Un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo

Immunology and Infection

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Summary

Qui descriviamo un protocollo che è un host adattabile, intero, strumento di screening ad alto contenuto che possa essere utilizzata per studiare le interazioni ospite-patogeno ed essere utilizzato per la scoperta di nuovi farmaci.

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Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (137), e58068, doi:10.3791/58068 (2018).

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Abstract

Il numero di nuovi farmaci identificati da tradizionale, schermi in vitro è scemato, riducendo il successo di questo approccio nella ricerca di nuove armi combattere la Resistenza multifarmaco. Questo ha portato alla conclusione che i ricercatori non solo la necessità di trovare nuovi farmaci, ma anche bisogno di sviluppare nuovi modi di trovare loro. Tra i candidati più promettenti metodi sono intero-organismo, in vivo dosaggi che uso alto-rendimento, fenotipica letture e ospita che vanno da Caenorhabditis elegans di Danio rerio. Questi host presentano parecchi vantaggi potenti, tra cui le riduzioni drammatiche in falsi positivi colpisce, come composti che sono tossici per l'ospite e/o biounavailable vengono in genere eliminati nella schermata iniziale, prima di seguire costosi fino.

Qui vi mostriamo come nostra analisi sono stato utilizzato per interrogare variazione host la ben documentata di c. elegans— patosistema come contributo liquido uccisione diPseudomonas aeruginosa . Inoltre dimostriamo diverse estensioni di questa tecnica ben lavorata fuori. Per esempio, siamo in grado di svolgere high throughput genetiche schermate mediante RNAi in 24 o 96 pozzetti formati piastra di fattori dell'ospite query in questa interazione ospite-patogeno. Usando questa analisi, schermi intero genoma possono essere completati in pochi mesi, che possono di semplificare notevolmente il compito di individuare bersagli farmacologici, potenzialmente senza la necessità di approcci biochimici laboriosa purificazione.

Inoltre segnaliamo qui una variazione del nostro metodo che sostituisce il batterio gram-positivo Enterococcus faecalis per l'agente patogeno gram-negativo p. aeruginosa. Molto come è il caso per p. aeruginosa, uccisione di E. faecalis è dipendente dal tempo. A differenza del precedente c. elegans— saggi diE. faecalis , nostra analisi per E. faecalis non richiede preinfection, migliorando il suo profilo di sicurezza e riducendo le possibilità di contaminazione liquido-per la movimentazione. Il dosaggio è estremamente robusto, mostrando ~ 95% tassi di mortalità 96h post infezione.

Introduction

L'identificazione e lo sviluppo di efficaci antibiotici ad ampio spettro, ora quasi un secolo fa, ha portato a un momento di svolta nella sanità pubblica dove c'era una credenza diffusa che infettiva malattia sarebbe un flagello del passato. Entro pochi decenni, questo ottimismo iniziò a scemare, come agente patogeno dopo agente patogeno ha sviluppato meccanismi di resistenza che limitato questi trattamenti una volta miracolosi. Per qualche tempo, la corsa agli armamenti tra azioni di individuazione di droga e gli agenti patogeni sembrava equilibrata. Tuttavia, l'uso improprio degli antimicrobici è recentemente culminato nell'emergere di ceppi di Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescense p. aeruginosa1, pan-farmaco resistenti 2,3,4.

P. aeruginosa è un patogeno di negativo, multi-host di grammo di opportunisti, che è una grave minaccia ai pazienti con gravi ustioni, coloro che sono immunocompromessi, o hanno la fibrosi cistica. È inoltre sempre più identificato come un agente eziologico nelle infezioni nosocomial severa, particolarmente dovuto la sua acquisizione in corso della resistenza antimicrobica. Per cominciare ad affrontare questa minaccia, abbiamo usato la ben documentata elegans del c.-p. aeruginosa infezione sistema5. Il nostro laboratorio ha sfruttato questo sistema per sviluppare una piattaforma di base liquida, ad alta velocità, ad alto contenuto di screening per identificare nuove molecole che limitano la capacità del patogeno di uccidere l' host6. Curiosamente, questi composti sembrano appartenere ad almeno tre categorie generali, compresi gli antimicrobici7 e virulenza inibitori8. Altri saggi di scoperta di droga ad alto contenuto in c. elegans sono stati segnalati per del micobatterio tuberculosum, Chlamydia trachomatis, pestis di Yersinia, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, e Enterococcus faecalis, tra gli altri9,10,11,12,13,14,15,16. Questi tipi di analisi presentano parecchi vantaggi ben riconosciuti, ad esempio limitando falsi positivi successi che possono essere tossici per sia l'host e l'agente patogeno, probabilità aumentata della biodisponibilità rispetto a uno schermo di chimico e la capacità di identificare successi di là semplicemente limitando la crescita microbica, come anti-virulents, stimolatore immunitario molecole o composti che altrimenti inclinare la bilancia dell'interazione ospite-patogeno in favore della ex. Inoltre, i composti scoperti in queste schermate sono spesso efficaci in mammiferi padroni di casa.

Vale la pena notare che almeno due altri saggi17,18 sono disponibili per realizzare schermi di alto-rendimento in c. elegans in liquido. Tuttavia, ciascuno di questi test è una modifica che permette il dosaggio di colonizzazione intestinale prototipo, conosciuto come lento-uccisione, da eseguirsi in liquido, aumentando la produttività e consentendo di composti più facilmente essere schermato. Un'attenta caratterizzazione ha dimostrato conclusivamente che i meccanismi di virulenza batterica sono diversi tra questi saggi e nostra base liquida schermo7. Poiché entrambi i tipi di virulenza sono osservati nei sistemi mammiferi, è importante considerare quali determinanti di virulenza sono più rilevante per gli interessi dello sperimentatore prima della selezione di test.

Qui dimostriamo una versione ottimizzata del liquido basato su analisi di c. elegans-P. aeruginosa . Segnaliamo anche l'adattamento del nostro metodo di analisi liquido-basata per ospitare l'agente patogeno batterico gram-positivo Enterococcus faecalis. Come p. aeruginosa, E. faecalis è sempre più identificato come una minaccia seria nosocomial con un armamento crescente di resistenza antimicrobica vie1. Anche se esiste un metodo precedente per high throughput screening di E. faecalis 14, richiede preinfection con l'agente patogeno, che complica la procedura e aumenta la probabilità di contaminazione di attrezzature come il FlowSort COPAS. Il nostro protocollo Elimina la necessità di pre-infezione, miglioramento del profilo di sicurezza. Infine, segnaliamo un mezzo mediante il quale uno di questi test possono essere combinato con alimentazione di RNAi, permettendo all'utente di cercare per fattori ospite che giocano un ruolo nella creazione di, o resistenza a, infezione.

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Protocol

Attenzione: P. aeruginosa ed E. faecalis sono patogeni di livello 2 di biosicurezza, e precauzioni appropriate devono essere prese per prevenire l'infezione accidentale e per minimizzare la contaminazione delle superfici. Tutti i supporti e i materiali che vengono a contatto con agenti patogeni devono essere sterilizzati e/o scartati. Ulteriori linee guida sono disponibili dalla pubblicazione CDC Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL), 5a edizione.

1. preparazione e manutenzione di p. aeruginosa

  1. Striscia p. aeruginosa da azione congelate su una piastra di agar LB (brodo di Lisogenesi). Incubare per 16-24 h a 37 ° C
    Nota: Eseguire esperimenti di p. aeruginosa all'interno di un armadietto per garantire la sterilità di sicurezza biologica BSL-2. Utilizzare opportune misure di sicurezza per minimizzare la probabilità di infezione patogena o contaminazione.
  2. Trasferire questa piastra a 4 ° C. Questo piatto può essere conservato a 4 ° C e utilizzato per inoculare culture fino a una settimana. Dopo una settimana, decontaminare e scartare la piastra e fare una nuova piastra di striatura LB.
    Nota: La virulenza di p. aeruginosa diminuisce dopo una conservazione prolungata.
  3. Due giorni prima della data di creazione di piastre di dosaggio, inoculare 3-5 mL di libbra di brodo sterile con una singola colonia di p. aeruginosa dalla piastra fatta in 1.1. Incubare a 37 ° C per 12-16 ore.
    Nota: Non Incubare più di 16 h. In colture liquide ricche, p. aeruginosa PA14 comincia a lyse.
  4. Preparare piastre sterili cm 10 con media uccidere lento (3 g NaCl, peptone di 3,5 g, 1 mM CaCl2, 1mm MgSO4, 25 mL di tampone fosfato (quantità per litro: 132 mL di K2HPO4 (1 M) e 868 mL di KH2PO4 (1 M)) e agar 18 g/L).
    Nota: Preparare piastre prima del tempo. Essi possono essere memorizzati fino a 3 settimane in un contenitore ermetico a 4 ° C.
  5. Ogni 10 cm uccidere lento piastra (SK) con 350 μL di p. aeruginosa da coltura LB durante la notte fresca del seme. Utilizzando una spatola sterile batterica, diffondere i batteri in modo uniforme su tutta la superficie del supporto e far per asciugare in una cappa di sicurezza biologica BSL-2.
  6. Incubare le piastre a 37 ° C per 24 h.

2. preparazione di batteri di RNAi

  1. Striscia fuori o pin-trasferimento desiderati ceppi di RNAi contenenti batteri sui piatti di agar LB che contengono antibiotici appropriati (carbenicillina a 100 µ g/mL) e la tetraciclina a 15 µ g/mL per le librerie Ahringer e Vidal da azione congelate.
    Nota: Quando si lavora con i batteri non patogeni, utilizzare entrambi un BSL-2 A cappa di sicurezza biologica B o un flusso laminare BSL-1 cofano posteriore per garantire la sterilità delle colture e per minimizzare il rischio di contaminazione incrociata della biblioteca.
  2. Incubare le piastre per 24 h a 37 ° C.
  3. Conservare le piastre a 4 ° C fino a due settimane.
    1. Dopo due settimane, scartare le piastre e sostituirli con piatti appena fatte.
  4. Prova più ceppi di RNAi in parallelo inoculando individualmente una singola Colonia da ogni clone in 4 mL di LB carbenicillina-completati in un unico bene di una piastra a 24 pozzetti profondi pozzetti o in una provetta sterile.
    Nota: Tetraciclina è stata segnalata per ridurre l'efficienza di RNAi. Non utilizzarlo in questa media.
  5. Inserire un incubatore d'agitazione ottimizzato per piastre multipozzetto piastre a 24 pozzetti profondi pozzetti e incubare a 37 ° C per 16 ore agitando a 950 giri/min.
    Nota: È difficile da ottenere uniforme crescita batterica in piastre multipozzetto utilizzando un incubatore d'agitazione convenzionale. L'incubatore di agitazione deve essere in grado di scuotere a un minimo di 750 giri/min in ordine per le colture a crescere correttamente. In assenza di un agitatore specializzato, è possibile far crescere ogni cultura in un singolo tubo. Colture possono essere trasferiti nella piastra 24 pozzetti per centrifugazione in seguito, se lo si desidera.
  6. Raccogliere i batteri mediante centrifugazione per 5 minuti a 2.000 x g.
  7. Decantare il supernatante invertendo la piastra e agitando energicamente. Risospendere i batteri di RNAi in 100 µ l di S basale (5,85 g di NaCl, 1 g K2HPO4, 6g KH2PO4 disciolto in 1 L di acqua ultrapura e sterilizzato in autoclave).
  8. Pipettare batteri sedimento in un congruo numero di pozzetti di una piastra NGM multipozzetto (Nematode crescita Media, 3 g di NaCl, peptone di 2,5 g, 1 mM CaCl2, 1mm MgSO4, 25 mL di tampone fosfato (quantità per litro: 132 mL di K2HPO4 (1 M) e 868 mL di KH2PO4 (1 M)) e 18 g di agar per litro di acqua) completati con IPTG (concentrazione finale di 1 mM) e carbenicillina (concentrazione finale di 100 μg/mL).
    1. Utilizzare 3,5 mL di media NGM per pozzetto della piastra a 6 pozzetti, 1 mL / pozzetto di una piastra a 24 pozzetti o 150 µ l per pozzetto della piastra a 96 pozzetti.
    2. Utilizzare 100 μL/pozzetto di batteri per piastra a 6 pozzetti; 50 μL/pozzetto per 24-pozzo; o 20 μL/pozzetto per piastra a 96 pozzetti. Lasciare per asciugare.
      Nota: Essiccazione avviene normalmente in una cappa a flusso sterile per promuovere uniforme, rapida asciugatura. L'essiccamento uniforme è molto importante. Evitare sovra, come crepe nell'agar promuovono scavatori di vermi. Questo porta a perdite e potenziali intasamento del liquido-gestione sistemi a vite senza fine.
  9. Utilizzare le piastre preparate immediatamente o conservarli a 4 ° C fino a due settimane per un uso successivo.
    Nota: Per impedire l'essiccazione di piastre, possono essere sigillate con la pellicola di plastica paraffina o collocati in un contenitore ermeticamente sigillato con tovaglioli di carta umidi.

3. manutenzione e preparazione di c. elegans

Nota: Prima di iniziare gli esperimenti, generare una popolazione sincronizzata delle viti ermafroditi gravid, adulti come segue.

  1. Lavare gravid adulti (cioè, con più embrioni visibili all'interno della gonade) da 4-6 piastre di NGM 10 cm in una provetta conica da 15 mL aggiungere 4 mL di S basale a piastra, agitando delicatamente e poi versare in una provetta conica da 15 mL.
  2. A pellet worm tramite centrifugazione a 1.000 x g per 30 secondi.
  3. Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non per disturbare il pellet di verme.
  4. Aggiungere 3,5 mL di soluzione di candeggina di vite senza fine (concentrazione finale di 0,5 M NaOH, 1% di ipoclorito di sodio, in acqua sterile) pellet di verme, e mescolare capovolgendo per 1 minuto.
  5. Brevemente vortex e centrifugare a 1.000 x g per 30 secondi.
  6. Aspirare o decantare il supernatante, facendo attenzione a non per disturbare il pellet di verme.
  7. Aggiungere 3,5 mL di soluzione di candeggina verme fresco al pellet di verme.
  8. Agitare energicamente vermi in soluzione di candeggina. Periodicamente (circa ogni dieci secondi) ispezionare visivamente i vermi sotto un microscopio per dissezione. Guardare per le cuticole di verme di rompere, rilasciare le uova. Una volta che la maggior parte dei vermi adulti sono stati disciolti (~ 95%), diluire candeggina a 15 mL con S basale per interrompere la digestione.
    Nota: Gusci d'uovo sono più resistenti alla candeggina di tessuti adulti, ma può essere sciolto durante l'esposizione prolungata. Per evitare la dissoluzione di uovo, non esporre le uova per la soluzione di candeggina per più di 7 minuti a vite senza fine. Se gusci d'uovo sono eccessivamente danneggiati, è possibile che gli embrioni si morirà.
  9. A pellet embrioni a 1.000 x g per 30 secondi e aspirare o decantare il supernatante senza rimuovere il pellet di embrioni.
  10. Risospendere vermi in S basale ad un volume finale di 15 mL per diluire la soluzione di candeggina rimanenti.
  11. Ripetere i passaggi di lavaggio (3.9-3.10) tre volte per un totale di 4 lavaggi consecutivi.
  12. Dopo il quarto lavaggio, aspirare il surnatante e aggiungere fino a 5 o 6 mL di sterile S basale nella provetta conica da 15 mL. L'obiettivo è per risospendere embrioni ad una concentrazione di ~ 50 worm al µ l.
    Nota: La quantità di S basale dipende dalla dimensione del pellet uovo; più grande il pellet, più S basale è necessario.
  13. Incubare la provetta conica durante la notte su un tavolo dei rotatori a temperatura ambiente o 48 ore a 15 ° C. Le larve si schiudono, ma lo sviluppo larvale arresto nella fase L1 (L1 diapausa) a causa di privazione nutriente.
  14. Esaminare gli embrioni sotto un microscopio per dissezione per verificare che la maggior parte di loro hanno covato e arrestato nella fase L1 di sviluppo.
  15. Determinare il numero di vite senza fine prendendo 20 µ l di prep verme e diluirla con 80 µ l di S basale. Pipettare 10 µ l di soluzione diluita verme direttamente su una piastra NGM vuota. Ripetere 2 volte.
    1. Contare le larve in ogni posto e determinare il numero medio. Dividere questa media per 2 per ottenere un conteggio approssimativo di vermi per µ l a prep il verme. Preps vite senza fine può essere utilizzato quindi per piastre di propagazione o per esperimenti.
      Nota: Dopo 4-5 giorni, affamate larve inizierà a morire; scartare la preparazione a questo punto.
  16. Il ceppo di moltiplicazione, pipetta un numero adeguato di L1 vermi (5.000-6.000) sulle piastre di 3-4 10-cm NGM notato con concentrato OP50 Escherichia coli – "superfood" (e. coli OP50 avvistati alla concentrazione di 25 X (cioè, 1 L di pernottamento OP50 40 mL di 25 X OP50 superfood le rese cultura cresciuta in LB); 2 mL di questa sospensione batterica concentrata sono macchiati su ogni piastra NGM di 10 cm).
  17. Per preparare piatti per esperimenti, effettuare una delle seguenti operazioni (per installazione di uso 3.17.1 "Protocollo di base", per i passaggi di uso "RNAi schermo impostato" 3.17.2 - 3.17.4 come appropriato):
    1. Pipetta ~ 5.000 piastra di vermi/10 cm seminato con RNAi o OP50 superfood.
    2. Pipetta ~ 500 vermi/pozzetto di una piastra a 6 pozzetti seminato con RNAi.
    3. Pipetta ~ 300 vermi/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti seminato con RNAi.
    4. Pipetta ~ 100 vermi/pozzetto di una piastra a 96 pozzetti seminato con RNAi.
      Nota: Per istruzioni su come RNAi è stato seminato fare riferimento ai passaggi 2,7-2,9 in preparazione di RNAi batteri.
  18. Se viene utilizzato un fertile ceppo di vermi, incubare vermi a 25 ° C per ~ 44-48 h. uso questi vermi più rapidamente possibile dopo che la popolazione ha raggiunto l'età appropriata. Questo riduce al minimo l'impatto delle uova da cova entro i vermi durante il dosaggio.
  19. Se viene utilizzato il ceppo è temperatura-sterile (ad es., fer-15(b26); FEM-1(HC17) o glp-4(bn2)), incubare vermi a 15 ° C per ~ 16 h e poi il trasferimento a 25 ° C per 44 h completare lo sviluppo e prevenire l'embriogenesi.

4. liquido uccidendo Assay Setup (protocollo di base)

Nota: Si tratta di un protocollo per un ceppo batterico e una fonte di vermi.

  1. Utilizzando un raschietto di cella, rimuovere la p. aeruginosa da una piastra di SK e risospendere in ~ 5 mL di S basale. Scalabilità verticale se necessario. Misurare la densità ottica della sospensione batterica utilizzando uno spettrofotometro (OD600)
  2. Preparare 24 mL di brodo diluito di p. aeruginosa in basale S presso OD600 ≈ 0.09 (concentrazione finale di 3 X). 4.6.2 per contenuto finale per pozzetto di vedere e di conseguenza scala volume di diluizione batterica.
  3. Aggiungere 21 mL di liquido media uccidere lento (3 g di NaCl, 3,5 g di peptone/L completati con CaCl2 e MgSO4 a una concentrazione finale di 1 mM). Usando una pipetta multicanale, trasferire 45 µ l di batteri e media in ciascun pozzetto di una piastra 384 pozzetti.
  4. Lavare i vermi dalla loro fonte (cioè, passo 3.17.1) in una provetta conica da 50 mL e consentire vermi da stabilirsi nell'ambito di forza gravitazionale. Aspirare il supernatante a 5 mL. Risospendere in un totale di 50 mL S basale.
  5. Ripetere due volte il punto 4.4.
  6. Usando un sorter di verme, ordinare circa 22 vermi in ciascun pozzetto della piastra 384 pozzetti.
    Nota: L'installazione di gocce ogni verme in ~1.1 µ l di liquido. 22 vermi saranno pari a 25 µ l, portando il volume di dosaggio totale a 70 µ l/pozzetto.
    1. La composizione finale di ciascun pozzetto è costituito da 70 µ l. 45 µ l di questo volume viene aggiunto come mezzo batterica (0,03 batteri di600 OD in 24 µ l S µ l basale e 21 SK completati con CaCl2 e MgSO4). Gli altri 25 µ l è aggiunto con i 22 vermi.
    2. Se il criterio di ordinamento utilizzato qui (Vedi Tabella materiali) non è disponibile, vermi possono essere diluiti ad una concentrazione finale di 1 vite senza fine / µ l in S basale e pipettato 25 µ l/pozzetto usando una pipetta multicanale. Tuttavia, i risultati possono esibire aumento della variabilità. In alternativa, è possibile utilizzare un erogatore liquido peristaltico, come descritto da Leung e colleghi19.
  7. Dopo i vermi sono stati ordinati nella piastra 384 pozzetti, sigillare la piastra con una pellicola gas-permeabile e incubare le piastre a 25 ° C per 24-48 h.
  8. Al momento desiderato, utilizzare un lavaggio micropiastre per lavare la piastra 384 pozzetti con S basale un totale di 5 volte.
    1. Dopo il secondo lavaggio, aspirare la maggior parte dei mezzi di comunicazione, lasciando ~ 20 µ l. vigorosamente agitare piastre utilizzando un Vortex micropiastra per almeno 30 secondi per allentare eventuali detriti dal fondo dei pozzi).
  9. Dopo il lavaggio finale, aspirare il surnatante fino a 20 µ l. aggiungere 50 μl di 0,98 µM dell'acido nucleico macchia (Vedi Tabella materiali) / bene della piastra 384 pozzetti, per una concentrazione finale di 0,7 µM.
  10. Incubare a temperatura ambiente per 12-16 h. Questa tintura macchierà solo vermi morti. Dopo il periodo di incubazione desiderato, lavare piatti utilizzando il lavaggio micropiastre per rimuovere l'eccesso macchiano (un minimo di 3 lavaggi).
  11. Per l'acquisizione di dati, utilizzare uno spettrofotometro o un microscopio automatizzato dell'immagine sia luce trasmessa e fluorescenza (531 nm eccitazione e emissione 593).
    1. Utilizzare un obiettivo di ingrandimento basso per consentire un'immagine del pozzo tutta per essere catturato.
    2. In alternativa, utilizzare il flusso vermimetry. Questa tecnica utilizza un citometro a flusso oggetto di grandi dimensioni come un verme fluorimetro, misurare le dimensioni e la fluorescenza di tutto l'organismo (cioè, c. elegans) in un modo che è fortemente simile per citometria a flusso.
  12. Utilizzare software di analisi di immagine automatizzato (ad esempio CellProfiler, uno studio di analisi di immagine gratis basato su MatLab http://cellprofiler.org/) per calcolare le aree di verme fluorescente e totale per pozzetto in modo imparziale.
    Nota: Il quoziente di questi numeri rappresenta la morte di frazione per ciascun pozzetto. Se uno ha avuto ben 7 macchiato vermi fuori di 20 totale, poi la morte di frazione comprende 0.35 o 35%.
    1. Prima del primo utilizzo, la pipeline di elaborazione di immagine automatizzato deve essere convalidata da Punteggio manuale. Questo viene fatto confrontando i risultati dalla pipeline automatizzata a punteggi ottenuti visivamente esaminando immagini e registrazione frazioni di vermi morti per ciascuno di essi. Il processo di convalida garantisce che i parametri per l'elaborazione automatica di imaging sono accurati e rappresentano i dati correttamente.

5. adattamento per Screening più di c. elegans ceppi o atterramenti (RNAi schermata Setup)

Nota: Questa è una schermata di RNAi descritta per un setup di piastra a 24 pozzetti.

  1. Aggiungere 1 mL di S basale per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti (vedere il passaggio 3.17.3). Delicatamente agitare vermi agitando la piastra, poi il trasferimento worm ad una piastra del profondo-ben 24 vuoto, sterile. Consentire il worm a stabilirsi gravitazionalmente (~ 5 minuti).
  2. Aspirare il surnatante, lasciando circa 1 mL. Aggiungere 7 mL di S basale in ciascun pozzetto.
  3. Ripetere i passaggi da 5.1-5.2 un minimo di 2 volte. Dopo il lavaggio finale, aspirare il supernatante, lasciando circa 400 µ l.
  4. Utilizzando la funzione Resampler del sorter verme, ordinare 22 vermi dalla sospensione verme piastra a 24 pozzetti in ciascun pozzetto di una piastra 384 pozzetti (ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti rendimenti 8-12 pozzetti di una piastra 384 pozzetti).
    1. Per non morire di fame, pipettare batteri in piastre da 384 pozzetti (un ceppo che serve esclusivamente come cibo, come ad esempio OP50, o un ceppo patogeno) prima dell'ordinamento.
      Nota: Gli agenti patogeni possono essere aggiunti da passaggi seguenti 2.3-2.5 o 6.4-6.5 e fonte di cibo batteri possono essere diluiti e aggiunto seguendo lo stesso schema di p. aeruginosa.
  5. Dopo worm sono stati ordinati nella piastra 384 pozzetti, aggiungere piccole molecole o altri materiali specifici di esperimento.

6. adattamento per E. faecalis

Nota: Solo le differenze da analisi di p. aeruginosa sono descritte.

  1. Preparare una fresca fonte di E. faecalis striature batteri da uno stock congelato su una piastra di agar BHI (Brain Heart Infusion) e incubando per 16-24 h a 37 ° C.
    Nota: Eseguire esperimenti di E. faecalis all'interno di un armadietto per garantire la sterilità di sicurezza biologica BSL-2. Utilizzare opportune misure di sicurezza per minimizzare la probabilità di infezione patogena o contaminazione.
  2. Piastre possono essere memorizzati a 4 ° C fino a una settimana. Dopo questo periodo, sostituire con un piatto fresco.
  3. La notte prima dell'ordinamento vermi, inoculare 3-5 mL BHI sterile con una singola colonia di E. faecalis. Incubare per 12-16 h a 37 ° C con agitazione.
  4. Aggiungere batteri nei pozzetti per quanto riguarda p. aeruginosa (3 batteri x in S basale, OD600≈0.09).
    Nota: Per E. faecalis, è la composizione ben finale: E. faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10% v/v, con il volume restante composto S basale. Ricordate che 25 µ l di S basale verrà consegnato con i vermi.
    Nota: E. faecalis produce biofilm spesso che assorbono la macchia fluorescente, causando immagini sfocate. Vasto lavaggio può essere insufficiente a rimuovere questo biofilm. In questo caso, i vermi possono essere trasferiti a un piatto vuoto usando una pipetta multicanale. Per facilitare il trasferimento, Tween 20 può essere aggiunto ai S basale a una concentrazione finale pari allo 0,1% (v/v) Tween 20 in S basale. Questo aiuta a rimuovere i vermi dal biofilm.

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Representative Results

Parametri importanti per le prestazioni

Una corretta comprensione della biologia alla base di questa analisi è necessaria per risolvere i problemi e ottimizzare il dosaggio. A tal fine, ci riferiamo in primo luogo a parecchie carte chiave delucidamento dei meccanismi di patogenesi di p. aeruginosa-mediata uccidendo in liquido7,20. Condizione che i passaggi descritti sopra sono seguiti (vedere la Figura 1 per lo schema di protocollo di analisi) una dipendente dal tempo di uccisione di c. elegans sarà osservata solo in presenza del patogeno (Figura 2A). Al contrario, in assenza di chiavi supplementi nutrizionali (ad esempio, se il peptone viene lasciato fuori dalla media, e viene aggiunto solo S basale), poco o nessun omicidio verrà osservato (Figura 2B). Interessante, l'incubazione in due fasi di p. aeruginosa (per 24 ore a 37 ° C, allora 24 h a 25 ° C) che è fondamentale per le analisi di lento-uccisione convenzionale ed era originariamente implementato in liquido uccidendo21, è superfluo in questo dosaggio ( Figura 2). Mentre è possibile aggiungere p. aeruginosa direttamente dalla cultura LB durante la notte, facendo così in modo significativo cambia la cinetica di letalità e non è raccomandato.

Comprensione della biologia di analisi consente anche la semplificazione del test, se opportuno e auspicabile. Ad esempio, il driver più importante dell'host uccidendo in questo saggio è il sideroforo pioverdina e tossicità ospite causata da pioverdina è subordinato alla sua capacità di legare il ferro7. Come tale, il dosaggio può essere semplificato sostituendo pioverdina ricchi filtrato, pioverdina purificato o anche qualche ferro-chelante prodotti chimici sintetici (ad es., 1,10-fenantrolina) per batteri vivi, come la risposta trascrizionale di c. elegans a questi trattamenti è molto simile (Figura 3)22.

Diverse linee di evidenza parlano alla robustezza dell'apparato sperimentale. In primo luogo, il programma di installazione tollera una vasta gamma di concentrazioni batteriche iniziale. Concentrazioni basse quanto OD600 = 0.0025 (circa 10 volte inferiore di quella raccomandata) ancora esibire uccisione tempo e concentrazione-dipendente, anche se i tempi di spostamento (Figura 4A). In secondo luogo, la riproducibilità del dosaggio è tale che come pochi come 4 pozzi è spesso sufficiente per ottenere dati statisticamente significativi (Figura 4B).

Ci sono diverse modifiche che non è consigliabile. Ad esempio, utilizzando inoculi di batteri iniziale con concentrazioni molto superiori a quelli elencati nel protocollo; Questa operazione genera spesso, biofilm-come materiale che è difficile o impossibile per lavare in modo efficace, che complica la letalità notante. Inoltre, alta concentrazione batterici inoculi anche possono competere per ossigeno e innescare non specifico host uccisione7.

Un'altra nota importante è limitare il periodo di tempo tra arrestando il dosaggio e i vermi morti di imaging. Si noti che questo lasso di tempo deve includere colorazione, pertanto è fondamentale per essere efficiente. Dopo la morte, il materiale biologico all'interno di vermi comincia ad estrudere e/o essere consumato da batteri. Nel giro di 24-32 h, rimane solo la cuticola. La cuticola macchie molto male ed è molto leggera, che lo rende facile da perdere durante i lavaggi. È importante notare che ceppi o ceppo/RNAi condizioni con molto diversa cinetica di uccisione possono essere complicate da questo fenomeno (cioè, alcuni vermi potrebbero essere ancora vivi mentre gli altri hanno già perso il loro contenuto e sono impossibili da immagine). Figura 4A Mostra questo fenomeno, come vermi sul lato sinistro della piastra, inoculato con concentrazioni molto basse di batteriche iniziale, sono ancora in gran parte viva mentre vermi sul lato destro della piastra, che sono stati esposti a concentrazioni molto più elevate di batteri, sono stati mondati.

Un determinante importante del successo di dosaggio è il metodo utilizzato per raccogliere e analizzare i dati. Nel nostro laboratorio, abbiamo usato almeno tre metodi per la raccolta dati da queste analisi: spettrofotometria, microscopia automatizzata e flusso vermimetry (cioè, l'adattamento delle tecniche di citometria a flusso di c. elegans; letteralmente, la misurazione di vermi in una soluzione che scorre). Il primo di questi metodi utilizza un spectophotometer per leggere la fluorescenza della tintura o reporter dei vermi in questione. Questo metodo ha il vantaggio di utilizzare un pezzo abbastanza onnipresente di attrezzature (uno spettrofotometro standard con un lettore di micropiastre) ed è il metodo più veloce per acquisire dati. Tuttavia, manca il contenuto informativo disponibile in microscopia automatizzata e il potere statistico di flusso vermimetry.

Microscopia automatizzata è un'altra valida opzione. Un numero di sistemi di imaging micropiastra è attualmente sul mercato, che vanno a prezzi che sono accessibili a un singolo investigatore (ad es., un Cytation5 di Bio-Tek) ai più grandi, più costosi e macchine di qualità superiore che più comunemente si trovano nel nucleo strutture (ad es., un microscopio di ImageXpress dispositivi molecolari). In pratica, la maggior parte di queste soluzioni sono favorevole per il punteggio più schermi e saggi. Più piattaforme imaging automatizzati possono anche essere accoppiati a valle software per elaborazione delle immagini (ad es., MetaMorph, ImageJ, Gene5 o Cell Profiler) per ulteriormente la resa delle informazioni. Esempi dell'utilità di elaborazione sono mostrati in Figura 5 e Figura 6. Quando il rapporto segnale-rumore è alto (come in Figura 5), l'analisi è semplice e discriminare tra condizioni positive e negative è banale. In questi casi, anche deboli colpi possono essere facilmente identificati. Molti saggi, tuttavia, hanno un rapporto segnale-rumore più debole. Ad esempio, il trattamento delle viti senza fine22 rosa-1::GFP (con l'espressione costitutiva mCherry nella loro pharynges) con 1,10-phenathroline aumenta il livello di rosa-1::GFP. Per l'analisi dei dati, il reporter GFP inducibile è normalizzato al segnale mCherry costitutiva (Figura 6). In questo caso, il reporter ha più debole espressione e/o non è attivato nella maggior parte dei vermi. Di conseguenza, l'implementazione di ulteriori strumenti elaborazione delle immagini, come cellula Profiler, che possono ridurre la priorità bassa e amplificare il segnale può essere vantaggioso.

Infine, se un FlowPilot COPAS è disponibile, può essere utilizzato per acquisire i dati tramite flusso vermimetry. Molto simile al concetto più familiare di citometria a flusso, questo strumento può essere utilizzato per misurare la fluorescenza di c. elegans in almeno due o tre canali alla volta. Questo metodo è molto favorevole per l'acquisizione dei dati con alta significatività statistica, ma la velocità effettiva è molto diminuita rispetto alla microscopia automatizzata. Il vantaggio più significativo di flusso vermimetry è nella capacità di analizzare le popolazioni di intere vite senza fine come un unico gruppo per una replica, anziché dividendoli in pozzi multipli e analizzando la media dei pozzetti. Analisi dei grandi gruppi in questo modo drasticamente migliora la potenza statistica e consente di rilevare anche piccoli effetti.

Modifiche del dosaggio liquido uccisione

Recenti sviluppi del dosaggio hanno esteso la sua utilità includendo analizzante attivazione di reporter fluorescenti (Figura 6), utilizzando tecniche di medio-alto rendimento RNAi (Figura 3) e anche la sostituzione dell'originale agente patogeno.

Il motivo più ovvio utilizzare RNAi istituito è quello di testare per le vie di difesa ospite contro p. aeruginosa (o altri agenti patogeni). Esempi di RNAi atterramento di geni rilevanti per la sopravvivenza nell'analisi sono mostrati nella Figura 3. Coerente con precedenti osservazioni20,23,24,25, daf-2(RNAi) migliorata sopravvivenza di c. elegans durante l'esposizione di p. aeruginosa, mentre daf-16 ( RNAi), zip-2(RNAi) e cebp-1(RNAi) ridotto. Come notato, RNAi è più semplicemente incluso nell'analisi della crescita vermi sulle piastre multipozzetto dove ciascun pozzetto contiene un altro clone di RNAi. A causa l'elevata viscosità del agar e piccoli volumi coinvolti, è difficile ottenere un riempimento uniforme, privo di bolle di piastre da 96 pozzetti senza attrezzature specializzate. Inoltre, i ceppi batterici che trasportano il RNAi di essiccazione anche può essere un problema, come i pozzetti esterni asciugano più velocemente di pozzi interne, che conduce al potenziale non-uniformità e significativo per il cracking di agar. Come notato sopra, questo incoraggia vermi alla tana, riducendo il numero di animali disponibili per lo screening e rischi di intasamento movimentazione del liquido. Per entrambi questi motivi, piastre da 24 pozzetti sono più facili da lavorare con più piastre da 96 pozzetti. Anche se questo riduce la velocità effettiva di dosaggio, migliora l'affidabilità ed è suggerito, in particolare per le schermate iniziali.

Infine, il dosaggio è stato modificato il dosaggio per sostituire p. aeruginosa con E. faecalis. (In linea di principio, sostituzione con altre specie batteriche non dovrebbe fornire indebite difficoltà, purché le condizioni di esposizione e di coltura appropriati sono identificate.) Il fattore più importante da considerare è i requisiti di media dell'agente patogeno, sia per la crescita e lo sviluppo e per l'induzione della virulenza. Ad esempio, il Gram positivo, opportunistico patogeno E. faecalis richiede media ricchi di nutrienti (come BHI) e l'incubazione a temperature più elevate rispetto a p. aeruginosa14,26. Prendendo questi fattori in considerazione, adattamento del dosaggio da utilizzare E. faecalis è stato semplice. Come osservato per p. aeruginosa, abbiamo visto uccisione tempo-dipendente (Figura 7). È interessante notare che, il momento della morte era simile a saggi pubblicati in precedenza che utilizzato pre-infezione su piastre agar26, nonostante l'assenza di questo passaggio, che può suggerire che i meccanismi coinvolti nella patogenesi variano.

Figure 1
Figura 1: schema per liquido a base di c. elegans – analisi di p. aeruginosa infezione. Passaggi riguardanti la preparazione e la propagazione del nematode sono sul lato sinistro, preparazione batterica sono a destra. Passaggi riguardanti entrambi sono centrati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Uccisione di c. elegans da p. aeruginosa è specifico e richiede una corretta alimentazione batterica. (A) c. elegans morte in presenza di Escherichia coli e di p. aeruginosa. (B) morte di c. elegans in presenza di p. aeruginosa con (a destra) e senza (sinistra) media di uccidere lento aggiunto per mescolare (cioè, S solo basale). S basale è un minimo di media e non contiene le sostanze nutrienti richieste per la crescita batterica e impedisce la produzione di pioverdina. (C) c. elegans morte in presenza di diversamente preparato p. aeruginosa. p < 0.01, basato su t di Student-test. Barre di errore rappresentano s.e.m. 10 pozzi sono stati utilizzati per replica biologico a condizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Resistenza di c. elegans di p. aeruginosa dipende da vie immuni ospite. Un gruppo di selezionati RNAi atterramenti è stato trattato con p. aeruginosa (A) o 1,10-fenantrolina (un chelante chimico che imita l'esposizione a p. aeruginosa in liquido) (B). p < 0.01, #p < 0,05, basato su t di Student-test. Barre di errore rappresentano s.e.m. 10 pozzi sono stati utilizzati per replica biologico a condizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Uccisione di c. elegans da p. aeruginosa è robusto e dipende dalla concentrazione batterica. Immagini rappresentative (A-B) (A) e quantificazione (B) di c. elegans morte dopo l'esposizione a concentrazioni variabili di p. aeruginosa per 72 h. p-valori sono stati calcolati basati su Student t -test. Barra della scala in (A) è di 1 mm. 16 pozzi sono stati utilizzati per replica biologico a condizione. BF: Brillante campo, FL: fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: elaborazione dei dati di acquisizione e l'immagine di un test con un forte segnale. (A) immagini rappresentative dei live (controllo negativo) e morti (controllo positivo) di c. elegans. (B) analisi statistica dei controlli positivi e negativi, basato sul metodo di acquisizione dati, modalità di elaborazione e numero di pozzi analizzati. Fluorescenza (C) è stato analizzato per i vermi da quattro singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (due positive e due pozzetti di controllo negativo). Ogni bene contenuta ~ 100 vermi. Ogni punto sul grafico rappresenta un singolo verme, mostrando il tempo di volo (che correla con ma, a causa l'avvolgimento delle viti senza fine viventi, imperfettamente rappresenta dimensioni) e la fluorescenza misurata per i vermi che sono macchiati con Sytox Orange. Controllo positivo vermi pre-sono stati uccisi da esposizione al calore. A causa di cambiamenti nella tensione e nella forma di vermi morti (come si può vedere nel(), vermi morti appaiono più rod-like e hanno alcuni tornanti di corpo) rispetto alle loro controparti viventi, vermi morti hanno un TOF più a lungo. p-valori sono stati calcolati basato su t di Student-test. Barra della scala nel()è 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: elaborazione dei dati immagine e acquisizione di un test con un segnale moderato. (A) immagini rappresentative di c. elegans che trasportano un reporter di rosa-1::GFP viscoelastico e un marcatore costitutiva mCherry (per normalizzare l'espressione dei geni dalla matrice extracromosomico). C. elegans esposto a DMSO (controllo negativo) o 1,10-fenantrolina (controllo positivo). (B) analisi statistica dei controlli positivi e negativi, basato sul metodo di acquisizione dati, modalità di elaborazione e numero di pozzi analizzati. (C) quattro singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (due positive e due pozzetti di controllo negativo) sono stati analizzati usando il flusso vermimetry. p-valori sono stati calcolati basato su t di Student-test. Barra della scala nel()è 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Uccisione di elegans del c. di E. faecalis è dipendente dal tempo e robusto. Immagini rappresentative (A-B) (A) e quantificazione (B) di c. elegans morte dopo l'esposizione di E. faecalis. p < 0.01, basato su t di Student-test. 10 pozzi sono stati utilizzati per replica biologico a condizione. Barre di errore rappresentano s.e.m. scala bar in (A) è 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo saggio (o simili saggi dove altri agenti patogeni vengono sostituiti con p. aeruginosa o E. faecalis) sono utile per una varietà di scopi, tra cui la scoperta di nuovi farmaci. È anche utile per affrontare questioni biologiche fondamentali, come identificare i fattori di virulenza, la delucidazione dei meccanismi di difesa ospite e determinare il regolamentazione macchinari coinvolti nell'interazione ospite-patogeno.

Anche se il dosaggio di uccisione liquido p. aeruginosa è robusto, ci sono diversi punti dove l'attenzione attenta dovrebbe essere pagata per minimizzare la probabilità di guasto. In primo luogo, come già fatto notare, la piastra di origine batterica per p. aeruginosa vaccinazioni deve rimanere fresca, per timore che i batteri perdono virulenza, nonostante la crescita durante la notte in LB. In secondo luogo, è chiave per assicurarsi che il calcio e magnesio sono aggiunti a p. aeruginosa uccidendo saggi. Senza di essa, virulenza sarà significativamente compromessa. Infine, vale la pena notare che vermi allevati su HT115 (per le analisi basate su RNAi) morirà significativamente più successivamente di vermi allevati su OP50 (N. Kirienko, comunicazione personale). Per questo motivo, se passando a studi basati su RNAi, è importante determinare empiricamente il miglior punto di tempo per il dosaggio.

Per l'uccisione di saggi con p. aeruginosa o E. faecalis, è fondamentale per garantire un'alimentazione adeguata per lo sviluppo dei vermi dalla fase L1 fino a quando non sono pronti per essere utilizzati nel test. Fame, anche nel breve periodo, è noto per attivare un numero di vie di difesa ospite, quali l'insulina/IGF di DAF-2/DAF-16 segnalazione rete27. I nostri dati suggeriscono che DAF-16/FOXO è già leggermente attivato da essere coltivate in liquido20, e ulteriore attivazione è fortemente auspicabile, poiché DAF-16/FOXO promuove patogeno ad ampio spettro resistenza23.

Infine, è fondamentale utilizzare completamente sterile vermi in qualsiasi test che si basa sulla mortalità come una lettura. Se i vermi sono fertili, essendo in liquido provoca difficoltà di deposizione delle uova. Di conseguenza, alcuni degli embrioni si schiudono all'interno del padre, alla fine causando la sua morte. Per questo motivo, generalmente usiamo una lesione genetica, come glp-4(bn2)28, che dimostra un fenotipo completamente penetrante sterile per queste analisi. L'uso di sostanze chimiche che impediscono lo sviluppo embrionale ma consentire comunque la deposizione delle uova, ad esempio 5-fluorodeossiuridina (FUdR), dovrebbe essere evitato come essi possono anche interferire con lo sviluppo e la crescita batterica.

In generale, abbiamo trovato molto utile per pianificare parecchi punti di tempo per l'analisi. Anche se il dosaggio è robusto e la tempistica è generalmente coerente, stocastici e impercettibili cambiamenti è in grado di spostare il momento della morte nell'analisi entro 2-4 ore. Quando è necessaria la risoluzione dei problemi, spesso è utile prendere in considerazione in primo luogo la più semplice delle risposte; cioè, preparare supporti freschi, scartare le colture batteriche più recente e ri-rigare ceppi batterici dal scorte congelate, ecc solo molto raramente queste misure non ripristinare il test di funzionalità.

Dovuto la relativa semplicità del metodo, un'ampia varietà di modifiche può essere facilmente eseguita. Cambiando i vermi da uno sfondo uniforme glp-4(bn2) per gli schermi di RNAi di alto-rendimento, come quelli Descriviamo qui, è utile per l'identificazione delle vie di risposta di host per una vasta gamma di xenobiotici e sostanze chimiche tossiche. Ad esempio, aggiungendo la stessa sostanza chimica o tossina in tutti i pozzetti di piastre di RNAi (ad es., Cry5B tossina, fenantrolina, ecc.), le vie che alterano la sensibilità a queste tossine possono essere facilmente identificate. Questi tipi di schermi è utilizzabile anche per identificare le reti di difesa contro qualsiasi della panoplia di agenti patogeni che infettano c. elegans.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse a divulgare.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto dal Research Institute del Texas (CPRIT) premio RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930 e la prevenzione di cancro e dell'istituti nazionali di salute K22 AI110552 assegnato a NVK. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COPAS FP BioSorter Union Biometrica Large object flow cytometer/worm sorter
Cytation 5 BioTek
EL406 Washer Dispenser BioTek
Multitron Pro Infors HT
24 Deep-Well RB Block Thermo Fisher Scientific CS15124
384-Well plate Greiner Bio-One MPG-781091
Nematode Growth Media (NGM) Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) plates Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Slow Killing (SK) media Amount per liter:  3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water
Lysogeny Broth (LB) USBiological Life Sciences L1520
Brian Heart Infusion broth (BHI) Research Products International Corp 50-488-526
Worm Bleach Solution Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water
S Basal Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water
Agar USBiological Life Sciences A0930
NaCl USBiological Life Sciences S5000
Peptone USBiological Life Sciences P3300
CaCl2 USBiological Life Sciences
MgSO4 Fisher Scientific M63-500
Phospate buffer amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)
KH2PO4 Acros Organics 7778-77-0
K2HPO4 USBiological Life Sciences P5100
5% Sodium Hypochlorite Solution BICCA 7495.5-32
NaOH solution Fisher Scientific SS255-1
Breathe-easy Diversified Biotech BEM-1
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain Fisher Scientific S11368
Bacterial Strains
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis(OG1RF)
E. coli superfood (OP50)
E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)
Worm Strains
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)

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