Aislamiento, caracterización y MicroRNA basado en la modificación genética de las células madre del folículo Dental humano

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Genetics

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Summary

Este protocolo describe la ingeniería genética transitoria de células dentales extraídas del folículo dental humano. La estrategia de modificación no aplicada puede llegar a ser una base para la mejora de los productos terapéuticos de células madre.

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Müller, P., Ekat, K., Brosemann, A., Köntges, A., David, R., Lang, H. Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58089, doi:10.3791/58089 (2018).

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Abstract

Hasta la fecha, varios tipos de células madre en diferentes etapas de desarrollo están en el foco para el tratamiento de enfermedades degenerativas. Sin embargo, ciertos aspectos, como la muerte celular masiva inicial y bajos efectos terapéuticos, problemas de su traducción clínica amplia. Ingeniería genética de células antes del trasplante surgió como un método prometedor para optimizar los efectos terapéuticos de células madre. Sin embargo, todavía carecen de sistemas de entrega de genes seguros y eficientes. Por lo tanto, el desarrollo de métodos adecuados puede proporcionar un enfoque para resolver los retos actuales en terapias basadas en células madre.

El presente Protocolo describe la extracción y caracterización de células madre de folículo dental humana (hDFSCs) así como su modificación genética no-virales. El folículo dental postnatal dio a conocer como una fuente prometedora y de fácil acceso para la recolección de las células madre adultas multipotentes que poseen potencial de proliferación alta. El procedimiento de aislamiento descrito presenta un método simple y confiable para cosechar hDFSCs de cordales. Este protocolo incluye también métodos para definir las características de células madre de células aisladas. Para la ingeniería genética de hDFSCs, una estrategia optimizada transfección catiónico base de lípidos se presenta introducción de microARN altamente eficiente que permite sin producir efectos citotóxicos. MicroRNAs son candidatos adecuados para la manipulación de celda transitoria, como estos pequeños reguladores traslacionales controlan el destino y el comportamiento de células madre sin el peligro de la integración del genoma estable. Así, este protocolo representa un procedimiento seguro y eficaz para la ingeniería de hDFSCs que puede llegar a ser importante para la optimización de su eficacia terapéutica.

Introduction

El folículo dental humano es un flojo Tejido fino conectivo de derivados de ectomesenchymally que rodea el diente en desarrollo1,2. Al lado de su función de coordinar la osteoclastogénesis y osteogénesis para el proceso de erupción del diente, este tejido presenta células madre y progenitoras especialmente para el desarrollo del periodonto3,4,5. Por lo tanto, el folículo dental se considera como una fuente alternativa para cosechar las células madre adultas humanas6,7.

Varios estudios demostraron que las células madre del folículo dental humana (hDFSCs) son capaces de diferenciarse en el linaje periodontal incluyendo osteoblastos, fibroblastos del ligamento y cementoblastos8,9,10 . Además, estas células fueron demostradas para que coincida con todas las características de las células estromales mesenquimales (MSCs) incluyendo la capacidad de auto renovación, adhesión plástica, expresión de marcadores de superficie específicos (por ejemplo,, CD73, CD90, CD105) así como osteogénico, adipogenic y condrogénica diferenciación potencial11,12,13. Otros estudios también revelaron un potencial de diferenciación de los nervios de hDFSCs2,14,15,16,17,18.

Debido a sus prometedoras propiedades y fácil acceso, hDFSCs se convirtió recientemente relevantes para tejido ingeniería19,20,21. Los primeros estudios se concentraron en el potencial de DFSCs para regenerar hueso periodontal y dientes raíces19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Desde el conocimiento de la capacidad neurogénica de hDFSCs, su aplicación como tratamiento potencial para las enfermedades neurodegenerativas ha sido investigado31,32,33. HDFSCs también han cobrado importancia con respecto a la regeneración de otros tejidos (p. ej., epitelio corneal)34,35. El potencial terapéutico de hDFSC no se basa sólo en su potencial de diferenciación directa sino también en su actividad paracrina. Recientemente, hDFSCs se han demostrado para secretar una gran cantidad de factores bioactivos, como las metaloproteinasas de matriz (MMPs), factor de crecimiento insulínico (IGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento básico del fibroblasto (bFGF) y el crecimiento de hepatocito factor (HGF), que desempeñan un papel crucial de la angiogénesis, inmunomodulación, remodelación de la matriz extra celular y procesos reparativos36.

Sin embargo, amplia traducción clínica de la terapia de células madre se deteriora aún por varios desafíos, como la muerte masiva de células iniciales y células beneficioso bajo efectos37,38. Ingeniería genética proporciona una estrategia prometedora para abordar estos desafíos y por lo tanto, puede realzar grandemente la eficacia terapéutica de células madre38,39,40. Para la manipulación de celda transitoria, microRNAs (miRs) son los candidatos idóneos, como estos pequeños reguladores traslacionales controlan el destino y el comportamiento de las células madre sin el peligro de genoma estable integración41,42, 43. hasta la fecha, se han identificado varios miRs beneficiosos promover la proliferación de la célula de vástago, supervivencia, homing, actividad paracrina, así como su diferenciación en varios linajes44. Por ejemplo, miR-133a ingeniería MSCs mostraron un aumento de la supervivencia y el engraftment en corazones de rata infartado, dando por resultado una función cardíaca mejorada en comparación con MSCs45. Además, miR-146a MSCs expresando mostraron secretan mayores cantidades de VEGF, que a su vez condujo a una mayor eficacia terapéutica en el tejido isquémico46.

Este manuscrito presenta un protocolo detallado para la extracción selectiva y la ingeniería genética de hDFSCs. Para ello, describimos la digestión enzimática y cosecha de los folículos dentales humanas, así como el aislamiento posterior de hDFSCs. Para caracterizar las células aisladas, instrucciones importantes para la verificación de propiedades MSC se han incluido siguiendo las directrices de la sociedad internacional de terapia celular13. Además, ofrecemos una descripción detallada para la generación de hDFSCs miR-modificado por aplicación de una estrategia de transfección basada en lípidos catiónicos y la evaluación de la eficiencia de transfección y citotoxicidad.

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Protocol

HDFSCs están aisladas de los folículos dentales de los dientes extraídos de la sabiduría proporcionados por el Departamento de Cirugía Oral y maxilofacial plástico de Rostock University Medical Center. Se obtuvo consentimiento informado y autorización por escrito de todos los pacientes. Este estudio fue autorizado por el Comité de ética local de la Universidad de Rostock (permiso No. A 2017-0158).

1. aislamiento de hDFSCs

Nota: Para evitar la contaminación bacteriana, dientes de la sabiduría no debe ser estalló antes de la extracción

  1. Preparación de soluciones requiere
    1. Preparar una solución salina tamponada con fosfato (PBS) / solución de penicilina-estreptomicina-glutamina (P-S-G): mezclar 495 mL de PBS con 5 mL de solución de P-S-G. Almacenar en alícuotas de 50 mL a 4 ° C.
    2. Preparar medio de cultivo de hDFSC: 445 ml de medio basal con 5 mL de agente antibiótico y 50 mL de suero bovino fetal (FBS). Almacenar a 4 ° C.
    3. Preparar colagenasa tipo stock solución (30 mg/mL): diluir 300 mg del tipo de colagenasa en 10 mL de medio basal suplementado con 1% de agente antibiótico. Mezcle la solución con energía. Filtrar la solución con un filtro de 0.2 μm. Tienda alícuotas de 500 μl de colagenasa tipo I solución a-20 ° C.
    4. Prepare solución Dispase II (40 mg/mL): diluir 40 mg del Dispase II en 10 mL de medio basal suplementado con 1% antibiótico agente. Mezcle la solución con energía. Filtrar la solución con un filtro de 0.2 μm. Almacenar en alícuotas de 500 μl de solución stock Dispase II a-20 ° C.
  2. Procedimiento quirúrgico
    1. Inyectar una cantidad suficiente (máximo: 2 mL) del anestésico local.
    2. Crear y levantar un colgajo mucoperióstico de tres lados. No es necesario levantar un colgajo lingual.
    3. Proteger el aspecto lingual con un elevador perióstico.
    4. Suavemente molino bucal y distal del hueso con una fresa redonda de metal duro.
    5. Aflojar el tejido del folículo con un elevador perióstico. Retire con cuidado el diente completo (germen) y folículo tirando de la corona (y folículo) con posterior (tercer molar) fórceps.
    6. Desbridar y regar la toma bien con solución de NaCl.
    7. Vuelva a colocar la aleta mucoperióstica con suturas de vicryl (véase Tabla de materiales).
    8. Sacar el folículo dental de la cavidad oral y en una alícuota de 50 mL de solución de PBS/P-S-G.
      Nota: La muestra puede guardarse a 4 ° C hasta el procesamiento posterior.
  3. Digestión enzimática del folículo dental
    1. Caliente previamente el medio de cultivo de hDFSC y solución de PBS/P-S-G a la temperatura ambiente (RT).
    2. Descongelar una alícuota de cada tipo de colagenasa I y II Dispase soluciones stock. Preparar una solución de digestión de 3 mg/mL tipo de colagenasa y 4 mg/mL Dispase II agregar 500 μl de cada colagenasa tipo I y solución a 4 mL de basal medio que contiene 1% agente antibiótico Dispase II.
    3. Lugar del folículo extraído en una placa Petri estéril y añadir 10 mL de solución de PBS/P-S-G para lavar el tejido extraído. Repita este paso de lavado dos veces.
    4. Pique el folículo extraído a los pedazos de aproximadamente 1 mm x 1 mm con un bisturí estéril dentro de la caja Petri con 10 mL de solución de PBS/P-S-G.
    5. Transferencia de tejido picadito y solución de PBS/P-S-G de la placa de Petri en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL. Lave la placa de Petri con 10 mL de solución de PBS/P-S-G y transferir la solución al mismo tubo.
    6. Centrifugar el tubo de centrífuga cónico de 10 min a 353 x g a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.
    7. Añadir 5 mL de solución de digestión a los tejidos concentrados. Mezclar suavemente la solución y el tejido. Incubar la mezcla a 37 ° C y 5% de CO2 por 2 h en un incubador de agitación.
    8. Centrífuga digerido suspensión de células y tejidos en 353 x g durante 10 min a RT. descartar el sobrenadante y Resuspenda el sedimento obtenido en 6 mL de medio de cultivo hDFSC.
    9. Suspensión de células de la semilla en una de 25 cm2 matraz de cultivo de células e incubar las células a 37 ° C, 5% CO2 y 20% O2.
      Nota: Si el tejido no es totalmente digerido, transferir el tejido restante en el matraz de cultivo celular así.
    10. Cambiar el medio cuidadosamente 24 horas después de la siembra de la célula. Luego cambiar el medio cada tres días hasta confluencia.
      Nota: HDFSCs debe ser adherente de plástico 24 h después de la siembra de células y se puede separar de las células no adherentes y componentes de la sangre simplemente cambiando el medio.
  4. Recolección de células
    1. Caliente previamente el medio de cultivo hDFSC, solución de PBS/P-S-G y solución de ácido (EDTA) tripsina/etilendiaminotetracético a RT.
    2. Desechar el sobrenadante del frasco de cultivo y lavado las células confluentes con 5 mL de solución de PBS/P-S-G.
    3. Añadir 1 mL de solución de tripsina/EDTA al matraz de cultivo e incubar 3 min a 37 ° C. Detener el proceso de digestión mediante la adición de 3 mL de medio de cultivo de hDFSC en el matraz de la cultura.
    4. Transferir la suspensión de células en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL y centrifugar la suspensión durante 10 min a 353 x g en RT. descartar el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en una cantidad apropiada hDFSC de medio de cultivo.
    5. Contar celdas: suavemente mezclar 10 μl de suspensión celular con 10 μl de solución de azul tripán. Aplique 10 μL en una cámara de recuento y calcular la cantidad de células hDFSC.

2. Caracterización de hDFSCs

  1. Immunophenotyping
    1. Preparación de las células para análisis cytometric del flujo
      1. Preparación de soluciones requiere
        1. PBS/EDTA (2 mM) de preparar: Mezcle 996 mL de PBS con 4 mL de EDTA (0.5 M).
        2. Preparar el tampón de tinción: mezcla de 995 mL de PBS/EDTA (2 mM) con 5 g de BSA. Filtrar la solución utilizando una unidad de filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C hasta uso.
        3. Preparar la solución stock de paraformaldehido (PFA) (4%): diluir 4 g PFA en 100 mL de PBS y calentar la solución a 80 ° C. Mezclar la solución y ajustar el pH a 7.3. Parte alícuota obtuvo solución de la PFA en cantidades respectivas (1.5 mL) y almacenar a-20 ° C hasta uso.
          PRECAUCIÓN: Debido a los humos PFA son tóxicos, preparar la solución PFA en una campana de ventilación.
      2. Después de la cosecha (1.4) de la célula, transferir 14 muestras de 5 x 104 células en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar la suspensión a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
        Nota: Realizar el siguiente trabajo en una sala más bien sombreada. Mantener las células y los reactivos en el hielo a menos que se indique lo contrario.
      3. Resuspenda las células en ciertas cantidades de tampón de tinción (4 ° C) y añadir FcR bloqueo reactivo (4 ° C) como se indica en la tabla 1.
      4. Añadir los siguientes anticuerpos hacia el lado interno de la respectiva muestra como se indica en la tabla 1: Allophycocyanin (APC) ratón humana CD29; Ratón APC control de isotipo κ IgG1; Proteína Peridinin-clorofila (PerCP)-Cyanine5.5 ratón humana CD44; PerCP-Cyanine5.5 mouse IgG2b control de isotipo κ; V500 ratón humana CD45; V500 mouse IgG1 control de isotipo κ; Ficoeritrina (PE) ratón humana CD73; Ratón de PE control de isotipo κ IgG1; PerCP-Cyanine5.5 ratón humana CD90; Ratón de PerCP-Cyanine5.5 control de isotipo κ IgG1; ratón contra CD105: Alexa Fluor (AF) 488; control negativo de IgG1 de ratón: AF488; PE-Cyanine7 ratón humana CD117; PE-Cyanine7 mouse IgG1, control de isotipo κ. Después de que los anticuerpos se han añadido a cada muestra, girar por anticuerpos y mezclar suavemente. Incubar las soluciones durante 10 min a 4 ° C.
      5. Añadir 1 mL de PBS (4 ° C) y centrifugar las muestras a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
      6. Resuspenda las células en 100 μl de PBS (4 ° C) y agregar 33 μl de PFA (4%). Mezclar las soluciones y almacenar en hielo o a 4 ° C hasta el análisis cytometric del flujo.
    2. Medición de citometría de flujo de células
      Nota: Realizar el siguiente trabajo en una sala más bien sombreada. Mantener las células en hielo hasta la medición.
      1. Para examinar la expresión de antígenos de superficie, transferir muestras en tubos adecuados para mediciones de citometría de flujo.
      2. Medir por lo menos 2 x 104 eventos usando un citómetro de flujo. Analizar como se muestra en la figura 2.
  2. Potencial de diferenciación multipotentes de hDFSCs
    1. Utilice un disponible en el mercado humano mesenquimales células madre funcional Kit de identificación para confirmar adipogenic osteogénica y condrogénica diferenciación potencial de hDFSCs. Aplicar burro anti-cabra AF488 de anticuerpo secundario para la coloración de la proteína de unión a ácidos grasos 4 (FABP4) y aggrecan así como burro anti-ratón AF488 de anticuerpo secundario para la tinción de la osteocalcina. Para la tinción de núcleos, uso de medio de montaje con 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI).
      Nota: Preparar muestras sin anticuerpo primario como controles negativos para análisis microscópicos.
    2. Analizar la expresión de proteínas por microscopía confocal de barrido láser. Configuración de microscopía: objetivo de 40 x con inmersión en aceite; la excitación láser de 488 nm (para AF488) y 405 nm (para DAPI).

3. transfección de hDFSCs

  1. Después de la célula (1.4) la cosecha, la semilla hDFSCs en una placa de cultivo celular de 24 pozos 24 h antes de la transfección.
    Nota: A partir de la densidad celular es aproximadamente de 4 x 104 células por pocillo. Células deben llegar a confluencia de ~ 80% en el día de la transfección.
    Nota: La semilla una muestra adicional de la célula como control para el análisis cytometric del flujo.
  2. Preparación de complejos de transfección
    Nota: Para evitar contaminación por RNasas, limpie el área de trabajo directamente antes de la preparación de complejos de transfección con solución de descontaminación de Rnasa. Utilizar sólo material libre de ARNasas y soluciones.
    Nota: Realizar el siguiente trabajo en una sala más bien sombreada.
    1. Preparar la solución stock de miR (50 μm): resuspender miR precursor marcado con Cy3 (5 nmol) en 100 μl de agua libre de nucleasa. Solución madre de alícuota miR obtenidos en la tienda en la oscuridad a-20 ° C hasta uso y cantidades respectivas (5 μl).
    2. Diluir 40 pmol de miR (0,8 μl de la solución madre de miR de 50 μm) en 66,7 μl de medio de suero reducido. Mezclar suavemente la solución
    3. Diluir 0.67 μl de reactivo de transfección basada en lípidos catiónicos en 66,7 μl de medio de suero reducido. Mezcle la solución suavemente e incubar 5 min a TA.
    4. Después de la incubación, añadir el reactivo de transfección previamente diluido a la miR previamente diluida. Mezcle la solución suavemente e incubar por 15 min a TA.
  3. Añadir gota a gota los complejos preparados transfección directamente al medio de cultivo en las células. Mezclar suavemente, meciendo la placa de cultivo celular de 24 pozos y hacia atrás.
  4. Incube las células a 37 ° C, 5% CO2y 20% O2 durante 24 h.

4. Análisis de la transfección

Nota: Realizar el siguiente trabajo en una sala más bien sombreada.

  1. Cosecha después de la transfección de la célula
    Nota: Recopilar todas las soluciones de células de una muestra en el mismo tubo de centrífuga cónico de 15 mL.
    1. 24 h después de la transfección, recoger el sobrenadante de las muestras en tubos de centrífuga correspondiente.
    2. Lavar las células con 1 mL de PBS, PBS de transferencia en el tubo de centrifugadora respectivos y agregar 500 μl tripsina/EDTA (RT) a las células. Incubar las soluciones por 3 min a 37 ° C.
    3. Parar la tripsinización añadiendo 1 mL de medio de cultivo (RT) a las células y la transferencia de la solución en el tubo de centrifugadora respectivos. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a 4 ° C.
      Nota: De este tiempo, mantener las células y los reactivos en el hielo a menos que se indique lo contrario.
  2. Preparación de las células para análisis cytometric del flujo
    1. Deseche el sobrenadante. Resuspenda las células en 100 μl de tampón de tinción (4 ° C) y solución de transferencia celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    2. Añadir 0,5 μl de colorante reactivo amina a las muestras para distinguir entre células vivas y muertas. Suavemente mezcle la solución e incubar 10 min a 4 ° C.
    3. Añadir 1 mL de PBS (4 ° C) a las células y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
    4. Resuspenda las células en 100 μl de PBS (4 ° C) y agregar 33 μl de PFA (4%). Mezclar las soluciones y almacenar en hielo o a 4 ° C hasta el análisis cytometric del flujo.
  3. Medición de citometría de flujo de células
    Nota: Realizar el siguiente trabajo en una sala más bien sombreada. Mantener las células en hielo hasta la medición.
    1. Transferir las muestras a tubos adecuados para mediciones de citometría de flujo.
    2. Examinar la viabilidad celular y la eficiencia de absorción de miR utilizando un citómetro de flujo. Medir por lo menos 2 x 104 eventos. Utilice la estrategia bloquea representada en la figura 4.
      Nota: Utilice las células untransfected como control negativo para arreglar la compuerta el uso de las células positivas Cy3 y calcular la muerte celular causada por transfección.

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Representative Results

Aquí, presentamos una instrucción detallada aislamiento cosecha hDFSCs del tejido del folículo dental humana. Por el fácil acceso del folículo dental durante la cirugía de rutina, es una fuente prometedora para la extracción de células madre adultas.

El hDFSCs aislado demostró todas las características descritas para la definición de MSCs13. De hecho, las células eran de plástico adherente debajo se describen las condiciones de cultivo y muestran una morfología de fibroblasto-como (figura 1). Análisis de citometría de flujo revelaron que hDFSCs expresa un panel de ciertos antígenos de la superficie, incluyendo CD29, CD44, CD73, CD90 y CD105, mientras CD45 y CD117 estaban ausentes (figura 2). Por otra parte, la adipogenic, osteogénico y potencial de la diferenciación condrogénica de células específicas in vitro Cultura condiciones fue confirmada por la inmunotinción de la proteína obligatoria 4 del ácido graso (FABP4), osteocalcina y aggrecan (figura 3).

La estrategia de la transfección de base de lípidos catiónicos descrito permitió eficiente modificación genética transitoria de hDFSCs con una absorción miR en ~ 100% de la transfección después de 24 h de células viables (Figura 4B). Por otra parte, transfected (Figura 4A) y untransfected (figura 4) las muestras demostraron cantidades comparables de las células muertas, demostrando las condiciones de procesamiento suave de la célula.

Figure 1
Figura 1: luz representativa imagen de microscopio de hDFSCs. Las células muestran una morfología de fibroblasto-como bajo condiciones de cultivo estándar.

Figure 2
Figura 2: flujo representativo immunophenotyping cytometric del hDFSCs. Análisis cytometric del flujo de células después de la tinción para marcadores de superficie celular específicos (azul). Controles de isotipo correspondiente se utilizaron como controles negativos (gris). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: verificación representante de la adipogenic osteogénica y condrogénica diferenciación potencial de hDFSCs. Después de la diferenciación, adipocitos, osteocitos y condrocitos fueron identificados por el immunostaining de proteína de unión de ácidos grasos (A) 4 (FABP4) (verde), osteocalcina (B) (verde) y (C) aggrecan (verde). Los núcleos fueron teñidos con DAPI (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Representante gating estrategia para el análisis de la transfección. Representación esquemática de la estrategia utilizada para la cuantificación de la citotoxicidad (A) que bloquean (azul: las células muertas) y (B) eficiencia de absorción miR marcado con Cy3 (rojo: Cy3+ células) transfección después de 24 h. Las células untransfected (C,D) se utilizaron como control.

MACS FcR Anticuerpos [μl] Controles de isotipo [μl]
Muestra tampón de bloqueo CD29 CD44 CD45 CD73 CD90 CD105 CD117 APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7
[μl] reactivo [μl] APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
1 30 10 10
2 37.5 10 2.5
3 37.5 10 2.5
4 30 10 10
5 35 10 5
6 35 10 5
7 37.5 10 2.5
8 30 10 10
9 30 10 10
10 37.5 10 2.5
11 30 10 10
12 40 10 10
13 30 10 5
14 37.5 10 2.5

Tabla 1: Pipetear diseño de immunophenotyping de hDFSCs.

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Discussion

Las células madre adultas están en foco para el tratamiento de varias enfermedades degenerativas. En particular, ósea la médula (BM)-derivado de las células madre, incluyendo las células madre hematopoyéticas (HSCs) y MSCs, están bajo intensa investigación clínica47. Sin embargo, BM la cosecha es un procedimiento invasivo que causa dolor en el sitio de la donación y puede conducir a eventos adversos48. Recientemente, el tejido dental postnatal ha emergido como una nueva y accesible fuente de células madre. Estas células madre dentales fueron demostradas que conoce todas las características MSC y mostró mayor capacidad de proliferación de células madre derivadas de BM49. Aquí, presentamos un protocolo detallado para la extracción, caracterización e ingeniería de hDFSCs.

El procedimiento de aislamiento descritos se ha desarrollado en los folículos dentales humanos de cordales, este tejido es comúnmente extraído y eliminado como desechos médicos19. Sin embargo, otros tejidos dentales, incluyendo pulpa dental50,51, ligamento periodontal52, dientes de hojas caducas exfoliada53y raíz apical papila54, pueden ser utilizados para la extracción del tallo dental células.

Ingeniería genética de las células madre mediante la inserción de miRs es una nueva estrategia para superar ciertas dificultades en terapias basadas en células madre, como la célula de vástago baja supervivencia43,55,56,57. Este protocolo presenta instrucciones cruciales para la introducción eficiente de miR sintético en hDFSCs utilizando un reactivo de transfección de base de lípidos catiónicos comercialmente disponibles. La aplicación de formulaciones liposómicos catiónicas para la entrega de reactivos, terapéuticos, tales como drogas y ácidos nucleicos, se ha investigado en numerosos ensayos clínicos58,59. Sin embargo, son potencialmente citotóxicos en una manera dose-dependent liposomas catiónicos causando por ejemplo,, daño a la integridad de la membrana de la célula o alteraciones en el gene expresión59,60,61 . Por lo tanto, debe prestarse especial atención a los efectos tóxicos sobre las células inducidos por transfección.

En particular, las condiciones indicadas de la transfección se han optimizado para miR-mediada de la modificación genética de hDFSCs con respecto a la eficiencia y la citotoxicidad. Sin embargo, otros estudios demostraron el uso acertado de este reactivo de transfección para la entrega de más ácidos nucleicos, incluyendo ADN de plásmido, mRNA y siRNA, en células diferentes tipos62,63, 64 , 65 , 66 , 67 , 68. resultados de estos estudios revelaron que las condiciones de entrega ideal variaron significativamente y tienen que ser definidos para cada tipo de célula.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el programa de Cajamarca del centro médico de la Universidad de Rostock (889018) y la Fundación húmeda (2016-11). Además, P.M. y R.D. son apoyados por el BMBF (VIP + 00240).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA1557A488 Clone SN6, monoclonal
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA928A488 monoclonal
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody BD Biosciences 559883 Clone MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555751 Clone MOPC-21, monoclonal
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody BD Biosciences 550257 Clone AD2, monoclonal
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555749 Clone MOPC-21, monoclonal
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody BD Biosciences 339217 Clone 104D2, monoclonal
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 557872 Clone MOPC-21, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody BD Biosciences 560531 Clone G44-26, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 558304 Clone 27-35, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody BD Biosciences 561557 Clone 5E10, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 55095 Clone MOPC-21, monoclonal
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody BD Biosciences 560777 Clone HI30, monoclonal
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 560787 Clone X40, monoclonal
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec 130-059-901
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-020 0.5M, pH 8.0
Steritop Merck Millipore SCGPT05RE 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone
BSA Sigma-Aldrich A7906
PFA Merck Millipore 1040051000
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit R&D Systems SC006
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fisher Scientific AM9780
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17120 5 nmol
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17110 5 nmol
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11055 polyclonal
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 polyclonal
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML histology mounting medium
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Zeiss
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
ZEN2011 software Zeiss
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) Biochrom L2143 in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
PBS (1x) Thermo Fisher Scientific 10010023 pH: 7.4; w/o: Ca and Mg
P-S-G (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 Thermo Fisher Scientific 11039021
Antibiotic, ZellShield Biochrom W 13-0050
FBS Thermo Fisher Scientific 10500064
Collagenase type I Thermo Fisher Scientific 17100017
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm Braun 4099206
50 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,547,254
15 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,554,502
Cell culture flask 75 cm2 Sarstedt 833,910,002
Cell culture flask, 25 cm2 Sarstedt 833,911,002
Freezing medium, Biofreeze Biochrom F 2270
Cryotubes Thermo Fisher Scientific 377267 1.8 mL
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154 0.4 %
Counting chamber Paul Marienfeld
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% Mibe
NaCl solution Braun 0.9 %
Vicryl satures, Vicryl rapide Ethicon 3 - 0

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