Myography 와이어를 사용 하 여 마우스 Mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

선법 myograph 혈관 부드러운 근육 기능과 화면 새로운 약물을 조사 하는 데 사용 됩니다. 우리 보고 마우스 mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정 및 혈관 평활 근의 새로운 relaxants 심사에 대 한 자세한 프로토콜.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sun, J., Yang, G. M., Tao, T., Wei, L. S., Pan, Y., Zhu, M. S. Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography. J. Vis. Exp. (138), e58064, doi:10.3791/58064 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

와이어 myograph 기술은 depolarization 응답, GPCR 촉진제/저 해제 및 약. 에 혈관 부드러운 근육의 수축 평가 하는 데 사용 됩니다. 그것은 혈관 부드러운 근육의 생리 기능, 고혈압 등 혈관 질환의 병 인 및 부드러운 근육 이완 약물의 개발에 많은 연구에서 널리 이용 된다. 마우스는 널리 사용 되는 모델 동물 질병 모델, 유전자 변형된 종자의 큰 수영장. 자세히 마우스 mesenteric 동맥의 수축 isometric을 측정 하기 위해이 방법을 도입 했습니다. 마우스 mesenteric 저항 동맥의 1.4 m m 세그먼트 격리 되었고 그것의 루멘을 통해 두 개의 강철 와이어를 전달 하 여 myograph 챔버에 장착. 평형 및 정규화 단계 후 선박 세그먼트 수축 분석 결과 이전에 두 번 하이-K+ 솔루션으로 potentiated 이었다. 신약 개발에서이 방법의 응용 프로그램의 예를 들어, 마우스 mesenteric에 새로운 자연 물질, neoliensinine, 중국 약초, 연꽃 씨 (Nelumbo nucifera Gaertn.)의 배아에서에서 분리의 이완 효과 측정 동맥입니다. Myograph 챔버에 장착 된 선박 세그먼트 높은-K+ 솔루션으로 자극 했다. 힘 긴장에 안정적인 지속적인된 단계에 도달 하면 neoliensinine의 누적 복용량 챔버에 추가 되었습니다. 우리는 neoliensinine 했다 복용량 의존 이완 효과 부드러운 근육 수축에 따라서 고혈압에 대 한 잠재적인 활동 곰 제안 발견. 또한, 선박 세그먼트 장착 후 적어도 4 시간을 살아남을 수 있고 여러 번, 우리는 제안에 대 한 높은-K+ 솔루션에 의해 유도 된 수축 유지 와이어 myograph 시스템 마약 검사의 시간이 걸리는 과정에 사용할 수 있습니다.

Introduction

여기에 사용 된 작은 그릇 myograph 시스템 되었고 측정에 대 한 내부 직경 100에서 400 µ m. 고립 된 작은 배 (약 2 m m 긴)에 이르기까지 작은 저항 혈관의 수축 isometric 두 40 µ m 직경 철사에 의해 삽입 된 그 마이크로미터 측면과 변환기 쪽 턱에 순차적으로 탑재. 이 myograph 기술은 19721 에서 처음 제안 되었고 Mulvany와 그의 동료2,3,4,,56에 의해 주로 개발. 그것은 지금 안정 장비, 쉬운 성능 및 표준 정규화 절차7,,89성숙한 기술. 우리 마우스 mesenteric 동맥에서 측정에 대 한 몇 가지 수정이 방법을 활용.

혈관 평활 근 거의 모든 혈관의 벽을 라인. 그들의 기본적인 함수는 다양 한 자극에 대 한 응답에서 수 축을 통해 힘을 생성 하는. 혈관 부드러운 근육의 정상적인 수축 혈액 압력 조절에 필수적 이며 영양 보충10. 다양 한 질병, 고혈압, 심장 마비와 뇌. 을 포함 하 여 혈압의 비정상적인 규제 여러 연구 결과 비정상적인 혈압은 항상 역 기능 혈관 평활 근 수축7,11,,1213와 관련 된 제안 했다. Myograph 메서드는 vasoconstrictors, 저 해제 및 약물을 포함 하 여 다양 한 자극에 의해 유도 된 마우스 선박의 isometric 수축의 조사 수 있습니다. 수축의 성공적인 측정 혈압 유지 보수와 새로운 치료 접근을 탐구 하 고 혈관 부드러운 근육 관련 질환의 pathogenesis의 메커니즘을 이해 하는 데 도움이 됩니다.

많은 중국 약초; 혈관 질환의 임상 치료에 널리 사용 된 그러나, 그들의 성분에 일반적으로 알 수 없는 남아 있습니다. 따라서, 절연 및 효과적인 구성 요소 식별 새로운 약물의 개발에 대 한 매우 중요 하다. 멀티 와이어 myograph 기술 심사 허브에 활성 구성 요소에 대 한 간단한 접근을 제공 합니다. 우리 마우스 mesenteric 동맥 수축 조사를 작은 그릇 myograph 시스템을 사용 하 여 여러 연구 결과 보고 하 고 반대로 고혈압 활동12,,1314자연 화합물 발견. 여기, 우리는 자세한 설명 로터스 씨 (Nelumbo nucifera Gaertn.)의 배아에서 분리 된 neoliensinine의 이완 효과 평가 하 고 myograph 메서드에 대 한 프로토콜 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

동물 조작 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 모델 동물 연구 센터 남 경 대학에 의해 승인 되었다.

1. 솔루션 준비

  1. HEPES Tyrode 솔루션 (H-T) 137.0 m NaCl, 2.7 m KCl m m, 1.8 m m CaCl2, 1 mM MgCl2∙6H2O, 5.6 m m D-포도 당, 및 10 mM HEPES를 사용 하 여 준비 pH 7.3-7.4.
  2. 칼슘 없이 HEPES Tyrode 솔루션 준비 (캘리포니아2 +-H T 무료) 140.6 m NaCl m, 2.7 m KCl m, 1 mM MgCl2∙6H2O, 5.6 m m D-포도 당, 및 10 mM HEPES, pH 7.3-7.4를 사용 하 여.
  3. HEPES Tyrode 솔루션 124 mM 15.7 m m NaCl, 124.0 m m KCl, 1.8 m m CaCl2, 1 mM MgCl2∙6H2O, D-포도 당, 그리고 10 mM HEPES, pH를 5.6 m m를 사용 하 여 KCl (높은 K+)를 사용 하 여 준비 7.3-7.4.

2. 실험 준비

  1. H-T와 37 ° C 물 목욕을 사용 하 여 높은-K+ 솔루션 예 열.
  2. Myograph 시스템, 데이터 수집 하드웨어와 컴퓨터를 켭니다.
  3. 신중 하 게 모든 myograph 챔버 채울 H T 솔루션의 5 mL.
  4. 4 ° C H-T와 캘리포니아의2 +20 mL 두 접시를 채워-H T 솔루션, 각각, 얼음 저장 고.
  5. H-T 솔루션의 20 mL와 코팅된 10 cm 배양 접시를 실내 온도에 그것을 유지.

3. 마우스 Mesenteric 동맥 해 부

  1. 자 궁 경부 전위에 의해 8 12 주 된 C57BL/6J 여성 또는 남성 마우스를 안락사. 향하도록 하는 복 부와 함께 마우스를 고정.
  2. 70% 에탄올과 복 부 축 그리고는 사 타 구니에서 피부 복 부 정중 선 따라가 위로 잘라 첫 번째 절 개의 시작에서 아래쪽으로 양쪽에 다리를 절 개 하 게 합니다. 양쪽;에 다시 피부를 당겨 복 여 비슷한 절 개를 확인 합니다.
  3. 가 위를 사용 하 여 잘라는 식도, 대 장 및 시체에서 맥 관 구조와 위장을 완전히 다른 결합 조직.
  4. 집게와 피를 씻어 감기 H T 단계 2.4에서에서 준비 하 고 부드럽게 조직의 여러 번 H T 솔루션에서 린스를 포함 하는 접시에 격리 된 세그먼트를 이동 합니다.
  5. 2.5 단계에서 준비 코팅된 페 트리 접시에 격리 된 세그먼트를 전송 하 고 실 온에서 mesenteric 동맥 해 부를 수행 합니다.
  6. 위, 공장, 회장, caecum 시계 방향에서 밖으로 부드럽게 하 고 각각 위장과 caecum 왼쪽과 오른쪽 측면에 고정.
  7. Mesenteric 맥 관 구조 침대 스트레칭 및 해 부 mesenteric 동맥을 노출 하는 핀 소장을 수정.
    참고:이 조건 하에서 동맥 혈관 위에 있습니다.
  8. 해 부 현미경 동맥 및 전송 입체 현미경의 광원을 켭니다. 솔루션에는 전체 조직 몰입은 다는 것을 확인 하십시오.
  9. 집게와 동맥 주위 지방 조직 클램프 그리고 해 부가 위 잘라 모든 결합 조직에 의해 동맥을 분리. 동맥을 부상 하지 마십시오.

4. 동맥 장착

  1. 전송 및 mesenteric 동맥 나무에는 감기 캘리포니아2 +담가-무료 H T 솔루션 (단계 2.4에서에서 준비) 집게와 초과 동맥을 죄 여.
  2. 동맥의 1.4 m m 부분에서 mesenteric 아케이드의 창 자 벽에 인접 잘라내어 두 개의 집게를 사용 하 여이 동맥 세그먼트의 양쪽 모두를 신중 하 게 열.
  3. 스테인레스 스틸 와이어 길이, 2.5 c m의 두 세그먼트를 준비 하 고 같은 그릇에 넣어.
  4. 부드럽게 클램프, 집게를 사용 하 여 동맥의 한쪽 끝을 신중 하 게 다른 집게의 도움으로 하나 하나 동맥의 루멘으로 2 개의 철사를 삽입 합니다. 전선을 똑바로 유지 됩니다 endothelium 만지지 마십시오 확인 하십시오.
  5. 두 개의 집게를 사용 하 여 스레드 선박 외부 두 개의 강철 와이어 클램프를 동시에, 그리고 신중 하 게 H T 솔루션 (2.3 단계)으로 가득 이전 myograph 약 실에 페 트리 접시에서 선박을 전송.
  6. 설치를 위한 공간을 만들기 위해 떨어져 턱을 나사. 두 개의 집게를 사용 하 여 두 개의 삽입된 와이어 중의 양쪽 모두를 클램프과 턱 간격 (그림 1A)에 배를 놓습니다.
  7. 나사 마이크로미터 (그림 1B)에 연결 된 턱의 주위 클램프 와이어의 양쪽을 감싸 줍니다.
  8. 시계 방향으로 왜곡 하 여 왼쪽 나사를 해결. 오른쪽 집게를 사용 하 여 와이어를 곧게 다음 시계 방향으로 (그림 1C)을 왜곡 하 여 오른쪽 나사를 해결 합니다. 배는 항상 턱 간격 안에 다는 것을 확인 하지만 손상을 피하기 위해 턱을 만지지 마십시오.
  9. 마이크로미터 (그림 1D)를 사용 하 여 두 개의 문 턱을 닫습니다. 두 턱은 충분히 가까이 하지만 그들은 서로 고정된 와이어 고정된 와이어 상단은 만지지 마십시오 있는지 확인 하십시오.
  10. 오른쪽 집게를 사용 하 여 신중 하 게 변환기, 강제로 연결 하는 턱의 모서리에 풀 었된 와이어를 접어 하 고 시계 방향으로 오른쪽 나사 (그림 1E) 주위 포장. 그런 다음 나사를 수정 합니다. 와이어의 왼쪽된 측면에서이 단계를 반복 하 고 왼쪽 나사 (그림 1 층)을 수정.
  11. 마이크로미터 (그림 1G)을 신중 하 게 회전 하 여 약간 떨어져 턱을 이동 합니다. 선박을 스트레칭 하지 마십시오. 집게를 사용 하 여 변환기에서 와이어의 수평 평면에 와이어 마이크로미터 측에 이동. 두 턱 사이의 간격 단지 2 개의 철사를 수용할 수 있도록 신중 하 게는 마이크로미터를 회전 합니다.
  12. 4.2-4.11 동맥 다른 챔버에 탑재 단계 반복 합니다. 장비에 모든 챔버를 연결, 챔버 커버, 100% 산소 공급 및 온도 프로브 연결 고 37 ° c에 난방 시작 차트 소프트웨어 열고 녹음을 시작 차트 뷰 창에서 시작 버튼을 누릅니다.
  13. 약 20 분 동안 equilibrate.

5입니다. 정규화

참고: 실험 조건을 표준화 하 고 혈관의 믿을 수 있는 생리 적인 응답을 얻을, 정규화 절차는 필요한15입니다. 활성 힘 및 선박의 내부 둘레 사이의 관계에 따라 와이어 myograph 시스템에 탑재 된 선박5,8, 내부 둘레 (IC)를 평가 하는 표준 정규화 프로그램 9. 짧게,를 계산 하는 IC (µ m), 읽고는 마이크로 미터 X 값 변환기로 값을 입력 힘, 즉, 휴식 하는 벽 긴장 (mN/m m), Y 값으로 출력 합니다. 프로그램 (X, Y)의 맞춤된 곡선을 반환 하 고 100 mmHg (IC100)의 과거 압력에 해당 하는 IC를 계산. 선박 정규화 된 내부 둘레 (IC1)로 설정 되어 때 활성 응답은 최대한.

  1. 장치에서 모든 채널에 대 한 0 힘을 설정 하 고 다른 1-2 분에 대 한 equilibrate.
  2. 정규화 설정 에서 선택 하는 "DMT 메뉴, 그리고 다음과 같이 매개 변수 설정:
    접 안 렌즈 교정 (mm/div): 0.36; 압력 (kPa) 대상: 13.3; IC1/IC100: 0.9; 온라인 평균 시간 (초): 2; 지연 시간 (초): 60. DMT 정규화 설정 창을 닫고 확인 버튼을 클릭 합니다.
  3. 해당 채널에 대 한 DMT 정규화 창을 열려면 DMT 메뉴 에서 관심의 채널을 선택 합니다. 창에 다음과 같은 상수 값을 입력: 조직 종점 a1: 0.1; 조직 종점 a2: 4; 와이어 직경 (µ m): 40. 창 1.40 m m로 계산 된 선박 길이 표시합니다.
  4. 적절 한 조직 챔버의 마이크로미터를 읽기. 마이크로미터 읽기 상자에 값을 입력 하 고 지점 추가 단추를 클릭 합니다. 이 값은 (X0) X의 초기 값이입니다. 60 s 지연 시간 후 창 힘 및이 마이크로 미터 값에 해당 하는 효과적인 압력 (ERTP)를 표시 합니다. 동시에, 마이크로 미터 독서 상자 활성화 됩니다.
  5. 스트레치는 마이크로미터 반시계 방향으로 선회 하 여 정규화 되 고 선박. 마이크로미터 읽는 상자에 마이크로 미터 값을 입력 하 고 지점 추가 단추를 클릭 합니다. 60의 지연 시간을 기다린 s 다시.
  6. 반복 단계 5.5, 선박, 스트레칭 "마이크로 미터 X1", 해당 IC1그릇을 스트레칭 하는 데 필요한 계산 된 마이크로미터 설정의 값을 표시 하는 창까지 마이크로 미터 값을 추가 하는 계속 해 서.
  7. 마이크로 미터 x1 값을 설정 합니다.
    참고: 정규화 된 긴장은 일반적으로 1-2만.

6. 동맥 수축 녹음

참고: H-T와이 섹션에서 사용 되는 하이-K+ 솔루션을 포함 한 모든 솔루션 단계 2.1에서에서 준비 되었다.

  1. 정규화 후 15-20 분 동안 상공에 있는 배를 equilibrate.
    참고:이이 단계에서 솔루션을 변경할 필요가 없습니다.
  2. 높은-K+ 솔루션으로 배를 두 번 도전 한다.
    1. 선박에 도전, H-T 솔루션을 H T 솔루션의 5 mL로 3-4 회 세척 뒤 10 분 동안 수축 유도 하 고 K+ 솔루션의 5 mL 바꿉니다.
      참고: 일반적인 수축 3 미네소타와 2.5 mN12주위 일정 지속적인된 힘 극대 힘이 있다. 2.5 mN 아래 최대한 힘을 생성 하는 첫 번째 도전 또는 지속적인된 힘 감소 시간 또는 처음 복용량 보다는 더 낮은 힘을 생성 하는 두 번째 도전, 선박 삭제 되 고 추가 조사를 위해 사용 되지 않습니다.
  3. 수 축을 유도 하 고 K+ 솔루션의 5 mL와 선박을 도전 한다. 5 분 후 1 µ M neoliensinine의 최종 농도에 선 긴장을 챔버로 neoliensinine 재고 솔루션 (DMSO에 10 m m)14 의 0.5 µ L를 추가 합니다.
  4. 힘은 안정 (이 일반적으로 몇 분 걸립니다), 4, 6, 8 및 10 µ M t를 생성 하 게 농도 증가 하는 농도를 2 µ M. 추가 1 µ L 재고 솔루션의 각 시간 증가를 챔버로 neoliensinine 재고 솔루션의 또 다른 0.5 µ L를 추가 그는 복용량 응답 곡선.
    참고: 재고와 작업 농도 약 마다 다릅니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

우리는 멀티 와이어 myograph 시스템을 사용 하 여 마우스 mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정 하 고 로터스 씨 (Nelumbo nucifera Gaertn.)의 배아에서 정화 neoliensinine의 이완 효과 평가 14. 마우스 mesenteric 저항 동맥은 고립 된 결합 조직의 청소 하 고 1.4 m m 세그먼트를 잘라. 동맥 세그먼트에 캘리포니아2 +2 개의 강철 철사에 의해 삽입 된-무료 페 트리 접시에 H T 솔루션 및 다음 세그먼트 myograph 챔버 (그림 2A)의 두 턱에 탑재 했다. 세그먼트를 장착, 2 개의 철사는 되도록 병렬, 가까이 하지 만지고 (그림 2B) 하지만 조정 되었다. 힘 측정 전에 선박 세그먼트 정상화 되었고 두 번 배를 안정 시키기 위하여 높은-K+ 솔루션으로 potentiated. 정규화 절차 동안 선박100, IC의 값에 도달할 때까지 여러 번 기지개 했다 고 각 뻗 기 주기 60에 강력한 수축, 빠른 휴식과 힘 유지 보수 포함 (그림 3). 일반적으로 높은-K+ 솔루션에 의해 유도 된 혈관 평활 근의 수축이 했다 두 단계, 강력한 단계 및 지속적인된 단계 (그림 3). 선박 세그먼트 수 경우에 실험 더 높은 K+사용-갖는 수축 정상 나타나고 재현. Neoliensinine는 일반적인 측정은 그림 4에 표시 됩니다. 힘 긴장 높은-K+ 지속적인된 단계에 도달 하 여 유도, 우리 실 덮개에 구멍을 통해 neoliensinine (1, 2, 4, 6, 8, 10 µ M)의 누적 복용량을 추가. 복용량 증가, 힘 감소 복용량 의존 방식. 결과 neoliensinine은 혈관 부드러운 근육 이완 물질 잠재적 후보 항 고혈압 약물14역할을 표시.

Figure 1
그림 1: 프로시저를 장착 하는 동맥의 회로도. 블루 라인 와이어, 나타내고 빨간색 사각형 동맥을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 마우스 mesenteric 동맥 세그먼트 myograph 챔버에 장착. (A) 마우스 mesenteric 동맥 세그먼트는 2 개의 강철 철사를 사용 하 여 두 턱에 장착. 흰색 바 = 2. (B) A 현미경 이미지 탑재 마우스 mesenteric 동맥 세그먼트 패널 (A)의. 검은 바 = 0.5 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 높은-K+ 솔루션 표준화 절차 및 potentiation를 보여주는 대표적인 원래 경시. 두 번째 하이-K+ 자극 후 일반 실험을 수행할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 높은에 의해 계약 마우스 mesenteric 동맥의 대표적인 추적-K + 솔루션 다음 neoliensinine의 누적 복용량을 추가 하 여 편안 하 게. 복용량-의존 방식에서 힘 감소 복용량 증가, 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

고혈압은 심혈 관 질환 등 심각한 합병증 및 신장 질환16광범위 한 보건 도전 이다. 고혈압의 병 인을 이해 하 고 탐구 더 고혈압 약물이이 분야에서 긴급 작업 되고있다. 혈압은 생성 하 고 순환의 주변 저항에 의해 유지. Poiseuille의 법률, 상대적으로 작은 동맥 순환 저항의 큰 비율을 생성 하 고 혈압3,10의 지배적인 생산자로 봉사. 따라서, 큰 동맥 보다는 오히려 작은 저항 동맥의 측정은 혈압의 연구에 더 적합 합니다. 와이어 myograph 기술 작은 저항 동맥의 생리 기능 및 혈관 질환의 병 인 연구에 가장 좋은 형식 중 하나입니다.

작은 그릇 와이어 myograph 시스템 다른 보고서에 잘 문서화 되어가 고 대동맥9같은 쥐 mesenteric 동맥8 및 마우스 동맥의 수축 측정 하는 데 사용 되었다. 유전자 조작, 다양 한 질병 모델 및 의약품 심사 모델, 마우스의 활용은 많은 분야에서 널리 사용 되는 모델 동물 되고있다. 따라서, 여기, 우리 제공 마우스 mesenteric 동맥 수축 측정에 대 한이 메서드의 수정 된 프로토콜. 이 보고서에서 우리는 성공적으로 기본 버퍼 및 장착 단계 수정 마우스 mesenteric 동맥의 수축 측정. Vasocontractility 측정 ex vivo에서 많은 연구는 생리 적 소금물을 모방 하 NaHCO3, Krebs 솔루션 등을 포함 하는 솔루션을 사용. 그러나, 같은 버퍼 CaCO3의 생산의 결과로 측정 과정에서 pH 값을 조정 하려면 CO2 필요 합니다. 우리는 버퍼 시스템으로 H-T 솔루션을 선택 하 고 그것은 잘 작동 발견. 온도pK값 HEPES에 는 효과가 거의 있기 때문에, 솔루션의 pH 값은 실 온에서 편리 하 게 조정 하 고 37 ° C 17에 변경 되지 않습니다. 또한, 우리가 사용 하 여 Ca2 +-캘리포니아2 +에서 혈관 수축 방지 하기 위하여 선박 루멘을 통해 전선을 지도 하는 때 H T 솔루션 무료. 이 프로토콜에서 다른 수정 장착 절차입니다. 일부 보고서8,95 장치 수동 턱에 첫 번째 와이어를 고정 시킨 후 두 번째 와이어를 지킬 것이 좋습니다. 우리는 2 개의 철사 배 루멘이이 방법은 제한 된 챔버 공간이 변환기의 손상을 줄일 수 있기 때문에 배를 탑재 하기 전에 안내는 때 더 나은 작품을 찾으십시오.

이 방법의 높은 재현성에 불구 하 고 우리는 몇 가지 주요 단계에 더 많은 관심을 기울여야 한다. 가장 중요 한 집게와가 위로 인 한 혈관 손상을 방지 하는 것입니다. 선박 해 부 동안 운영자 지방 조직 스트레칭 때 부드럽게는 집게를 사용 하 고 결합 조직을 절단 하는 경우 신중 하 게가 위를 사용 해야 합니다. 또한, 고정을 위한 선박을 클램핑 할 수 부드럽게, 그리고는 내 피에 손상을 endothelium 손상 선박 비정상적인 반응, 예를 들어상승 줄 것 이다 때문에 철사를 인도 할 때 피해 야 한다. , , 손상 된 선박이 보여줍니다 아 세 틸 콜린로 자극 후 명백한 힘 긴장 동안 정상적인 혈관 이완 효과 보여줍니다. 이 현상에 대 한 설명이입니다 손상 된 내 피 산화 질소를 제대로 생성할 수 없습니다. Note는 피 관련 수축 관련 된 실험에서 endothelium 상태 테스트 해야 힘 측정 전에. 또한, 우리 한다 또한 신중 하 게 탑재 선박 문 턱에 하드 힘으로 적용 하는 경우 변환기 쉽게 손상 된 때문에. 마지막으로, 우리가 일반적으로 사용 하지 마십시오 일정 증가 값은 마이크로미터에 정규화를 수행할 때. 증분 값 30 또는 20 µ m 처음 이며 효과적인 압력 후 10 µ m에 도달 11-12 kPa. 이 메서드는 정규화 시간을 줄일 수 있습니다을 잡아당기고, 그로 인하여 용기 손상 약하게 하는 것을 방지할 수 있습니다.

우리의 조사 마우스 mesenteric 동맥에 초점을 맞춘, 하지만이 방법을 사용할 수 있습니다 또한 대동맥, 기관지, 및 다른 작은 배 신장 등, 두뇌 및 폐 동맥. 이후이 시스템은 4 개의 채널을 포함, 동시에 4 개의 병렬 샘플의 측정에 편리 하다. 또한, 전체 mesenteric 혈관 침대 적어도 4 개의 동맥 세그먼트를 제공할 수 있습니다, 그리고 따라서 매우 쉽습니다 다른 실험적인 그룹 디자인. 우리의 경험에의 하면 각 동맥 세그먼트 적어도 4 시간을 통과 하 고 6 반복을 통해 높은-K+ 솔루션에 대 한 좋은 응답을 유지 합니다. 이 속성은 다양 한 후보 약물의 몇 가지 추가의 효과의 측정을 위한 매우 유용 합니다. 그러나, 와이어 myograph 시스템에 제한이 있습니다. Ex vivo 와이어 myograph 실험 아이소메트릭 vasocontractility를 측정할 수만 이지만 일반적으로 혈관의 복잡 한 분석에 대 한 다른 측정와 결합 한다.

요약, 우리는 이성질체 수축 멀티 와이어 myograph 시스템을 사용 하 여 마우스 mesenteric 동맥에서 측정 하는 방법을 설명 합니다. 부드러운 근육의 화면 relaxants을 혈관 평활 근의 기능을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 기술 지원에 대 한 박사 웨이 제나라 (Soochow 대학, 소 주, 중국)과 박사 연 닝 Qiao (산시 사범 대학, 서 안, 중국) 감사합니다. 이 작품은 자연 과학 재단의 중국 국가 (31272311, 81373295 및 81473420 부여)와 우선 교육 프로그램 개발의 장쑤 등 교육 기관 (부여 번호에 의해 투자 하는 프로젝트에 의해 지원 되었다 ysxk-2016 년)입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Multi wire myograph system DMT 610-M
Stainless steel wire DMT 400447
Geuder dissection scissor DMT 400431
Dumont forceps DMT 300413
PowerLab/8SP ADInstruments ML785
Software ADInstruments LabChart 5
NaCl SigmaAldrich S5886
KCl SigmaAldrich P5405
CaCl2 SigmaAldrich C4901
MgCl2·6H2O SigmaAldrich M2393
D-Glucose SigmaAldrich G6152
HEPES Sangon Biotech A100511-0250
NaOH SigmaAldrich S8045
DMSO SigmaAldrich D2650

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents and Actions. 2, (5), 257-260 (1972).
  2. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, (5552), 617-619 (1976).
  3. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile Properties of Small Arterial Resistance Vessels in Spontaneously Hypertensive and Normotensive Rats. Circulation Research. 41, (1), 19-26 (1977).
  4. Mulvany, M. J., Nyborg, N. An increased calcium sensitivity of mesenteric resistance vessels in young and adult spontaneously hypertensive rats. British Journal of Pharmacology. 71, (2), 585-596 (1980).
  5. Mulvany, M. J. Procedures for investigation of small vessels using small vessel myograph. Danish Myo Technology. Denmark. (2004).
  6. Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels. The Journal of Physiology. 275, 88-101 (1978).
  7. Michael, S. K., et al. High blood pressure arising from a defect in vascular function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (18), 6702-6707 (2008).
  8. Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  9. del Campo, L., Ferrer, M. Wire Myography to Study Vascular Tone and Vascular Structure of Isolated Mouse Arteries. Springer. New York. (2015).
  10. Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiological Genomics. 42, (3), 169-187 (2010).
  11. Crowley, S. D., et al. Distinct roles for the kidney and systemic tissues in blood pressure regulation by the renin-angiotensin system. The Journal of Clinical Investigation. 115, (4), 1092-1099 (2005).
  12. Qiao, Y. N., et al. Myosin phosphatase target subunit 1 (MYPT1) regulates the contraction and relaxation of vascular smooth muscle and maintains blood pressure. The Journal of Biological Chemistry. 289, (32), 22512-22523 (2014).
  13. He, W. Q., et al. Role of myosin light chain kinase in regulation of basal blood pressure and maintenance of salt-induced hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, (2), H584-H591 (2011).
  14. Yang, G. M., et al. Isolation and identification of a tribenzylisoquinoline alkaloid from Nelumbo nucifera Gaertn, a novel potential smooth muscle relaxant. Fitoterapia. 124, 58-65 (2018).
  15. Slezák, P., Waczulíková, I., Bališ, P., Púzserová, A. Accurate Normalization Factor for Wire Myography of Rat Femoral Artery. Physiological Research. 59, (6), 1033-1036 (2010).
  16. Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. The Lancet. 365, (9455), 217-223 (2005).
  17. Good, N. E., et al. Hydrogen Ion Buffers for Biological Research. Biochemistry. 5, (2), 467-477 (1966).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics