En høy gjennomstrømning, høyt innhold og vannbasert C. elegans Pathosystem

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her beskriver vi en protokoll som er tilpasningsdyktige, hele vert, høyt innhold screeningsverktøy som kan brukes til å studere vert-patogen interaksjoner og brukes for medisiner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (137), e58068, doi:10.3791/58068 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Antall nye stoffer identifisert av tradisjonelle i vitro skjermer har svekket, redusere suksessen til denne tilnærmingen i letingen etter nye våpen mot flere resistens. Dette har ført til konklusjonen at forskerne ikke trenger bare å finne nye stoffer, men må også utvikle nye måter å finne dem. Blant de mest lovende kandidaten metoder er hele-organisme, i vivo søk at bruk høy gjennomstrømning og fenotypiske readouts og vert som spenner fra Caenorhabditis elegans til Danio rerio. Disse vertene har flere kraftige fordeler, inkludert dramatiske reduksjoner i falske positive treff, som forbindelser som er giftige for vert og/eller biounavailable utelates vanligvis første skjermen før kostbare følge opp.

Her viser vi hvordan våre analysen er brukt til å forhøre vert variasjon i den godt dokumentert C. elegans,Pseudomonas aeruginosa flytende drap pathosystem. Vi viser også flere utvidelser av denne godt jobbet ut teknikken. For eksempel kan vi utføre høy gjennomstrømming genetisk skjermer bruker RNAi i 24 - eller 96-brønnen plate formater spørringen vert faktorer i denne verten-patogen samhandlingen. Bruker denne analysen, kan hele genomet skjermer gjennomføres på bare noen få måneder, som kan dramatisk forenkler oppgaven med å identifisere narkotika mål, potensielt uten behov for arbeidskrevende biokjemiske rensing tilnærminger.

Vi rapporterer også her en variant av vår metode som erstatter gram-positive bakterien Enterococcus faecalis for gram-negative patogen P. aeruginosa. Mye som er tilfellet for P. aeruginosa, er drepe av E. faecalis tidsavhengige. I motsetning til tidligere C. elegans-E. faecalis analyser, analysen vår E. faecalis ikke krever preinfection, forbedre sin sikkerhet profil og redusere sjansene for forurensende væske-håndtering av utstyr. Analysen er svært robust, viser ~ 95% dødelighet 96 h innlegget infeksjon.

Introduction

Identifisering og utviklingen av effektive, bredspektret antibiotika, nå nesten et århundre siden, førte til et vannskille øyeblikk i folkehelsen der det var en utbredt tro at smittsomme sykdommer ville være en svøpe fortiden. I noen få korte tiår begynte optimismen å avta, som patogen etter patogen utviklet resistens som begrenset disse en gang mirakuløse behandlinger. For noen tid syntes våpenkappløp mellom drug discovery innsats og patogener balansert. Men har misbruk av poesi aksent nylig kulminerte i fremveksten av pan-resistente stammer av Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescensog P. aeruginosa1, 2,3,4.

P. aeruginosa er en opportunistisk, gram negativ, multi-Host patogen som er en alvorlig trussel for pasienter med alvorlige forbrenninger, som er nedsatt immunforsvar, eller har cystisk fibrose. Det er også stadig identifisert som en utløsende agent i alvorlig nosokomiale infeksjoner, spesielt på grunn av pågående oppkjøpet av resistensutvikling. For å begynne å ta denne trusselen, har vi brukt den veldokumenterte C. elegans-P. aeruginosa infeksjon system5. Våre lab har utnyttet dette systemet for å utvikle en vannbasert, høy gjennomstrømning og høyt innhold screening plattform for å identifisere romanen forbindelser som begrenser patogen å drepe vert6. Intriguingly, synes disse forbindelsene å tilhøre minst tre generelle kategorier, inkludert poesi aksent7 og virulens hemmere8. Andre høyt innhold drug discovery analyser i C. elegans er rapportert for Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, blodlegemer, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, og Enterococcus faecalis, blant annet9,10,11,12,13,14,15,16. Disse typer analyser har flere anerkjente fordeler, for eksempel begrense falske positive treff som kan være giftig for både verten og patogen, økt sannsynlighet for biotilgjengelighet sammenlignet med en kjemisk skjerm, og evnen til å identifisere treff utover bare begrense mikrobiell vekst, som anti-virulents, immun stimulerende molekyler eller forbindelser som ellers vipper vert-patogen samhandlingen for den tidligere balansen. I tillegg er forbindelser i disse skjermene ofte effektive i pattedyr verter.

Det er verdt å merke seg at minst to andre analyser17,18 er tilgjengelig til å utføre høy gjennomstrømming skjermer i C. elegans i væske. Hver av disse analyser er imidlertid en endring som lar prototypiske intestinal kolonisering analysen, kjent som sakte-drapet, utføres i væske, øke gjennomstrømming og gir forbindelser til screenes lettere. Forsiktig karakterisering har definitivt vist at mekanismer for bakteriell virulens er forskjellige mellom disse analyser og våre vannbasert skjermen7. Siden begge typer virulens er observert i pattedyr systemer, er det viktig å vurdere hvilke virulens determinant er mest relevante for den eksperimentator interesser før analysen valget.

Her viser vi en optimalisert versjon av den vannbasert C. elegans-P. aeruginosa analysen. Vi rapporterer også tilpasningen av vår vannbasert analysen metode å imøtekomme gram-positive bakteriell patogen Enterococcus faecalis. Som P. aeruginosa, er E. faecalis stadig identifisert som en alvorlig nosocomial trussel med en voksende armament resistensutvikling veier1. Selv om en tidligere metode for høy gjennomstrømming screening av E. faecalis finnes14, krever det preinfection med patogen, som kompliserer prosedyren og øker sannsynligheten for forurensende utstyr som COPAS FlowSort. Våre protokollen eliminerer behovet for pre-smitte, forbedre sikkerhet profilen. Til slutt, vi rapporterer et middel som en av disse analyser kan kombineres med mating RNAi, tillater brukeren å søke for vert faktorer som spiller en rolle i etableringen av, eller resistens mot infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsiktig: P. aeruginosa og E. faecalis er grad 2 patogener, og riktige sikkerhetsforanstaltninger må tas for å hindre utilsiktet infeksjon og for å redusere forurensning av overflater. Alle medier og materialer som kommer i kontakt med patogener må bli sterilisert og/eller forkastet. Ytterligere retningslinjene er tilgjengelig fra CDC publikasjonen biosikkerhet mikrobiologisk og biomedisinsk Laboratories (BMBL), 5th edition.

1. forberedelse og vedlikehold av P. aeruginosa

  1. Strek P. aeruginosa fra en frossen aksje til en LB (Lysogeny buljong) agar plate. Inkuber 16-24 h på 37 ° C
    Merk: Utfør P. aeruginosa eksperimenter i en BSL-2 biologiske sikkerhetskabinett regjering å sikre sterilitet. Bruk nødvendige forholdsregler for å minimere sjansen for patogene infeksjon eller forurensning.
  2. Overføre denne platen til 4 ° C. Denne platen kan være bevart på 4 ° C og brukes til å vaksinere kulturer i opptil en uke. Etter en uke, sterilisering og kast platen og gjør en ny LB strek plate.
    Merk: P. aeruginosa virulens reduseres etter langvarig lagring.
  3. To dager før definere analysen plater, vaksinere 3-5 mL steril LB buljong med en enkelt koloni av P. aeruginosa fra platen i 1.1. Ruge på 37 ° C for 12 til 16 h.
    Merk: Ikke ruge lenger enn 16 h. I rike flytende kulturer begynner P. aeruginosa PA14 å lyse.
  4. Forberede sterilt 10 cm plater med langsom drepe media (3 g NaCl, 3.5 g pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL av fosfatbuffer (beløp per liter: 132 mL K2HPO4 (1 M) og 868 mL KH2PO4 (1 M)) og 18 agar finanskonti).
    Merk: Forberede plater forhånd. De kan lagres i opptil 3 uker i en lufttett beholder på 4 ° C.
  5. Frø hver 10 cm langsom drepe plate (SK plate) med 350 μL P. aeruginosa fra friske over natten LB kultur. Bruker en steril bakteriell sprederen, spre bakterier jevnt over overflaten av media og la det tørke i en BSL-2 biologiske sikkerhetskabinett kabinett.
  6. Inkuber plater ved 37 ° C i 24 timer.

2. forberedelse av RNAi bakterier

  1. Strek ut eller pin-transfer ønsket bakteriestammer RNAi inneholder på LB agar plater som inneholder aktuelle antibiotika (carbenicillin på 100 µg/mL) og tetracycline på 15 µg/mL for Ahringer og Vidal biblioteker fra en frossen lager.
    Merk: Når du arbeider med nonpathogenic bakterier, bruke enten en BSL-2 A / B biologiske sikkerhetskabinett regjering eller en BSL-1 laminær strømning hette å sikre steriliteten av kulturer og redusere risikoen for kryss-kontaminering av biblioteket.
  2. Inkuber plater for 24 h på 37 ° C.
  3. Lagre platene på 4 ° C i opptil to uker.
    1. Etter to uker, forkaste platene og erstatte dem med nystekte plater.
  4. Teste flere RNAi stammer i parallell ved individuelt vaksinere en enkelt koloni fra hver klone til 4 mL av carbenicillin-supplert LB i ett godt av en 24-og dyptgående brønn plate eller et sterilt reagensrør.
    Merk: Tetracycline er rapportert å redusere effektiviteten av RNAi. Ikke bruk det i dette mediet.
  5. Plasser 24-og dypt bra plater i en risting inkubator optimalisert for multiwell plater og ruge på 37 ° C 16 h mens riste på 950 rpm.
    Merk: Det er vanskelig å få uniform bakterievekst i multiwell plater ved hjelp av en konvensjonell risting inkubator. Risting inkubator må kunne riste på minst 750 rpm for at kulturer å vokse riktig. I fravær av en spesialisert shaker er det mulig å vokse hver kultur i en enkelt rør. Kulturer kan overføres inn i 24-vel plate for sentrifugering, om ønskelig.
  6. Samle bakterier av sentrifugering i 5 minutter ved 2000 x g.
  7. Dekanter nedbryting av snu platen og riste kraftig. Resuspend RNAi bakterier i 100 µL av S basale (5,85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4 oppløst i 1 L ultrapure vann og steriliseres ved autoklav).
  8. Pipetter resuspended bakterier i et passende antall brønner av en multiwell NGM plate (Rundormer vekst medier, 3 g NaCl, 2.5 g pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL av fosfatbuffer (beløp per liter: 132 mL K2HPO4 (1 M) og 868 mL KH2PO4 (1 M)), og 18 g agar per liter vann) med IPTG (1 mM endelige konsentrasjon) og carbenicillin (100 μg/mL siste konsentrasjon).
    1. Bruke 3,5 mL NGM media per vel 6-vel plate, 1 mL per brønn av en 24-vel plate eller 150 µL per brønn av 96-brønns plate.
    2. Bruke 100 μL/vel av bakterier for 6-vel plate; 50 μL/godt for 24-godt; eller 20 μL/godt for 96-brønns tallerken. La tørke.
      Merk: Tørking normalt utføres i sterilt flyt hette å fremme rask, jevn tørking. Uniform tørking er svært viktig. Unngå over tørking, som sprekker i agar fremme gravende ormer. Dette fører til ormen tap og potensielle tilstopping av væske-håndteringssystemer.
  9. Bruke forberedt platene umiddelbart eller lagre dem på 4 ° C i opptil to uker for senere bruk.
    Merk: For å forhindre plater tørker ut, de kan forseglet med plast parafin film eller plassert i en tett lukket beholder med fuktig papirhåndklær.

3. vedlikehold og forberedelse C. elegans

Merk: Før du starter eksperimenter, generere synkronisert innbyggere gravid, voksen hermafroditter ormer som følger.

  1. Vask gravid voksne (dvs. med flere embryo synlig innenfor gonad) fra 4-6 10 cm NGM platene i en 15 mL konisk rør ved å legge til 4 mL S basale plate, virvlende forsiktig og så helle i en 15 mL konisk rør.
  2. Pellets ormer via sentrifugering 1000 x g i 30 sekunder.
  3. Sug opp nedbryting, å ta vare ikke å forstyrre ormen pellets.
  4. Legge til 3,5 mL av ormen bleike løsning (siste konsentrasjon 0,5 M NaOH, 1% natriumhypokloritt, i sterilt vann) til ormen pellets og blanding ved å snu i 1 minutt.
  5. Kort vortex og sentrifuger 1000 x g i 30 sekunder.
  6. Sug opp eller Dekanter nedbryting, ta vare ikke for å forstyrre ormen pellets.
  7. Legge til 3,5 mL frisk ormen bleike løsning ormen pellets.
  8. Kraftig blanding ormer i bleike løsning. Med jevne mellomrom (ca hver ti sekunder) visuelt inspisere ormer under dissecting mikroskop. Se på ormen neglebåndene å bryte ut egg. Når de fleste av de voksne ormene er oppløst (~ 95%), fortynne bleke 15 mL med S basale stoppe fordøyelsen.
    Merk: Egg skall er mer motstandsdyktig mot bleike enn voksen vev, men de kan løses i løpet av langvarig eksponering. For å unngå egg oppløsning, Utsett ikke egg å ormen bleike løsning lenger enn 7 minutter. Hvis egg skall er svært skadet, vil embryoene dø.
  9. Pellets embryo 1000 x g i 30 sekunder og Sug opp eller Dekanter nedbryting uten å fjerne pellet av embryo.
  10. Resuspend ormer i S basale et endelig antall 15 mL å fortynne gjenværende bleike løsning.
  11. Gjenta de vask (3.9-3.10) tre ganger for totalt 4 påfølgende vasker.
  12. Etter den fjerde vasken, Sug opp nedbryting og legge opp til 5 eller 6 mL steril S basale inn i 15 mL konisk røret. Målet er å resuspend embryo til en konsentrasjon av ~ 50 per µL.
    Merk: Mengden S basale er avhengig av størrelsen på det egg pellet; Jo større pellets, de mer S basale er nødvendig.
  13. Inkuber konisk røret overnatter på et bord rotator ved romtemperatur eller 48 h på 15 ° C. Larvene vil klekkes, men larver utvikling vil arrestere på L1 scenen (L1 diapause) på grunn av næringsstoffer deprivasjon.
  14. Undersøk embryoene under dissecting mikroskop å kontrollere at de fleste av dem har klekket og arrestert på L1 utviklingstrinn.
  15. Bestemme ormen greven av tar 20 µL ormen prep og fortynning det med 80 µL av S Basal. Pipetter 10 µL utvannet ormen løsning direkte på tomme NGM plater. Gjenta 2 ganger.
    1. Telle Larvene på hvert sted og bestemme gjennomsnittlig antall. Del dette gjennomsnittet av 2 å få en omtrentlig antall ormer per µL i orm-prep. Ormen forutbetalt kan deretter brukes for forplantning plater eller eksperimenter.
      Merk: Etter 4-5 dager, sultet Larvene vil begynne å dø. forkaste prep på dette punktet.
  16. For å spre belastningen, pipette et passende Antall L1 ormer (5000-6000) på 3-4 10 cm NGM plater oppdaget med konsentrert OP50 E. coli- "supermat" (E. coli OP50 oppdaget på 25 X konsentrasjonen (dvs. 1 L av natten OP50 kultur dyrket i LB gir 40 mL av 25 X OP50 superfood); 2 mL av denne konsentrert bakteriell suspensjon er oppdaget på hver 10 cm NGM plate).
  17. For å forberede plater eksperimenter, gjør du ett av følgende (for "Grunnleggende Protocol" Bruk 3.17.1 oppsett, "RNAi skjerm satt opp" Bruk trinnene 3.17.2 - 3.17.4 som passer):
    1. Pipetter ~ 5000 ormer/10 cm plate plantet med RNAi eller OP50 superfood.
    2. Pipetter ~ 500 ormer/godt i en 6-vel plate plantet med RNAi.
    3. Pipetter ~ 300 ormer/godt i en 24-vel plate plantet med RNAi.
    4. Pipetter ~ 100 ormer/godt i en 96-brønns plate plantet med RNAi.
      Merk: For instruksjoner om hvordan RNAi ble sådd se trinnene 2.7-2.9 i utarbeidelsen av RNAi.
  18. Hvis det brukes en fruktbar stamme av ormer, ruge ormer ved 25 ° C i ~ 44-48 h. Bruk disse ormene så raskt som mulig etter at befolkningen har nådd myndighetsalder. Dette reduserer virkningen av egg klekking i ormer under analysen.
  19. Hvis påkjenningen brukes er temperatur-sterilt (f.eks fer-15(b26); fem-1(hc17) eller glp-4(bn2)), ruge ormer ved 15 ° C i ~ 16 h og deretter overføre til 25 ° C 44 h å fullføre utvikling og hindre embryogenesis.

4. væske drepe analysen Setup (grunnleggende Protocol)

Merk: Dette er en protokoll for en bakteriell stamme og en kilde til ormer.

  1. Bruke en celle skraper, fjerne P. aeruginosa fra en SK plate og resuspend i ~ 5 mL av S Basal. Skalere opp hvis nødvendig. Måle den optiske densitet for bakteriell suspensjon bruker et spektrofotometer (OD600)
  2. Forberede 24 mL utvannet lager av P. aeruginosa i Basal S på OD600 ≈ 0.09 (3 X siste konsentrasjon). Se 4.6.2 for siste innhold per brønn og skalere volumet av bakteriell fortynning tilsvarende.
  3. Legge til 21 mL væske langsom drepe media (3 g av NaCl, 3.5 g på pepton/L med CaCl2 og MgSO4 en siste konsentrasjon av 1 mM). Bruke en flerkanals pipette, overføre 45 µL av bakterier og media i hver brønn av en 384-vel plate.
  4. Vask ormer fra kilden (dvs.trinn 3.17.1) i et 50 mL konisk rør og tillate ormer å avgjøre under gravitasjonskraft. Sug opp nedbryting til 5 mL. Resuspend i totalt 50 mL S basal.
  5. Gjenta trinn 4.4 to ganger.
  6. Bruker ormen sortering, sortere ca 22 ormer i hver brønn av 384-vel plate.
    Merk: Oppsettet drops hver orm ~1.1 µL av væske. 22 ormer vil beløpe seg til 25 µL, bringe totale analysen volumet til 70 µL/godt.
    1. Den endelige sammensetningen av hver brønn består av 70 µL. 45 µL av dette volumet er lagt som bakteriell medium (0,03 OD600 bakterier i 24 µL S Basal og 21 µL SK supplert med CaCl2 og MgSO4). Den andre 25 µL legges med 22 ormer.
    2. Hvis du sorterer brukes her (se Tabell for materiale) er utilgjengelig, ormer kan bli fortynnet til en siste konsentrasjon av 1 orm/µL i S Basal og pipetted 25 µL/godt med en flerkanals pipette. Resultatene kan imidlertid ha økt grad av variabilitet. Alternativt er det mulig å bruke en peristaltiske flytende dispenser, som beskrevet av Leung og kolleger19.
  7. Etter ormer er sortert inn i 384-vel plate, forsegle platen med en gass-permeable film og ruge plater ved 25 ° C i 24-48 h.
  8. Da ønskede, bruk en microplate skive for å vaske 384-vel platen med S basale totalt 5 ganger.
    1. Etter andre vask, Sug opp de fleste av media, forlater ~ 20 µL. kraftig riste plater ved hjelp av en microplate vortexer for minst 30 sekunder for å løsne noen rusk fra bunnen av brønnene).
  9. Etter siste vask, leveringstanken nedbryting ned 20 µL. legge til 50 µL av 0.98 µM nukleinsyre flekker (se Tabell for materiale) / Vel av 384-vel plate, for en siste konsentrasjon av 0,7 µM.
  10. Inkuber ved romtemperatur for 12-16 h. Dette fargestoffet vil bare flekken døde ormer. Etter ønsket inkubasjonstiden flekker vask plater med microplate vaskemaskinen fjerne overflødig (minimum 3 vasker).
  11. For datainnsamling, kan du bruke et spektrofotometer eller et automatisert mikroskop til både lyset og fluorescens (531 nm eksitasjon og 593 utslipp).
    1. Bruke en lav forstørrelse målsetting for å gi et bilde av hele brønnen overføres.
    2. Alternativt bruke flyt vermimetry. Denne teknikken bruker et stort objekt flyt cytometer som en orm fluorimeter, måle størrelse og fluorescens av hele organismen (dvs. C. elegans) på en måte som ligner sterkt på flowcytometri.
  12. Bruk automatiserte image analyseprogramvare (som CellProfiler, et gratis bilde analyse studio basert på MatLab http://cellprofiler.org/) til å beregne fluorescerende og totale ormen områder per brønn på en objektiv måte.
    Merk: Kvotienten av disse tallene representerer brøkdel død for hver brønn. Hvis man også hadde farget 7 ormer ut av 20 totalt, så at brøkdel består av 0,35 eller 35%.
    1. Før første bruk må rørledningen automatisert bildebehandling valideres manuell scoret. Dette gjøres ved å sammenligne resultatene fra automatisert pipeline å score ved å visuelt inspisere bilder og opptak fraksjoner av død for hver av dem. Valideringen sikrer at parameterne for automatisert bildebehandling behandling er nøyaktige og representerer dataene riktig.

5. tilpasning for Screening flere C. elegans stammer eller bokseren (RNAi skjermen Setup)

Merk: Dette er en RNAi skjermen på en 24-vel plate oppsett.

  1. Legge 1 mL av S basale per brønn av en 24-vel plate (se trinn 3.17.3). Forsiktig agitere ormer av risting platen, og deretter overføre ormer til en tom, sterile 24 dyptgående brønn plate. Tillate ormer å avgjøre gravitasjonskraften (~ 5 minutter).
  2. Sug opp nedbryting, forlater ca 1 mL. Legge til 7 mL av S basale i hver brønn.
  3. Gjenta 5.1-5.2 minimum 2 flere ganger. Sug opp nedbryting, forlater ca 400 µL etter siste vask.
  4. Funksjonen kvalitet av ormen sorter, sortere 22 ormer fra 24-vel plate ormen suspensjon i hver brønn av en 384-vel plate (hver vel en 24-vel plate gir 8-12 brønner på en 384-vel plate).
    1. For å unngå sult, pipette bakterier i 384-vel platene (en stamme som fungerer utelukkende som mat, for eksempel OP50, eller en sykdomsfremkallende belastning) før sortering.
      Merk: Patogener kan legges ved følgende 2.3-2.5 eller 6.4-6.5 og matkilde bakterier kan utvannet og lagt ved å følge samme ordningen for P. aeruginosa.
  5. Når ormer er sortert inn i 384-vel plate, legge små molekyler eller lignende eksperiment-spesifikke.

6. tilpasning for E. faecalis

Merk: Bare forskjellene fra P. aeruginosa analysen er beskrevet.

  1. Forberede en ny kilde til E. faecalis av striper bakterier fra en frossen lager på en BHI (hjernen hjertet infusjon) agar tallerken og rugende 16-24 h på 37 ° C.
    Merk: Utfør E. faecalis eksperimenter i en BSL-2 biologiske sikkerhetskabinett regjering å sikre sterilitet. Bruk nødvendige forholdsregler for å minimere sjansen for patogene infeksjon eller forurensning.
  2. Platene kan lagres på 4 ° C i opptil en uke. Etter denne perioden, kan du erstatte med en frisk plate.
  3. Natten før sortering ormer vaksinere 3-5 mL steril BHI med en enkelt koloni av E. faecalis. Inkuber 12-16 h på 37 ° C med agitering.
  4. Legge til bakterier i brønnene som P. aeruginosa (3 x bakterier i S Basal, OD600≈0.09).
    Merk: For E. faecalis, den endelige godt sammensetningen er: E. faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10% v/v, med gjenværende volum består av S basal. Husk at 25 µL av S basale leveres med ormer.
    Merk: E. faecalis produserer tykke biofilm som absorbere fluorescerende flekken, forårsaker uskarpe bilder. Omfattende vask kan være nok til å fjerne denne biofilm. I dette tilfellet kan ormer overføres til en tom plate med en flerkanals pipette. For å lette overføringen, kan mellom 20 legges til S basale til en siste konsentrasjon på 0,1% (v/v) mellom 20 i S Basal. Dette hjelpemidler i fjerning av ormer fra biofilm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Viktige parametere for analysen ytelse

En riktig forståelse av biologi underliggende denne analysen er nødvendig for feilsøking og optimalisering analysen. Derfor, vi viser først til flere viktige papirer Klargjørende mekanismer av patogenesen av P. aeruginosa-mediert drap i flytende7,20. Forutsatt at fremgangsmåten ovenfor følges (se figur 1 for en skjematisk av analysen protokollen) vil en tidsavhengige killing C. elegans observeres kun gjennom patogen (figur 2A). I kontrast, i fravær av nøkkelen kosttilskudd (f.eks hvis pepton er utelatt av media, og bare S basale legges), vil liten eller ingen drapet bli observert (figur 2B). Interessant, er i two-step inkubering av P. aeruginosa (for 24 timer på 37 ° C, deretter 24 h ved 25 ° C) som er avgjørende for konvensjonell langsom-drapet analyser, og var opprinnelig implementert i flytende drepte21, unnværlig i denne analysen ( Figur 2C). Det er mulig å legge til P. aeruginosa rett fra overnatting LB kultur, gjør det vesentlig endrer dødelighet kinetics og anbefales ikke.

Forstå analysen biologi tillater også forenkling av analysen, hvis hensiktsmessig og ønskelig. For eksempel den viktigste driveren av vert drap i denne analysen er siderophore pyoverdine, og vert toksisitet forårsaket av pyoverdine er betinget av dens evne til å binde jern7. Som sådan, kan analysen forenkles ved å erstatte pyoverdine-rik filtratet, renset pyoverdine eller noen syntetiske jern-chelaterande kjemikalier (f.eks 1,10-phenanthroline) for live bakterier, som transcriptional svar C. elegans til disse behandlingene er svært lik (Figur 3)22.

Flere ulike linjer av bevis snakker til robusthet av eksperimentelle. Først tåler oppsettet en rekke innledende bakteriell konsentrasjoner. Konsentrasjoner så lavt som OD600 = 0.0025 (omtrent 10 ganger lavere enn anbefalt) fortsatt utstillingen og konsentrasjon-tidsavhengige drap, selv om timingen SKIFT (figur 4A). Andre reproduserbarhet til analysen er slik at så lite som 4 brønner er vanligvis tilstrekkelig for å få statistisk signifikante data (figur 4B).

Det er flere endringer som ikke anbefales. For eksempel bruker første bakterier inocula med konsentrasjoner mye høyere enn de som vises i protokollen; Dette gir tykk, biofilm-lignende materiale som er vanskelig eller umulig å effektivt vaske bort, noe som kompliserer scoring dødelighet. Videre kan høy-konsentrasjon bakteriell inocula også konkurrere om oksygen og utløse uspesifisert vert drepe7.

En annen viktig er å begrense tidsperioden mellom stoppe analysen og imaging døde ormer. Merk at denne tidsrammen må inkludere flekker, så det er viktig å være effektiv. Etter døden begynner biologisk materiale innen ormer å extrude og/eller brukes av bakterier. I løpet av 24-32 h fortsatt bare cuticle. Cuticle flekker veldig dårlig og er veldig lett, gjør det enkelt å miste under vasker. Det er viktig å merke seg at stammer eller belastning/RNAi forhold med svært forskjellige kinetics Lukk kan kompliseres av dette fenomenet (dvs. noen ormer kan fremdeles være i live mens andre har allerede mistet innholdet og er umulig å image). Figur 4A viser dette fenomenet, som ormer på venstre side av platen, inokulert med svært lav innledende bakteriell konsentrasjoner, er fortsatt i stor grad i live mens ormer på høyre side av platen, som ble utsatt for mye høyere konsentrasjoner av bakterier, har blitt vasket vekk.

En svært viktig determinant av analysen suksess er metoden som brukes til å samle og analysere dataene. I vår lab, har vi brukt minst tre metoder for innsamling av data fra disse analyser: spectrophotometry, automatisert mikroskopi og flyt vermimetry (dvs. tilpasning av flyt cytometri teknikker å C. elegans, bokstavelig talt, måling ormer i en strømmende løsning). Først av disse metodene bruker en spectophotometer lese fluorescens fargestoff eller reporter av ormene i spørsmålet. Denne metoden har fordelen av benytter en ganske allestedsnærværende stykke utstyr (et standard spektrofotometer med en microplate leseren) og er den raskeste måten å skaffe seg data. Imidlertid, den mangler trene tilgjengelig fra automatisert mikroskopi og statistiske makt flyt vermimetry.

Automatisert mikroskopi er et levedyktig alternativ. En rekke microplate imaging-systemer er på markedet, alt i priser som er rimelige i en enkelt etterforsker (f.eks en Bio-Tek Cytation5) til større, dyrere og høyere kvalitet maskiner som er mer vanlig i kjernen fasiliteter (f.eks molekylær enheter ImageXpress mikroskop). I praksis er de fleste av disse løsningene mottakelig for scoring de fleste skjermer og analyser. Mest automatiserte tenkelig plattformer kan også kobles til nedstrøms programvare for bildebehandling (f.eks MetaMorph, ImageJ, Gene5 eller cellen Profiler) for å fremme avkastningen av informasjon. Eksempler på nytten av behandling er vist i figur 5 og figur 6. Når signal-til-støy er høy (som i figur 5), analyse er enkel og skiller mellom positive og negative forhold er trivielt. I disse tilfellene, kan selv svakt treff lett identifiseres. Mange analyser, men har et svakere signal-til-støy-forhold. For eksempel øker behandling av rosa-1::GFP22 ormer (med grunnleggende mCherry uttrykk i deres pharynges) med 1,10-phenathroline nivået av rosa-1::GFP. For dataanalyse normaliseres induserbart GFP reporteren på konstituerende mCherry signalet (figur 6). I dette tilfellet reporteren har svakere uttrykk og/eller aktiveres ikke i fleste ormer. Derfor kan implementerer flere bildebehandling verktøy, som cellen Profiler, som kan redusere bakgrunnen og forsterke signalet være fordelaktig.

Endelig hvis en COPAS FlowPilot er tilgjengelig, kan det brukes til å hente data via flyt vermimetry. Mye som kjenner begrepet flowcytometri, kan dette brukes til å måle fluorescens C. elegans i minst to eller tre kanaler samtidig. Denne metoden er svært mottakelig for oppkjøpet av data med høy statistisk betydning, men gjennomstrømningen er veldig mye redusert sammenlignet med automatisert mikroskopi. Den viktigste fordelen med flyt vermimetry er evne til å analysere hele orm populasjoner som en enkelt gruppe for en gjenskape, heller enn å splitte dem i flere brønner og analysere gjennomsnittet av brønnene. Analysere store grupper på denne måten dramatisk forbedrer statistiske kraften og tillater påvisning av selv små effekter.

Endringer av flytende drapet analysen

Siste utviklingen i analysen har utvidet nytten ved å inkludere assaying aktivering av fluorescerende journalister (figur 6), bruker middels til høy gjennomstrømming RNAi teknikker (Figur 3), og selv substitusjon av opprinnelige patogen.

Den mest åpenbare grunnen til å bruke RNAi definere er å teste vert forsvar trasé mot P. aeruginosa (eller andre patogener). Eksempler på RNAi knockdown av gener som er relevante for å overleve i analysen er vist i Figur 3. I samsvar med tidligere observasjoner20,23,24,25, daf-2(RNAi) forbedret C. elegans overlevelse ved eksponering for P. aeruginosa, mens daf-16 ( RNAi), zip-2(RNAi) og cebp-1(RNAi) forkortet den. Som nevnt, er de fleste bare RNAi inkludert i analysen voksende ormer på multiwell plater der hver også inneholder en annen RNAi klone. På grunn av høy viskositet agar og små volumer involvert er det vanskelig å oppnå jevn, boble-fri fylling av 96-brønns plater uten spesialisert utstyr. Tørking bakteriell stammene bærer RNAi kan i tillegg også være et problem, som de ytre brønnene tørker raskere enn indre brønner, fører til ingen-enhetlighet og betydelig potensial for agar sprengning. Som nevnt ovenfor, oppfordrer dette ormer å hule, reduserer dyr tilgjengelig for screening og risiko tilstopping væske-håndtering maskiner. For begge disse grunnene er 24-vel platene enklere å arbeide med enn 96-brønns plater. Selvom dette reduserer analysen gjennomstrømning, det forbedrer pålitelighet, og er foreslått, spesielt for første skjermer.

Til slutt, analysen er blitt endret analysen for å erstatte P. aeruginosa med E. faecalis. (I prinsippet substitusjon med andre bakterie-art bør ikke gi unødig vanskeligheter, forutsatt at riktig dyrking og betingelsene for stråling identifiseres.) Den viktigste faktoren å vurdere er media krav av patogen, både for vekst og utvikling og for induksjon av virulens. Gram positiv, opportunistiske patogene E. faecalis krever for eksempel næringsrike media (som BHI) og inkubasjon ved høyere temperaturer sammenlignet P. aeruginosa14,26. Ved å ta disse faktorene i betraktning, tilpasning av den analysen bruke E. faecalis var grei. Som nevnt for P. aeruginosa, så vi tidsavhengige drap (figur 7). Interessant, var på tidspunktet for dødsfallet lik publisert tidligere analyser som brukes før infeksjonen på agar plater26, til tross for fraværet av dette trinnet som kan foreslå at mekanismene som er involvert i patogenesen varierer.

Figure 1
Figur 1: plan for vannbasert C. elegans - P. aeruginosa infeksjon analysen. Rundormer overføring og forberedelse er venstre, bakteriell forberedelse til høyre. Foranstaltningene innvolvere begge er sentrert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Drapet på C. elegans av P. aeruginosa er bestemt og krever riktig bakteriell ernæring. (A) C. elegans død i nærvær av E. coli og P. aeruginosa. (B) C. elegans død i nærvær av P. aeruginosa med (høyre) og uten (venstre) treg drepe media lagt til mix (dvs. S basale bare). S basale er en minimal media og inneholder ikke næringsstoffer som kreves for bakterievekst og utelukker produksjon av pyoverdine. (C) C. elegans død i nærvær av annerledes forberedt P. aeruginosa. p < 0,01, basert på Student t-test. Feilfelt representerer S.E.M. 10 brønner ble brukt per biologiske replikere per betingelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: C. elegans motstand mot P. aeruginosa , avhenger av vert immun trasé. Et panel av valgte RNAi bokseren ble behandlet med P. aeruginosa (A) eller 1,10-phenanthroline (en kjemisk chelator som etterligner eksponering for P. aeruginosa i væske) (B). p < 0,01, #p < 0,05, basert på Student t-test. Feilfelt representerer S.E.M. 10 brønner ble brukt per biologiske replikere per betingelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: C. elegans dreping av P. aeruginosa er robust og avhenger bakteriell konsentrasjon. (A-B) representant bilder (A) og (B) kvantifisering av C. elegans død etter eksponering for ulike konsentrasjoner av P. aeruginosa 72 h. p-verdier ble beregnet basert på studentens t -test. Skala bar i (A) er 1 mm. 16 brønner ble brukt per biologiske replikere per betingelse. BF: Lyse feltet, FL: fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Kjøp og image behandling av analysen med et sterkt signal. (A) representant bilder av live (negativ kontroll) og døde (positiv kontroll) C. elegans. (B) statistisk analyse av negative og positive kontroller basert på data anskaffelsesmetoden prosessmodus og antall ble analysert. (C) fluorescens ble analysert for ormer fra fire individuelle brønner av en 96-brønns plate (to positive og to negativ kontroll brønner). Hver inneholdt også ~ 100 ormer. Hvert punkt på grafen representerer en enkelt orm, viser tid-av-klassen (som korrelerer med, men på grunn av coiling levende ormer, ufullkomment representerer størrelsen) og målt fluorescens for ormer er farget med Sytox Orange. Positiv kontroll ormer drept pre av varme eksponering. På grunn av endringer i spenning og form av død (som kan sees i (A), døde ormer vises mer stang-like og har noen kroppen svinger) sammenlignet med sine levende kolleger, død ormer har en lengre TOF. p-verdier ble beregnet basert på Student t-test. Skala bar i (A) er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Kjøp og image behandling av analysen med et moderat signal. (A) representant bilder av C. elegans bærer en induserbart rosa-1::GFP reporter og en mCherry konstituerende markør (å normalisere uttrykket av gener fra extrachromosomal array). C. elegans utsatt for DMSO (negativ kontroll) eller 1,10-phenanthroline (positiv kontroll). (B) statistisk analyse av negative og positive kontroller basert på data anskaffelsesmetoden prosessmodus og antall ble analysert. (C) fire individuelle brønner av en 96-brønns plate (to positive og to negativ kontroll brønner) ble analysert ved hjelp av flyt vermimetry. p-verdier ble beregnet basert på Student t-test. Skala bar i (A) er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: C. elegans dreping av E. faecalis er robust og tid avhengige. (A-B) representant bilder (A) og (B) kvantifisering av C. elegans død etter eksponering for E. faecalis. p < 0,01, basert på Student t-test. 10 brønner ble brukt per biologiske replikere per betingelse. Feilfelt representerer S.E.M. skala bar (A) er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne analysen (eller lignende analyser der andre patogener ut P. aeruginosa eller E. faecalis) er nyttig for ulike formål, herunder medisiner. Det er også nyttig for å ta opp grunnleggende biologisk spørsmål, for eksempel identifisere virulens faktorer, utviklingen av vert forsvar trasé, og bestemme regulatoriske maskineriet involvert i interaksjonen som vert-patogen.

Selv om P. aeruginosa flytende drapet analysen er robust, finnes det flere punkter hvor forsiktig oppmerksomhet bør vies å minimere sjansen for feil. Først, som nevnt, må bakteriell kilde platen i P. aeruginosa vaksiner være friske, at bakterier ikke mister virulente, til tross for overnatting vekst i LB. Det andre er nøkkelen å sørge for at kalsium og magnesium legges til P. aeruginosa drepe analyser. Uten vil virulens bli betydelig svekket. Endelig er det verdt å merke seg at ormer fostret opp på HT115 (for RNAi-baserte analyser) vil dø betydelig senere enn ormer fostret opp på OP50 (N. Kirienko, personlig kommunikasjon). Derfor, hvis du bytter til RNAi-baserte studier, er det viktig å fastslå empirisk beste tidspunktet for analysen.

For å drepe analyser P. aeruginosa eller E. faecalis, er det avgjørende å sikre at det er tilstrekkelig mat for utvikling av ormer fra L1 scenen før de er klar til å brukes i analysen. Sult, selv på kort sikt, er kjent for å aktivere en rekke vert forsvar trasé, som DAF-2/DAF-16 insulin/IGF signalering nettverk27. Våre data tyder på at DAF-16/FOXO aktiveres allerede litt blir kultivert i flytende20, og fremme aktivisering er sterkt uønsket, siden DAF-16/FOXO fremmer bredspektret patogen motstand23.

Til slutt, er det avgjørende å bruke absolutt bakteriefri ormer i noen analysen som er avhenger av dødelighet som en avlesning. Hvis ormer er fruktbare, skaper i væsken problemer i egglegging. Som et resultat, klekkes noen av embryoene innenfor den overordnet, til slutt forårsaker døden. Av denne grunn bruker vi vanligvis en genetisk leksjonen, som glp-4(bn2)28, som demonstrerer en helt penetrant sterilt fenotypen for disse analyser. Bruk av kjemikalier som hindre embryonale utvikling men la egglegging, for eksempel 5-fluorodeoxyuridine (FUdR), bør unngås så de også kan forstyrre bakteriell vekst og utvikling.

Generelt, har vi funnet det ganske nyttig å planlegge flere tidspunkt for analyse. Selv om analysen er robust og timingen er vanligvis konsekvent, kan stokastiske og umerkelig endringer skifte på tidspunktet for dødsfallet i analysen innen 2-4 timer. Når feilsøking er nødvendig, er det ofte nyttig å vurdere først de enkleste svar; dvs. forberede frisk medier, forkaste de siste bakteriekulturer og re strek bakteriell stammer fra frosne aksjer, etc. bare sjelden disse tiltakene ikke gjenopprette analysen til funksjonalitet.

På grunn av relativt enkle metoden, kan en rekke endringer enkelt utføres. Endre ormer fra en ensartet glp-4(bn2) bakgrunn for høy gjennomstrømming RNAi skjermer, som de beskriver vi her, er nyttig for identifikasjon av verten svar trasé for en rekke xenobiotics og giftige kjemikalier. For eksempel ved å legge samme kjemiske eller giftstoffer i hver brønn av RNAi plater (f.eks Cry5B gift, phenanthroline, etc.), kan veier som endrer følsomheten til disse giftstoffene lett identifiseres. Slike skjermer kan også brukes til å identifisere forsvar nettverk mot noen av the utvalg av patogener som infisere C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konflikter av interesse å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av kreftforebygging og Research Institute of Texas (CPRIT) Award RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930, og den nasjonale institutter for helse K22 AI110552 til NVK. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COPAS FP BioSorter Union Biometrica Large object flow cytometer/worm sorter
Cytation 5 BioTek
EL406 Washer Dispenser BioTek
Multitron Pro Infors HT
24 Deep-Well RB Block Thermo Fisher Scientific CS15124
384-Well plate Greiner Bio-One MPG-781091
Nematode Growth Media (NGM) Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) plates Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) media Amount per liter:  3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Lysogeny Broth (LB) USBiological Life Sciences L1520
Brian Heart Infusion broth (BHI) Research Products International Corp 50-488-526
Worm Bleach Solution Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water
S Basal Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water
Agar USBiological Life Sciences A0930
NaCl USBiological Life Sciences S5000
Peptone USBiological Life Sciences P3300
CaCl2 USBiological Life Sciences
MgSO4 Fisher Scientific M63-500
Phospate buffer amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)
KH2PO4 Acros Organics 7778-77-0
K2HPO4 USBiological Life Sciences P5100
5% Sodium Hypochlorite Solution BICCA 7495.5-32
NaOH solution Fisher Scientific SS255-1
Breathe-easy Diversified Biotech BEM-1
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Fisher Scientific S11368
Bacterial Strains
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Falagas, M. E., et al. Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 32, (5), 450-454 (2008).
  2. Hsueh, P. R., et al. Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 8, (8), 827-832 (2002).
  3. Wang, C. Y., et al. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes. Clinical Microbiology and Infection. 12, (1), 63-68 (2006).
  4. Yao, Y., et al. Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1. Genome Announcements. 5, (3), (2017).
  5. Utari, P. D., Quax, W. J. Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism. Trends in Microbiology. 21, (7), 315-316 (2013).
  6. Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model. Current Protocols in Chemical Biology. 6, (1), 25-37 (2014).
  7. Kirienko, N. V., et al. Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death. Cell Host & Microbe. 13, (4), 406-416 (2013).
  8. Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence. mSphere. 1, (4), (2016).
  9. Manning, A. J., et al. A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis. Methods. 127, 3-11 (2017).
  10. Marwaha, S., et al. N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, (5), 2968-2971 (2014).
  11. Kota, K. P., et al. Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection. PLoS One. 8, (1), e55167 (2013).
  12. Arif, M., et al. Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion. Journal of Biotechnology. 154, (1), 76-83 (2011).
  13. Jayamani, E., et al. Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61, (9), (2017).
  14. Moy, T. I., et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chemical Biology. 4, (7), 527-533 (2009).
  15. Rajamuthiah, R., et al. Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 9, (2), e89189 (2014).
  16. Breger, J., et al. Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay. PLoS Pathogens. 3, (2), e18 (2007).
  17. Garvis, S., et al. Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence. PLoS Pathogens. 5, (8), e1000540 (2009).
  18. Zhou, Y. M., et al. An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75, (9), 1746-1751 (2011).
  19. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visual Experiments. (51), (2011).
  20. Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (6), 1821-1826 (2015).
  21. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).
  22. Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response. Virulence. 1-41 (2018).
  23. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300, (5627), 1921 (2003).
  24. Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (5), 2153-2158 (2010).
  25. Tjahjono, E., Kirienko, N. V. A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genetics. 13, (6), e1006876 (2017).
  26. Moy, T. I., et al. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (27), 10414-10419 (2006).
  27. Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61, (5), 444-460 (2006).
  28. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116, (3), 755-766 (1992).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics