Genetik varyantların, kısa hedefleri ve nokta mutasyonlar bir RNA In Situ hibridizasyon tahlil ile morfolojik doku bağlamda görüntülenmesi

Biology
 

Summary

Burada, hassas ve belirli algılama dizileri gibi tek hücre düzeyinde tek nükleotid çözünürlük ile 50 nukleotid kısa sağlayan bir in situ hibridizasyon tahlil açıklayın. El ile veya otomatik olarak gerçekleştirilebilir, tahlil splice türevleri, kısa dizileri ve mutasyonlar doku çerçevede görselleştirme etkinleştirebilirsiniz.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Anderson, C. M., Laeremans, A., Wang, X. M., Wu, X., Zhang, B., Doolittle, E., Kim, J., Li, N., Pimentel, H. X., Park, E., Ma, X. J. Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay. J. Vis. Exp. (138), e58097, doi:10.3791/58097 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hassas tıp biyolojik doğru tespiti son derece bağımlı olduğundan, RNA biyolojik in situ klinik örneklerin ölçmek standart ve sağlam teknolojileri için artan bir ihtiyaç vardır. Kantitatif RT-PCR etkinleştirmek son derece hassas gen ifade ölçümleri ve eziyet ve bağlama deneyleri RNAseq gibi iken, onlar da RNA ayıklama gerektirir ve böylece değerli ifade analizi morfolojik doku çerçevede önlemek. Burada açıklanan in situ hibridizasyon (ISH) tahlil RNA hedef sıraları gibi 50 nukleotid tek nükleotid çözünürlük ve tek hücre düzeyinde kısa algılayabilir. Bu tahlil daha önce gelişmiş ticari tahlil için tamamlayıcı ve hassas ve belirli in situ tespiti splice türevleri, kısa hedefleri ve nokta mutasyonlar doku içinde sağlar. Bu protokol için probları iki klinik olarak önemli ek yeri değişik, EGFRvIII ve METΔ14 için benzersiz exon kavşak hedeflemek için dizayn edilmiştir. Kısa hedef sıralarının algılama CDR3 dizileri T-hücre reseptör α ve β Jurkat T-hücre doğrultusunda özel algılama tarafından sunuldu. Ayrıca gösterilen bu ISH tahlil için aralarındaki tek nükleotid çözünürlükte (nokta mutasyonlar) aracılığıyla otomatik boyama kullanarak hücre satırları EGFR L858R ve KRAS G12A tek nükleotid değişimler görselleştirme RNA hedef sıralarının yardımcı programıdır platformlar. Özetle, protokol splice türevleri, kısa dizileri ve mutasyonlar in situ el ile performans ve otomatik stainers tespiti sağlar özel bir RNA ISH tahlil gösterir.

Introduction

Microarrays ve yeni nesil RNA sıralama (RNAseq) gibi yüksek üretilen iş transcriptomic teknolojileri katlanarak RNA biyolojik dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için klinik değerle tanı, prognostik ve akıllı keşfi düzeldi kanser1,2. Bu biyolojik hassas tıpta kullanımı ilerlemek için bir yüksek olan RNA biyolojik doku içeriği klinik örneklerin içinde-ebilmek ölçü standart ve sağlam teknolojileri ihtiyacını. Yaygın olarak eziyet ve bağlama deneyleri RNAseq ve kantitatif RT-PCR gibi son derece hassas gen ifade ölçümleri etkinleştirmek kurulmuş olsa da, gerekli doku homojenizasyon ve RNA izolasyon içinde vivo hücre tipi özgüllük kaybı anlamına ve morfolojik bilgileri3. Geleneksel in situ RNA algılama yöntemleri duyarlılık ve özgüllük nadir veya düşük ifade RNA biyolojik doku bağlam4içinde güvenilir bir şekilde ölçmek için gerekli yoksun.

Bir ticari in situ hibridizasyon (ISH) tahlil (Örn., RNAscope tahlil) Bunlar ele vardır bir teknoloji meydan okuyor ve ayrıca tek RNA molekülleri 300'den büyük ve son derece hassas ve belirli görselleştirme sağlar nükleotit doku morfolojik içeriği içinde. Bu tür bir tahlil yaklaşık 6 – 20 çift-Z sonda çiftleri bir Gelişmiş hibridizasyon tabanlı sinyal güçlendirme5ile kombine bir benzersiz oligonükleotid sonda tasarım kullanır.

Bu çalışmada BaseScope, RNA hedef sıraları gibi tek nükleotid çözünürlükte 50 nukleotid kısa algılayabilir önceden tasarlanmış ticari teknoloji için tamamlayıcı bir özel RNA ISH tahlil açıklar. Bu tahlil transcriptome karmaşık karmaşıklığı giderir ve exon kavşaklar, kısa hedef dizileri ve nokta mutasyonlar bir çift-Z sonda çiftini kullanarak doku bağlamda (Tablo 1) doğru tespiti için geçerlidir. FFPE tek nükleotid mutasyonların hücre satırları ve tümör doku ve tam tahlil Protokolü ve kullanımı splice türevleri, T-hücre reseptör klonlar, CDR3 dizileri tespiti ile bu rapor gösterilmiştir.

Protocol

Bu çalışmada kullanılan insan tümör örnekleri deidentified ve insan araştırma için yerel etik kurallar doğrultusunda ticari kaynaklardan elde edildi.

1. örnek, ekipman ve reaktif hazırlık

  1. FFPE numune hazırlama
    1. Doku
      1. Hemen ardından diseksiyon, % 10 tarafsız tamponlanmış formalin (NBF) 16-32 h, oda sıcaklığında (RT) içinde (kalınlığı 3-4 mm bloklar halinde kesilmiş) doku düzeltmek.
        Not: Fiksasyon zaman doku türü ve boyutu bağlı olarak değişir.
      2. Örnek 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x ile yıkayın ve bir standart etanol (alkol) serisi kullanarak kurutmak (% 70 alkol 30-60 dk, % 80'i için alkol 30-60 dk, %90 30-60 dk, % 95 alkol alkol 30-60 dk, 3 x %100 alkol için 30-60 dk) ksilen tarafından takip.
      3. Örnek standart prosedürler6 kullanarak parafin katıştırmak ve aşırı parafin kaldırmak için gerektiği gibi parafin blok döşeme.
        Not: Blok boyutu doku örnek boyutu bağlı olarak değişir, ancak 0,75 x 0,75 inç2 ya da daha küçük tipik bir boyutudur.
    2. Hücre hatları
      1. Toplamak ve hücreleri belirli hücre için önerilen yöntem göre cips.
      2. RT, % 10 formaldehit 24 h için hücrelerde bir rotator düzeltmek.
      3. Prewarmed işleme jel bir Pelet olarak hücreleri hazırlayın (Örn., Histogel). Buz üstünde jel-hücre Pelet parafilm bir parça üzerine yerleştirerek katılaşmaya Pelet izin ve 2-3 dk. Submerge 1 x PBS jel-hücre Pelet oturmak izin.
      4. Kurutmak ve 1.1.1. adımda açıklandığı gibi hücre topakları embed.
    3. Bölümüne hazırlık
      1. Katıştırılmış doku/hücre bir microtome kullanarak 5 ± 1 mikron bölümler halinde kesmek, bölümler elektrostatik yapışkanlı cam slaytlarda dağ ve onları gecede RT. kuruması
        Not: Slaytlar RT 3 aya kadar kuruma altında depolanabilir.
      2. Slaytları bir slayt rafa yerleştirin ve tahlil yapmadan önce bağlı doku slaytlar 1 h için 60 ° C'de dolaşan bir hava fırında pişirin.
        Not: slayt hemen kullanın veya stok onları RT Nem Çekiciler ile 1 hafta kadar. Uzun süreli depolama RNA düşmesine neden olabilir.
  2. Ekipman hazırlık
    1. Hibridizasyon fırın 40 ° C'ye ayarla İyice ıslak nemlendirici kağıt ve herhangi bir kalıntı dH2O. Ekle kağıt nem kontrol tepsisine çıkarın ve kullanmadan önce en az 30 dk prewarm için hibridizasyon fırın tepsiyi takın.
  3. Reaktif hazırlık
    1. İki ajan yemekleri 200 mL ksilen ile takas doldurun ve boyama tabağı % 100 200 mL ile doldurulması bölümleri deparaffinization için kullanılan alkol.
    2. Piyasada bulunan 1 x hedef alma reaktif 200 mL 20 mL 10 x hedef alma reaktif dH2O 180 mL ekleyerek hazırlayın. İki slayt sahipleri bir gemi içinde yeri. Bir slayt sahibi 200 mL 1 x hedef alma reaktif ile doldurun ve diğer slayt tutucu dH2O. ısı 200 mL ile her iki çözüm de gemi kullanarak kaynatın doldurun.
    3. 10-20 dk. hazırlamak 3 L 60 mL sulandrarak tarafından 1 x yıkama arabelleği için 40 ° C sıcak 50 x yıkama arabelleğe dH2O. 2.94 L ile 50 x yıkama tampon prewarmed
    4. DH2O. için 100 mL 100 mL Gill'in hematoksilen ekleyerek çözüm counterstaining % 50 Gill'in hematoksilen bir duman başlık, hazırlık DH2O. için 250 mL 1,43 mL % 28-30 amonyum hidroksit ekleyerek mavileştirme reaktif (%0.02 (w/v) Amonyaklı su) duman başlık, hazırlık
    5. 10 dk önce sonda hibridizasyon 40 ° C'de hedef sonda prewarm ve RT için kuvvetli reaktifleri (AMP 0-6) getirmek

2. RNA In Situ hibridizasyon tahlil

  1. Deparaffinization ve su kaybı
    1. 1.1.3.2. adımda açıklandığı gibi pişirme sonra (isteğe bağlı durdurma nokta 1), ksilen ajitasyon ile 5 min için bölümlerde deparaffinize. Tekrar 5 dk. Dehydrate % 100 taze ksilen içinde deparaffinize alkol ajitasyon ve tekrar tekrar içinde taze %100 ile 2 min için alkol 2 dk için.
    2. Hava dolaşan hava fırında 60 ° C'de 5 min için slaytlar kuru veya tamamen onlar kadar RT (isteğe bağlı durdurma noktası 2) kuru.
  2. Örnek pretreatments
    1. ~ 4 damla ile bölümlerini kullanıma hazır hidrojen peroksit endojen peroksidaz aktivitesi gidermek için RT, 10 min için kuluçkaya. Slaytları çözümden dikkatle boşaltmak ve iki kez dH2ile O. yıka
    2. 200 mL bölümlerle hedef alma reaktif için 15-30 dakika içinde bir gemi 100 ° C'de kuluçkaya.
      Not: Kuluçka zaman doku türüne bağlı olarak değişebilir. Bu protokol için hedef alma 15dk tümör örnekleri ve hücre topakları yapıldı.
    3. Slaytları çözümden dikkatle boşaltmak, durulama iki kez dH2ile O, % 100 daldırma alkol 3 dk ve slaytlar dolaşan hava fırında 60 ° C veya RT kadar tamamen kuru kuru için.
    4. Hidrofobik bir bariyer hidrofobik bir kalemi yaklaşık 0,75 x 0,75 inç2bölüm çizmek.
      Not: Bu daha küçük bir engel çizmek için önerilmez. Daha büyük bölümler için büyük bir engel çizilmiş olması gerekir.
    5. 1 dk. tamamen kuru veya gece RT bırakın engeli izin (isteğe bağlı durdurma noktası 3).
    6. Slaytları bir slayt sahibi yerleştirin ve slayt tutucu nem kontrol tepsisine yerleştirin. Proteaz III ~ 4 damla her slayta eklemek ve onları protein sindirimi için hibridizasyon fırında 40 ° C'de 15-30 dakika için kuluçkaya.
      Not: Kuluçka süresi doku türüne bağlı olarak değişebilir. Bu protokol için tümör örnekleri için 30 dk ve hücre Pelet 15 dk proteaz sindirim yapıldı.
    7. Slaytları çözümden dikkatle boşaltmak ve iki kez dH2ile O. yıka
  3. Sonda hibridizasyon
    1. Bölümün tamamını kapsayacak şekilde uygun kullanıma hazır sonda çözüm ~ 4 damla ekleyin. Daha büyük bölümler kullanıyorsanız, Ekle ~ 5-6 damla.
    2. Hibridizasyon fırında 40 ° C'de 2 h için probları melezlemek. Slaytları çözümden dikkatle boşaltmak ve slaytları 200 mL 1 x yıkama arabellek RT, 2 dk ara sıra ajitasyon ile yıkayın. Bu adımda çamaşır yordamı yineleyin.
  4. Sinyal Güçlendirme
    1. AMP slayt 30 dk. Decant çözüm için hibridizasyon fırında 40 ° C'de 0 ~ 4 damla ile bölümlerini kuluçkaya ve slaytları 200 mL 1 x yıkama arabelleği için RT, 2 dk ara sıra ajitasyon ile yıkayın. Bu adımda çamaşır yordamı yineleyin.
    2. 15 dk. Decant çözüm için hibridizasyon fırında 40 ° C'de slayt AMP 1 ~ 4 damla bölümlerle kuluçkaya ve slaytları 200 mL 1 x yıkama arabellek RT, 2 dk ara sıra ajitasyon ile yıkayın. Çamaşır yordamı yineleyin.
    3. 30 dk. Decant çözüm için hibridizasyon fırında 40 ° C'de slayt AMP 2 ~ 4 damla bölümlerle kuluçkaya ve slaytları 200 mL 1 x yıkama arabellek RT, 2 dk ara sıra ajitasyon ile yıkayın. Çamaşır yordamı yineleyin.
    4. 30 dk. Decant çözüm için hibridizasyon fırında 40 ° C'de slayt AMP 3 ~ 4 damla bölümlerle kuluçkaya ve slaytları 200 mL 1 x yıkama arabellek RT, 2 dk ara sıra ajitasyon ile yıkayın. Çamaşır yordamı yineleyin.
    5. 15 dk. Decant çözüm için hibridizasyon fırında 40 ° C'de slayt AMP 4 ~ 4 damla bölümlerle kuluçkaya ve slaytları 200 mL 1 x yıkama arabellek RT, 2 dk ara sıra ajitasyon ile yıkayın. Çamaşır yordamı yineleyin.
    6. 30 dk. Decant çözüm için RT, slayt AMP 5 ~ 4 damla bölümlerle kuluçkaya ve slaytları 200 mL 1 x yıkama arabellek RT, 2 dk ara sıra ajitasyon ile yıkayın. Çamaşır yordamı yineleyin.
    7. 15 dk. Decant çözüm için RT, slayt AMP 6 ~ 4 damla bölümlerle kuluçkaya ve slaytları 200 mL 1 x yıkama arabellek RT, 2 dk ara sıra ajitasyon ile yıkayın. Çamaşır yordamı yineleyin.
  5. Sinyal algılama
    1. Çözüm çalışma hızlı kırmızı boya hazırlamak. 0,75 x 0,75 inç2 bariyer ile bir slayt için hızlı kırmızı B boya 2 μL hızlı 120 μL için eklemek kırmızı-A içine bir tüp ve karıştırmak iyi.
      Not: hızlı kırmızı çalışma çözüm hacimleri hidrofobik bariyer ve slayt sayısını boyutuna bağlı olarak değişir.
    2. Aşırı sıvı slaytlardan dikkatle boşaltmak ve çözüm için slaytları çalışma hızlı kırmızı boya ekleyin. RT, 10 dk içinde belgili tanımlık tepsi ışığa maruz önlemek için bir kapak ile slaytlarını kuluçkaya.
      Not: hızlı çözüm hazırlık 5 dk içinde çalışma kırmızı kullanın ve doğrudan güneş ışığı veya UV ışığı göstermez.
    3. Hızlı kırmızı çözüm dikkatle boşaltmak ve slaytlar iki kez dokunun su ile durulayın. Slaytları bir slayt rafa geri yerleştirin.
  6. Counterstaining
    1. Dik Yıkama 2 min için % 50 Gill'in hematoksilen çözüm ile doku bölümleri musluk suyu ile slaytlar counterstain ve slaytların bölümleri mor kalırken, berraklaşana kadar bunu birkaç kez tekrarlayın. Slaytlar mavileştirme için %0,02 amonyak suya daldırma (2-3 kez daldırma). Amonyaklı su musluk suyu ile değiştirin ve slayt 3 – 5 kez yıkayın.
  7. Montaj slayt
    1. Kuru slaytlar dolaşan hava fırında 15 dakika 60 ° C veya RT kadar tamamen kuru. 1-2 damla montaj reaktif her slayt ve yer coverslips her bölümünün üzerine yerleştirin. Hava kabarcıkları herhangi bir bindirme kaçının. Hava kuru en az 5 min için slaytlar.
      Not: Hızlı kırmızı substrat alkol duyarlı. Alkol slaytları kurutmak değil.
  8. Görselleştirme
    1. Standart aydınlık alan mikroskop altında slaytlar gözlemlemek.

Representative Results

Situ hibridizasyon tahlil iş akışı:
İş akışını Şekil 1 ' de tasvir ve dört bölümden oluşur: permeabilization hücreleri veya hedef alma ve proteaz çözümleri, RNA, hedefe probları hibridizasyon kurcalayarak sinyal güçlendirme ve görselleştirme sinyal. Dijital görüntüleme yazılım sistemleri kullanarak sinyali de sayısal veya hücre başına nokta sayısını temel alan yarı nicel bir şekilde. Şekil 2 ' de açıklanan elle yapılan prosedür de kadar tamamen ticari otomatik boyama sistemlerinde otomatik.

Temsilcisi exon junction algılama (EGFRvIII splice varyant) boyama: EGFRvIII için yapısal etkin oncogenic7 sinyal önde gelen bir ekzonlar 2 ile 7, çerçeve genomik silme doğar epidermal büyüme faktörü reseptörü bir türevi olduğunu . Tahlil EGFRvIII durum FFPE glioblastoma (GBM) tümör örneklerinde tanımlamak için kullanıldı. Tek Kişilik-Z probları ya WT algılamak için exon kavşak yayılmak üzere tasarlanmıştır mutant veya her iki transkript (Şekil 3A). EGFRvIII özgü probları ekzonlar 1 ve 8 (E1/E8) Kavşağı span ederken WT EGFR probları ekzonlar 1 ve 2 (E1/E2) veya ekzonlar 7 ve 8 (E7/E8), kavşak span. Ekzonlar 8 ve 9 (E8/E9) Kavşağı kapsayan bir ortak araştırma Ayrıca toplam EGFR (WT ve EGFRvIII transkript) tespit etmek için kullanıldı. Tüm Probe prob sonra FFPE GBM örneklerinde EGFR durumunu belirlemek için kullanılmıştır. Şekil 3B ' gösterilen iki temsilcisi örnek daha büyük bir çalışma alınmıştır. EGFR durum bağımsız bir yöntem tarafından RT-PCR doğrulandı. Her iki WT probları her iki örnekleri gösteren iki örnek WT EGFR (3B rakam) hızlı, sinyal algılandı. Ancak, mutant sonda sadece sinyal algılama Bu örnek (Şekil 3B, sol kapı aynası) EGFRvIII değişken için gerçekten olumlu olduğunu teyit EGFRvIII + örnek gösterdi. Diğer taraftan, mutant sonda EGFRvIII-örnek (Şekil 3B, doğru kapı aynası) sinyal algılamadı. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar exon junction tahlil GBM FFPE tümör örneklerinde EGFRvIII durumunu belirleyebilir gösterilmektedir.

Temsilci: kısa hedefler için boyama
CDR3 veya tamamlayıcı belirleyici bölge 3, T-hücre reseptör son derece değişken bir malıdır. Genellikle, CDR3 sıra oldukça kısa; Örneğin, Jurkat T-hücre satırından CDR3 α ve β sıraları 51 ve 48 nükleotid uzunluğunda, sırasıyla şunlardır (Şekil 4A). Jurkat hücreleri, CDR3 için antianlamlı probları ifade belirli CDR serileri tanımlamak için α ve β Jurkat T-hücre hattında ifade edilir, ek olarak anlamda probları CDR3 için oluşturulan α ve β olarak hizmet için negatif kontrol sondalar. Tüm Probe prob sonra FFPE hazırlanan Jurkat hücreleri tahlil ile test edildi. Sağlam boyama gözlenen her iki CDR3 için anti-anlamda probları ile α ve β Jurkat hücrelerdeki anlamda probları, ancak algılanan küçük hiçbir sinyal (Şekil 4B). Bu sonuçlar kısa hedef tahlil T-hücre reseptör klonlar için son derece değişken ama kısa CDR serileri arasında ayırt yeteneğini göstermek.

Temsilci: nokta mutasyon EGFR L858R boyama
Nokta mutasyonu probları tek nükleotid varyasyonları ve küçük eklemelerin veya silmelerin (INDELs) tümör bağlamda algılamak için geliştirilmiştir. Şekil 5A nokta mutasyon EGFR L858R in situ algılanması için yeteneği gösterir (2573T > G). İki problar tasarlanmıştır: bir L858R algılamak için mutasyona uğramış EGFR sırası ve başka EGFR L858 WT sıra algılamak için. Her iki probları iki FFPE hazırlanan hücre hatlarında test edildi: sadece EGFR L858 WT; ifade H2229 ve L858R EGFR mutasyon için Heterozigoz H1975. L858R mutant sonda sadece H1975 hücre kültürünü ama H2229 hücre kültürünü sinyal algılandı. Ancak, WT sonda her iki hücre hatlarında sinyal algılandı. Benzer şekilde, 5B rakam nokta mutasyon KRAS G12A tespiti in situ görüntüler (35 G > C). İki problar KRAS G12A MT ve KRAS G12 WT diziler algılamak için tasarlanmış ve (ki sadece KRAS G12 WT ifade eder) HuT78 hücre kültürünü ve (KRAS G12A mutasyon için Heterozigoz olan) SW116 hücre satırı üzerinde test edilmiştir. KRAS G12 WT sonda sinyal her iki hücre hatlarında tespit ederken KRAS G12A sonda sinyal SW116 hücre hattında sadece algıladı. Birlikte ele alındığında, bu veri içinde tek nükleotid polimorfizmleri hücre ve doku bağlamda hafiye nokta mutasyon tahlil teknik kapasitesini gösterir.

Temsilci: otomatik in situ tahlil için boyama
Otomatikleştirilmiş testleri, arası Kullanıcı değişkenliği ve uygulamalı zamanı en aza indirmek ve sürekli tekrarlanabilir sonuçlar üreten örnekleri daha fazla sayıda için daha güvenilir bir şekilde çalışmasına izin. Bu nedenle, otomatik bir sürüm testin geliştirilmiştir. Bu tahlil ile otomatik boyama göstermek için algılama splice varyantın METΔ14 incelenmiştir. Bu varyant exon 14 pre-yapıştırma, bünye harekete geçirmek ve MET reseptör8,9oncogenic dönüşümü için mRNA sırasında atlanır MET gen sonucudur. İki exon junction problar özellikle METΔ14 değişken algılamak için tasarlanmıştır: bir ekzonlar 13 ve 15 (E13/E15) METΔ14 değişken transkript algılamak için kavşak yayılan ve ekzonlar 14 ve 15 (E14/E15) WT tanıştım algılamak için kavşak kapsayan başka bir Transkript (Şekil 6A). Her iki prob sonra 2 FFPE hazırlanan hücre hatlarında test edildi: METΔ14 değişken ifade eder, H596 ve A549, WT bir araya geldi gen ifade eder. Her iki probları dışlayan ifade desenleri, sadece H596 hücreleri ve sadece A549 hücrelerinde (rakamlar 6B ve 6 C) sinyal algılama E14/E15 sonda sinyal algılama E13/E15 sonda ile gösterdi. Son olarak, sonda dapB için arka plan sinyal (rakamlar 6B ve 6 C) gösteren hiçbir sinyal gösterdi. Genel olarak, bu veri belirli algılama otomatik BaseScope tahlil kullanan MET varyant METΔ14 in situ gösterir.

Figure 1
Resim 1 : Tahlil iş akışı. İş akışı 4 büyük adımlardan oluşur: hücre ve doku, sonda hibridizasyon hedef RNA, permeabilize ön sinyal güçlendirme ve sinyal algılama görselleştirme aydınlık alan veya floresan mikroskop altında tarafından. Tek tek nokta bir dijital görüntü analiz platformu kullanarak sayılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Resimde el ile tahlil Protokolü'nün. Tüm tahlil 9 h. bu doku Önarıtma öneriler ile ilgili kuluçka süresi için Kullanım Kılavuzu Ek A danışmak için tavsiye edilir böylece kez doku türüne bağlı olarak değişebilir ön içinde tamamlanabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Exon junction algılama temsilcisi görüntüler. (A)gösterildi burada EGFR WT ve EGFRvIII transkript ve EGFR WT veya EGFRvIII algılamak için kavşak apışıp kalmak çift-Z exon junction probları resmeden bir şematik exon Teşkilatı vardır. (B) exon junction tahlil yanı sıra pozitif bir denetim sonda, POLR2A ve negatif kontrol sonda, dapB (A), listelenen problar kullanarak iki FFPE glioblastoma örnekleri üzerinde gerçekleştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Kısa hedef temsilcisi görüntüleri sıra algılama. (A)gösterildi burada Jurkat hücrelerdeki CDR3 dizileri vardır. Kanat ortak sırası sırasıdır siyah ve kırmızı sırayla ya CDR3α ya da CDR3β için benzersizdir. Tek Kişilik-Z kısa hedef sıra probları bu dizilere karşı tasarlanmıştır. (B) kısa hedef tahlil Anti-anlamda ya da sonda (A) serilerinde hedefleme kullanarak bir FFPE hücre Pelet olarak hazırlanan Jurkat hücreleri üzerinde gerçekleştirilmiş ve dapB bir negatif kontrol kullanıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Nokta mutasyon algılama temsilcisi görüntüler. (A) tahlil gerçekleştirilen H2229 hücreleri (EGFR L858 için homozigoz) ve tek çift-Z nokta mutasyon probları EGFR L858 WT sıra veya EGFR L858R hedefleme kullanarak bir FFPE hücre Pelet hazırlanan H1975 hücreleri (Heterozigoz EGFR L858R mutasyon için) mutasyona uğramış sıra. (B) nokta mutasyon tahlil gerçekleştirilen HuT78 hücreleri (KRAS G12A için homozigoz) ve tek çift-Z nokta mutasyon probları KRAS G12 WT sıra hedefleme kullanarak bir FFPE hücre Pelet hazırlanan SW116 hücreleri (Heterozigoz KRAS G12A mutasyon için) veya KRAS G12A dizisi mutasyona uğramış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : Otomatik exon junction tahlil ile boyama temsilcisi görüntüler. (A)gösterildi burada olduğunu WT bir araya geldi ve METΔ14 transkriptleri ve bir araya geldi WT veya METΔ14 algılamak için kavşak apışıp kalmak tek kişilik-Z exon junction probları resmeden bir şematik exon Teşkilatı. (B) ve (C) otomatik exon junction tahlil H596 hücreleri (METΔ14 ifade) ve (A), listelenen problar kullanarak bir FFPE hücre Pelet olarak hazırlanan (WT bir araya geldi ifade) A549 hücreleri üzerinde negatif kontrol sonda dapB yanı sıra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

EXoN Junction Kısa sıra Nokta mutasyon
Değişken/izoformu splice Dizileri arasında 50 ve 300 nt Nokta mutasyon
Dairesel RNA (circRNA) Son derece homolog dizileri Kısa INDEL
Gene füzyon CDR3 sırası TCR klonlar için Gen düzenleme
Gene nakavt (KO) Pre-miRNA
Küçük genelde RNA (snoRNA)
Gen düzenleme

Tablo 1: uygulamaları situ tahlil. Bu testin uygulamalar için 3 ana kategorisi vardır: exon junction, kısa hedef sıra ve nokta mutasyon. Her sütunda listelenen her kategori için belirli uygulama örnek verilebilir.

Discussion

Bu raporda, roman ISH tahlil Protokolü ve uygulamaları ayrıntılı olarak tartışılmıştır. Tahlil exon kavşaklar, kısa-hedef ve son derece homolog dizileri ve doku bağlamda nokta mutasyonlar doğrudan görselleştirme sağlar. Tahlil RNAscope teknoloji5 üzerinde temel alır ve bu nedenle tek molekül algılama yeteneğine sahiptir. Ancak, bir Gelişmiş amplifikasyon sistemi nedeniyle sinyal bir çift-Z çifti içeren probları ile ya da sadece 50 nukleotid hedef şablon uzunluğu ile tespit edilebilir. Sondalar gibi tek bir çift-Z uzunluğu kısa olduğu için bu exon kavşaklar, kısa-hedef ve son derece homolog dizileri ve nokta mutasyonlar (Tablo 1) tespiti için sağlar.

Testin başarılı performans için çeşitli teknik öneriler vardır. İlk olarak, dokuların taze % 10 tarafsız tamponlanmış formalin içinde (NBF) 16-32 h10için oda sıcaklığında sabit olmalıdır. Underfixation (< 16 h) veya overfixation (> 32 h) tahlil performansını bozabilir ve ek optimizasyon gerektirebilir. İkinci olarak, sıcaklık ve nem, sağlam sonda hibridizasyon ve sinyal güçlendirme için gerekli olan en iyi kontrolünü sağlamak için sistem ve hibridizasyon fırın işleme slayt Protokolü adımları 2.3-5 (proteaz tedavi öncesi, soruşturma için kullanılmalıdır hibridizasyon, sinyal güçlendirme ve sinyali algılama). Üçüncü olarak, aşırı kalan arabellekleri düzgün çıkarmak her adım protokol boyunca önce (ama değil o kadar doku bölümleri kurumasına) olmalıdır. Slaytları kurumasına Eğer önemli non-spesifik sinyal gelişecektir. Dördüncü olarak, doku türüne bağlı olarak, tedavi öncesi optimizasyon gerekli olabilir. Yanlış proteaz kullanarak veya bir suboptimal uzun süre performans altında - veya aşırı - digestion içinde ve sinyal olumsuz etkiler. Son olarak, her zaman pozitif ve negatif kontrolleri ile test probları çalıştırmanız önemlidir. Negatif kontrol probları arka plan çekmiyor ve tahlil doğru yapılması olumlu denetim probları sağlamak ve RNA kalite örnek test sonda sonuçları yorumlama için en uygun olduğundan emin olun. Pozitif kontrol sonda ile sinyal yok RNA kalite örnek sonra suboptimal ve varsa a sinyali test sonda ile görülebilir değil.

El ile testin yanı sıra yetenek otomatik stainers tahlil yapmak da gösterilmiştir (Şekil 6) oldu. Bu otomatik ISH tahlil sinyal / gürültü oranı yüksek verimleri ve Tablo 1' de gösterildiği gibi aynı uygulamalar için geçerlidir; Ancak, otomatik bir tahlil faydaları tahlil koşulları, arası Kullanıcı değişkenliği ve uygulamalı zaman pykał standardizasyonu eklemek ve doku örnekleri yüksek üretilen iş tarama için güvenilir bir şekilde ödeneği.

İmmünhistokimya (IHC) ve qRT-PCR splice türevleri (özellikle EGFRvIII), FFPE klinik örneklerin algılanması için izin verirken bu teknikler gerekli özgüllük eksikliği ve splice Uzaysal Çözünürlük içgörü sunuyor musunuz değişken ifadesi, sırasıyla11,12. Bu iletişim kuralı tahlil önemli bir avantajı morfolojik doku bağlam koruma sırasında onun son derece hassas ve belirli görsel olarak splice kavşak var. Burada, tam olarak EGFRvIII ve METΔ14, dahil olmak üzere çeşitli splice türevleri için benzersiz exon kavşak hedeflemek için tahlil'ın yeteneği gösterilmiştir (Şekil 3 ve 6) oldu. Ayrıca, prostat kanseri, beyin ErbB4, birden çok izoformlarının ve dairesel RNA Cdr1as fare beyin3,13,14nakavt onay splice değişken AR-V7 algılamak için tahlil gösterilmiştir.

Kısa hedef sıra tespit bu ISH tahlil tarafından görselleştirme gibi içinde uzunluk, 50 nukleotid kısa RNA dizilerinin CDR3 dizileri (Şekil 3) Jurkat hücrelerden türetilmiş tespiti tarafından gösterildiği gibi sağlar. Tahlil da Revêchon ve arktarafından gösterildiği gibi diğer aile üyeleri ya da türler, son derece homolog gen dizileri algılayabilir., kim kısa hedef tahlil fare beyaz deri altı yağ dokusu15dakika içinde ifade insan progerin algılamak için kullanılır. Buna ek olarak, küçük genelde RNA (snoRNA), CRISPR-aracılı gen düzenleme ve öncü-mikroRNA kısa hedef tahlil ile tespit edilen in situ olabilir. Daha yakın zamanlarda, Fu ve ark. IHC pre-miRNA mir125b16ifade retina kesin hücreleri tanımlamak için bu ISH tahlil birlikte.

Tümörler profil oluşturma mutasyon tümörler ilerleme çalışmak için ve hedefli tedaviler geliştirmek için önemlidir. Mutasyon profil oluşturma yolu ile yüksek-den geçerek sıralama elde edilebilir olsa da, bu teknoloji tamamen intratumoral heterojenlik veya bağlantı genetik değişiklik ile hücresel morfoloji17,18adresi olamaz. Nokta mutasyonlar bu ISH tahlil kullanarak tespiti çözünürlükte bir tek-base, hücre hatları (Şekil 5) EGFR L858R ve KRAS G12A tek nükleotid değişimler tespiti tarafından doğrulanmış RNA hedef sıralarının düzeye çıkarılmasını sağlar. Ayrıca, Baker ve ark. nokta mutasyon tahlil kolorektal kanser18BRAF, KRAS ve PIK3CA oncogenes birden çok mutasyonların hedeflemek için kullanılır. Onlar tanımlamak ve dağınık şekilde nadir mutant subclones sonuçta nasıl katkıda bulundukları Intra-tümör heterojenite için gösterilen tümör hücrelerinin eşlemek başardık.

Özet olarak, özel bir RNA ISH tahlil geliştirilmiştir. Bu metodoloji splice türevleri, kısa dizileri ve mutasyonlar in situtespiti için sağlar. Performans tarafından el ile gerçekleştirilebilecek yöntemler ve otomatik stainers üzerinde hassas, belirli, ölçülebilir ve adapte olduğunu.

Disclosures

Tüm yazarlar Gelişmiş hücre tanılama, Inc tarafından istihdam edilmektedir

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) ACD 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II)
HybEZ Humidity Control Tray (with lid) ACD 310012
ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 ACD 310017
HybEZ Humidifying Paper ACD 310015
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required)  Vector Laboratory  H-4000
SuperFrost Plus Slides (required)  Fisher Scientific  12-550-15
10% neutral-buffered formalin (NBF)  MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Paraffin wax MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microtome MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Gill’s Hematoxylin I  American Master Tech Scientific/MLS  HXGHE1LT MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Xylene  Fisher Scientific/MLS X3P-1GAL MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack  American Master Tech Scientific/MLS LWSRA24 MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Staining Dishes  American Master Tech Scientific/MLS LWT4457EA MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant  American Master Tech Scientific/MLS LWT4456EA MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
100% alcohol (EtOH)  American Master Tech Scientific/MLS ALREACS MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
VectaMount Permanent Mounting Medium (required) Vector Labs  H-5000
Cover Glass, 24 mm x 50 mm Fisher Scientific/MLS  12-545-F MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Ammonium hydroxide, 28–30% Sigma-Aldrich/MLS 320145-500mL MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Carboy (>3L) MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer / /
Digital thermometer MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1 °C MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Pipettors and tips, 1–1,000 μL MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Distilled water MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tubes (various sizes) MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Fume hood MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Graduated cylinder MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Parafilm MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Paper towel or absorbent paper MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microcentrifuge MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microscope and accessories MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1 °C MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Formaldehyde MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Histogel Fisher Scientific/MLS 22-110-678
BaseScope Reagent Kit - RED Advanced Cell Diagnostics 322900
BaseScope Hs-EGFR-E1E2 Advanced Cell Diagnostics 701701
BaseScope Hs-EGFR-E1E8 Advanced Cell Diagnostics 701711
BaseScope Hs-EGFR-E7E8 Advanced Cell Diagnostics 701721
BaseScope Hs-EGFR-E8E9 Advanced Cell Diagnostics 701731
BaseScope Hs-MET-E14E15 Advanced Cell Diagnostics 701811
BaseScope Hs-MET-E13E15 Advanced Cell Diagnostics 701801
BaseScope Hs-KRAS-G12A Advanced Cell Diagnostics 705491
BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT Advanced Cell Diagnostics 705531
BaseScope Hs-EGFR-L858R Advanced Cell Diagnostics 705451
BaseScope Hs-EGFR-L858WT Advanced Cell Diagnostics 705461
BaseScope Control Probe Pack Human Advanced Cell Diagnostics 322975

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bolha, L., Ravnik-Glavač, M., Glavač, D. Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers. International Journal of Genomics. 2017, 6218353 (2017).
  2. Yamada, A., Yu, P., Lin, W., Okugawa, Y., Boland, C. R., Goel, A. A RNA-Sequencing approach for the identification of novel long non-coding RNA biomarkers in colorectal cancer. Scientific Reports. 8, (1), 575 (2018).
  3. Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. Epub ahead of print (2017).
  4. Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods in Molecular Biology. 461, 675-686 (2008).
  5. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, (1), 22-29 (2012).
  6. Paraffin processing of tissue. Protocols Online. Available from: https://www.protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2016).
  7. An, Z., Aksoy, O., Zheng, T., Fan, Q. W., Weiss, W. A. Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies. Oncogene. Epub ahead of print (2018).
  8. Frampton, G. M., et al. Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors. Cancer Discovery. 5, (8), 850-859 (2015).
  9. Awad, M. M., et al. MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer Are Associated With Advanced Age and Stage-Dependent MET Genomic Amplification and c-Met Overexpression. Journal of Clinical Oncology. 34, (7), 721-730 (2016).
  10. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 134, (6), 907-922 (2010).
  11. Gan, H. K., Cvrljevic, A. N., Johns, T. G. The epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII): where wild things are altered. Federation of European Biochemical Societies Journal. 280, (21), 5350-5370 (2013).
  12. Wheeler, S. E., Egloff, A. M., Wang, L., James, C. D., Hammerman, P. S., Grandis, J. R. Challenges in EGFRvIII detection in head and neck squamous cell carcinoma. Public Library of Science One. 10, (2), e0117781 (2015).
  13. Zhu, Y., et al. Novel Junction-specific and Quantifiable In Situ Detection of AR-V7 and its Clinical Correlates in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer. European Urology. Epub ahead of print (2017).
  14. Piwecka, M., et al. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function. Science. Epub ahead of print (2017).
  15. Revêchon, G., et al. Rare progerin-expressing preadipocytes and adipocytes contribute to tissue depletion over time. Scientific Reports. 7, (1), 4405 (2017).
  16. Fu, Y., et al. Functional ectopic neuritogenesis by retinal rod bipolar cells is regulated by miR-125b-5p during retinal remodeling in RCS rats. Scientific Reports. 7, (1), 1011 (2017).
  17. Yates, L. R., et al. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nature Medicine. 21, (7), 751-759 (2015).
  18. Baker, A. M., et al. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nature Communications. 8, (1), 1998 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics