تصور المتغيرات الجينية وأهداف قصيرة والطفرات في سياق الأنسجة المورفولوجية الجيش النيبالي الملكي في الموقع تهجين المقايسة

Biology
 

Summary

هنا، يمكننا وصف في الموقع تهجين الإنزيم الذي تمكن من كشف حساسة ومحددة لمتواليات قصيرة قدر النيوكليوتيدات 50 مع قرار واحد-النوكليوتيدات على مستوى خلية واحدة. المقايسة، التي يمكن أن يؤديها يدوياً أو تلقائياً، يمكنك تمكين التصور المتغيرات لصق ومتواليات قصيرة، والطفرات في سياق النسيج.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Anderson, C. M., Laeremans, A., Wang, X. M., Wu, X., Zhang, B., Doolittle, E., Kim, J., Li, N., Pimentel, H. X., Park, E., Ma, X. J. Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay. J. Vis. Exp. (138), e58097, doi:10.3791/58097 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نظراً لدقة الطب اعتماداً كبيرا على كشف دقيق للمؤشرات الحيوية، وهناك حاجة متزايدة لتكنولوجيات موحدة وقوية بقياس الحمض النووي الريبي المؤشرات الحيوية في الموقع في العينات السريرية. بينما فحوصات طحن وربط مثل رناسيق وتمكين RT-PCR الكمي القياسات التعبير الجيني حساسة للغاية، أنها تتطلب أيضا استخراج الحمض النووي الريبي ومما يحول دون تحليل قيمة التعبير في سياق النسيج المورفولوجية. في الموقع التهجين (العش) مقايسة الموصوفة هنا يمكن الكشف عن الحمض النووي الريبي الهدف تسلسل قصيرة قدر النيوكليوتيدات 50 في قرار واحد-النوكليوتيدات، وعلى مستوى خلية واحدة. هذا الفحص مكمل للمقايسة التجارية المتقدمة سابقا وتمكن من كشف حساسة ومحددة في الموقع المتغيرات لصق وأهداف قصيرة والطفرات نقطة داخل الأنسجة. صممت تحقيقات في هذا البروتوكول، لاستهداف تقاطعات إكسون فريدة من نوعها للخيارين لصق المهمة سريرياً، اجفرفيي و METΔ14. وتجلى في الكشف عن تسلسل الهدف القصير كشف تسلسل CDR3 من خلايا تي مستقبلات α و β في خط جوركات تي خلية محددة. كما هو موضح من فائدة هذا الإنزيم العش لتمييز تسلسل الحمض النووي الريبي المستهدف في قرار واحد-النوكليوتيدات (الطفرات) من خلال تصور تباينات واحد-النوكليوتيدات EGFR L858R و G12A كراس في خطوط الخلايا باستخدام التلوين الآلي الأنظمة الأساسية. وخلاصة القول، يظهر البروتوكول فحص العش الحمض النووي الريبي متخصصة التي تمكن من الكشف عن المتغيرات لصق متواليات قصيرة والطفرات في الموقع للأداء اليدوي والآلي ستينيرس.

Introduction

وتحسنت التكنولوجيات ترانسكريبتوميك الفائق مثل [ميكروارس] والجيل التالي تسلسل الحمض النووي الريبي (رناسيق) أضعافاً مضاعفة اكتشاف الحمض النووي الريبي المؤشرات الحيوية مع التشخيص وتنبؤاتها، وتوقع القيمة السريرية للأمراض المختلفة بما في ذلك السرطان1،2. للنهوض باستخدام هذه المؤشرات الحيوية في الطب الدقة، هناك ارتفاع الحاجة إلى تكنولوجيات موحدة وقوية التي يمكن قياس المؤشرات الحيوية في الجيش الملكي النيبالي في سياق الأنسجة العينات السريرية. بينما أنشئت على نطاق واسع معبراً طحن وربط مثل رناسيق والكمية RT-PCR تمكين القياسات التعبير الجيني حساسة للغاية، بتجانس الأنسجة المطلوبة وعزل الحمض النووي الريبي يعني الخسارة في فيفو خصوصية نوع الخلية و معلومات الخصائص المورفولوجية3. التقليدية في الموقع الحمض النووي الريبي منهجيات الكشف تفتقر إلى الحساسية والنوعية المطلوبة لقياس المؤشرات الحيوية الحمض النووي الريبي نادرة أو التعبير عن منخفضة داخل سياق النسيج4موثوق بها.

فحص تهجين (العش) تجاري في الموقع (على سبيل المثال.، الإنزيم رناسكوبي) هو واحد من التكنولوجيا التي عالجت هذه التحديات ويتيح أيضا التصور حساسة للغاية ومحددة من جزيئات الحمض النووي الريبي واحد أكبر من 300 النيوكليوتيدات ضمن سياق المورفولوجية الأنسجة. يستخدم هذا النوع من التحليل تصميم مسبار اليغنوكليوتيد فريدة من نوعها تقريبا 6 – 20 مسبار مزدوج زي أزواج جنبا إلى جنب مع إشارة متقدمة المستندة إلى التهجين تضخيم5.

تصف هذه الدراسة مقايسة ايش الجيش الملكي النيبالي متخصصة، باسيسكوبي، مكملة للتكنولوجيا التجارية المصممة مسبقاً التي يمكن الكشف عن الحمض النووي الريبي الهدف تسلسل قصيرة قدر النيوكليوتيدات 50 في القرار النوكليوتيدات واحدة. هذا التحليل يتناول تعقيدات معقدة الترنسكربيتوم وقابلاً للكشف عن دقة تقاطعات إكسون وتسلسل الهدف القصير والطفرات في سياق النسيج (الجدول 1) استخدام أقل قدر من مسبار مزدوج زي زوج. هذا التقرير يوضح البروتوكول الفحص الكامل واستخدامها في الكشف عن المتغيرات لصق، تسلسل CDR3 لخلايا تي مستقبلات الحيوانات المستنسخة، والطفرات النوكليوتيدات واحدة في فب الخلية خطوط وورم الأنسجة.

Protocol

ديدينتيفيد عينات الأورام البشرية المستخدمة في هذه الدراسة وتم الحصول عليها من مصادر تجارية وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية المحلية للبحوث البشرية.

1-عينة، المعدات، وإعداد كاشف

  1. إعداد نموذج فب
    1. الأنسجة
      1. مباشرة بعد التشريح، إصلاح الأنسجة (قص إلى كتل من 3 – 4 مم في السمك) في 10% مخزنة المحايدة الفورمالين (NBF) ح 16 – 32 في درجة حرارة الغرفة (RT).
        ملاحظة: وقت التثبيت سوف تختلف تبعاً لنوع النسيج وحجمها.
      2. تغسل العينة مع 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) ويذوي باستخدام سلسلة إيثانول قياسية (EtOH) (70% EtOH لمدة 30 – 60 دقيقة، 80% EtOH لمدة 30 – 60 دقيقة، 90% EtOH لمدة 30 – 60 دقيقة، 95% EtOH مدة 30 – 60 دقيقة، 3 x 100% ل EtOH 30 – 60 دقيقة) تليها زيلين نفط.
      3. تضمين العينة في البارافين استخدام إجراءات معيارية6 وتقليم كتل البارافين حسب الحاجة لإزالة الزائدة البارافين.
        ملاحظة: حجم الكتلة سوف تختلف تبعاً لحجم عينة الأنسجة، ولكن حجم نموذجي هو 0.75 × 0.75 بوصة2 أو أصغر.
    2. خطوط الخلايا
      1. جمع وبيليه الخلايا وفقا للأساليب الموصى بها لخط الخلية المحددة.
      2. إصلاح الخلايا في فورمالدهايد 10% على RT ح 24 على دوار.
      3. إعداد الخلايا كبيليه في تجهيز بريوارميد هلام (مثلاً., هيستوجيل). تسمح بيليه ترسيخ وضع بيليه هلام الخلية على قطعة من بارافيلم على الجليد، والسماح لها الجلوس على 2 – 3 دقيقة Submerge بيليه هلام الخلية في برنامج تلفزيوني 1 x.
      4. يذوي وتضمين الكريات الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.
    3. إعداد قسم
      1. قص خلايا الأنسجة المضمنة/إلى 5 ± 1 ميكرومتر مقاطع باستخدام مبضع وتحميل المقاطع على الشرائح الزجاجية لاصقة الكهربية الاستاتية وأيردري عليها بين عشية وضحاها في الرايت
        ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في RT تحت جفاف لمدة تصل إلى 3 أشهر.
      2. ضع الشرائح على حامل شرائح وخبز الشرائح الأنسجة المركبة في فرن هواء المتداولة عند 60 درجة مئوية ح 1 قبل القيام الفحص.
        ملاحظة: استخدام الشرائح مباشرة أو تخزينها في الرايت مع ﻣﺟﻓﻓﺍﺗ لمدة تصل إلى أسبوع واحد. مخزن لفترات طويلة قد يؤدي إلى تدهور الجيش الملكي النيبالي.
  2. إعداد المعدات
    1. تعيين الفرن التهجين إلى 40 درجة مئوية. دقة الرطب ورقة هوميديفيينج وإزالة أي بقايا dH2O. إدراج الورقة في علبة التحكم الرطوبة، وإدراج صينية في الفرن التهجين إلى بريوارم لمالا يقل عن 30 دقيقة قبل الاستخدام.
  3. إعداد كاشف
    1. ملء اثنين مسح الأطباق عامل مع 200 مل من زيلين نفط وملء الأطباق المصبوغة اثنين مع 200 مل من 100% EtOH، التي سيتم استخدامها ديبارافينيزيشن مقاطع.
    2. إعداد 200 مل من س 1 متوفرة تجارياً الهدف استرجاع كاشف عن طريق إضافة 180 مل من dH2س إلى 20 مل كاشف استرجاع الهدف x 10. مكان اثنين أصحاب الشريحة في باخرة. ملء واحدة حامل الشرائح مع 200 مل 1 × هدف استرجاع الكاشف وملء حامل الشرائح الأخرى مع 200 مل من dH2الحرارة O. كلا الحلول يغلي الباخرة باستخدام.
    3. المخزن المؤقت ليغسل الحارة x 50 إلى 40 درجة مئوية على 10 – 20 دقيقة ل 3 إعداد 1 x يغسل المخزن المؤقت بتمييع 60 مل من بريوارميد x 50 يغسل العازلة مع 2.94 لتر من dH2o.
    4. وفي غطاء دخان، تعد توضع 50% جيل كونتيرستينينج الحل بإضافة 100 مل من توضع لجيل إلى 100 مل من dH2o. في غطاء الدخان، إعداد كاشف لالتشطيب (0.02% (w/v) الأمونيا المياه) عن طريق إضافة 1.43 مل هيدروكسيد الأمونيوم 28 – 30% إلى 250 مل من dH2o.
    5. بريوارم المسابير الهدف عند 40 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة قبل التحقيق التهجين وإحلال الكواشف زيادة (أمبير 0 – 6) الرايت

2-الجيش الملكي النيبالي في الموقع التهجين بالانزيم

  1. ديبارافينيزيشن والجفاف
    1. بعد الخبز كما هو موضح في الخطوة 1.1.3.2 (نقطة التوقف الاختياري 1)، ديبارافينيزي المقاطع في زيلين نفط لمدة 5 دقائق مع الانفعالات. ديبارافينيزي مرة أخرى في زيلين نفط جديدة للحد الأدنى 5 ديهيدراتي في 100% EtOH لمدة 2 دقيقة مع الانفعالات، وكرر مرة أخرى في الطازج 100% EtOH لمدة 2 دقيقة.
    2. الهواء الجاف للشرائح لمدة 5 دقائق عند 60 درجة مئوية في فرن هواء المتداولة أو في الرايت حتى هم تماما الجافة (النقطة 2 من وقف اختياري).
  2. المعالجات عينة
    1. احتضان الفروع مع ~ 4 قطرات من بيروكسيد الهيدروجين جاهزة للاستخدام لمدة 10 دقيقة على RT إخماد النشاط البيروكسيديز الذاتية. صب الحل من الشرائح وشطف لهم مرتين مع dH2o.
    2. احتضان الفروع مع 200 مل من الكاشف استرجاع المستهدفة لمدة 15 – 30 دقيقة عند 100 درجة مئوية في باخرة.
      ملاحظة: قد تختلف وقت الحضانة تبعاً لنوع النسيج. في هذا البروتوكول، تم إجراء استرجاع المستهدفة لمدة 15 دقيقة لعينات الورم والكريات الخلية.
    3. صب الحل من الشرائح، وشطف مرتين مع dH2س، وتراجع بنسبة 100% EtOH 3 دقيقة، والجاف الجاف للشرائح عند 60 درجة مئوية في فرن هواء المتداولة أو في الرايت حتى تماما.
    4. رسم حاجزاً مسعور حول المقطع استخدام قلم مسعور، حوالي 0.75 x 0.75 بوصة2.
      ملاحظة: لا ينصح برسم حاجزاً أصغر. لأقسام أكبر، سوف تحتاج حاجز أكبر التي يمكن استخلاصها.
    5. اسمحوا الجدار جاف تماما لمدة 1 دقيقة، أو ترك بين عشية وضحاها في الرايت (النقطة 3 من وقف اختياري).
    6. ضع الشرائح في حامل شريحة ووضع صاحب الشريحة في علبة التحكم الرطوبة. إضافة قطرات ~ 4 الثالث مبطلات لكل شريحة، واحتضان لهم لمدة 15-30 دقيقة عند 40 درجة مئوية في الفرن التهجين لهضم البروتين.
      ملاحظة: قد تختلف وقت الحضانة تبعاً لنوع النسيج. في هذا البروتوكول، أنجزت الهضم حوزتي عن 30 دقيقة لعينات الورم و 15 دقيقة لخلايا الكريات.
    7. صب الحل من الشرائح وشطف لهم مرتين مع dH2o.
  3. التحقيق التهجين
    1. إضافة ~ 4 قطرات الحل التحقيق جاهزة للاستخدام المناسب لتغطية المقطع بأكمله. في حالة استخدام أقسام أكبر، إضافة ~ 5-6 قطرات.
    2. هجن المسابير ح 2 عند 40 درجة مئوية في الفرن التهجين. صب الحل من الشرائح ويغسل الشرائح في 200 مل 1 × أغسل المخزن المؤقت لمدة 2 دقيقة في الرايت مع الانفعالات العرضية. كرر الإجراء الغسيل في هذه الخطوة.
  4. تضخيم الإشارات
    1. احتضان الأبواب مع قطرات ~ 4 أمبير 0 كل شريحة على 40 درجة مئوية في الفرن التهجين عن 30 دقيقة صب الحل ويغسل الشرائح في 200 مل 1 x يغسل من المخزن المؤقت لمدة 2 دقيقة في الرايت مع الانفعالات العرضية. كرر الإجراء الغسيل في هذه الخطوة.
    2. احتضان الفروع مع قطرات ~ 4 1 أمبير في الشريحة عند 40 درجة مئوية في الفرن التهجين عن 15 دقيقة صب الحل ويغسل الشرائح في 200 مل 1 × أغسل المخزن المؤقت لمدة 2 دقيقة في الرايت مع الانفعالات العرضية. كرر الإجراء الغسيل.
    3. احتضان الفروع مع قطرات ~ 4 2 أمبير في الشريحة عند 40 درجة مئوية في الفرن التهجين عن 30 دقيقة صب الحل ويغسل الشرائح في 200 مل 1 × أغسل المخزن المؤقت لمدة 2 دقيقة في الرايت مع الانفعالات العرضية. كرر الإجراء الغسيل.
    4. احتضان الفروع مع قطرات ~ 4 3 أمبير في الشريحة عند 40 درجة مئوية في الفرن التهجين عن 30 دقيقة صب الحل ويغسل الشرائح في 200 مل 1 × أغسل المخزن المؤقت لمدة 2 دقيقة في الرايت مع الانفعالات العرضية. كرر الإجراء الغسيل.
    5. احتضان الفروع مع قطرات ~ 4 من 4 أمبير في الشريحة عند 40 درجة مئوية في الفرن التهجين عن 15 دقيقة صب الحل ويغسل الشرائح في 200 مل 1 × أغسل المخزن المؤقت لمدة 2 دقيقة في الرايت مع الانفعالات العرضية. كرر الإجراء الغسيل.
    6. احتضان الفروع مع قطرات ~ 4 من 5 أمبير كل شريحة على RT ل 30 دقيقة صب الحل ويغسل الشرائح في 200 مل 1 × أغسل المخزن المؤقت لمدة 2 دقيقة في الرايت مع الانفعالات العرضية. كرر الإجراء الغسيل.
    7. احتضان الأبواب مع قطرات ~ 4 6 أمبير كل شريحة على RT لصب الحل 15 دقيقة ويغسل الشرائح في 200 مل 1 × أغسل المخزن المؤقت لمدة 2 دقيقة في الرايت مع الانفعالات العرضية. كرر الإجراء الغسيل.
  5. كشف الإشارات
    1. إعداد الصبغ "الأحمر سريع" يعمل الحل. للحصول على شريحة واحدة بحاجز2 بوصة 0.75 x 0.75، إضافة 2 ميكروليتر من الصبغ الأحمر ب سريع إلى 120 ميكروليتر من سرعة الأحمر-أ إلى أنبوب ومزيج جيد.
      ملاحظة: اعتماداً على حجم الجدار مسعور وعدد الشرائح، تتنوع أحجام الحل "السريع الأحمر" العامل.
    2. صب السائل الفائض من الشرائح وإضافة الصبغ "الأحمر سريع" يعمل حل للشرائح. احتضان الشرائح لمدة 10 دقيقة في RT في علبة بغطاء لتجنب التعرض للضوء.
      ملاحظة: استخدم "الأحمر سريع" يعمل الحل في 5 دقائق لإعداد، ولا تعرض لأشعة الشمس المباشرة أو ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
    3. صب حل "سريع من الأحمر" وشطف الشرائح مرتين بماء الصنبور. ضع الشرائح مرة أخرى في حامل شريحة.
  6. كونتيرستينينج
    1. كونتيرستين أقسام الأنسجة مع توضع حل 50% جيل لمدة 2 دقيقة في غسل الرايت الشرائح بماء الصنبور وكرر ذلك عدة مرات حتى الشرائح واضحة، بينما تظل الأبواب الأرجواني. تراجع الشرائح إلى 0.02 في المائة ماء الأمونيا لالتشطيب (تراجع 2 – 3 مرات). استبدال الماء الأمونيا بماء الصنبور ويغسل الشرائح 3 – 5 مرات.
  7. شريحة متزايدة
    1. الشرائح في فرن هواء المتداولة على 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو على RT حتى تماما الجافة جاف. ضع 1-2 قطرات كاشف تصاعد على كل شريحة، ومكان كوفيرسليبس على كل قسم. تجنب أي تعويض من فقاعات الهواء. الهواء الجاف للشرائح لمدة 5 دقائق على الأقل.
      ملاحظة: الركيزة "سريع الأحمر" حساسة للكحول. لا يذوي الشرائح في الكحول.
  8. التصور
    1. مراقبة الشرائح تحت مجهر برايتفيلد قياسية.

Representative Results

في الوضع الطبيعي التهجين المقايسة سير العمل:
سير العمل هو مبين في الشكل 1 ، ويتألف من أربعة أجزاء: permeabilization للخلايا أو الأنسجة مع حلول حوزتي، تهجين التحقيقات لهدف الجيش الملكي النيبالي، واسترجاع الهدف إشارة التضخيم، والتصور للإشارة. الإشارة يمكن أن يكون كمياً أيضا استخدام أنظمة برمجيات التصوير الرقمي أو بطريقة شبه كمي استناداً إلى العدد النقاط لكل خلية. دليل الإجراء الموضح في الشكل 2 أيضا الآلي الكامل في النظم التجارية التلوين التلقائي.

تلوين الممثل للكشف عن تقاطع إكسون (الخيار لصق اجفرفيي): اجفرفيي هو البديل من مستقبلات عامل نمو البشرة التي تنشأ من في إطار حذف المجينية exons 2 إلى 7، مما أدى إلى إشارات النمطان active مؤثرا7 . المقايسة استخدمت لتحديد حالة اجفرفيي في عينات الورم جليوبلاستوما (GBM) فب. واحد مزدوج زي المسابير صممت لتغطي الوصلات إكسون بغية الكشف عن أي وزن، متحولة، أو كلا المحاضر (الشكل 3A). تمتد المسابير WT EGFR الوصلات exons 1 و 2 (E1/E2) أو exons 7 و 8 (E7/E8)، بينما تمتد تحقيقات محددة اجفرفيي تقاطع exons 1 و 8 (E1/E8). تحقيق مشترك الذي يمتد من تقاطع exons 8 و 9 (E8/E9) استخدمت أيضا للكشف عن مجموع EGFR (محاضر WT واجفرفيي). ثم استخدمت جميع المسابر تحديد مركز EGFR في عينات GBM فب. المثالين الممثل هو موضح في الشكل 3B مأخوذة من دراسة أكبر. وأكد مركز EGFR بطريقة مستقلة، الرايت-بكر. كلا المسابير WT الكشف عن الإشارات في كلا العينتين، مشيراً إلى أن كلتا العينتين إكسبريس EGFR WT (الشكل 3B). ومع ذلك، أظهرت المسبار متحولة فقط الكشف عن إشارة في اجفرفيي + العينة، مما يؤكد أن هذه العينة إيجابية في الواقع للبديل اجفرفيي (الشكل 3B، لوحات الأيسر). على العكس من ذلك، لم يكشف التحقيق متحولة عن إشارة في اجفرفيي-العينة (الشكل 3B، لوحات الحق). أخذت معا، تبين هذه النتائج أن المقايسة مفرق إكسون يمكن تحديد مركز اجفرفيي في عينات الورم GBM FFPE.

الممثل تلطيخ لأهداف قصيرة:
CDR3، أو المنطقة المحددة مكملة 3، مجال اختلافاً كبيرا في مستقبلات خلية تي. عادة، يتم تسلسل CDR3 قصيرة جداً؛ على سبيل المثال، تسلسل α و β CDR3 من خط جوركات تي خلية هي النيوكليوتيدات 51 و 48 في الطول، على التوالي (الشكل 4 أ). لتحديد تسلسل مجلس الإنماء والإعمار المحددة المعرب عنها في الخلايا جوركات، والعقاقير المسابير ل CDR3 α و β التي يتم التعبير عنها في خط جوركات تي خلية تم إنشاؤها، بالإضافة إلى الإحساس بتحقيقات ل CDR3 α و β بمثابة السلبية مراقبة تحقيقات. ثم اختبرت جميع التحقيقات في الخلايا جوركات فب-أعدت مع المقايسة. تلوين قوية لوحظ مع تحقيقات مكافحة الشعور لكلا CDR3 α و β في الخلايا جوركات، حين يسبر معنى الكشف عن القليل إلى أي إشارة (الشكل 4 باء). هذه النتائج تظهر قدرة الإنزيم الهدف القصير على تمييز بين تسلسلات مجلس الإنماء والإعمار متغير لكنها قصيرة جداً لخلايا تي مستقبلات الحيوانات المستنسخة.

الممثل تلطيخ للطفرة نقطة EGFR L858R:
وقد وضعت المسابير طفرة نقطة للكشف عن الاختلافات النوكليوتيدات واحدة وصغيرة عمليات الإدراج أو الحذف (إينديلس) في سياق الورم. يوضح الشكل 5A القدرة في الموقع الكشف عن الطفرة نقطة EGFR L858R (2573T > ز). صممت المسابير اثنين: واحد للكشف عن L858R تحور تسلسل EGFR، وآخر للكشف عن تسلسل EGFR L858 WT. تم اختبار كلا المسابير في اثنين من خطوط الخلايا FFPE-أعدت: H2229، الذي يعرب فقط WT L858 EGFR؛ و H1975، ومتخالف للطفرة EGFR L858R. التحقيق متحولة L858R تم الكشف عن إشارة فقط في خط الخلية H1975 ولكن ليس في السطر خلية H2229. ومع ذلك، كشف التحقيق WT إشارة في كلا خطوط الخلايا. وبالمثل، الشكل 5B يتصور في الموقع الكشف عن الطفرات نقطة G12A كراس (35 ز > ج). مصممة للكشف عن تسلسل كراس G12A مليون طن ووزن G12 كراس المسابير اثنين واختبار ثم على خط الخلية HuT78 (الذي يعبر فقط عن كراس G12 WT) وخط الخلية SW116 (ومتخالف للطفرة G12A كراس). بينما التحقيق كراس G12 WT الكشف عن الإشارات في كل خطوط الخلايا، كشف التحقيق G12A كراس فقط إشارة في خط الخلية SW116. أخذت معا، هذه البيانات إثبات القدرة التقنية للمقايسة طفرة نقطة في الكشف عن مجمع الأشكال المتعددة النوكليوتيدات واحدة في سياق الخلايا والأنسجة.

الممثل تلطيخ للفحص الآلي في الموقع :
الاختبارات المؤتمتة تسمح لعدد أكبر من العينات المراد تشغيلها أكثر موثوقية، التقليل من التباين بين المستخدم ووقت العملي وتوليد النتائج استنساخه باستمرار. ولذلك، وضعت لإصدار تلقائي من المقايسة. وللتدليل على التلوين الآلي مع هذا التحليل، تم فحص الكشف عن الخيار لصق METΔ14. هذا الخيار هو نتيجة إكسون 14 في الجينات MET يجري تخطي أثناء الربط، مرناً قبل مما يؤدي إلى تنشيط التأسيسي والتحول النمطان MET مستقبلات8،9. صممت للكشف عن الخيار METΔ14 على وجه التحديد، تحقيقات مفرق إكسون اثنين: واحدة تمتد عبر تقاطع exons 13 و 15 (E13/E15) للكشف عن النص البديل METΔ14، وأخرى تمتد عبر تقاطع exons 14 و 15 (E14/E15) للكشف عن التقى WT نسخة (الشكل 6A). ثم تم اختبار كلا المسابير في خطوط الخلايا أعد فب 2: H596، الذي يعبر عن الخيار METΔ14، و A549، التي تعبر عن الجينات اجتمع WT. أظهر كلا المسابير أنماط التعبير يستبعد بعضها بعضا، ومع التحقيق E13/E15 فقط الكشف عن الإشارات في الخلايا H596 والتحقيق E14/E15 فقط الكشف عن الإشارات في خلايا A549 (6B الأرقام وج 6). أخيرا، أظهر التحقيق دابب أي إشارة، مما يشير إلى أي إشارة خلفية (6B الأرقام وج 6). وعموما، يوضح هذه البيانات الكشف محددة ليلتقي متغير METΔ14 في الموقع استخدام الإنزيم باسيسكوبي الآلي.

Figure 1
الشكل 1 : سير عمل المقايسة. يتكون سير العمل من 4 خطوات رئيسية: المعالجة الأولية بيرميبيليزي الخلايا أو الأنسجة والتهجين تحقيقا لهدف الجيش الملكي النيبالي، وإشارة التضخيم، وإشارة الكشف عن طريق التصور تحت المجهر برايتفيلد أو الفلورسنت. يمكن تحديده كمياً النقاط الفردية باستخدام منصة تحليل صور رقمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : شكل توضيحي للبروتوكول الفحص اليدوي- يمكن إكمال فحص كامل في حاء 9 مرات قد تختلف تبعاً لنوع النسيج، حيث ينصح بالرجوع إلى التذييل ألف في دليل المستخدم للأنسجة المعالجة التوصيات فيما يتعلق بحضانة وقت المعالجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : صور الممثل للكشف عن تقاطع إكسون- (أ) الموضح هنا هي منظمة إكسون المستنسخات EGFR WT واجفرفيي وتخطيطي يصور إكسون مزدوج زي مفرق المسابير التي تمتد وصلة للكشف عن وزن EGFR أو اجفرفيي. (ب) إكسون مفرق المقايسة أجرى على عينتين جليوبلاستوما فب استخدام المسابير المذكورة في (أ)، فضلا عن دابب مراقبة المسبار، POLR2A، ومسبار المراقبة السلبية، إيجابية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : صور تمثيلية قصيرة الهدف تسلسل الكشف. (أ) الموضح هنا تسلسل CDR3 في الخلايا جوركات. التسلسل في الأسود تسلسل مشتركة ترافقه والتسلسل باللون الأحمر فريدة من نوعها إلى CDR3α أو CDR3β. وقد صممت المسابير تسلسل واحد مزدوج زي الهدف القصير ضد هذه التسلسلات. (ب) تحليل الهدف القصير تم إجراؤها على خلايا جوركات التي أعدت كبيليه خلية فب استخدام المسابر المضادة الإحساس أو الشعور بالاستهداف في التسلسل في (أ)، واستخدمت دابب كعنصر سلبي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : صور الممثل للكشف عن الطفرات نقطة. (أ) الفحص أجرى على خلايا H1975 (متخالف للطفرة EGFR L858R) أعد كبيليه خلية فب استخدام المسابر طفرة نقطة مزدوجة-Z واحدة تستهدف تسلسل EGFR L858 WT أو EGFR L858R والخلايا H2229 (متماثل ل EGFR L858) تسلسل المتحولة. (ب) تحليل طفرة نقطة تم إجراؤها على خلايا HuT78 (متماثل ل G12A كراس) والخلايا SW116 (متخالف للطفرة G12A كراس) أعد كبيليه خلية فب استخدام المسابر طفرة نقطة مزدوجة زي واحد استهداف تسلسل كراس G12 WT أو G12A كراس المتحولة بالتسلسل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : الصور التمثيلية للتلوين الآلي مع المقايسة مفرق إكسون- (أ) الموضح هنا هو منظمة إكسون المستنسخات WT اجتمع و METΔ14 وتخطيطي تصور واحد مزدوج زي إكسون مفرق المسابير التي تمتد وصلة للكشف عن التقى WT أو METΔ14. (ب) و (ج) مقايسة مفرق إكسون الآلي تم إجراؤها على خلايا H596 (التعبير عن METΔ14) وخلايا A549 (التعبير عن التقى WT) أعد كبيليه خلية فب استخدام المسابر المذكورة في (أ)، فضلا عن مراقبة سلبية مسبار دابب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تقاطع إكسون تسلسل قصيرة طفرة نقطة
لصق البديل/إيسوفورم تسلسل بين 50 و 300 nt طفرة نقطة
التعميم الحمض النووي الريبي (سيركرنا) متواليات عالية مثلى إينديل قصيرة
الجينات الانصهار تسلسل CDR3 لاستنساخ تكر الجينات تحرير
خروج المغلوب الجينات (كو) ميرنا قبل
الجيش الملكي النيبالي النوية الصغيرة (سنورنا)
الجينات تحرير

الجدول 1: تطبيقات في الموقع المقايسة. وهناك 3 فئات رئيسية لتطبيقات لهذا الفحص: مفرق إكسون وتسلسل الهدف القصير، وطفرة نقطة. المدرجة في كل عمود هي بعض الأمثلة على تطبيق معين لكل فئة.

Discussion

وفي هذا التقرير، البروتوكول المقايسة ايش الرواية وتطبيقاتها، نوقشت بالتفصيل. يسمح المقايسة للتصور مباشرة من تقاطعات إكسون ومتواليات قصيرة-الهدف والغاية مثلى، والطفرات في سياق النسيج. المقايسة يستند إلى التكنولوجيا رناسكوبي5 وهو لذلك قادر على الكشف عن جزيء واحد. ومع ذلك، نظراً لنظام تضخيم متقدمة، الإشارة يمكن الكشف عن المسابير التي تحتوي على أقل من واحد مزدوج زي زوج أو مع طول قالب مستهدفة من النيوكليوتيدات 50 فقط. نظراً للتحقيقات قد تكون قصيرة بقدر مزدوج-Z واحدة في الطول، وهذا يسمح للكشف عن الوصلات إكسون ومتواليات قصيرة-الهدف والغاية مثلى، والطفرات (الجدول 1).

للحصول على الأداء الناجح للمقايسة، وهناك العديد من التوصيات التقنية. أولاً، ينبغي إصلاح الأنسجة في الطازجة مخزنة المحايد 10% فورمالين (NBF) في درجة حرارة الغرفة ل 16 – 32 ح10. أونديرفيكسيشن (< ح 16) أو أوفيرفيكسيشن (> ح 32) سوف يضعف الأداء للمقايسة وقد تتطلب التحسين إضافية. ثانيا، لضمان التحكم الأمثل لدرجة الحرارة والرطوبة، ومطلوبة من أجل التضخيم التهجين وإشارة قوية التحقيق، ينبغي أن تستخدم الشريحة تجهيز الفرن النظام والتهجين لبروتوكول الخطوات 2، 3 إلى 5 (مبطلات مسبار المعالجة المسبقة، التهجين وتضخيم الإشارات والكشف عن إشارة). المخازن المؤقتة المتبقية الزائدة، والثالث ينبغي أن يكون وفوجازارو بشكل صحيح قبل كل خطوة في جميع أنحاء البروتوكول (ولكن ليس كثيرا حتى أن تجف أقسام الأنسجة). إذا كانت الشرائح تجف، ستضع كبيرة غير محددة إشارة. ورابعاً، تبعاً لنوع النسيج، المعالجة المسبقة الأمثل قد يكون ضروريا. استخدام حوزتي خاطئة أو أداء لطول الوقت الأمثل قد يؤدي في إطار-أو أكثر-digestion وستؤثر سلبا على الإشارة. وأخيراً، من المهم دائماً تشغيل عناصر إيجابية وسلبية مع تحقيقات الاختبار. ضمان تحقيقات الرقابة السلبية أن هناك أي إشارة خلفية، ومجسات مراقبة إيجابية تضمن أنه تم القيام الفحص بشكل صحيح وأن نوعية الجيش الملكي النيبالي في العينة الأمثل لتفسير نتائج التحقيق الاختبار. إذا لم يكن هناك لا إشارة مع المسبار مراقبة إيجابية، ثم نوعية الجيش الملكي النيبالي في العينة من المحتمل دون المستوى الأمثل، وقد لا تعتبر إشارة مع المسبار الاختبار.

بالإضافة إلى الفحص اليدوي، والقدرة على القيام التحليل على ستينيرس الآلي كان أيضا أظهر (الشكل 6). هذا الفحص الآلي ايش نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية الغلة وقابلاً للتطبيق للتطبيقات نفسها كما هو مبين في الجدول 1؛ بيد أن فوائد الفحص الآلي تشمل توحيد شروط المقايسة، التقليل من التباين بين المستخدم ووقت التدريب العملي، وبدل للفرز الفائق لعينات الأنسجة بطريقة موثوقة.

بينما تسمح إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) و qRT-PCR للكشف عن المتغيرات لصق (وبخاصة اجفرفيي)، في العينات السريرية فب، هذه التقنيات يمكن أن تفتقر إلى الدقة اللازمة ولا توفر نظرة ثاقبة القرار المكانية للوصلة تعبير متغير، على التوالي11،12. مزايا رئيسية للتحليل في هذا البروتوكول هو في التصور حساسة للغاية ومحددة من تقاطعات الوصلة مع الحفاظ على سياق الأنسجة المورفولوجية. هنا، كان الفحص القدرة على التحديد استهداف تقاطعات إكسون فريدة من نوعها لمتغيرات لصق عدة، بما في ذلك اجفرفيي و METΔ14، أظهر (الشكلان 3 و 6). وبالإضافة إلى ذلك، قد ثبت الفحص للكشف عن الخيار لصق ع-V7 في سرطان البروستاتا، isoforms متعددة من ErbB4 في المخ، وتأكيدا للضربة القاضية للتعميم Cdr1as الجيش الملكي النيبالي في الماوس الدماغ3،،من1314.

الهدف القصير تسلسل الكشف بواسطة هذا الإنزيم ايش يسمح بتصور لتسلسل الحمض النووي الريبي قصيرة قدر النيوكليوتيدات 50 في الطول، كما يتضح من الكشف عن تسلسل CDR3 المستمدة من الخلايا جوركات (الشكل 3). الفحص يمكن أيضا الكشف عن تسلسل الجينات التي الغاية مثلى لأفراد الأسرة أو الأنواع الأخرى كما هو مبين من Revêchon et al.، الذين استخدموا المقايسة الهدف القصير للكشف عن progerin البشرية التي أعرب عنها في الأنسجة الدهنية البيضاء تحت الجلد الماوس15. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون الحمض النووي الريبي النوية الصغيرة (سنورنا)، وتحرير كريسبر بوساطة الجينات والسلائف-ميكرورنا المكتشفة في الموقع مع المقايسة الهدف القصير. في الآونة الأخيرة، مجتمعة فو et al. هذا الإنزيم العش مع المدينة لتحديد الخلايا الدقيقة في الشبكية معربا عن mir125b ميرنا قبل16.

الطفرة التنميط في أورام أمر بالغ الأهمية لدراسة تطور الأورام وتطوير العلاجات المستهدفة. بينما التنميط الطفرات يمكن أن يتحقق عن طريق التسلسل الفائق، هذه التكنولوجيا لا يمكن أن تتناول بالكامل intratumoral التعديلات الوراثية التغاير أو الارتباط مع مورفولوجيا الخلوية17،18. الكشف عن الطفرات باستخدام مقايسة ايش هذا يسمح بتمييز تسلسل الحمض النووي الريبي الهدف بدقة قاعدة واحدة، كما تم التحقق من صحتها قبل الكشف عن الاختلافات النوكليوتيدات واحدة EGFR L858R و G12A كراس في خطوط الخلايا (الشكل 5). وعلاوة على ذلك، تستخدم بيكر وآخرون المقايسة طفرة نقطة لاستهداف طفرات متعددة في المسرطنة براف وكراس و PIK3CA في سرطان القولون والمستقيم18. أنهم كانوا قادرين على تحديد ورسم خريطة مكانياً سوبكلونيس سلاحف نادرة من الخلايا السرطانية، وفي نهاية المطاف تبين كيف أنها تسهم في عدم التجانس داخل الورم.

وباختصار، وضعت فحص العش الحمض النووي الريبي متخصصة. تسمح هذه المنهجية للكشف عن المتغيرات لصق ومتواليات قصيرة والطفرات في الموقع. أنها حساسة ومحددة وقابلة للقياس وقابلة للتكيف للأداء بالأساليب اليدوية، وفي ستينيرس الآلي.

Disclosures

ويعمل جميع المؤلفين متقدمة خلية التشخيص، وشركة

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) ACD 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II)
HybEZ Humidity Control Tray (with lid) ACD 310012
ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 ACD 310017
HybEZ Humidifying Paper ACD 310015
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required)  Vector Laboratory  H-4000
SuperFrost Plus Slides (required)  Fisher Scientific  12-550-15
10% neutral-buffered formalin (NBF)  MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Paraffin wax MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microtome MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Gill’s Hematoxylin I  American Master Tech Scientific/MLS  HXGHE1LT MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Xylene  Fisher Scientific/MLS X3P-1GAL MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack  American Master Tech Scientific/MLS LWSRA24 MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Staining Dishes  American Master Tech Scientific/MLS LWT4457EA MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant  American Master Tech Scientific/MLS LWT4456EA MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
100% alcohol (EtOH)  American Master Tech Scientific/MLS ALREACS MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
VectaMount Permanent Mounting Medium (required) Vector Labs  H-5000
Cover Glass, 24 mm x 50 mm Fisher Scientific/MLS  12-545-F MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Ammonium hydroxide, 28–30% Sigma-Aldrich/MLS 320145-500mL MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Carboy (>3L) MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer / /
Digital thermometer MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1 °C MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Pipettors and tips, 1–1,000 μL MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Distilled water MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tubes (various sizes) MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Fume hood MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Graduated cylinder MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Parafilm MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Paper towel or absorbent paper MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microcentrifuge MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microscope and accessories MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1 °C MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Formaldehyde MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Histogel Fisher Scientific/MLS 22-110-678
BaseScope Reagent Kit - RED Advanced Cell Diagnostics 322900
BaseScope Hs-EGFR-E1E2 Advanced Cell Diagnostics 701701
BaseScope Hs-EGFR-E1E8 Advanced Cell Diagnostics 701711
BaseScope Hs-EGFR-E7E8 Advanced Cell Diagnostics 701721
BaseScope Hs-EGFR-E8E9 Advanced Cell Diagnostics 701731
BaseScope Hs-MET-E14E15 Advanced Cell Diagnostics 701811
BaseScope Hs-MET-E13E15 Advanced Cell Diagnostics 701801
BaseScope Hs-KRAS-G12A Advanced Cell Diagnostics 705491
BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT Advanced Cell Diagnostics 705531
BaseScope Hs-EGFR-L858R Advanced Cell Diagnostics 705451
BaseScope Hs-EGFR-L858WT Advanced Cell Diagnostics 705461
BaseScope Control Probe Pack Human Advanced Cell Diagnostics 322975

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bolha, L., Ravnik-Glavač, M., Glavač, D. Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers. International Journal of Genomics. 2017, 6218353 (2017).
  2. Yamada, A., Yu, P., Lin, W., Okugawa, Y., Boland, C. R., Goel, A. A RNA-Sequencing approach for the identification of novel long non-coding RNA biomarkers in colorectal cancer. Scientific Reports. 8, (1), 575 (2018).
  3. Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. Epub ahead of print (2017).
  4. Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods in Molecular Biology. 461, 675-686 (2008).
  5. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, (1), 22-29 (2012).
  6. Paraffin processing of tissue. Protocols Online. Available from: https://www.protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2016).
  7. An, Z., Aksoy, O., Zheng, T., Fan, Q. W., Weiss, W. A. Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies. Oncogene. Epub ahead of print (2018).
  8. Frampton, G. M., et al. Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors. Cancer Discovery. 5, (8), 850-859 (2015).
  9. Awad, M. M., et al. MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer Are Associated With Advanced Age and Stage-Dependent MET Genomic Amplification and c-Met Overexpression. Journal of Clinical Oncology. 34, (7), 721-730 (2016).
  10. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 134, (6), 907-922 (2010).
  11. Gan, H. K., Cvrljevic, A. N., Johns, T. G. The epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII): where wild things are altered. Federation of European Biochemical Societies Journal. 280, (21), 5350-5370 (2013).
  12. Wheeler, S. E., Egloff, A. M., Wang, L., James, C. D., Hammerman, P. S., Grandis, J. R. Challenges in EGFRvIII detection in head and neck squamous cell carcinoma. Public Library of Science One. 10, (2), e0117781 (2015).
  13. Zhu, Y., et al. Novel Junction-specific and Quantifiable In Situ Detection of AR-V7 and its Clinical Correlates in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer. European Urology. Epub ahead of print (2017).
  14. Piwecka, M., et al. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function. Science. Epub ahead of print (2017).
  15. Revêchon, G., et al. Rare progerin-expressing preadipocytes and adipocytes contribute to tissue depletion over time. Scientific Reports. 7, (1), 4405 (2017).
  16. Fu, Y., et al. Functional ectopic neuritogenesis by retinal rod bipolar cells is regulated by miR-125b-5p during retinal remodeling in RCS rats. Scientific Reports. 7, (1), 1011 (2017).
  17. Yates, L. R., et al. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nature Medicine. 21, (7), 751-759 (2015).
  18. Baker, A. M., et al. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nature Communications. 8, (1), 1998 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics