En høj overførselshastighed, High-indhold, væskebaseret C. elegans Pathosystem

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her beskriver vi en protokol, der er en fleksibel, hele vært, high-indhold screeningsværktøj, der kan udnyttes til at studere vært-patogen interaktioner og bruges for drug discovery.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (137), e58068, doi:10.3791/58068 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Antallet af nye stoffer identificeret af traditionelle, in vitro- skærme er aftaget, reducere succes af denne tilgang i søgen efter nye våben til at bekæmpe flere medicinresistens. Dette har ført til den konklusion, at forskere ikke kun behovet for at finde nye lægemidler, men også nødt til at udvikle nye måder at finde dem. Blandt de mest lovende kandidat metoder er hele-organisme, i vivo -undersøgelser, at bruge høj overførselshastighed, fænotypisk readouts og vært der spænder fra Caenorhabditis elegans til Danio rerio. Disse værter har flere stærke fordele, herunder dramatiske nedskæringer i falske positive hits, som forbindelser, der er giftige for værten og/eller biounavailable er typisk faldt i begyndelsesskærmen før dyre følge op.

Her viser vi, hvordan vores assay er blevet brugt til at afhøre vært variation i de veldokumenterede C. elegansPseudomonas aeruginosa flydende drab pathosystem. Vi viser også flere udvidelser af denne gennemarbejdet ud teknik. For eksempel, er vi i stand til at udføre høj overførselshastighed genetiske skærme ved hjælp af RNAi i 24 - eller 96-brønd plade formater til forespørgsel vært faktorer i denne vært-patogen interaktion. Ved hjælp af denne analyse, kan samlede genom skærme være afsluttet i kun et par måneder, der drastisk kan forenkle opgaven med at identificere stoffet mål, potentielt uden brug af besværlige biokemiske rensning tilgange.

Vi rapporterer også her en variation af vores metode, der erstatter de gram-positive bakterie Enterococcus faecalis for gram-negative patogenet P. aeruginosa. Meget som det er tilfældet for P. aeruginosa, er drab af E. faecalis tidsafhængig. I modsætning til tidligere C. elegansE. faecalis assays, vores assay for E. faecalis ikke kræver preinfection, forbedre dens sikkerhedsprofil og reducere chancerne for kontaminerende væske-håndtering udstyr. Analysen er meget robust, viser ~ 95% dødelighed 96 timer efter infektion.

Introduction

Identifikation og udvikling af effektiv, bredspektret antibiotika, nu næsten et århundrede siden, førte til en skelsættende øjeblik i offentlige sundhed hvor der var en udbredt tro det smitsomme sygdom ville være en svøbe af fortiden. Inden for et par korte årtier begyndte denne optimisme at aftage, som patogen efter patogen udviklet resistensmekanismer, der begrænsede disse engang mirakuløse behandlinger. For nogen tid syntes våbenkapløb mellem drug discovery indsats og patogener afbalanceret. Dog har misbrug af antimikrobielle stoffer for nylig kulminerede i fremkomsten af pan-resistente stammer af Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescensog P. aeruginosa1, 2,3,4.

P. aeruginosa er en opportunistisk, gram negative, multi vært patogen, der er en alvorlig trussel mod patienter med alvorlige forbrændinger, dem, der er immunkompromitterede eller har cystisk fibrose. Det er også i stigende grad identificeret som en udløsende agens i svær nosokomielle infektioner, især på grund af dens igangværende erhvervelse af antimikrobiel resistens. Til at begynde at imødegå denne trussel, har vi brugt de veldokumenterede C. elegans-P. aeruginosa infektion system5. Vores lab har leveraged dette system til at udvikle en væskebaseret, høj overførselshastighed, high-indhold screening platform for at identificere nye forbindelser, der begrænser patogenet evne til at dræbe vært6. Intriguingly, synes disse forbindelser at tilhøre mindst tre generelle kategorier, herunder antimikrobielle stoffer7 og virulens hæmmere8. Andre high-indhold drug discovery assays i C. elegans er blevet rapporteret til Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, og Enterococcus faecalis, blandt andre9,10,11,12,13,14,15,16. Disse typer af assays har flere velkendt fordele, såsom begrænsning af falske positive hits, der kan være giftige for både vært og patogen, øget sandsynlighed for biotilgængelighed i forhold til en kemisk skærm, og evnen til at identificere hits ud over blot begrænse mikrobiel vækst, såsom anti-virulents, immun stimulerende molekyler eller forbindelser, der ellers vipbar balancen i vært-patogen interaktionen til fordel for førstnævnte. Derudover er forbindelser opdaget i disse skærme ofte effektiv i pattedyr værter.

Det er værd at bemærke, at mindst to andre assays17,18 rådighed til at udføre høj overførselshastighed skærme i C. elegans i væske. Hver af disse assays er imidlertid en ændring, der tillader den prototypiske tarm-kolonisering assay, kendt som sen-drab, der skal udføres i flydende, øge gennemløb og giver forbindelser til at være mere let screenet. Omhyggelig karakterisering har endegyldigt viste, at mekanismerne for bakteriel virulens er forskellige mellem disse assays og vores væske-baseret skærm7. Da begge typer af virulens er observeret i pattedyr systemer, er det vigtigt at overveje, hvilke virulens determinant er mest relevante for eksperimentatorens interesser forud for analysen udvalg.

Her viser vi en optimeret version af de væskebaseret C. elegans-P. aeruginosa assay. Vi rapporterer også tilpasning af vores væske-baseret analyse metode til at rumme de gram-positive bakteriel patogen Enterococcus faecalis. Ligesom P. aeruginosaidentificeres E. faecalis stadig som en alvorlig nosokomielle trussel med en voksende bevæbning af antimikrobiel resistens veje1. Selv om en tidligere metode for high throughput screening af E. faecalis findes14, kræver det preinfection med det patogen, der komplicerer proceduren og øger sandsynligheden for kontaminerende udstyr som COPAS FlowSort. Vores protokol eliminerer behovet for før inficeringen, forbedre sikkerhedsprofilen. Endelig, vi rapportere et middel, hvormed enten af disse assays kan kombineres med fodring RNAi, tillade bruger hen til ransage for værten faktorer, der spiller en rolle i oprettelsen af, eller resistens over for infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsigtig: P. aeruginosa og E. faecalis er biosikkerhedsniveau 2 patogener, og korrekte sikkerhedsforanstaltninger skal træffes til at forhindre utilsigtet infektion og at minimere forurening af overflader. Alle medier og materialer, der kommer i kontakt med patogener skal være steriliseret og/eller kasseres. Yderligere retningslinjer er tilgængelige fra CDC publikation biosikkerhed i mikrobiologiske og biomedicinske laboratorier (BMBL), 5th edition.

1. forberedelse og vedligeholdelse af P. aeruginosa

  1. Streak P. aeruginosa fra en frossen bestand på en LB (Lysogeny bouillon) agar plade. Inkuber 16 til 24 timer ved 37 ° C
    Bemærk: Udføre P. aeruginosa eksperimenter i en BSL-2 biologiske sikkerhed kabinet at sikre sterilitet. Brug passende sikkerhedsforanstaltninger til at minimere risikoen for patogene smitte eller kontaminering.
  2. Overføre denne plade til 4 ° C. Denne plade kan opbevares ved 4 ° C og anvendes til podes kulturer i op til en uge. Efter en uge, dekontaminering og kassér pladen og foretage en ny LB streak plade.
    Bemærk: P. aeruginosa virulens falder efter længere tids opbevaring.
  3. To dage før opsætning af assay plader, podes 3-5 mL sterilt LB bouillon med en enkelt koloni af P. aeruginosa fra pladen lavet i 1.1. Der inkuberes ved 37 ° C i 12 til 16 timer.
    Bemærk: Ikke udruge længere end 16 h. I rige flydende kulturer begynder P. aeruginosa PA14 at lyse.
  4. Forberede sterile 10 cm plader med langsom dræbe media (3 g NaCl, 3.5 g pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL af fosfat buffer (beløb pr. liter: 132 mL K2HPO4 (1 M) og 868 mL KH2PO4 (1 M)) og 18 g agar/L).
    Bemærk: Forberede plader før tid. De kan opbevares i op til 3 uger i en lufttæt beholder ved 4 ° C.
  5. Frø hver 10 cm langsom dræbe plade (SK plade) med 350 μl af P. aeruginosa fra Frisk overnight LB kultur. Ved hjælp af en steril bakteriel spreader, sprede bakterier jævnt over hele overfladen af medier og lad tørre i en BSL-2 biologiske sikkerhed kabinet.
  6. Inkuber plader ved 37 ° C i 24 timer.

2. forberedelse af RNAi bakterier

  1. Streak ud eller pin-overførsel ønskede stammer af RNAi-holdige bakterier på LB agar plader der indeholder passende antibiotika (carbenicillin på 100 µg/mL) og tetracyklin på 15 µg/mL for Ahringer og Vidal biblioteker fra en frossen bestand.
    Bemærk: Når du arbejder med nonpathogenic bakterier, bruge Andersen BSL-2 / B biologiske sikkerhed kabinet eller en BSL-1 laminar flow hætte til at sikre, at steriliteten af kulturer og at minimere risikoen for krydskontaminering af biblioteket.
  2. Inkuber plader i 24 timer ved 37 ° C.
  3. Gemme plader ved 4 ° C i op til to uger.
    1. Efter to uger, kassere pladerne og erstatte dem med frisklavet plader.
  4. Teste flere RNAi stammer parallelt ved at individuelt vaccinere en enkelt koloni fra hver klon til 4 mL af carbenicillin-suppleret LB i en enkelt godt af en 24-godt dybt-godt plade eller i en steril reagensglas.
    Bemærk: Tetracyklin er blevet rapporteret til at reducere effektiviteten af RNAi. Brug det ikke i dette medie.
  5. Placer 24-godt dyb brønd plader i en rystende inkubator optimeret til flerhulsplader og inkuberes ved 37 ° C i 16 h mens ryste på 950 rpm.
    Bemærk: Det er svært at opnå ensartet bakterievækst i flerhulsplader ved hjælp af en konventionel ryster inkubator. De ryster inkubator skal være i stand til at ryste som et minimum på 750 rpm for at kulturer til at vokse ordentligt. I mangel af en specialiseret shaker er det muligt at dyrke hver kultur i en individuel tube. Kulturer kan blive overført til den 24-godt plade til centrifugering bagefter, hvis det ønskes.
  6. Indsamle bakterier ved centrifugering i 5 minutter ved 2.000 x g.
  7. Dekanteres af invertere pladen og ryste voldsomt. Resuspend RNAi bakterier i 100 µL af S Basal (5.85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4 opløst i 1 L ultrarent vand og steriliseres ved autoklavering).
  8. Der afpipetteres resuspenderet bakterier i et passende antal brønde i en multiwell NGM plade (Nematode vækst medier, 3 g NaCl, 2,5 g pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL af fosfat buffer (beløb pr. liter: 132 mL K2HPO4 (1 M) og 868 mL KH2PO4 (1 M)), og 18 g agar pr. liter vand) suppleret med IPTG (1 mM slutkoncentration) og carbenicillin (100 μg/mL endelige koncentration).
    1. Bruge 3,5 mL af NGM media pr. brønd 6-godt plade, 1 mL pr. brønd af en 24-godt plade eller 150 µL pr. brønd af 96-brønd plade.
    2. Bruge 100 μL/brønd af bakterier til 6-godt plade; 50 μL/brønd for 24-godt; eller 20 μL/brønd til 96-brønd plade. Lad det tørre.
      Bemærk: Tørring er normalt udføres i en steril flow hætte til at fremme hurtig og ensartet tørring. Ensartet tørring er meget vigtigt. Undgå over tørring, som revner i agaren fremme gravende af orme. Dette fører til orm tab og potentielle tilstopning af væske-håndtering systemer.
  9. Bruge rede pladerne straks eller gemme dem på 4 ° C i op til to uger til senere brug.
    Bemærk: For at forhindre plader fra udtørring, de kan forseglet med plastik paraffin film eller anbringes i en tæt lukket beholder med fugtige papirservietter.

3. vedligeholdelse og forberedelse af C. elegans

Bemærk: Før du indleder eksperimenter, generere en synkroniseret befolkningen i fælderne, voksen tvekønnede orme som følger.

  1. Vask fælderne voksne (dvs. med flere embryoner synlige inden for gonade) fra 4-6 10-cm NGM plader i en 15 mL konisk slange ved at tilføje 4 mL S Basal plade, hvirvlende forsigtigt, og derefter hælde i en 15 mL konisk slange.
  2. Pellet orme via centrifugering ved 1.000 x g i 30 sekunder.
  3. Aspirat supernatanten, pas på ikke for at forstyrre orm pelleten.
  4. Tilsættes 3,5 mL orm blegemiddel (slutkoncentration 0,5 M NaOH, 1% natriumhypochlorit, i sterilt vand) til orm pellet og mix af invertere i 1 minut.
  5. Kort vortex og centrifugeres ved 1.000 x g i 30 sekunder.
  6. Opsug eller dekanteres, pas på ikke for at forstyrre orm pelleten.
  7. Tilsættes 3,5 mL frisk orm blegemiddel til orm pellet.
  8. Energisk Bland orme i blegemiddelopløsning. Jævnligt (omkring hvert tiende sekund) Inspicér visuelt orme under et dissekere mikroskop. Hold øje med orm neglebånd at bryde, frigive æg. Når de fleste af de voksne orme har været opløst (~ 95%), fortyndes blegemiddel til 15 mL med Basal S at stoppe fordøjelsen.
    Bemærk: Æggeskaller er mere modstandsdygtige over for blegemiddel end voksne væv, men de kan opløses under langvarig eksponering. For at undgå æg opløsning, Udsæt ikke æg for at ormen blegemiddelopløsning til længere end 7 minutter. Hvis æggeskaller er alt for beskadiget, vil embryoner dø.
  9. Pellet embryoner på 1.000 x g for 30 sekunder og Opsug eller dekanteres uden at fjerne pellet af embryoner.
  10. Resuspend orme i S basal til en endelige mængden af 15 mL til at fortynde resterende blegemiddelopløsning.
  11. Gentag trinene vask, (3.9-3.10) tre gange mere for i alt 4 træk vasker.
  12. Efter den fjerde vask, Aspirér supernatanten og tilføje til 5 eller 6 mL sterilt S Basal ind i 15 mL konisk rør. Målet er at resuspend embryoner til en koncentration af ~ 50 orme pr. µL.
    Bemærk: Mængden af S Basal afhænger af størrelsen af æg pellet; jo større pellet, mere S Basal er nødvendige.
  13. Inkuber den koniske rør natten på en tabel-top rotator ved stuetemperatur eller 48 h på 15 ° C. Larverne vil udklækkes, men larve udvikling vil anholde på stadiet L1 (L1 diapause) på grund af næringsstof afsavn.
  14. Undersøge embryoner under en dissekere mikroskop for at kontrollere, at de fleste af dem har udklækket og anholdt på L1-udviklingstrin.
  15. Bestemme optællingen ormen ved at tage 20 µL af ormen prep og fortynde det med 80 µL af S Basal. Tilsæt 10 µL fortyndede orm opløsning direkte på en tom NGM tallerken. Gentag 2 gange mere.
    1. Tælle larver i hver plet og bestemme det gennemsnitlige antal. Opdele dette gennemsnit af 2 at få en omtrentlig optælling af orme pr. µL i orm prep. Ormen preps kan derefter bruges til formering plader eller eksperimenter.
      Bemærk: Efter 4-5 dage, udsultet larver vil begynde at dø; Kassér prep på dette punkt.
  16. Formeringsmateriale fra stammen, pipette et passende antal L1 orme (5.000-6.000) på 3-4 10-cm NGM plader spottet med koncentreret OP50 E. coli- "superfood" (E. coli OP50 spottet på 25 X koncentration (dvs. 1 L af natten OP50 kultur dyrket i LB udbytter 40 mL 25 X OP50 superfood); 2 mL af denne koncentrerede bakteriel suspension er spottet på hver 10 cm NGM tallerken).
  17. Benyt en af følgende (i "grundlæggende" Brug 3.17.1 protokolopsætningen for "RNAi skærmen oprettet" Brug trin 3.17.2 - 3.17.4 som passende) for at forberede plader til eksperimenter:
    1. Pipette ~ 5.000 orme/10 cm plade seedede med RNAi eller OP50 superfood.
    2. Pipette ~ 500 orme/godt i en 6-godt plade seedede med RNAi.
    3. Pipette ~ 300 orme/godt i en 24-godt plade seedede med RNAi.
    4. Pipette ~ 100 orme/godt i en 96-brønd plade seedede med RNAi.
      Bemærk: For instruktioner om, hvordan RNAi var seedet henvises til trinene 2,7-2.9 i forberedelse af RNAi bakterier.
  18. Hvis der bruges en frugtbar stamme af orme Inkuber orme ved 25 ° C til ~ 44-48 h. Brug disse orme så hurtigt som muligt efter at befolkningen har nået en passende alder. Dette minimerer virkningen af æg udrugning inden for ormene under analysen.
  19. Hvis stammen, der bliver brugt er temperatur-steril (f.eks. fer-15(b26); fem-1(hc17) eller glp-4(bn2)), inkuberes orme ved 15 ° C for ~ 16 h og derefter overføre til 25 ° C til 44 h at fuldføre udvikling og forebygge embryogenese.

4. flydende dræbe Assay opsætning (grundlæggende protokol)

Bemærk: Dette er en protokol til en bakteriel stamme og en kilde til orme.

  1. Bruger en celle skraber, fjerne P. aeruginosa fra en SK plade og resuspend i ~ 5 mL S Basal. Skalere hvis det er nødvendigt. Måling af Ekstinktionen af bakteriel suspensionen ved hjælp af et spektrofotometer (OD600)
  2. Forberede 24 mL fortyndet bestand af P. aeruginosa i S Basal på OD600 ≈ 0,09 (3 X endelige koncentration). Se 4.6.2 for endelige indhold pr. brønd og skalere volumen af bakteriel fortynding i overensstemmelse hermed.
  3. Tilføje 21 mL flydende langsom dræbe media (3 g NaCl, 3.5 g pepton/l suppleret med CaCl2 og MgSO4 til en endelig koncentration på 1 mM). Ved hjælp af en multikanalpipette, overføre 45 µL af bakterier og medier til hver brønd af et 384-godt plade.
  4. Vaske orme fra kilden (dvs.trin 3.17.1) i en 50 mL konisk slange og tillade orme at bilægge under gravitationel kraft. Aspirat supernatanten til 5 mL. Resuspend i alt 50 mL S basal.
  5. Gentag trin 4.4 to gange.
  6. Bruger en worm sorteringsanlæg, sortere ca 22 orme i hver brønd af 384-godt plade.
    Bemærk: Opsætning dråber hver orm i ~1.1 µL af væske. 22 orme vil beløbe sig til 25 µL, overbringe samlede assay volumen til 70 µL/brønd.
    1. Den endelige sammensætning af hver brønd består af 70 µL. 45 µL af denne diskenhed er tilføjet som bakteriel medium (0,03 OD600 bakterier i 24 µL S Basal, og 21 µL SK suppleret med CaCl2 og MgSO4). De andre 25 µL er tilføjet med en af 22.
    2. Hvis sorteringsanlæg bruges her (Se Tabel af materialer) er ikke tilgængelig, orme kan fortyndes til en endelig koncentration på 1 orm/µL i S Basal og pipetted 25 µL/brønd ved hjælp af en multikanalpipette. Dog, resultaterne kan udvise øget variation. Alternativt er det muligt at bruge en peristaltiske flydende dispenser, som beskrevet af Leung og kolleger19.
  7. Efter orme er blevet sorteret i 384-godt pladen, forsegle pladen med en gas-gennemtrængelige film og inkuberes plader ved 25 ° C i 24-48 timer.
  8. På det ønskede tidspunkt, bruge en mikrotiterplade skive for at vaske 384-godt plade med S Basal ialt 5 gange.
    1. Efter den anden vask, Aspirér de fleste medier, forlader ~ 20 µL. kraftigt ryste plader ved hjælp af en mikrotiterplade vortexer i mindst 30 sekunder til at løsne snavs fra bunden af brøndene).
  9. Efter den sidste vask, aspirat supernatanten ned til 20 µL. tilsættes 50 µL af 0,98 µM nukleinsyre pletten (Se Tabel af materialer) / godt af 384-godt plade, til en slutkoncentration på 0,7 µM.
  10. Inkuber ved stuetemperatur i 12-16 timer. Dette farvestof vil kun pletter døde orme. Efter den ønskede inkubationstid pletten vask plader ved hjælp af mikrotiterplade vaskemaskinen til at fjerne overskydende (minimum 3 vasker).
  11. For dataopsamling, brug et spektrofotometer eller en automatiseret mikroskop til billede både lys og fluorescens (531 nm excitations- og 593).
    1. Brug en lav forstørrelse mål for at give et billede af hele brønden at blive fanget.
    2. Alternativt kan du bruge flow vermimetry. Denne teknik bruger et stort objekt flow Flowcytometret som en orm fluorimeter, måling af størrelse og fluorescens af hele organisme (dvs., C. elegans) i en mode, der stærkt ligner flowcytometri.
  12. Bruge automatiserede billede analyse software (såsom CellProfiler, en gratis billede analyse studie baseret på MatLab http://cellprofiler.org/) til at beregne de fluorescerende og samlede orm områder pr. brønd på en saglig måde.
    Bemærk: Kvotienten for disse tal repræsenterer brøkdel død til hver brønd. Hvis en godt havde farves 7 orme ud af 20 samlede, så brøkdel død består af 0,35 eller 35%.
    1. Før første brug, skal automatiseret billedbehandling rørledningen valideres af manuelle scoring. Dette gøres ved at sammenligne resultaterne fra de automatiserede pipeline til score opnået ved visuelt inspicere billeder og optagelse brøkdele af døde orme for hver af dem. Valideringsprocessen sikrer, at parametre for automatiseret billedbehandling forarbejdning er nøjagtige og repræsentere dataene korrekt.

5. tilpasning til Screening flere C. elegans stammer eller Knockdowns (RNAi skærmen Setup)

Bemærk: Dette er et RNAi skærmen beskrevet for en 24-godt plade setup.

  1. Der tilsættes 1 mL af S Basal pr. brønd af en 24-godt plade (Se trin 3.17.3). Forsigtigt agitere orme ved at ryste pladen, derefter overføre orme til en tom, sterile 24 deep-godt plade. Tillad orme at bilægge gravitationelt (~ 5 minutter).
  2. Aspirat supernatanten, forlader omkring 1 mL. 7 mL S Basal tilsættes til hvert hul.
  3. Gentag trin 5.1-5.2 et minimum af 2 flere gange. Efter sidste vask, Aspirér supernatanten, forlader ca 400 µL.
  4. Bruger funktionen Resampler af ormen sorteringsanlæg, sortere 22 orme fra 24-godt plade orm suspension i hver brønd af et 384-godt plade (hver brønd af en 24-godt plade udbytter 8-12 brønde i en 384-godt plade).
    1. For at undgå sult, afpipetteres bakterier i 384-godt plader (enten en stamme, der tjener udelukkende som mad, såsom OP50, eller en patogene stamme) forud for sortering.
      Bemærk: Patogener kan tilføjes følgende trin 2,3-2,5 eller 6,4-6,5 og fødekilde bakterier kan fortyndes og tilføjet ved at følge den samme ordning for P. aeruginosa.
  5. Efter orme er blevet sorteret i 384-godt pladen, tilføje små molekyler eller andre eksperiment-specifikke materialer.

6. tilpasning til E. faecalis

Bemærk: Kun forskelle fra P. aeruginosa assay er beskrevet.

  1. Forberede en frisk kilde til E. faecalis af striber bakterier fra en frossen bestand på en BHI (hjernen hjerte Infusion) agar plade og inkubere i 16-24 timer ved 37 ° C.
    Bemærk: Udføre E. faecalis eksperimenter i en BSL-2 biologiske sikkerhed kabinet at sikre sterilitet. Brug passende sikkerhedsforanstaltninger til at minimere risikoen for patogene smitte eller kontaminering.
  2. Pladerne kan opbevares ved 4 ° C i op til en uge. Efter denne periode, erstatte med en ny plade.
  3. Aftenen før sortering orme, podes 3-5 mL sterilt BHI med en enkelt koloni af E. faecalis. Inkuber 12-16 timer ved 37 ° C med agitation.
  4. Tilføje bakterier til brønde som for P. aeruginosa (3 x bakterier i S Basal, OD600≈0.09).
    Bemærk: For E. faecalis, den endelige godt sammensætning er: E. faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10% v/v, med den resterende mængde består af S basal. Husk, at 25 µL af S basal vil blive leveret med orme.
    Bemærk: E. faecalis producerer tykke biofilm, der absorberer de fluorescerende plet, der forårsager uskarpe billeder. Omfattende vask kan være utilstrækkelige til at fjerne denne biofilm. Orme kan i dette tilfælde overføres til en tom plade ved hjælp af en multikanalpipette. For at lette overførslen, kan Tween 20 føjes til S Basal til en endelig koncentration på 0,1% (v/v) Tween 20 i S Basal. Dette aids i at fjerne orme fra biofilm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vigtige parametre for analysen ydeevne

En korrekt forståelse af den biologi, der ligger til grund for denne analyse er nødvendig for fejlfinding og optimering af analysen. I forbindelse henviser vi først til flere vigtige papirer belyse mekanismerne i patogenesen af P. aeruginosa-medieret drab i flydende7,20. Forudsat at trinene ovenfor følges (Se figur 1 for en skematisk af assay protokol) observeret en tidsafhængig drab af C. elegans kun ved tilstedeværelse af patogen (figur 2A). I modsætning hertil, i mangel af centrale kosttilskud (f.eks., hvis pepton er udeladt af medierne, og kun S Basal tilføjes), vil lidt at ingen drab observeres (figur 2B). Interessant, er to-trins inkubation af P. aeruginosa (i 24 timer ved 37 ° C, derefter 24 timer ved 25 ° C), som er afgørende for konventionelle langsom-drab assays, og var oprindelig gennemført i flydende drab21, undværes i dette assay ( Figur 2 c). Mens det er muligt at tilføje P. aeruginosa lige fra overnatning LB kultur, gør det væsentligt ændrer dødelighed kinetik og anbefales ikke.

Forståelse assay biologi giver også forenkling af analysen, hvis passende og ønskeligt. For eksempel, den vigtigste drivkraft for vært drab i dette assay er siderophore pyoverdine, og værten toksicitet forårsaget af pyoverdine er betinget af dens evne til at binde jern7. Som sådan, kan analysen forenkles ved at erstatte pyoverdine-rige filtratet, renset pyoverdine eller endda nogle syntetiske jern-chelaterende kemikalier (fx 1,10-phenanthroline) for levende bakterier, som det transkriptionel svar af C. elegans til disse behandlinger er meget lignende (figur 3)22.

Flere forskellige linjer af beviser tale til robustheden af opsætningen af eksperimenterende. Først, setup tåler en bred vifte af indledende bakteriel koncentrationer. Koncentrationer OD600 = 0.0025 (ca 10-fold lavere end anbefalet) stadig udstille afhængig af tid og koncentration drab, selv om timingen Skift (figur 4A). Andet reproducerbarhed af analysen er det sådan, at så få som 4 brønde er ofte tilstrækkelig til at opnå statistisk signifikante data (figur 4B).

Der er flere ændringer, som vi ikke anbefale. For eksempel ved hjælp af indledende bakterier inocula med koncentrationer meget højere end dem, der er anført i protokollen; gøre resultatet så tyk, biofilm-lignende materiale, der er vanskeligt eller umuligt at effektivt vaske væk, hvilket komplicerer scoring dødelighed. Desuden kan høj koncentration bakterielle inocula også konkurrere for ilt og udløse uspecifikke vært drab7.

En anden betydelig kommentar er at begrænse perioden mellem stoppe analysen og imaging de døde orme. Bemærk, at denne tidsramme skal omfatte farvning, så det er afgørende at være effektiv. Efter død begynder det biologiske materiale inden for orme til ekstrudering og/eller indtages af bakterier. I løbet af 24-32 h forbliver kun hårstrået. Hårstrået pletter meget dårligt og er meget lys, hvilket gør det let at miste under vasker. Det er vigtigt at bemærke, stammer eller stamme/RNAi betingelser med meget forskellige kinetik af drab kan være kompliceret af dette fænomen (dvs. nogle orme kan stadig være i live, mens andre har allerede mistet deres indhold og er umulige at billede). Figur 4A viser dette fænomen, som orme på venstre side af pladen, podes med meget lave indledende bakteriel koncentrationer, er stadig i vid udstrækning i live mens orme på højre side af pladen, der blev udsat for meget højere koncentrationer af bakterier, er blevet vasket væk.

En meget vigtig determinant for analysen succes er den metode til at indsamle og analysere data. I vores laboratorium, vi har brugt mindst tre metoder til indsamling af data fra disse assays: spektrofotometri, automatiseret mikroskopi og flow vermimetry (dvs. tilpasning af flow flowcytometri teknikker til C. elegans, bogstaveligt talt, måling af orme i en flydende løsning). Først af disse metoder bruger en spectophotometer til at læse fluorescens dye eller reporter for de pågældende orm. Denne metode har fordelen ved hjælp af en forholdsvis allestedsnærværende stykke udstyr (Spektrofotometer standard med en mikrotiterplade læser) og er den hurtigste metode til at erhverve data. Men det mangler det informative indhold tilgængeligt fra automatiseret mikroskopi og den statistiske effekt af flow vermimetry.

Automatiseret mikroskopi er en anden holdbar løsning. En række mikrotiterplade Billeddannende systemer er i øjeblikket på markedet, der spænder i priser, der er overkommelige for en enkelt investigator (f.eks. en Bio-Tek Cytation5) til større og dyrere og bedre maskiner, der er mere almindeligt forekommende i core faciliteter (f.eks. en molekylære enheder ImageXpress mikroskop). I praksis er de fleste af disse løsninger modtagelig for scoring de fleste skærme og assays. Mest automatiseret billedbehandling platforme kan også kobles til downstream-software til billedbehandling (f.eks. MetaMorph, ImageJ, Gene5 eller cellen Profiler) for yderligere at udbyttet af oplysninger. Eksempler på nytten af behandling er vist i figur 5 og figur 6. Når signal-støj-forholdet er højt (som i figur 5), analyse er enkel og diskriminere mellem positive og negative betingelser er trivielt. I disse tilfælde, kan selv svagt hits nemt identificeres. Mange assays, men har en svagere signal / støj-forhold. For eksempel, øger behandling af PINK-1::GFP22 orme (med konstitutiv mCherry udtryk i deres pharynges) med 1,10-phenathroline niveauet af PINK-1::GFP. Til dataanalyse, er inducerbar normal god landbrugspraksis reporter normaliseret til det konstituerende mCherry signal (figur 6). I dette tilfælde reporter har svagere udtryk og/eller er ikke aktiveret i størstedelen af ormene. Derfor kan gennemføre yderligere billedbehandling værktøjer, som cellen Profiler, der kan reducere baggrund og forstærke signalet være fordelagtige.

Endelig, hvis en COPAS FlowPilot er tilgængelige, det kan bruges til at hente data via flow vermimetry. Meget ligesom de mere velkendte begrebet flowcytometri, kan dette instrument bruges til at måle fluorescens af C. elegans i mindst to eller tre kanaler ad gangen. Denne metode er meget modtagelig for erhvervelse af data med høj Statistisk signifikans, men gennemløb er meget formindsket i forhold til automatiseret mikroskopi. Den mest markante fordel ved flow vermimetry er i evnen til at analysere hele orm befolkninger som en enkelt gruppe for en replikeres i stedet opdele dem i flere brønde og analysere gennemsnittet af brøndene. Analysere store grupper i denne mode dramatisk forbedrer den statistiske effekt og giver mulighed for påvisning af selv små effekter.

Ændringer af flydende drab analysen

Den seneste udvikling af analysen har udvidet sin nytte ved herunder boltpistoler aktivering af fluorescerende journalister (figur 6), ved hjælp af medium til høj overførselshastighed RNAi teknikker (figur 3), og selv substitution af oprindelige patogenet.

Den mest indlysende grund til at bruge RNAi oprettet er at teste for værten forsvar veje mod P. aeruginosa (eller andre patogener). Eksempler på RNAi knockdown af gener, der er relevante for overlevelse i analysen er vist i figur 3. I overensstemmelse med tidligere bemærkninger20,23,24,25, daf-2(RNAi) forbedret C. elegans overlevelse under eksponering til P. aeruginosa, mens daf-16 ( RNAi), zip-2(RNAi) og cebp-1(RNAi) forkortes det. Som bemærket, er RNAi mest blot inkluderet i analysen voksende orme på flerhulsplader hvor hver godt indeholder en anden RNAi klon. Høj viskositet agar og små mængder involveret er det vanskeligt at opnå ensartet, boble-gratis påfyldning af 96-brønd plader uden specialudstyr. Desuden kan tørring bakteriestammer transporterer RNAi også være et problem, som ydre brøndene tørre hurtigere end indre wells, fører til ikke-ensartethed og betydelige potentiale for agar revner. Som nævnt ovenfor, tilskynder den orme til graver, reduktion af antallet af dyr, der er tilgængelige for screening og risici tilstopning væske-håndtering maskiner. For begge disse grunde er 24-godt plader lettere at arbejde med end 96-brønd plader. Selvom dette reducerer assay overførselshastighed, det forbedrer pålidelighed, og foreslås, især for første skærme.

Endelig, er analysen blevet ændret assay for at erstatte P. aeruginosa med E. faecalis. (I princippet substitution med andre bakteriearter bør ikke give unødig vanskeligheder, forudsat at passende dyrkning og eksponeringsforhold identificeres.) Den vigtigste faktor til at overveje er kravene medier af patogenet, både for vækst og udvikling og til induktion af virulens. For eksempel, kræver Gram positive, opportunistisk patogen E. faecalis næringsrige medier (som BHI) og inkubation ved højere temperaturer i forhold til P. aeruginosa14,26. Ved at tage disse faktorer i betragtning, tilpasning af den assay bruge E. faecalis var ligetil. Som nævnt P. aeruginosa, så vi tidsafhængig drab (figur 7). Interessant, var timingen af død svarende til tidligere offentliggjorte assays, der anvendes før inficeringen agar plader26, trods manglen på dette trin, som kan tyde på, at de mekanismer, der er involveret i patogenesen varierer.

Figure 1
Figur 1: ordningen for væskebaseret C. elegans P. aeruginosa infektion assay. Skridt involverer ødelægge formering og forberedelse er på venstre side, bakteriel forberedelse til højre. Skridt involverer begge er centreret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Aflivning af C. elegans af P. aeruginosa er specifikke og kræver ordentlig bakteriel ernæring. (A) C. elegans død E. coli og P. aeruginosa. (B) C. elegans død i overværelse af P. aeruginosa med (højre) og uden (venstre) langsomt dræbe medier tilføjet til mix (dvs., S basal kun). S Basal er en minimal medier og indeholder ikke de næringsstoffer, der kræves for bakteriel vækst og er til hinder for produktion af pyoverdine. (C) C. elegans død i overværelse af forskelligt rede P. aeruginosa. p < 0,01, baseret på Student's t-test. Fejllinjer udgør S.E.M. 10 brønde blev brugt pr. biologiske replikat pr. betingelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: C. elegans modstand mod P. aeruginosa afhænger vært immun veje. Et panel af valgte RNAi knockdowns blev behandlet med enten P. aeruginosa (A) eller 1,10-phenanthroline (en kemiske chelator, der efterligner eksponering for P. aeruginosa i væske) (B). p < 0,01, #p < 0,05, baseret på Student's t-test. Fejllinjer udgør S.E.M. 10 brønde blev brugt pr. biologiske replikat pr. betingelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: C. elegans drab af P. aeruginosa er robust og afhænger af bakteriel koncentration. (A-B) repræsentative billeder (A) og kvantificering (B) C. elegans død efter eksponering for varierende koncentrationer af P. aeruginosa for 72 h. p-værdier blev beregnet på grundlag af studerendes t -test. Skalalinjen i (A) er 1 mm. 16 wells blev brugt pr. biologiske replikat pr. betingelse. BF: Lyse felt, FL: fluorescens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: databehandling erhvervelse og billedet af en assay med et stærkt signal. (A) repræsentative billeder af live (negativ kontrol) og døde (positiv kontrol) C. elegans. (B) statistiske analyse af negative og positive kontrol baseret på data erhvervelse metode, tilstand for behandling og antallet af brønde analyseret. (C) Fluorescens blev analyseret for orme fra fire individuelle brønde på en 96-brønd plade (to positive og to negative kontrolhullerne). Hver indeholdt godt ~ 100 orme. Hver prik på grafen repræsenterer en enkelt orm, viser den time of flight, (som korrelerer med, men på grund af coiling af levende orme ufuldkomment repræsenterer størrelse) og den målte fluorescens for orme, der farves med Sytox Orange. Positiv kontrol orme blev præ dræbt af varme eksponering. Ændringer i spænding og form af døde orme (som kan ses i(), den døde orme vises mere stang-lignende og har få kroppen bøjninger) sammenlignet med deres levende modstykker, døde orme har en længere TOF. p-værdier blev beregnet på grundlag af Student's t-test. Skalalinjen i()er 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: databehandling erhvervelse og billedet af en assay med en moderat signal. (A) repræsentative billeder af C. elegans transporterer en inducerbar PINK-1::GFP reporter og en mCherry konstituerende markør (for at normalisere udtryk af gener fra extrachromosomal array). C. elegans udsat for DMSO (negativ kontrol) eller 1,10-phenanthroline (positiv kontrol). (B) statistiske analyse af negative og positive kontrol baseret på data erhvervelse metode, tilstand for behandling og antallet af brønde analyseret. (C) fire individuelle brønde på en 96-brønd plade (to positive og to negative kontrolhullerne) blev analyseret ved hjælp af flow vermimetry. p-værdier blev beregnet på grundlag af Student's t-test. Skalalinjen i()er 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: C. elegans drab af E. faecalis er robust og tid afhængige. (A-B) repræsentative billeder (A) og kvantificering (B) C. elegans død efter udsættelse for E. faecalis. p < 0,01, baseret på Student's t-test. 10 brønde blev brugt pr. biologiske replikat pr. betingelse. Fejllinjer udgør S.E.M. skalalinjen i (A) er 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne analyse (eller lignende assays hvor andre patogener er stedet for P. aeruginosa eller E. faecalis) er nyttig for en række formål, herunder drug discovery. Det er også nyttigt for grundlæggende biologiske spørgsmål, såsom identificering af virulens faktorer, klarlæggelsen af vært forsvar, og fastlægge den lovgivningsmæssige maskiner involveret i vært-patogen interaktion.

P. aeruginosa flydende drab assay er robust, er der flere punkter hvor omhyggelig opmærksomhed skal betales til at minimere risikoen for svigt. Først, som bemærket, skal bakteriel kilde plade for P. aeruginosa vaccinationer forblive frisk, lest bakterier mister virulens, trods overnight vækst i LB. For det andet, det er nøglen til at sikre, at calcium og magnesium er føjet til P. aeruginosa dræbe assays. Uden det, vil virulens blive betydeligt kompromitteret. Endelig er det værd at bemærke, at orme opdrættes på HT115 (for RNAi-baserede assays) vil dø væsentligt senere end orme opdrættes på OP50 (N. Kirienko, personlig meddelelse). Af denne grund, hvis skifte til RNAi-baserede undersøgelser, er det vigtigt at empirisk bestemme det bedste tidspunkt for analysen.

For at dræbe assays med enten P. aeruginosa eller E. faecalis, er det afgørende at sikre, at der er tilstrækkelig føde for udviklingen af orme fra L1 fase, indtil de er klar til at blive brugt i analysen. Sult, selv på kort sigt, er kendt for at aktivere en række vært forsvar veje, såsom DAF-2/DAF-16 insulin/IGF signalering netværk27. Vores data tyder på, at DAF-16/FOXO aktiveres allerede lidt ved at blive kulturperler i flydende20, og yderligere aktivering er stærkt ønskeligt, da DAF-16/FOXO fremmer bredspektret patogen modstand23.

Endelig er det afgørende at bruge helt sterile orme i enhver assay, der bygger på dødelighed som en udlæsning. Hvis orme er frugtbar, forårsager der i flydende vanskeligheder i æglægning. Som et resultat, udklækkes nogle af embryonerne inden i den overordnede, i sidste ende forårsager dens død. Derfor bruger vi generelt en genetiske læsion, som glp-4(bn2)28, , viser en helt penetrant sterile fænotype for disse assays. Brugen af kemikalier, der forhindre embryonale udvikling, men stadig tillader æglægning, som 5-fluorodeoxyuridine (FUdR), bør undgås, da de også kan påvirke med bakteriel vækst og udvikling.

Generelt har vi fundet det ganske nyttigt at planlægge flere tidspunkter for analyse. Selvom analysen er robust og timingen er generelt konsekvente, kan stokastiske og umærkelig ændringer flytte timingen af død i analysen inden for 2-4 timer. Når fejlfinding er nødvendig, er det ofte nyttigt at overveje først den enkleste svar; dvs., forberede friske medier, kassere de seneste bakterielle kulturer og re streak bakterielle stammer fra frosne bestande, osv. , kun meget sjældent disse foranstaltninger ikke gendanne analysen til funktionalitet.

På grund af den relative enkelhed af metoden, kan der nemt udføres en lang række ændringer. Orme fra en ensartet glp-4(bn2) baggrund for høj overførselshastighed RNAi skærme som dem vi beskrive heri, er nyttigt at ændre til identifikation af host reaktion veje for en bred vifte af fremmedstoffer og giftige kemikalier. For eksempel, tilføjer den samme kemiske eller toksin i hver brønd af RNAi plader (f.eks. Cry5B toksin, phenanthroline, etc.), kan veje, der ændrer følsomheden over for disse toksiner nemt identificeres. Disse typer af skærme kan også bruges til at identificere forsvar netværk mod nogen af vifte af patogener, der inficerer C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har nogen interessekonflikter at videregive.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af kræftforebyggelse og Research Institute of Texas (CPRIT) Award RR150044, Welch Foundation forskning tilskud C-1930, og af de nationale institutter for sundhed K22 AI110552 tildeles NVK. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COPAS FP BioSorter Union Biometrica Large object flow cytometer/worm sorter
Cytation 5 BioTek
EL406 Washer Dispenser BioTek
Multitron Pro Infors HT
24 Deep-Well RB Block Thermo Fisher Scientific CS15124
384-Well plate Greiner Bio-One MPG-781091
Nematode Growth Media (NGM) Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) plates Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) media Amount per liter:  3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Lysogeny Broth (LB) USBiological Life Sciences L1520
Brian Heart Infusion broth (BHI) Research Products International Corp 50-488-526
Worm Bleach Solution Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water
S Basal Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water
Agar USBiological Life Sciences A0930
NaCl USBiological Life Sciences S5000
Peptone USBiological Life Sciences P3300
CaCl2 USBiological Life Sciences
MgSO4 Fisher Scientific M63-500
Phospate buffer amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)
KH2PO4 Acros Organics 7778-77-0
K2HPO4 USBiological Life Sciences P5100
5% Sodium Hypochlorite Solution BICCA 7495.5-32
NaOH solution Fisher Scientific SS255-1
Breathe-easy Diversified Biotech BEM-1
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Fisher Scientific S11368
Bacterial Strains
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Falagas, M. E., et al. Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 32, (5), 450-454 (2008).
  2. Hsueh, P. R., et al. Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 8, (8), 827-832 (2002).
  3. Wang, C. Y., et al. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes. Clinical Microbiology and Infection. 12, (1), 63-68 (2006).
  4. Yao, Y., et al. Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1. Genome Announcements. 5, (3), (2017).
  5. Utari, P. D., Quax, W. J. Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism. Trends in Microbiology. 21, (7), 315-316 (2013).
  6. Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model. Current Protocols in Chemical Biology. 6, (1), 25-37 (2014).
  7. Kirienko, N. V., et al. Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death. Cell Host & Microbe. 13, (4), 406-416 (2013).
  8. Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence. mSphere. 1, (4), (2016).
  9. Manning, A. J., et al. A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis. Methods. 127, 3-11 (2017).
  10. Marwaha, S., et al. N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, (5), 2968-2971 (2014).
  11. Kota, K. P., et al. Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection. PLoS One. 8, (1), e55167 (2013).
  12. Arif, M., et al. Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion. Journal of Biotechnology. 154, (1), 76-83 (2011).
  13. Jayamani, E., et al. Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61, (9), (2017).
  14. Moy, T. I., et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chemical Biology. 4, (7), 527-533 (2009).
  15. Rajamuthiah, R., et al. Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 9, (2), e89189 (2014).
  16. Breger, J., et al. Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay. PLoS Pathogens. 3, (2), e18 (2007).
  17. Garvis, S., et al. Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence. PLoS Pathogens. 5, (8), e1000540 (2009).
  18. Zhou, Y. M., et al. An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75, (9), 1746-1751 (2011).
  19. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visual Experiments. (51), (2011).
  20. Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (6), 1821-1826 (2015).
  21. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).
  22. Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response. Virulence. 1-41 (2018).
  23. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300, (5627), 1921 (2003).
  24. Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (5), 2153-2158 (2010).
  25. Tjahjono, E., Kirienko, N. V. A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genetics. 13, (6), e1006876 (2017).
  26. Moy, T. I., et al. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (27), 10414-10419 (2006).
  27. Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61, (5), 444-460 (2006).
  28. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116, (3), 755-766 (1992).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics