Intravenøs og Intra-amniotic In Utero transplantasjon i Murine modellen

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver en protokoll for å utføre en i utero transplantasjon (IUT) gjennom intravenøs og intra-amniotic ruter av injeksjon i murine modellen. Denne protokollen kan brukes å innføre celler, viral vektorer og andre stoffer i unike immun-tolerant fosterets miljøet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ahn, N. J., Stratigis, J. D., Coons, B. E., Flake, A. W., Nah-Cederquist, H. D., Peranteau, W. H. Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model. J. Vis. Exp. (140), e58047, doi:10.3791/58047 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In utero transplantasjon (IUT) er en unik og allsidig modus av å innføre stamceller, viral vektorer eller noen andre stoffer tidlig i av svangerskapet. Begrunnelsen bak IUT for terapeutiske formål er basert på den lille størrelsen på fosteret, fosterets immunologic umodenhet, tilgjengelighet og proliferativ natur fosterets stammen eller stamfar celler og potensial til å behandle en sykdom eller utbruddet av symptomene før fødselen. Utnytter normal utviklingsmessige egenskapene av fosteret, levering av blodkreft stamceller (HSC) via en IUT har potensial til å behandle medfødt hematologic sykdommer som sigdcelleanemi, uten de nødvendige myeloablative eller suppressive condition kreves for postnatal HSC transplants. Tilsvarende gir tilgjengelighet av progenitor celler i flere organer under utvikling potensielt en mer effektiv målretting av stammen/stamfar celler etter en IUT viral vektorer for genterapi eller genomet redigering. I tillegg kan IUT bli brukt til å studere normal utviklingsprosesser inkludert, men ikke begrenset til, utviklingen av immunologiske toleranse. Murine modellen gir en verdifull og rimelig måte å forstå muligheter og begrensninger på IUT før pre-klinisk store dyrestudier og en eventuell klinisk anvendelse. Her beskriver vi en protokoll for å utføre en IUT i murine fosteret gjennom intravenøs og intra-amniotic. Denne protokollen er brukt med hell å belyse de nødvendige betingelsene og mekanismene bak i utero blodkreft stilk cellen transplantasjon, toleranse induksjon og i utero genterapi.

Introduction

Nylige fremskritt innen prenatal screening og diagnose har avdekket at behandling av fosteret for en rekke medfødte sykdommer som ikke har tilstrekkelig postnatal behandlingstilbud og resultere i betydelig sykelighet og dødelighet. Spesielt har i utero blodkreft stilk cellen transplantasjon (IUHCT) og gene terapi/genomet redigering potensial til å dra nytte av normal utviklingsmessige egenskaper av fosteret å behandle medfødt hematologic, immun og genetisk lidelser mer effektivt enn postnatal HSC transplantasjon og gene terapi/genomet redigering kan gjøre1,2. Spesielt på grunn av den lille størrelsen på fosteret, kan giveren cellen eller viral vector-dose maksimeres per vekten av mottakeren. I tillegg lar immunologic umodenhet av fosteret donor HSCs skal injiseres uten myeloablative og suppressive condition som kreves i postnatal transplantasjon protokoller. Tilsvarende kan viral vektorer bærer en terapeutisk transgene eller genomet redigering teknologi injiseres uten en begrensende immunrespons transgene produktet eller viral vektoren. Til slutt, tilgjengelighet og proliferativ natur fosterets stammen/stamfar celler råd mulighet for en mer effektiv Albin på målet stamfar celler, samt visse former for genomet redigering (homologi-rettet reparasjon) som krever sykling celler oppstår effektivt. Murine modellen fungerer som en innsiktsfull og rimelig måte å ta opp viktige spørsmål i stem cell biology og immunologi før eksperimentere i pre-klinisk store dyr modeller og, som sådan, har fungert som den primære modellen IUHCT og i utero gene terapi har vært utforsket1,2,3.

Selv om mange variabler spiller en viktig rolle i suksessen til IUHCT og i utero gene terapi/genomet redigering i murine og store dyr modeller, er en viktig variabel metoden for levering av HSCs eller viral vektor. Levering av store doser av donor HSCs med første-pass effekt oppstår i fosterets leveren, blodkreft orgel ved IUHCT, har vist seg å være medvirkende i å oppnå macrochimeric nivåer med engraftment i mus og store dyr modeller4 ,5. Dette var oppnådd via en injeksjon av donor cellene via eggeplomme venen i musemodell og via en intra cardiac injeksjon i hjørnetann modellen. Ruten injeksjon også spiller en grunnleggende rolle i utvelgingen progenitor celler av ulike organer under utvikling. For eksempel en intravenøs injeksjon via eggeplomme åre har vist seg å effektivt transduce cardiomyocytes og hepatocytter etter en sen svangerskapet injeksjon6,7. Alternativt kan en intra-amniotic injeksjon av viral vektorer målretting av organer som fysisk vises basert på embryonale folding/utvikling av injeksjon8. Dette er best eksemplifisert ved målretting av respiratoriske epitel via en intra-amniotic injeksjon sent i svangerskapet for å dra nytte av normal fosterets "puste" bevegelser, som viser luftveiene til viral vektor i den amniotic flytende9. Disse to modusene for IUT, intravenøs via eggeplomme venen og intra-amniotic, har vært grunnlaget for flere pågående og tidligere eksperimenter i vårt laboratorium. I denne protokollen beskrive vi i detalj metodene for å utføre intravenøs og intra-amniotic IUT i murine modellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimentell protokollene ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen på barnas sykehus i Philadelphia.

1. opprette injeksjon Pipetter

  1. Bruker en loddrett brønnene avtrekker, trekke en 100 µL microcapillary pipette (figur 1A - 1 C). Kalibrere brønnene puller slik at konisk slutten > 1 cm lang.
    Merk: I utgangspunktet innstillingene for puller bør justeres for en optimal lengde. En høyere varme innstilling vil gjøre spissen lengre, og en høyere innstilling for trekk vil gjøre diameteren på spissen smalere.
  2. Skjær koniske enden slik at det er ≥ 1 cm lang. Sikre at interne diameter på spissen av nålen er mellom 70 µm og 100 µm og at det er omvendt proporsjonal med hvor konisk slutten.
    Merk: Interne diameter avhenger også kalibrering av brønnene puller. Se instruksjonene fra produsenten av vertikal brønnene puller eller foretrukket brønnene avtrekker type.
  3. Kontroller at nålen har den riktige interne diameteren, lage skråkant på 15-20 grader ved å skjerpe spissen en brønnene beveller med en diamant skarphet hjulet (figur 2A - 2 C). Husk å hvile spissen forsiktig på rattet uten for mye press, redusere sjansene for å bryte eller sprengning spissen.
    Merk: En pensel kan brukes til å tørke bort rusk bygger på pinne-spissen.
  4. Evaluere spissen under et mikroskop og sikre at spissen runde uten sjetonger eller sprekker. Revurdere interne diameter å sørge for at det er mellom 70 µm og 100 µm (figur 2D - 2 H).
  5. Tegne linjer på resten av nålen angi 5 µL av volumet mellom dem (f.eksnåler med en indre diameter på 1,3 mm bør ha linjer trukket på 3.77 mm trinn).
  6. Autoclave nåler forutgående i kirurgi og håndtere dem sterile hansker.

2. i utero injeksjoner

  1. Forberede nødvendige instrumenter av autoklavering dem forhånd. Inkluderer viktige instrumenter som microinjector nål holder, en kirurgisk nål sjåfør, et par Adson tang, et par buede vanlig vev saks, en 1 mL insulinsprøyte, et par bomull-tip påføring, en overføring pipette, en 50 mL konisk tube, og pakke 4-0 polyglactin 910 suturer.
  2. Bruker en steril teknikk, knytte nålen til nål holder og koble den til microinjector.
    Merk: Innstillingene for komprimert nitrogen brukes er som følger: injisere 4-6 psi, saldo 0 psi. Avhengig av hva er blitt injisert, spesielt på viskositet av injectate og størrelsen på brønnene, innsprøytingstider varierer mellom 0,3 - 1.5 s.
  3. Rense pinne-spissen av alle mulige rusk ved å tegne opp 5-10 µL av sterile 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS) og deretter fjerne den. Gjenta denne 2-3 x.
  4. Forberede gravid 2 - til 6-måneden-gamle kvinnelige mus kirurgi ved barbering deres sklerotisert med en clipper. Pass på at du ikke skade brystvortene. Administrere muntlig smertestillende medikamenter (f.eks, 100 µL av 1.5 mg/mL har meloksikam oral suspensjon per musen).
  5. Begynne å fylle nålen med ønsket materialet (celler/vektor/narkotika) på det ønskede volumet. Vær forsiktig med å bryte pinne-spissen mens fylle nålen.
    Merk: Volumet av injeksjon per fosteret varierer avhengig av bestemt eksperimentell design. 20 µL fungerer bra for å injisere et stort antall celler (dvs.opp til 107 celler i eggeplomme venen. For eksempel vi levert 1 x 107 hele bein margtransplantasjon celler isolert fra C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 ["B6 Green fluorescerende Protein (GFP)"] mus via eggeplomme venen inn svangerskapsdiabetes dag-14 Balb/c fostre. For viral vektor injeksjoner, en enkelt injeksjon av 10 µL av en 1:1 utvannet vektor med PBS fungerer bra.
  6. Gjør følgende for å kalibrere injeksjon tiden.
    1. Trykk Mode -knappen 3 x på microinjector å komme til skjermbildet for innsetting-kalibrering. Justere injeksjon tid ved å legge til intervaller på 10 eller 100 ms, og trykk på modus -knappen 2 x.
    2. Trykk på knappen Saldo og trykk fotpedalen når. Nå Trykk pedalen igjen og vurdere hvor mye volum tømmes ut av nålen per push. Hvis ikke kalibrert til det ønskede volumet av 5-20 µL per pedal push, Gjenta trinn 2.6.1 og 2.6.2.
      Merk: Vanligvis er det godt å kalibrere hver push å levere halv totale målvolumet samtidig. Det er mulig å injisere mer enn 30 µL eller selv 40 µL av det totale volumet, går vi vanligvis ikke over 20 µL per fosteret, intravenøs eller intra-amniotic.
  7. Fyll nålen opp til ønsket nivå.
  8. Starte levere bedøvelse til musen ved å justere oksygen flowmeter til 1 L/min og isoflurane vaporizer 3%.
  9. Kontroller om musen er anesthetized ved å merke av for fraværet av den pedal refleks. Overføre musen til en varmeputen i supine posisjon.
  10. Bruke smøremiddel øye gel for å unngå hornhinnen uttørking. Sikre musen i stedet ved taping øvre og nedre lemmer til pad.
  11. Prep magen med chlorhexidine scrub etterfulgt av alkohol og injisere en lokal bedøvelse (f.eks, 100 µL av 0,25% bupivacaine) subcutaneously (Figur 3A).
  12. Med saks, en 1-2 cm huden snitt slik at den nedre grensen er ikke nærmere enn 1 cm introitus; fascia under er svært tynn og gjennomsiktig.
  13. Identifisere midtlinjen av fascia som er mer gjennomsiktig enn området. Pass på at du ikke skade epigastric fartøyene som ligger på hver side av midtlinjen. Bør epigastric fartøyene få skadet, holde trykket med bomull-tip påføring å stoppe blødningen.
  14. Bruker Adson tang, knip fascia uten å flytte noen av de underliggende organene som tarm, blære eller fostre. Åpne fascia med saks, være forsiktig med å skade noen av organene. Når trygt i magen, utvide den fascial snittet. Gjør det lenger enn den hud snittet.
  15. Bruk bomull-tip påføring for å flytte tarmen i den øvre delen av magen, dermed utsette gravid livmor. Levere livmor av snitt, nøye identifisere høyre og venstre eggstokkene å sikre alle fostre telles (Figur 3B).
  16. Plass venstre livmoren tilbake i magen slik at bare riktig livmoren er utsatt; Dette forhindrer uttørking av livmoren og holder de ikke-injisert fostre varm.
  17. Hold de mest lateral fosteret/amniotic sac mellom tommelen og indeksen fingrene på operatørens ikke-dominante hånd (Figur 3C). Alltid være forsiktig å ikke forårsaker skade på fostre.
  18. Plasser disseksjon mikroskopet (en 10 X forstørrelse er ideelle) og justere avstanden slik at fosteret er i sikte. Innstille belysningen for en bedre visualisering.
  19. Identifiserer delen som injiseres (eggeplomme blodåre, amnion). For intravenøs injeksjoner, visualisere både eggeplomme venene og deres anastomose først. For intra-amniotic injeksjoner, orientere fosteret med til høyre i visningen.
  20. Nå målet plassen med nålen som beskrevet nedenfor.
    1. For en intravenøs injeksjon, gjør du som følger.
      1. Rotere livmoren slik at eggeplomme venen som er blitt injisert er parallell til spissen av nålen; huske på at injeksjoner må gjøres mot anastomose av to.
      2. Lå nålen på livmoren i 5° vinkel og pierce livmor veggen. Nå at spissen er mellom livmor veggen og amniotic sac, plassere direkte oppå eggeplomme venen.
      3. I nesten tangentiell vinkel, gli nålen over venen til skråkant skjærer og fremskritt i fartøyet; Dette er tydelig ved en flash av blod i pinne-spissen (Figur 3D).
        Merk: Tilgang til venen kan ta et par prøver som nålen ikke kan pierce venen med den første gli over venen.
    2. For en intra-amniotic injeksjon, gjør du som følger.
      1. Rotere amniotic sac og finne et sted blottet for fartøy å pierce.
      2. Velg nålen vinkelrett livmor veggen og pierce gjennom livmoren, plommesekken og amniotic sac. Vær forsiktig med å pierce gjennom eventuelle fosterets vev. Kontroller at nålen har gått mellom beina som dette bekrefter at nålen er i amniotic sac. Så fortsette med injeksjon.
  21. Sette inn riktige mengden materiale ønsket (vanligvis 10-20 µL) ved å skyve fotpedalen.
    Merk: Fordi injektoren må opprettholde visualisering av pinne-spissen gjennom mikroskopet på hele tiden, en annen person må lese markeringene på p å kvantifisere hvor injisert og informere injektoren hvor mye volum er igjen for å injisere. En diskusjon før injeksjon mellom injektor og assistent er viktig å unngå forvirring og forsinkelser. Dette er spesielt viktig for intravenøs injeksjoner fordi en forsinket fjerning av nålen vil tillate en tilbakestrømming av venøst blod i nålen og resultere i et unøyaktig dosering.
  22. Trekke nålen fra injeksjonsstedet når ønsket volum er levert. Det kan være noen blødning fra fartøyet punktering nettsted med intravenøs injeksjoner, trykksatt med side av nålen etter 10-15 s å stoppe blødningen.
  23. Fortsett til neste fosteret. Fortsett til alle fostre av rett livmor horn er blitt injisert.
  24. Fjerne venstre livmor Hornet fra magen og erstatte høyre livmor Hornet tilbake i bukhulen.
    Merk: Noen ganger nålen må fylles med injectant.
  25. Når alle fostre er blitt injisert, erstatte livmoren i magen (Figur 3E). Pass på å unngå en livmor eller intestinal Tarmslyng.
  26. Med en engangs overføring pipette, plassere omtrent 2 mL 1 x PBS i magen til å erstatte følelsesløs tap.
  27. Lukke fascia og magen i ett sammenhengende lag bruker 4-0 polyglactin 910 suturer for å unngå å skade den underliggende organer under nedleggelsen (figur 3F - 3 G).
  28. Fjern båndet og overføre musen til et bur under en varmelampe. Pass på at du ikke plasserer varmelampe for nær til musen. Kontroller at byrået har sengetøy, mat og vann.
    Merk: En termostatstyrt varmt kammer kan også brukes. Musen er våken når stående og gåing.
  29. Observere musen daglig og gi smerter medisinering etter behov.
    Merk: Vi rutinemessig gi har meloksikam postoperativ dager 1 og 2, og noen ganger på dag 3 Hvis musen viser underskriver av smerte.
  30. Hvis gjør en batch operasjon med samme injeksjon materialet, rense injeksjon nålen med sterilt PBS. Hvis injisere med et annet materiale, kaste nålen i en beholder og bruker en ny nål.
    Merk: Vi anbefaler fremme pups med surrogat demninger umiddelbart etter fødselen i tilfelle demningen montere en immunrespons på injectant og overføringer antistoffer til pups via brystmelk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overlevelse og engraftment er viktige mål for suksess for IUHCT eksperimenter. Avhengig av spesifikke endepunktene på et eksperiment, kan fostre mottok en IUHCT analyseres prenatally ved en c-delen eller fødselen. Gjennomsnittlig varierer overlevelse etter intravenøs injeksjoner fra 75-100%. Overlevelse etter intra-amniotic injeksjoner pleier å virkelig bedre enn intravenøs injeksjoner, på rundt 85-100%.

I vårt laboratorium tar utdanningsprosessen å oppnå ferdigheter i disse teknikkene ca 8-12 måneder. For å vurdere oppkjøpet av ferdigheter som kreves for å utføre disse injeksjoner i en reproduserbar mote, overvåkes traineer for fosterets overlevelse og donor celle engraftment på kort tid poeng etter IUT. Dette er demonstrert ved følgende kvalitetskontroll eksperimenter. Spesielt er 1 x 107 hele bein margtransplantasjon celler isolert fra C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 ("B6 GFP") mus som tidligere beskrevet5 og er injisert via eggeplomme venen inn svangerskapsdiabetes dag-14 Balb/c fostre. I en gruppe, i IUT ble utført av en erfaren instruktør, og i den andre gruppen av trainee som har vært praktisere teknikken for ~ 4 måneder. Representant fluorescerende mikroskopi bilder av de høstet fosterets lever 24 timer etter IUT er vist i Figur 4A. Lever av fostre som fikk IUT av trainee fluoresce mindre på grunn av en lavere engraftment av transplantert GFP celler. Disse lever ble deretter analysert for GFP+ giver celler av flowcytometri å kvantifisere engraftment nivåer. Forskjellen i mener engraftment nivåer mellom to injektorer korrelerer med bildene sett under fluorescerende mikroskopi (Figur 4B).

Muligheten for viral vektorer levert via intra-amniotic ruten til transduce celler i kontakt med den amniotic væsken er eksemplifisert ved Albin på epithelial celler 48 timer etter en intra-amniotic injeksjon av Ad-GFP (en adenovirus vektor bærer GFP transgene10) i svangerskapsdiabetes dag-12,5 fostre (figur 5A og 5B).

Figure 1
Figur 1 . Prosessen med å lage et glass pipette nål brønnene puller. (A) montere glass pipette og sikre den ved å stramme ringer på hver ende av puller. (B) når sikret, aktiveres bryteren trekke varmen. Innstillingene som vises er varme #1: 985 og trekk: 27. Mørk dekket glasset bør lukkes under denne prosessen for sikkerhet. Den ble åpnet for photoshoot formål. (C) av brønnene er separert. Forkaste nederst og ta den øverste delen av den separerte brønnene for de neste trinnene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Prosessen med sliping brønnene å forme spissen av nålen. (A) dette panelet viser det generelle oppsettet for slipe. En lyskilde er nødvendig for å visualisere spissen under mikroskopet. (B og C) montere brønnene i 15-20 ° vinkel. (D) en opphoping av avfall forventes gjennom sliping prosessen. Bruk en pensel for å fjerne spissen for å få en bedre visualisering av sliping prosessen. (E) A godt bakken pinne-spissen uten identifiserende sjetonger eller ujevne kanter vises under en 4 X forstørrelse. (F, Gog H) En re-inspeksjon av bakken nålen under en 10 X forstørrelse viser en godt bakken nål med en skarp spiss og jevne kanter rundt spissen. Pass på å sjekke pinnen på ulike vinkler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Laparotomy og i utero transplantasjon. (A) barbering, bedøve, og tape en gravid dam og prep hennes underliv. (B) etter laparotomy, levere helheten av livmoren utenfor magen for en identifikasjon av alle fostre. (C) plassering fosteret med kirurgens ikke-dominante pekefingeren og tommelen samtidig opprettholde spenningen med den tredje fingeren. Identifisere spissen av nålen under mikroskopet i forhold til fosteret. (D) en flash blod tilbake-flyter inn i brønnene nålen må ses på cannulation av eggeplomme venen. (E) etter ferdigstillelse av alle injeksjoner, plassere alle fostre tilbake i magen. (F) lukke magen med en ett-lags løpende stitch bruker 4-0 polygalactin 910 suturer. (G) når magen er helt lukket, la komme seg under en varmelampe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Engraftment av donor hele benmarg mononukleære celler etter en eggeplomme blodåre injeksjon. (A) forskjellen i graden av engraftment med (trainee) og uten (instruktør) lekkasje av celler vises tydelig under fluorescerende mikroskopi. (B) prosent chimerism gjenspeiles også samme funn vist av flyt cytometri analysen. Hvert datapunkt representerer leveren fra et annet injisert foster. Eksperimentet ble utført av en trainee og en instruktør. Feilfeltene representerer standardavviket (SD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Uttrykksmønster av grønne fluorescerende protein i en fosterets embryoet 48 timer etter en intra-amniotic injeksjon av Ad-GFP. (A) dette panelet viser hornhinnen (rød pil) og hud farget med GFP på E14.5 etter en intra-amniotic injeksjon av Ad-GFP på E12.5 (E12.5/E14.5). (B) en cryosection på baksiden av embryoet (angitt med en lyseblå boks i panelet en) på en høyere forstørrelse viser at viral signaltransduksjon er begrenset til overfladiske peridermal celle lag (røde piler) og ikke overhuden (epi). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In utero transplantasjon er en potensiell terapi for mange medfødt lidelser som kan diagnostiseres tidlig i svangerskapet. Murine modell for IUT tillater forskere å utforske fosterets miljøet eller eksperimentere med forskjellige terapi. Avhengig av hva er blitt injisert, og hva er målrettet, gir intravenøs eller intra-amniotic i utero transplantasjon en pålitelig levering av en injectant i den ønskede plassen.

Når målretting bestemte organer, er det viktig å velge riktig embryologiske alderen på fosteret samt injeksjon teknikken. Mens intravenøs injeksjon av celler på E14 er ideell for målretting hematologic nisje og intra-amniotic injeksjon på E16 er ideell for lunge målretting, er disse ikke de eneste tilgjengelige alternativene. For eksempel kan intra-amniotic injeksjoner utføres for fostre så tidlig som E8 med ultralyd veiledning8. Systemisk levering er også mulig før E14 med ultralyd-guidede intra cardiac injeksjoner på E9 - E1011. Muligheten til å utføre injeksjoner på ulike stadier av fosteret utvikling tilbyr stort potensial for eksperimenter undersøker sikkerheten og effektiviteten av genet overføringer og cellen transplants og undersøke grunnleggende spørsmål av utviklingsmessige biologi.

Videre, i tillegg til en intravenøs og intra-amniotic levering, andre steder er også tilgjengelig for målretting avhengig av formålet med terapi eller vitenskapelige spørsmålet blir forfulgt. Den i utero intramuskulær tilnærming har vært brukt i en genoverføring for muscular dystrophies12, en intraspinal tilnærming for signaltransduksjon ryggmargen motor neurons13, og intrakranielt tilnærming for genet overfører til målet sentralnervesystemet sykdommer14. I utero blodkreft cellen transplantasjon er intrahepatic og intraperitoneal levedyktig tilleggsalternativer som hver rute for levering til slutt mål blodkreft nisje15. Imidlertid gir intravenøs transplantasjon ruten en mer effektiv homing donor cellene i blodkreft nisje og en større dosering av donor cellene, dermed resulterer i generelt høyere nivåer av stabil langsiktig donoren cellen engraftment uten lagt fosterets dødelighet1.

Protokollene vi har beskrevet ovenfor for utføre IUT er kraftig og allsidig verktøy som gir en unik i vivo tilnærming til studere stamcelleforskningen biologi, utviklingsmessige immunologi og immunologiske toleranse induksjon, utviklingspsykologi biologi, og prenatal gene terapi/genomet redigering. Disse leveringsmåter også har relevante klinisk implikasjoner og har vært grunnlaget for studier av IUHCT og i utero genterapi i pre-klinisk store dyr modeller som hjørnetann og ovine modell4,16. De vil fortsette å tjene som et verdifullt verktøy for å teste ut nye ideer i utviklingspsykologi biologi og utforske nye terapier for ødeleggende medfødt genetisk, hematologic, immun og metabolske forstyrrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gloves Cardinal Health 2D73DP65
Adson Forceps w/ teeth Fine Science Tools 11027-12
Adson Forceps w/o teeth Fine Science Tools 11006-12
Curved scissors Fine Science Tools 14075-11
Heavy Scissors Fine Science Tools 14002-13
Needle Driver Fine Science Tools 12005-15
Vicryl 2.0 Ethicon JB945
Transfer Pipette Medline GSI135010
Cotton Tipped Applicators Medline MDS202000
50 mL Conical tube Fischer Scientific 14-432-22
Tape 3M 1527-1
Eye lubricant Major LubriFresh 0904-6488
Heating Pad K&H 3060
Stereomicroscope Leica MZ16
Injector Narishige HI01PK01
Glass Capillary tubes Kimble 71900-100
Vertical Micropipette Puller Sutter Instruments P-30
Microelectrode Beveler Sutter Instruments BV-10
IM-300 Pneumatic Microinjector Narishige IM-300
Insulin Syringe  BD  305935
Filter Genesee Scientific 25-244
Compac5 Anesthesia Machine VetEquip Compac5 901812 
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 66794-017-25
N2 gas Airgas NI 125
O2 gas Airgas OX 125
Ad-GFP viral vector Penn Vector Core H5'.040.CMV.eGFP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
  2. Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
  3. Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126, (10), 1245-1254 (2015).
  4. Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124, (12), 1987-1995 (2014).
  5. Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108, (13), 4268-4274 (2006).
  6. Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101, (4), 1359-1366 (2003).
  7. Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 1, 14040 (2014).
  8. Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15, (3), 579-587 (2007).
  9. Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, (6), 991-999 (2016).
  10. Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
  11. Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18, (7), 719-726 (2011).
  12. Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15, (7), 531-536 (2008).
  13. Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
  14. Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).
  15. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).
  16. Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19, (2), 201-209 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics