nog 小鼠多发性骨髓瘤异种移植的多模态生物发光和正电子发射成形断层扫描成像

Cancer Research

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Summary

在这里, 我们使用生物发光, x 射线和正电子发射断层扫描断层扫描断层扫描成像, 以研究如何抑制 mtor 活性影响骨骨髓移植骨髓瘤肿瘤在异种移植模型。这使得生理相关, 非侵入性, 多模态分析的抗骨髓瘤的作用治疗针对骨髓移植骨髓瘤肿瘤在体内

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Gastelum, G., Chang, E. Y., Shackleford, D., Bernthal, N., Kraut, J., Francis, K., Smutko, V., Frost, P. Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice. J. Vis. Exp. (143), e58056, doi:10.3791/58056 (2019).

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Abstract

多发性骨髓瘤 (mm) 肿瘤在骨髓 (bm) 中移植, 其生存和进展取决于存在于这种微环境中的复杂分子和细胞相互作用。然而, bm 微环境不可能在体外轻易复制, 这可能会限制许多体外外实验模型的生理相关性。这些问题可以通过利用异种移植模型来克服, 在该模型中, 荧光素酶 (luc) 转染 8226 mm 细胞将专门移植到小鼠的骨骼中。当这些小鼠被给予适当的底物 d-荧光素时, 可以通过测量肿瘤在体内产生的生物发光图像 (bli) 的变化来分析治疗对肿瘤生长和存活的影响。该 bri 数据结合正电子发射断层扫描 (pet/ct), 使用代谢标记 2-deoxy-2--(18f) 氟 d-葡萄糖 (18f-fdg) 进行分析, 用于监测肿瘤代谢随时间的变化。这些成像平台允许在肿瘤/bm 微环境中进行多种无创测量。

Introduction

mm 是一种不治之症, 由恶性血浆 b 细胞组成, 浸润 bm, 导致骨破坏、贫血、肾功能损害和感染。mm 占所有血液恶性肿瘤10%-15% 1, 是最常见的癌症涉及骨骼 2。mm 的发展源于长寿命浆细胞的致癌转化, 这些细胞在最终归属于 bm3之前建立在淋巴组织的萌发中心。bm 的特点是高度异质的利基;包括不同和关键的细胞成分, 低 po 2 (缺氧) 的区域, 广泛的血管, 复杂的细胞外基质, 细胞因子和生长因子网络, 所有这些都有助于 mm 肿瘤发生 4.因此, 一个传播 mm 异种移植模型的特点是肿瘤, 严格地在 bm 相关的工具, 研究 mm 病理在体内5,6。然而, 许多技术障碍可能会限制大多数异种移植模型的有效性, 使其成本高昂, 难以应用。这包括与 bm 生态位内一致和可重复的肿瘤雕刻相关的问题, 肿瘤发育时间长, 以及直接观察和测量肿瘤生长生存率变化的能力有限, 而无需牺牲老鼠在实验过程7,8

该协议使用了最初由宫川等人开发的修改后的异种移植模型.9. 其中与骨髓瘤细胞的静脉注射 (iv) 挑战导致 "传播" 肿瘤, 在 nod/scid/il-2γ (空) 小鼠 bm 中持续和可重复地移植 10.这些肿瘤的原位可视化是通过8226人 mm 细胞系的稳定转染和 luc 等位基因和依次测量这些移植肿瘤细胞产生的 bii 的变化 6.重要的是, 该模型可以扩展到利用各种其他表达 luc 的人 mm 细胞系 (u266 和 opm2), 具有类似的倾向, 特别是在 nog 小鼠的骨骼中移植。在通过小鼠的生物发光成像来识别肿瘤之后, pet任何 ct 测量放射性药物探针 (如18f-fdg) 的吸收情况。肿瘤/bm 微环境中的途径 (代谢改变、缺氧变化和诱导细胞凋亡)。该模型的主要优势可以通过提供广泛的放射性标记、生物发光和荧光探针和标记来突出, 这些探针和标记可用于研究 mm 的进展和体内病理。

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Protocol

下面描述的所有动物程序都得到了大洛杉矶 va 保健系统的动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准, 并在无菌和无病原体的条件下进行。

1. 荧光素表达8226个细胞 (8226-lu) 的制备

  1. 在含有95% 空气和5% 二氧化碳 (co 2) 的加湿大气中, 在37°c 条件下保持人类 mm 细胞系 8226, 在 rpmi-1640 培养基中补充10% 的胎儿牛血清 (fbs) 和1% 的青霉素链霉素.
  2. 通过转染 1 x 10 6 8226 细胞和荧光素酶报告载体生成稳定的 luc 表达记者8226细胞, 然后选择之前所述的 hygromycin (100-350 mg/ml) 6.
  3. 在标准无菌培养条件下保持细胞 2-3周, 每隔一天更换一次培养基, 直到建立稳定转染的8226个细胞系。
  4. 通过加入荧光素酶底物 d-荧光素 (15μgml 在预热培养基中的工作溶液), 确认 1 x 10 6 转染细胞中的体外荧光素酶活性 100μl.使用发光计6在试管或96孔板中的细胞的生物发光.

2. 原位异种移植模型

  1. 在适当的动物护理设施中, 将 nog 小鼠 (4-6周, 男性或女性) 保持在无消毒病原体的条件下。
  2. 在实验当天准备 8226 luc 转染细胞, 以便在 nog 小鼠 (~ 5 x10 6 细胞小鼠) 中进行静脉注射。在冰凉 pbs 中清洗 3 x 的细胞, 对其进行计数, 并在无菌试管中以 5 x10 6 细胞200μl 的最终浓度重新悬浮在冰凉 pbs 中 (减去抗生素和 fbs)。将细胞放在冰上, 尽快挑战老鼠 (30-120分钟内)。
  3. 将小鼠 (用异氟醚, 在 0.5-1 lmmin 的空气中占 1%-3%) 进行麻醉, 并将动物置于加热垫上的仰面位置, 头部朝外。通过捏脚趾检查麻醉的程度。将眼药膏涂在眼睛上。
  4. 使用1毫升胰岛素注射器和26-g 针, 通过尾静脉 (200μlp) 将8226-luc 细胞注射到小鼠体内。
    注: 热灯可用于加热尾巴, 从而扩张静脉, 提高注射效果。
  5. 将动物送回家中的笼子, 并对动物进行监控, 直到它们完全康复。
  6. 通过测量麻醉小鼠体内的 bli, 确认小鼠骨骼中8226-luc 细胞的雕刻 (如下图 1a 所示)。
    注: bm 渗出物也可以用流式细胞仪 (图 1b) 或采集骨的免疫组织化学 (1B) 染色, 用于人类 cd45 表达。

3. 体内 bri 的测量

注意: 通常情况下, 可测量的 bl 从移植到小鼠的肿瘤可以首先观察到10-20天的挑战后, 但这可能需要实验确定。

  1. 麻醉小鼠 (用异氟醚, 1%-3% 在 0.5-1 lmmin 的空气中), 并通过捏脚趾来检查麻醉剂的水平。将眼药膏涂在眼睛上。
  2. 给动物注射 ip "体内级" d-荧光素底物 (在无菌盐水中稀释 30 mg/ml)。
  3. 在注射荧光素底物后, 在5-10分钟内测量 bri (尽管在小鼠体内可以观察到 bli 活性长达 45-60分钟), 方法是将麻醉动物置于小动物成像系统中的仰角 (图 2)).选择发光和 x 射线分析并获取图像 (图 3)。
    1. 使用成像软件测量选定感兴趣区域 (roi) 的平均辐射量 (图4)。
    2. 将动物送回家笼中, 对其进行监测, 直到完全恢复 (约 15-20分钟)。

4. 靶向治疗小鼠

  1. 测量基线 bri, 并将动物随机分为治疗组 (4-8 微米组)。
  2. 使用每日 5次 ip 注射, 然后休息 2天, 每天再注射 5次, 对小鼠进行天二甲甲 (200μl/注射液).
  3. 如第3节所述, 测量荧光素酶活性 (光子/厘米2 ~ steradian) 每周 2次, 并绘制 bli 随时间变化的情况。肿瘤 bri 的变化可以显示为小鼠的连续图像 (图 5b)。
    注意: 建议对动物进行日常监测, 直到它们出现以下症状 (通常在最初的挑战发生后45-60天内): 体重减轻 (相对于植入前的体重损失超过 10%) 和/或后部肢体麻痹, 在这段时间, 他们应该安乐死使用 co 2室, 然后是颈椎脱位。

5. 利用18f-fdg 测量肿瘤代谢变化的 pet/ct 分析

  1. 在实验前, 通过将食物取出 24小时, 以避免过量的非特异性吸收 18 f-fdg, 从而使动物在家中的笼子里快速。
  2. 实验当天准备 18 f-放射性标记的 fdg pet 探针 (在无菌盐水中注射 50-100μci·)。使用剂量校准器记录18f-fdg 探头的时间和活动。
    注意: 由于18f 的半衰期相对较短 (~ 2小时), 因此必须为这些探头的使用进行精心的准备和规划。
  3. 将动物 (用异氟醚, 在 0.5-1 lmmin 的空气中占 1%-3%) 进行麻醉, 并将其置于加热垫上的仰面位置, 头部朝外。通过捏脚趾检查麻醉的程度。将眼药膏涂在眼睛上。
  4. 使用屏蔽的1毫升胰岛素注射器和26-g 针,通过尾静脉 (100μl 注射) 注入探针。
    注: 热灯可用于加热尾巴, 从而扩张静脉, 提高注射效果。
  5. 测量剂量校准器中针筒中的残余放射性, 并注意活性和时间。
    注: 小鼠孵化、剂量和时间的标准化对于确保数据的重现性和可比性至关重要。
  6. 在整个探针摄取过程中, 使用加热垫在麻醉和37°c 下保持小鼠麻醉和 37°c (~ 45-90分钟)。
    注意: 重要的是, 小鼠保持静止和在 37°c, 以避免非特异性吸收的探针。
  7. 错开注射 18f-ffg 探针的时间间隔约为20至 30分钟, 以确保小鼠有类似的标记时间。
    注意: 正确的工作流程和探头注射的时间安排将产生最佳和可重复的成像条件。
  8. 测量与移植肿瘤相对应的选定感兴趣区域的 pet/ct 小动物成像系统中的18f-fdg 活性 (图 6)。
    注意: 最初, 建议进行10分钟的静态 pet 曝光和2分钟的 ct 曝光, 但可能需要通过实验确定确切的曝光时间。
  9. 把动物送回家里的笼子里, 监控它们, 直到完全康复。将老鼠放在专门的返回室 2 4小时内, 而探头则会下降到背景水平。
    注意: 由于半衰期较短, 为18f,因此使用新探头进行的多次测量的频率可达每周2倍。

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Representative Results

在初步的试点研究中, 在 nodse:scid 小鼠体内注射8226-luc 细胞并没有发生 bm 移植的 mm 肿瘤, 尽管鳞状 mm 肿瘤很容易形成 (100% 成功率)。相反, iv 挑战8226个细胞进入 nog 小鼠产生的骨骼肿瘤 (很少在非骨骼组织中形成肿瘤, 如肝脏或脾脏)。由于骨骼中的肿瘤无法通过对动物进行物理检查来直观地证实, 因此必须考虑其他方法来确认成功的肿瘤雕刻和 bm 中肿瘤的位置 (图 1)。与宫川等人的报告相似.9. 人类 igg, 由8226个细胞生产, 可以检测到在免疫蛋白糖小鼠的血清中使用 elisa (未显示数据), 尽管这些数据只证实了植入物, 而没有确认肿瘤的位置或程度。多种动物的序列成像显示了 bm 雕刻 mm 肿瘤的分布 (图 4)。然后, 可以连续和非侵入性地测量这些移植肿瘤细胞产生的 bi, 以评估 mtor 抑制剂天氯莫司治疗的小鼠肿瘤生长和存活的变化 (图 5)。最后, 利用 pet任何 ct 分析肿瘤中18 f-fdg 的吸收, 证实了天罗莫司介导的葡萄糖代谢变化, 这与肿瘤生长的变化有关 (图 6)。然而, 通过稳定地转染8226个细胞的荧光素酶等位基因, 结合光学图像 x 射线分析, 可以快速、非侵入性地确定 mm 肿瘤在小鼠骨骼中的确切位置和分布。

Figure 1
图 1: 确认小鼠骨骼中8226-luc 细胞的雕刻.(a) nog 小鼠受到 5 x10 6 8226-luck 细胞 iv (左侧为小鼠) 或盐水 (右侧为小鼠) 的挑战。15天后, 对小鼠进行了 d-荧光素底物的 ip 注射, 并使用小动物成像系统进行成像。(b) 牺牲了小鼠, 采集了股骨, 收获了 bm 细胞渗出物。用 pe 结合抗人类 cd45 抗体用流式细胞仪测定人 cd45 的表达。(c) 该面板显示了在受到 8226 (右面板) 或盐水 (对照; 左面板) 挑战的小鼠中, 使用皮莫尼唑 (顶板) 或人 cd45 (底部面板) 染色的小鼠股骨连续切片的免疫组织化学。星号表示一个大血管在串行部分的位置。刻度栏 = 100μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 麻醉的 nog 小鼠在测量骨髓移植 mm 肿瘤的 bi 信号之前, 在成像系统中显示定位.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 从 nog 小鼠收集的生物发光信号的光学成像和 x 射线分析的设置.一旦这些动物被成功地挑战, 并且在 bm 中的肿瘤植入物已被确认, 小鼠可以随机分为治疗组。在实验过程中的不同时间, 可以对动物进行 bi 变化的监测。由于手术是无创的, 监测频率可以改变, 以反映肿瘤的预期生长, 以及癌细胞对治疗的反应速度。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 多个动物的序列成像显示骨骨髓移植 mm 肿瘤的分布.确定每个鼠标感兴趣的区域 (roi)。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 抗 mm 治疗方案中 nog 小鼠移植肿瘤 bri 的变化.(a) 该面板显示, 经特西罗莫 (20 mg/kg 称老鼠) 处理的 nog 小鼠的平均辐射量发生了变化, 对 iv 有 5 x10个6个细胞。一旦观察到小鼠对移植肿瘤呈阳性, 就会随机分为不同的治疗组。小鼠每天接受 5次 ip 注射, 然后休息 2天, 然后再注射5次天二氯莫司 (x 轴上的铁棍表示治疗日) 或车辆控制。在不同的日子里, 小鼠接受了 "体内级" d-荧光素的 ip 注射, 并使用光学成像平台对 bi 进行了测量。这些值表示95% 置信区间的平均亮度 (p/cm2/ser) ±。(b) 这个卡普兰-梅耶尔的剧情显示了存活老鼠百分比随时间的变化。已达到终点标准的老鼠 (体重下降 > 10% 或后肢瘫痪) 被人道地安乐死。(c) 该面板显示了第28、35和40天拍摄的具有代表性的小鼠图像, 显示了北爱尔兰和联的活动变化。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: pet/ct 对18f-fdg 吸收的串行成像和相对变化.(a) 该面板显示同一小鼠的生物发光 (光学成像 x 射线) 成像和18f-fdg 吸收的 pet/ct, 在麻醉小鼠身上测量 bti, 24小时后对同一小鼠进行 pet/ct 成像。老鼠禁食一夜, 在研究当天, 接受了 50μi 18 f-fdg静脉注射。在探针吸收孵育过程中, 小鼠在麻醉下保持不变 (60分钟), 然后通过 pet任何 ct 分析对18例 f-fdg 吸收进行分析。肿瘤 (t1 和 t2) 表示。h = 心脏, k = 肾, b = 膀胱。(b) 该面板显示了在对照小鼠 (无治疗) 或 temsirolimus (20 mgkg kg) 治疗小鼠 (在第22天、第35天和 40天) 中, 18f-fdg 吸收的相对变化 (占未治疗的控制肿瘤的百分比)。数据显示为平均值 (n = 5只鼠标) ±1 s. d. 请点击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

尽管 mm691112、13临床前异种移植模型多种多样, 但研究 bm 微环境中肿瘤/bm 相互作用的能力仍然困难14. 这里所述的技术允许在 nog 小鼠的骨骼中快速和可重复地雕刻8226-luc 肿瘤细胞。

该协议的关键步骤包括建立表达 lm 细胞系的荧光素酶, 并验证荧光素酶在体外15 的稳定表达。一旦细胞系建立, nog 小鼠就会受到静脉注射的挑战, 肿瘤在骨骼上的雕刻通过测量体内的 bi 活性 (通常在10-20天内) 得到证实 (图 1a)。使用 nog 小鼠很重要, 因为其他免疫缺陷菌株 (如 nod/scid) 通常不会形成 bm 移植的肿瘤。植入成功率相对较高 (> 90%) 和观察阳性 bli 信号的时间间隔较短, 因此该模型是高通量和纵向分析抗 mm 治疗方式的理想选择 (图 4)。该模型的另一个非常重要的方面是, bm 雕刻的 mm 细胞系保持其形态和免疫特征的亲本细胞系 (例如, 8226, u266);它们具有一致的、可重复的生长模式, 并表现出患者疾病的特点, 如血清人 igg 副蛋白水平的增加和骨损害的形成。

这一战略的优点是利用这些强大的成像技术, 在疾病进展过程中和对抗肿瘤治疗的反应中反复研究肿瘤的生化和分子成分。在这个实验中, 我们发现针对 bm 移植骨髓瘤肿瘤小鼠的 mtor 活性导致生物发光测量的减少, 可以随着时间的推移观察到。此外, 我们发现, 在这些相同的肿瘤中, 18f-fdg 探针 (图 6b) 的吸收变化与生物发光信号的变化有关 (图 5b)。这个过程的另一个关键组成部分是, 随着时间的推移, 可以在肿瘤内测量多个生化变量。这一点尤其重要, 因为肿瘤进展是一个动态过程, 其特点是肿瘤生理和微环境特征的变化。因此, 这个程序, 由于其非侵入性和相对较短的半衰期的探针, 允许多个纵向分析的变化, 肿瘤的反应治疗。

在掌握了该技术之后, 该技术的未来应用具有很大的灵活性。例如, 还可以使用其他生物发光或荧光标记 (例如荧光标记抗体), 其他各种18f 标记探针和放射性药物化合物也可以用于研究特定的生化肿瘤的途径或过程。由于其中许多放射性核素在内的半衰期较短, 因此可以在研究药物吸收、分布、动力学和衰变的特定实验过程中进行多次系列测量。使用这种异种移植模型, mm 利用厌氧糖酵解和其他代谢途径 (脂肪酸合成) 的能力, 使用其他探针 (例如,18f-co-氟-2d氧葡萄糖 [18f-fdg] 和18f-氟-4-硫代棕榈酸 [ftp] 16, 17, 以及使用另一个广泛使用的探针 (3 '-脱氧 3 '-[18f] 氟硫胺测量治疗的抗增殖效果的能力 [18f-flt]) 可包括在实验设计中。此外, 利用18F-Annexin b1 测量体内细胞凋亡 18, 可以直接测量细胞死亡. 其中许多化合物在商业上是可以买到的。

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Disclosures

提交人 kevin francis 是 perkin-elmer 的雇员。

Acknowledgments

这项工作得到了美国退伍军人事务部生物医学实验室研究和发展处 (blrds) 向 p. f. 提供的 va merit 赠款 1i01 bx001532 的支持, 欧洲经济合作署感谢 va 临床科学 & d 服务 (优异奖 i01cx001388) 和 va 康复 r & d 服务 (优异奖 I01CX001388)。进一步的支持来自加州大学洛杉矶分校向 j. k. 提供的种子赠款。这些内容不一定代表美国退伍军人事务部或美国政府的观点。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8226 human myeloma cell line ATCC CCL-155
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Mice (NOG) Jackson Labs 5557
VivoGlo Luciferin substrate Promega P1041
Hypoxyprobe-1Kit HPL HP1-100
PE-CD45 (clone H130) BD Biosciences 555483 Used for flow cytometry to identify human CD45+ tumor cells in BM exudate
rabbit anti-human CD45 (clone D3F8Q) Cell Signaling Technology 70527 Primary antibody used for Immunohistochemistry of excised bone
Goat Anti-rabbit IgG (HRP conjugated) ABCAM ab205718 Seconday antibody used for Immunohistochemistry of excised bone
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
pGL4.5 Luciferase Reporter Vector Promega E1310
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System Perkin Elmer
Sofie G8 PET/CT Imaging System Perkin Elmer

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References

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