuw en beoordelen hoeveel volume wordt geleegd uit de naald per push. Indien niet gekalibreerd om het gewenste volume van 5-20 µL per pedaal push, herhaal stap 2.6.1 en 2.6.2.
      Opmerking: In het algemeen, het is goed om te kalibreren van iedere push te leveren van de helft van het totale doelvolume tegelijk. Hoewel het mogelijk is te injecteren µL van meer dan 30 of zelfs 40 µL van het totale volume, gaan wij niet in het algemeen over 20 µL per foetus, intraveneus of intra-vruchtwater.
  7. Vul de naald tot het gewenste niveau.
  8. Start anesthesie te leveren aan de muis door aanpassing van de zuurstof debietmeter aan 1 L/min en de Isofluraan vaporizer tot 3%.
  9. Controleer of de muis door te controleren op de afwezigheid van de pedaal reflex is verdoofd. De muis overbrengen in een verwarming pad in een liggende positie.
  10. Glijmiddel eye gel Voorkom hoornvlies opdroging van toepassing. Beveilig de muis in plaats door de bovenste en onderste ledematen naar de pad vast te binden.
  11. Voorbereiding van de buik met chloorhexidine scrub gevolgd door alcohol en een plaatselijke verdoving (bijvoorbeeld, 100 µL van 0,25% bupivacaine) subcutaan injecteren (Figuur 3A).
  12. Met een schaar, een 1-2 cm huid incisie te maken zodat de onderrand niet dichter dan 1 cm bij het Introïtus is; de fascia onder is zeer dun en doorzichtig.
  13. Het identificeren van de middellijn van de fascia die transparanter dan de omgeving. Wees voorzichtig niet te verwonden de epigastrische vaartuigen die aan weerszijden van de middellijn liggen. Moeten de epigastrische schepen gewond raken, houd druk met katoen-tip applicator om te stoppen met het bloeden.
  14. Met behulp van Adson knijpen pincet, de fascia zonder grijpen een van de onderliggende organen zoals de darmen, blaas of foetussen. Open de fascia met een schaar, voorzichtig om niet te beschadigen een van de organen. Eenmaal veilig in de buik, verlengen de fasciaal incisie. Het niet langer maken dan de huid incisie.
  15. Katoen-tip applicator Hiermee kunt de darmen in het bovenste gedeelte van de buik, dus bloot de gravid baarmoeder. Leveren de baarmoeder uit de incisie, zorgvuldig het identificeren van de rechter en linker eierstok om ervoor te zorgen dat alle foetussen worden geteld (Figuur 3B).
  16. Plaats de linker baarmoeder terug in de buik, zodat alleen de juiste baarmoeder is blootgesteld; Dit verhindert de uitdroging van de baarmoeder en de niet-ingespoten foetussen warm houdt.
  17. Houd de meest laterale foetus/vruchtwater sac tussen duim en wijsvinger van de exploitant van de niet-dominante hand (Figuur 3C). Wees altijd zacht over geen schade kan aanrichten aan de foetussen.
  18. Plaats de dissectie Microscoop (een 10 X vergroting is ideaal) en de focus aanpassen, zodat de foetus in de weergave is. Aanpassen van de belichting voor een betere visualisatie.
  19. Identificeren van het gedeelte dat zal worden geïnjecteerd (vitelline ader, amnion). Visualiseer eerst zowel de vitelline aderen en hun wapendrager voor intraveneuze injecties. Voor intra-vruchtwater injecties, de foetus met rechts in beeld te oriënteren.
  20. Het bereiken van de doel-ruimte met de naald zoals hieronder beschreven.
    1. Ga als volgt te werk voor een intraveneuze injectie.
      1. Draaien van de baarmoeder, zodat de vitelline ader die wordt geïnjecteerd parallel aan het uiteinde van de naald is; Houd in gedachten dat de injecties moeten worden geboekt bij de anastomose van de twee aders.
      2. Leg de naald op de baarmoeder onder een hoek van 5° en doorboren van de baarmoederwand. Nu dat de tip tussen de baarmoederwand en het vruchtwater sac is, plaatst u de tip direct bovenop de vitelline ader.
      3. In een hoek van bijna tangentiële, glijden u de naald over de ader totdat de schuine kant doorboort en vooruitgang in het vaartuig; Dit is duidelijk door een flits van bloed gezien in het uiteinde van de naald (Figuur 3D).
        Opmerking: Toegang tot de ader kan duren een paar pogingen als de naald niet de ader met de eerste glijden over de ader doorboren kan.
    2. Ga als volgt te werk voor een intra-vruchtwater injectie.
      1. Draaien van het vruchtwater sac en vinden van een locatie verstoken van vaartuigen te doorboren.
      2. Wijs de naald loodrecht op de baarmoederwand en doorboren via de baarmoeder, de dooierzak, waarna het vruchtwater sac. Wees voorzichtig niet te doorboren via een foetaal weefsel. Zorg ervoor dat de naald is verstreken tussen de ledematen zoals dit bevestigt dat de naald in het vruchtwater sac. Ga vervolgens verder met de injectie.
  21. Injecteer de juiste volume van het materiaal gewenst (gewoonlijk 10-20 µL) door het indrukken van het voetpedaal.
    Opmerking: Omdat de injector de visualisatie van de naald tip via handhaven moet moet de Microscoop op alle tijden, een tweede persoon lezen de noteringen op de naald te kwantificeren van de ingespoten hoeveelheid en de injector te informeren hoeveel volume er overblijft om te injecteren. Een discussie voorafgaand aan de injectie tussen de injector en assistent is belangrijk om te voorkomen dat eventuele verwarring en vertraging. Dit is vooral belangrijk voor intraveneuze injecties omdat een vertraagde wegruiming van de naald een terugvoer van veneuze bloed zal toestaan in de naald en het resultaat in een onjuiste doseren.
  22. Trekken de naald uit de injectieplaats zodra het gewenste volume wordt geleverd. Omdat er mogelijk enkele bloeden uit het schip doorprikken site met intraveneuze injecties, druk te houden met de kant van de naald voor 10-15 s om te stoppen met het bloeden.
  23. Ga verder met de volgende foetus. Ga door totdat alle foetussen van de juiste uteriene hoorn zijn ingespoten.
  24. Verwijder van de linker uteriene hoorn uit de buik en vervang de rechts uteriene hoorn terug in de peritoneale holte.
    Opmerking: Soms de naald moet worden nagevuld met de injectant.
  25. Zodra alle foetussen zijn ingespoten, vervangen de baarmoeder in de buik (Figuur 3E). Zorg ervoor om te voorkomen dat een baarmoeder of intestinale volvulus.
  26. Pipetteer wegwerp overdracht ongeveer 2 mL 1 x PBS in de buik ter vervanging van eventuele gevoelloos verliezen te plaatsen.
  27. Sluit de fascia en de buik in een continue laag met 4-0 polyglactin 910 hechtingen te voorkomen verwonden van de onderliggende organen tijdens de sluiting (figuur 3F - 3 G).
  28. Verwijder de tape en de muis overbrengen in een kooi onder een warmte lamp. Wees voorzichtig niet om de warmte lamp te dicht aan de muis. Zorg ervoor dat de kooi beddengoed, voedsel en water.
    Opmerking: Een thermostatisch gecontroleerde warme kamer kan ook worden gebruikt. De muis is wakker wanneer het rechtop en wandelen.
  29. Dagelijks observeren van de muis en pijn medicatie geven indien nodig.
    Opmerking: We routinematig geven meloxicam op postoperatieve dag 1 en 2 en soms op dag 3 als de muis tekenen van pijn toont.
  30. Als het doen van een batch operatie met hetzelfde materiaal injectie, schoon uit de naald van de injectie met steriel PBS. Als injecteren met een ander materiaal, vervreemden van de naald in een slijpsel container en gebruikt een nieuwe naald.
    Opmerking: We raden aan de pups met surrogaatmoeders direct na de geboorte te bevorderen, in het geval dat de dam zet een immune reactie op de antilichamen van het injectant en transfers naar de pups via de moedermelk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overleving en engraftment zijn belangrijke maatstaf voor succes voor IUHCT experimenten. Afhankelijk van de specifieke eindpunten van een experiment, kunnen foetussen die een IUHCT ontvangen geïnduceerd door een C-section of postnatale stadium manifesteren worden geanalyseerd. Gemiddeld, variëren de overlevingskans van de patiënt na intraveneuze injecties van 75-100%. De overlevingskans van de patiënt na intra-vruchtwater injecties neiging om eerlijk beter dan intraveneuze injecties, op ongeveer 85-100%.

In ons laboratorium duurt het opleidingsproces te bereiken van vaardigheid in deze technieken ongeveer 8-12 maanden. Om te beoordelen van de verwerving van vaardigheden die zijn vereist voor het uitvoeren van deze injecties op een reproduceerbare wijze, worden op foetale overleving en donor cel engraftment op korte tijd punten na de IUT stagiairs gecontroleerd. Dit is aangetoond door de volgende kwaliteitscontrole-experimenten. Specifiek, 1 x 107 hele beenmergcellen zijn geïsoleerd uit C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 ("B6 GFP") muizen zoals eerder beschreven5 en zijn ingespoten via de vitelline ader in zwangerschapsduur dag-14 Balb/c foetussen. In één groep, de IUT werd uitgevoerd door een ervaren instructeur, en in de andere groep door een stagiair die heeft geoefend met de techniek voor ~ 4 maanden. Representatieve fluorescent microscopie beelden van de geoogste foetale levers 24u na de IUT worden weergegeven in Figuur 4A. De lever van de foetussen die de IUT door de stagiair ontvangen lichten minder als gevolg van een lagere engraftment van de getransplanteerde GFP-cellen. Deze levers waren het vervolgens geanalyseerd voor GFP+ donor cellen door stroom cytometry te kwantificeren van de niveaus van de engraftment. Het verschil in gemiddelde engraftment niveaus tussen de twee injectoren correlaten met de beelden gezien onder fluorescent microscopie (Figuur 4B).

Het vermogen van virale vectoren geleverd via de intra-vruchtwater route naar de transduce cellen in contact met het vruchtwater wordt geïllustreerd door de transductie van epitheliale cellen 48u na een intra-vruchtwater injectie van Ad-GFP (een adenovirus vector uitvoering GFP transgenic10) in zwangerschapsduur dag-12,5 foetussen (figuur 5A en 5B).

Figure 1
Figuur 1 . Het proces van het maken van een glazen pipet naald met de trekker micropipet. (A) monteren van de glazen pipet en veilige it-door aanscherping van de wijzerplaten aan beide kanten van de trekker. (B) zodra beveiligd, de trekken schakelaar activeert de hitte. De instellingen die worden weergegeven zijn warmte #1: 985 en Pull: 27. De donkere glazen cover moet worden gesloten tijdens dit proces voor de veiligheid. Het is geopend voor fotoshoot doeleinden. (C) de micropipet wordt gescheiden. Negeren van het onderste gedeelte en het bovenste gedeelte van de gescheiden micropipet voor de volgende stappen te nemen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Het proces van het slijpen van de micropipet om het topje van de naald vorm te geven. (A) dit paneel toont de algemene opzet van het slijpen. Een lichtbron is nodig om te visualiseren van de tip onder de Microscoop. (B en C) Monteer de micropipet onder een hoek van 15-20 °. (D) een ophoping van puin wordt verwacht tijdens het slijpen proces. Gebruik een verfkwast om te wissen de tip om een betere visualisatie van het maalprocédé. (E) A goed gemalen naald tip zonder enige identificeerbare chips of rafelige randen wordt weergegeven onder een 4 X vergroting. (F, Gen H) Een nieuwe inspectie van de naald van de grond onder een 10 X vergroting geeft een goed gemalen naald met een scherpe uiteinde en gladde randen rond de tip. Zorg ervoor om de naald onder verschillende hoeken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . Laparotomie en in utero transplantatie. (A) de scheerbeurt, anesthetize, en een zwangere dam tape en prep haar buik. (B) na de laparotomie, leveren het geheel van de baarmoeder buiten de buik voor een identificatie van alle foetussen. (C) positie de foetus met de surgeon's niet-dominante wijsvinger en duim met behoud van spanning met de derde vinger. De tip van de naald onder de microscoop met betrekking tot de foetus te identificeren. (D) een flitser van bloed terug-stromen in de naald van de micropipet moet worden gezien op de cannulation van de vitelline ader. (E) na een voltooiing van alle injecties, alle de foetussen terug in de buik te plaatsen. (F) sluiten de buik met een enkellaags running stitch met 4-0 polygalactin 910 hechtingen. (G) nadat de buik is volledig gesloten, laat de dam herstellen onder een warmte lamp. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . Engraftment van de donor hele beenmerg mononucleaire cellen na een injectie vitelline ader. (A) het verschil in de mate van engraftment met (stagiair) en zonder (instructeur) de lekkage van cellen duidelijk is aangegeven onder fluorescent microscopie. (B) percentage chimerism ook weerspiegeld de dezelfde bevinding blijkt uit de stroom cytometry analyse. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt de lever van een verschillende ingespoten foetus. Het experiment werd uitgevoerd door een stagiair en een instructeur. De foutbalken vertegenwoordigen een standaarddeviatie (SD). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 . Het expressiepatroon van groen fluorescent proteïne in een foetale embryo 48u na een intra-vruchtwater injectie van Ad-GFP. (A) dit paneel toont het hoornvlies (rode pijl) en de huid gekleurd met GFP op E14.5 na een intra-vruchtwater injectie van Ad-GFP bij E12.5 (E12.5/E14.5). (B) een cryosection aan de achterzijde van het embryo (aangegeven met een blauw lichtbak in deelvenster A) bij een hogere vergroting toont aan dat de virale transductie beperkt tot de oppervlakkige peridermal cellaag (rode pijlen) en niet de opperhuid (epi). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In utero transplantatie is een mogelijke therapie voor vele aangeboren stoornissen die vroeg in de zwangerschap kan worden gediagnosticeerd. De lymfkliertest model voor IUT kunnen onderzoekers om de foetale omgeving te verkennen of om te experimenteren met verschillende therapieën. Afhankelijk van wat wordt geïnjecteerd en wat wordt gericht, kan intraveneus of intra-vruchtwater in utero transplantatie zorgen voor een betrouwbare levering van een injectant in de gewenste ruimte.

Bij het uitstippelen van bepaalde organen, is het belangrijk om te kiezen van de juiste embryologische leeftijd van de foetus, alsmede de injectietechniek. Hoewel de intraveneuze injectie van cellen bij E14 ideaal is voor de hematologic niche targeting, en de intra-vruchtwater injectie op E16 ideaal voor het targeten van Long is, zijn dit niet de enige beschikbare opties. Bijvoorbeeld, kunnen intra-vruchtwater injecties worden uitgevoerd voor foetussen zo spoedig E8 met echografie begeleiding8. Systemische levering is ook mogelijk voor E14 met echografie-geleide intra cardiale injecties bij E9 - E1011. De haalbaarheid van het uitvoeren van injecties in verschillende stadia van ontwikkeling van de foetus biedt grote mogelijkheden voor experimenten onderzoek naar de veiligheid en efficiëntie van de overdracht van het gen en de cel transplantaties en onderzoeken basisvragen van ontwikkelingsstoornissen biologie.

Bovendien, naast een intraveneuze en intra-vruchtwater levering, andere sites zijn ook beschikbaar voor targeting afhankelijk van het doel van de therapie of de wetenschappelijke vraag wordt nagestreefd. De in utero intramusculaire aanpak is gebruikt voor de genenoverdracht van een voor muscular dystrophie12, een intraspinal aanpak van de transductie van ruggenmerg motorische neuronen13, en een intracraniële aanpak voor gene transfers naar doel centrale zenuwstelsel ziekten14. Voor in utero hematopoietische cel transplantatie zijn Intrahepatische en intraperitoneaal routes extra haalbare opties zoals elke route van levering uiteindelijk richt zich op de hematopoietische niche-15. Echter, de intraveneuze transplantatie-route zorgt voor een efficiëntere homing van de donor cellen in de hematopoietische niche en een grotere dosering van de donor cellen, waardoor in het algemeen hogere niveaus van stabiel op lange termijn donor cel engraftment zonder foetale sterfte1toegevoegd.

De protocollen die wij hebben hierboven is uiteengezet voor het uitvoeren van de IUT zijn krachtige en veelzijdige tools waarmee voor een unieke in-vivo benadering tot het bestuderen van de stamcelbiologie, developmental immunologie en immunologische tolerantie inductie, ontwikkelingsbiologie, en prenatale genetische therapie/genoom bewerken. Deze methoden voor het afleveren ook relevante klinische gevolgen hebben en zijn de basis voor studies van IUHCT en in utero gentherapie in pre-klinische grote dierlijke modellen zoals de Honds en de schapen model4,16. Zij zullen blijven om te dienen als een waardevol instrument voor het testen van nieuwe ideeën in Ontwikkelingsbiologie en verkennen van nieuwe therapieën voor verwoestende aangeboren genetische, hematologic, immuun en metabole aandoeningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gloves Cardinal Health 2D73DP65
Adson Forceps w/ teeth Fine Science Tools 11027-12
Adson Forceps w/o teeth Fine Science Tools 11006-12
Curved scissors Fine Science Tools 14075-11
Heavy Scissors Fine Science Tools 14002-13
Needle Driver Fine Science Tools 12005-15
Vicryl 2.0 Ethicon JB945
Transfer Pipette Medline GSI135010
Cotton Tipped Applicators Medline MDS202000
50 mL Conical tube Fischer Scientific 14-432-22
Tape 3M 1527-1
Eye lubricant Major LubriFresh 0904-6488
Heating Pad K&H 3060
Stereomicroscope Leica MZ16
Injector Narishige HI01PK01
Glass Capillary tubes Kimble 71900-100
Vertical Micropipette Puller Sutter Instruments P-30
Microelectrode Beveler Sutter Instruments BV-10
IM-300 Pneumatic Microinjector Narishige IM-300
Insulin Syringe  BD  305935
Filter Genesee Scientific 25-244
Compac5 Anesthesia Machine VetEquip Compac5 901812 
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 66794-017-25
N2 gas Airgas NI 125
O2 gas Airgas OX 125
Ad-GFP viral vector Penn Vector Core H5'.040.CMV.eGFP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
  2. Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
  3. Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126, (10), 1245-1254 (2015).
  4. Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124, (12), 1987-1995 (2014).
  5. Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108, (13), 4268-4274 (2006).
  6. Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101, (4), 1359-1366 (2003).
  7. Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 1, 14040 (2014).
  8. Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15, (3), 579-587 (2007).
  9. Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, (6), 991-999 (2016).
  10. Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
  11. Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18, (7), 719-726 (2011).
  12. Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15, (7), 531-536 (2008).
  13. Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
  14. Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).
  15. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).
  16. Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19, (2), 201-209 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics