Ein In vitro- Test zur Erkennung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität

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Biochemistry

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Summary

Hier haben wir ein Protokoll für die biochemische Charakterisierung der Hefe RNA-modifizierende Enzym, Mod5, beschreiben und diskutieren, wie dieses Protokoll auf andere RNA-modifizierende Enzyme angewendet werden könnte.

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Chambers, A. E., Richardson, A. E., Read, D. F., Waller, T. J., Bernstein, D. A., Smaldino, P. J. An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity. J. Vis. Exp. (140), e58100, doi:10.3791/58100 (2018).

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Abstract

N6- Isopentenyladenosine RNA Modifikationen sind funktional vielfältig und hoch konservierte zwischen Prokaryoten und Eukaryoten. Eine der am meisten hoch konservierten N6- Isopentenyladenosine Änderungen tritt an der A37 Position in eine Teilmenge der tRNAs. Diese Änderung verbessert Übersetzung Effizienz und Genauigkeit durch die Erhöhung der Affinität der tRNA für das Ribosom. Mutation von Enzymen verantwortlich für diese Änderung in den Eukaryotes sind mit verschiedenen Krankheitszuständen, einschließlich mitochondriale Dysfunktion und Krebs in Verbindung gebracht. Daher ist es wichtig für das Verständnis der normalen und pathologischen eukaryotic Biologie, Verständnis für die Substratspezifität und biochemischen Aktivitäten dieser Enzyme. Eine Vielfalt von Methoden wurde eingesetzt, um ich6A Modifikationen zu charakterisieren. Hierin wird einen direkten Zugang zur Erkennung von Isopentenylation durch Mod5 beschrieben. Diese Methode nutzt Inkubation von RNAs mit einem rekombinanten Isopentenyl-Transferase, gefolgt von RNase T1 Verdauung und 1-dimensionale Elektrophorese Gelanalyse ich6A Änderungen zu erkennen. Darüber hinaus ist die mögliche Anpassungsfähigkeit dieses Protokolls zum anderen RNA-modifizierende Enzyme charakterisieren diskutiert.

Introduction

Mindestens 163 verschiedene posttranskritionelle RNA Modifikationen wurden identifiziert, mit diesen Änderungen Übertragung vielfältige und Kontext-abhängige Funktionen RNAs direkt RNA-Struktur zu beeinflussen und Auswirkungen auf die Beziehungen der RNA Moleküle1,2. Mit zunehmender Wertschätzung für die Anzahl und Vielfalt der RNA Änderungen ist es wichtig, Tests zu entwickeln, die zuverlässig zu verhören kann die RNA-Modifikationen und die Enzyme, die sie katalysieren.

Eine der ersten RNA Änderungen identifiziert werden erfolgt auf Basis 37 in tRNAs, angrenzend an das Anti-Codon auf 3' Seite3,4. Eine Isopentenyl-Gruppe von Dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) auf die N6-Position von Adenosin 37 übertragen (ich6A37) 3,5 auf eine Teilmenge der zytoplasmatischen und mitochondriale tRNAs. Ich6A37 verbessert die Übersetzung Treue und Effizienz durch eine Erhöhung der tRNA-Affinität für das Ribosom4,6 und ich6A37 ist wichtig für die Stress-Reaktion in Bakterien7. Die Enzyme, die diese Änderung durchführen werden tRNA Isopentenyl Transferasen bezeichnet und sind hoch konserviert in Bakterien8,9, Pilze10Würmer11, Pflanzen12und höheren Eukaryoten13 , einschließlich Menschen14.

Mutationen im menschlichen tRNA Isopentenyl Transferase Gens, TRIT1, sind menschliche Krankheiten zugeordnet. Zum Beispiel ist eine Mutation im TRIT1 mit einer schweren mitochondrialen Erkrankung, wahrscheinlich verursacht durch einen Defekt im mitochondrialen Protein Synthese15,16korreliert. Darüber hinaus TRIT1 wurde beschrieben als ein Tumorsuppressor Gen17,18 und ist in verschiedene Arten von Krebs einschließlich Melanom19, Brust20, Magen-21und Lungenkrebs22 verwickelt ,23. Zu guter Letzt TRIT1 und Mod5 (Saccharomyces Cerevisiae) Isopentenyl Transferasen sind Aggregation neigen Proteine, die Prion-wie Amyloid Fasern24,25,26bilden. Diese Beobachtungen implizieren potenziell tRNA Isopentenyl Transferasen bei neurodegenerativen Erkrankungen, obwohl direkte Beweise für diese noch nicht gezeigt wurde.

Angesichts der Rolle, dass Isopentenyl Transferasen in Übersetzung und Krankheit, Methoden, mit denen direkt ich6Messen spielen eine Isopentenyl-Transferase-Aktivität sind wichtig für ein mechanistisches Verständnis dieser Enzyme unter normalen Bedingungen und Krankheitszustände. Eine wachsende Zahl von Methoden stehen zur Erkennung ich6A RNA Änderungen, einschließlich der in-vitro- Isopentenylation-Assays, positive Hybridisierung in Ermangelung von i6(PHA6) Tests, thin Layer Chromatography (TLC), Aminosäure Akzeptanz-Aktivität-Assays und Massenspektrometrie Ansätze (bewertet in Ref. 4).

Ein in-vitro- Isopentenylation-Assay ist beschrieben worden, die 14C-DMAPP und unbeschriftete tRNAs verwendet. In diesem Test wird radioaktiven Kohlenstoff an RNA von 14C-DMAPP durch Isopentenyl-Transferase übertragen. Während dieses Tests sehr empfindlich ist, ist es oft schwierig zu bestimmen, dass bestimmte Rückstände, die9,20,27geändert. PHA6 Assays verlasse ich mich auf die sperrigen6A Änderung Hybridation von 32P-markierten Sonden überspannt die modifizierte Rückstände zu stören. Als solche Hybridisierung ist größer bei fehlender ein i6eine Änderung18,28,29. PHA6-Assays sind hochsensible und geeignet zur Analyse von Gesamt-RNS von zellulären Lysates extrahiert. Darüber hinaus bietet die Möglichkeit, Sonden spezifisch auf die RNA von Interesse zu entwerfen diese Methode wesentliche Ziel Flexibilität. PHA6-Assays sind jedoch beschränkt auf die Charakterisierung der Änderungen, die auf Rückstände in der gezielten Region der Sonde auftreten und sind daher weniger wahrscheinlich neue Modifikation Websites identifizieren. Darüber hinaus fehlen verbindliche Richtwerte der Änderung ist, werden andere Veränderungen oder Mutationen, die RNA-bindende beeinflussen Datenanalyse verwechseln.

Ein weiterer Ansatz verbindet Benzyl DEAE Zellulose (BD) Zellulose Chromatographie mit Aminosäure Akzeptanz Aktivität als ein Auslesen von i6A Modifikationen in tRNA30. Dieser Ansatz Proben direkt die Funktion des i6A Änderung, sondern es ist eine indirekte Annäherung an erkennen ich6A Änderung und Auflösung zuordnen Änderungen an eine bestimmte Rückstände in der RNA fehlt. Ein TLC-Ansatz verwendet wurde, um insgesamt tRNA erkennen ich6A Modifikationen. Bei diesem Ansatz intern 32P-Label tRNAs werden einzelne Nukleotide verdaut und zweidimensionale TLC-Analyse wird verwendet, um Isopentenylation zu identifizieren. Dieser Ansatz ist sehr empfindlich bei der Aufdeckung von total ich6A in einer bestimmten RNA-Probe aber auf Verdauung, alle sequenzinformation ist verloren; So hat der Prüfer keineswegs zur Bestimmung, welche Rückstände veränderter31gewesen sein.

Vor kurzem sind flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Methoden entwickelt worden, die total RNA-Änderungen zwischen Arten, Zelltypen und Versuchsbedingungen32,33quantitativ zu vergleichen, 34. Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass es weniger in der Lage zu bestimmen, dass die Identität und die Position innerhalb der RNA aus dem modifizierten Nukleosid war34abgeleitet. Darüber hinaus begrenzen das Know-how und die notwendige Ausrüstung für diese Experimente führen die Praktikabilität dieses Ansatzes.

Darüber hinaus entstanden mehrere Next Generation Sequencing Technologien um RNA Modifikationen Transkriptom-weite34zuzuordnen. Immunopräzipitation RNAs mit Antikörpern, die spezifisch für eine bestimmte Änderung (RIP-Seq) ermöglichen die Ermittler alle Sequenzen mit einer spezifischen Änderung35,36zu identifizieren. Darüber hinaus setzen Reverse-Transkriptase-basierte Ansätze wie Chem-Seq und nicht-zufällige Abweichung Sequenzierung auf Störungen der reversen Transkription Reaktion bei der modifizierten Rückstände37,38,39. Trotz der Vorteil dieser Techniken RNA Modifikationen Transkriptom-weiten zuordnen sind RIP-Seq und Chem-Seq-Technologien durch den Mangel an zuverlässigen Antikörper oder reaktiven Chemikalien für jede gezielte Modifizierung bzw.34begrenzt. Darüber hinaus Enzyme Reverse Transkriptase verpflichtet, Chem-Seq durchführen und nicht-zufällige Abweichung Sequenzierung Techniken können durch stabile RNA-Strukturen behindert werden. Die stark veränderte und strukturell stabile Natur der tRNAs machen sie besonders schwierig, mit diesen Techniken zu befragen. Bisher wurden Sequenzierung-basierten Technologien der nächsten Generation nicht noch auf Karte ich6Modifikationen34genutzt.

Hier beschreiben wir einen einfachen und direkten Ansatz, ich6A tRNA Änderungen in Vitrozu erkennen. Diese Methode nutzt Inkubation von RNAs mit rekombinanten S. Cerevisiae Isopentenyl-Transferase (Mod5), gefolgt von RNase T1 Verdauung und 1-dimensionale Elektrophorese Gelanalyse zuordnen ich6A Modifikationen. Dieser Ansatz ist direkt und erfordert wenig Fachwissen zum Analysieren der Daten. Darüber hinaus ist diese Methode anpassungsfähig an andere RNA, Enzyme, einschließlich Enzyme, die das Molekulargewicht der RNA oder einer RNA Mobilität durch ein Gel kovalent ändern ändern.

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Protocol

Hinweis: Das Protokoll wurde vom Ref. 24angepasst.

1. besorgen Sie RNA und Enzym von Interesse

  1. Einsatz in Vitro transkribiert RNAs intern mit 32P gekennzeichnet, und rekombinante His6-Mod5 ausgedrückt und von E. Coli, wie zuvor beschrieben24gereinigt.
    1. Einführung in Vitro transkribiert RNAs (Abschnitt 3) T7-RNA-Polymerase im Beisein von unbeschrifteten ATP, UTP, CTP, GTP und 10 µCi Gel gereinigt, Ethanol ausgefällt α-ATP, mit Nukleinsäuretablette in 1 X TE (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 0,1 mM EDTA), und bei-80 ° C gelagert 24.
  2. Alternativ erhalten Sie im Handel erhältlichen eindringmittel beschrifteten RNAs von Interesse. Die Enzyme(s) des Interesses an einer bevorzugten Expressionssystems zu produzieren.
    Achtung: Interne fluoreszierende Tags in der RNA RNA-Struktur verändern können und Anerkennung durch Enzyme.

2. bereiten Sie einen 20 % Polyacrylamid Gel Denaturierung

Hinweis: Zur Erlangung ausreichenden Auflösung von RNA-Fragmenten ist eine 40 cm Länge vertikale Platte Gel empfohlen. Die Breite des Gels verwendet richtet sich nach der Anzahl der Proben analysiert werden.

  1. Glasplatten gründlich zu reinigen. Zuerst mit Seife und Wasser waschen, mit entionisiertem Wasser abspülen und anschließend mit Isopropanol und fusselfreien Tüchern reinigen.
  2. Montieren Sie die Platten und Distanzscheiben.
  3. Die folgenden Reagenzien um 100 mL 20 % Acrylamid, 7,5 M Harnstoff, 1 X TBE Gel zu mischen: 80 mL Harnstoff Gel konzentrieren (237,5 g/L von Acrylamid, 12,5 g/L Methylen Bisacrylamide, 7,5 M Harnstoff in entionisiertem Wasser), 10 mL von Harnstoff Gel Verdünnungsmittel (7.5M Harnstoff in entionisiertem Wasser) , und 10 mL Harnstoff Gel Puffer (0,89 M Tris-Borat-20 mM EDTA Puffer pH 8,3 und 7,5 M Harnstoff).
    Hinweis: Das Volumen der Gel-Lösung muss entsprechend dem Umfang des Gel angepasst werden.
  4. 40 µL N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) und 800 µL frisch zubereitete 10 % Ammonium Bleichen (APS) hinzufügen.
  5. Auszuarbeiten Sie Gel-Lösung, in eine große Spritze und zwischen Glasplatten zu verzichten. Tippen Sie auf Glas mit den Fingern beim Ausgießen, um Blasenbildung zu vermeiden.
  6. Lassen Sie Gel für 30 min zu festigen.
  7. Klemmen Sie erstarrten Gel auf vertikale Gel Apparat mit Binder Clips.
  8. Füllen Sie die oberen und unteren Puffer Kammern mit 1 X TBE.
  9. Zwei Stunden vor dem Laden des Gels vor laufen das Gel bei 20 mA, 2 h, die Puffer-Grenze, die kleinste Oligonucleotides - überholen lassen sonst die kleinste Nukleotide und Oligonukleotide tendenziell Puffer vorne zusammenbrechen.

3. RNA Isopentenylation Assay

  1. Bereiten Sie Reaktionen in einem Endvolumen von 17 µL mit 58 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1,2 mM ATP, 5,8 mM MgCl2, 0,2 mM DMAPP, 10 U RNase-Inhibitor (z.B.SuperRNaseIn), 40.000 CPM intern 32P-Label RNA, 5,3 µM Mod5, und 1,2 mM 2 - Mercaptoethanol.
  2. Inkubieren Sie Reaktionen bei 37 ° C für 1 h.
  3. Ethanol-Niederschlag RNAs mit 2,5 Bände (42.5 µL) aus 100 % Ethanol und 1/10 Bände (1,7 µL) von 3,5 M Natrium Acetat pH 5,5 und Ort bei-20 ° C für 1 Stunde oder über Nacht.
  4. Zentrifugieren Sie RNA-Proben für 20 min bei 15.400 x g und 4 ° C.
  5. Sorgfältig den überstand zu entfernen und Waschen der RNA-Pellet mit 500 µL 70 % Ethanol.
  6. Zentrifuge Proben bei 5 min 15.400 x g und 4° C.
  7. Entfernen Sie vorsichtig die überstehenden und an der Luft trocknen RNA-Pellets für 15 Minuten, oder bis alle Ethanol verdampft ist.
  8. RNA-Pellets in 10 µL von 8 M Harnstoff aufzuwirbeln.
  9. 150 U RNase T1 hinzufügen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
  10. Fügen Sie 2 µL 6 x Ladepuffer (60 % Glycerin, 0,1 % Xylol Cyanol).
  11. Laden Sie 10 µL jeder RNA-Probe auf einem vor dem Rechenlauf, 20 % Polyacrylamid, 7,5 M Harnstoff Gel (siehe Abschnitt 2 des Protokolls).
    Hinweis: Radioaktiven RNA Größe Leitern können als eine zusätzliche Mobilität Marker einbezogen werden.
  12. Gel für 2 h Laufzeit 25 mA.
  13. Gel zu stoppen und vom Gerät entfernen.
  14. Pause zwischen den beiden Glasplatten zu versiegeln und entfernen Sie eine der Glasplatten mit dem Gel auf die "Bodenplatte".
    Hinweis: Achten Sie darauf, nicht um das Gel während dieses Schrittes zu reißen.
  15. Legen Sie eine Schicht aus Plastikfolie über das Gel und alternativ auf einem Phosphor-Bildschirm für 3 h entlarven, Chromatographiepapier Gel auflegen und Trocknen mit einem Trockner vor der Phosphor Bildschirm Belichtung Gel.
  16. Bild-Phosphor-Bildschirm auf einem Phosphor Imager.

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Representative Results

Mod5 wurde mit einem Tyrosin inkubiert tRNA oder Serin tRNA in der Anwesenheit oder Abwesenheit von DMAPP. Im Anschluss an die Änderung Reaktion waren die RNase T1 verdaut, die bindet des 3'-Ende von allen Guanosines ein 3' Guanosin Monophosphates (GMP)24 (Abbildung 1) verlassen. Vollständige Verdauung des RNAs produziert einem vorhersagbaren Muster der radioaktiven Fragmente (Abb. 2A), die dann auf eine 20 %-Polyacrylamid-Gel Denaturierung gelöst werden. Die Übertragung einer Isopentenyl-Gruppe vom DMAPP auf die RNA bewirkt eine Mobilität Verschiebung des Fragments, enthält die geänderte Rückstände (Abbildung 1).

Dieses Protokoll erkennt zuverlässig Isopentenylation des kanonischen und nicht-kanonische tRNA Rückstände von Mod524geändert. Zum Beispiel Mod5 wird vorausgesagt, um eine Teilmenge der tRNAs, zu ändern, die die zuvor beschriebenen AAA36-38 Sequenz Anforderung10, einschließlich die Tyrosin enthalten tRNA und Serin tRNA in dieser Studie verwendet. Mod5 ändert den vorhergesagten Rückstand in Anwesenheit von DMAPP, wie durch den verschobenen 10 ist nt AAA36-38 , Fragment in die Tyrosin enthält tRNA (Abbildung 2B). Ebenso, wenn die Serin tRNA wird mit Mod5 und DMAPP, eine komplette Umstellung der 10 inkubiert nt AAA36-38 , Fragment enthalten ist (Abbildung 2C) beobachtet. Interessanterweise ist eine teilweise Verlagerung von 7 nt Fragment beobachtete, dass die AAA-36-38 (Abbildung 2C) nicht enthalten ist. Diese Daten deuten darauf hin, dass die AAA-36-38 -Sequenz und Struktur nicht für Mod5 in-vitro- Aktivität erforderlich sind; zukünftige Studien mit LC-MS/MS oder andere Methoden sind jedoch erforderlich, um die genaue chemische Natur der Änderung zu bestätigen.

Figure 1
Abbildung 1 : Abbildung des Isopentenyl-Transferase-Assays. tRNA, intern mit 32P-Adeonsine, beschriftet wird inkubierten mit S. Cerevisiae tRNA Isopentenyl-Transferase (Mod5) und ATP mit oder ohne DMAPP angezeigt. Positionen A36-A38 sind neben der Anticodon Region angegeben. Rote Sternchen darstellen radioaktiven Nukleotide. Nach Inkubation RNAs sind verdaut mit RNase T1 extrahiert und durch Denaturierung Seite 20 % gelöst. Die Übertragung einer Isopentenyl-Gruppe vom DMAPP auf die tRNA wird durch eine verzögerte Band während der Elektrophorese. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : RNase T1 Verdauung Karte und Vertreter-Ergebnisse einer Isopentenyl-Transferase-Assays. (A) schwarze Dreiecke RNase T1 spaltstellen und schwarze Linien über die Dreiecke darstellen resultierenden Fragmente, die mindestens 32P-Label Adenosin enthalten. Grau markierte Rückstände sind habe ich6A Änderung Websites (z.B. A37) vorausgesagt. (B) Tyrosin tRNA und (C) Serin tRNA wurden intern beschriftet, mit 32P-Adenosin. S. Cerevisiae Isopentenyl-Transferase, Mod5, wurde mit jedem RNA in das Vorhandensein oder Fehlen von DMAPP inkubiert. Die RNAs wurden dann mit RNase T1 verdaut und auf Denaturierung-Seite gelöst. Verschobene Bänder abhängig von DMAPP deuten auf das Vorhandensein eines modifizierten RNA-Rückstands. Die vorhergesagten Änderung Website, A37, unterstrichen und modifizierte A37 Rückstände sind mit einem Sternchen gekennzeichnet. Eine unerwartete und neuartigen Modifikation Website identifiziert und als "ich6A?". Diese Zahl wurde von Read Et Al. modifiziert 24 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

RNA-Änderungen weiterhin nachgewiesen werden, dass immer mehr wichtige und vielfältige Rollen in zellulären und organismal Funktion zu spielen. Als solche ist die Entwicklung von Assays RNA ändern Enzyme Verhören zentral zu einem besseren Verständnis der grundlegenden Aspekte der Biologie. Dieses Protokoll beschreibt einen hochauflösende in Vitro Assay zur Charakterisierung der tRNA Modifikation Aktivität von Mod5.

Dieses Protokoll hat den entscheidenden Vorteil bietet eine direkte und leicht interpretierbare Auslesen der Isopentenylation. Das Protokoll beschrieben ermöglicht robuste biochemische Charakterisierung der Isopentenyl-Transferasen. Darüber hinaus dieses System kann mit Enzymvarianten verwendet werden oder geändert RNA Substrate, zulassend direkte Bestimmung der Rollen, die bestimmte Rückstände oder Domänen auf Änderung haben. Um noch höhere Auflösung zu erhalten, könnte dieses Protokolls leicht angepasst werden parallel Verdauung mit anderen RNases, wie RNase P1 und/oder RNase A, enthalten, die bei allen vier Nukleotide oder in C und U, bzw. Spalten.

Eine Einschränkung dieser Assay ist, dass es relativ niedrigen Durchsatz und somit weniger RNAs, die praktisch analysiert werden können im Vergleich zu RNA-Sequenzierung und Massenspektrometrie nähert sich34. Daher wird nicht empfohlen, dass dieses Protokoll für diejenigen verwendet werden, die RNA Änderung Seiten Transkriptom-weite identifizieren wollen. Dieses Protokoll eignet sich am besten an die Ermittler, die bei der Prüfung einer spezifische RNS ändern Enzym mit bestimmten RNAs Sehenswürdigkeiten interessiert sind. Viele Transkriptom Breite Methoden zur Identifizierung von RNA Änderungen erfordern jedoch kovalente Zugabe von chemischen Glyko-, eine modifizierte Nukleotid. Diese Methode bietet einen kostengünstige und effizienten Assay wo eine Änderung Protokolle auf einem einzelnen Substrat chemische Modifikation vor der Festlegung auf eine Transkriptom-weiten Anstrengungen40optimieren testen konnten. Obwohl dieses Protokoll einen einfachen und direkten Assay um Isopentenyl-Transferase-Aktivität, zu erkennen bietet wie es hier beschrieben wird, kann nur die Prozent des gesamten RNA Fragments modifiziert berechnet und im Vergleich zwischen Gruppen. Forscher interessiert, quantitative Enzym Aktivität Vergleiche müssen zuerst die Einheiten der Aktivität pro Enzymkonzentration berechnen.

Erfolg dieser Methode stützt sich auf ein paar wichtige Schritte. Es ist wichtig, dass die Integrität der RNA des Interesse vor der Isopentenylation bestätigt wird. Abbau der RNA-Probe vor der Isopentenyl-Transferase-Assay könnte haben erhebliche Auswirkungen auf die RNA-Modifikation und Interpretation der Daten zu verwirren. Darüber hinaus ist dieser Abbau schwer zu erkennen, nachdem die RNase T1 Verdauung stattgefunden hat. Daher empfiehlt es sich, dass RNA Integrität durch Denaturierung Seite aktiviert ist. Darüber hinaus ist es um genau das Ausmaß der RNA-Modifikation zu charakterisieren, muss sichergestellt werden, dass RNase T1 Verdauung bis zur Fertigstellung vorgegangen ist. Zusätzliche RNases wie RNase P1/RNase A, oder kann zu verdauen RNAs parallel mit RNase T1 verwendet werden, um die Auflösung des Assays zu erhöhen. Radioaktiven Oligonukleotid-Leitern der bekannten Länge und Sequenz und unverdaute RNA-Proben können verwendet werden, um die Verdauung zu beurteilen. Zu guter Letzt für einige Enzyme hängt die Spezifität der Änderung die RNA in "richtig" zusammengeklappten Zustand. Während die meisten tRNAs synthetisiert in-vitro- Falte in ihrer in-Vivo -Struktur ähnelt Strukturen, ist dies weniger sicher für andere Klassen von RNAs, vor allem bei längeren RNAs41.

Obwohl das Protokoll beschriebenen Mod5 Isopentenylation der tRNAs spezifisch ist, könnte diese Methode leicht an andere RNA-modifizierende Enzyme zu charakterisieren, die kovalent chemische Glyko-hinzufügen, das Molekulargewicht oder Gel Mobilität deutlich verändert angepasst werden die RNA.

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Disclosures

Keiner, offen zu legen.

Acknowledgments

Wir möchten Dr. David Engelke für seine Führung und hilfreichen Kommentare auf dieser Handschrift zu danken. PJS - Ball State University Labor Start Mittel; DAB - 1R15AI130950-01 zu gewähren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
UreaGel Concentrate National Diagnostics EC-833 As part of a kit
UreaGel Diluent National Diagnostics EC-833 As part of a kit
UreaGel Buffer National Diagnostics EC-833 As part of a kit
10x TBE National Diagnostics EC-833 As part of a kit
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich 7727-54-0
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) Sigma-Aldrich T9281
Tris base Sigma-Aldrich T1503
Boric acid Sigma-Aldrich 10043-35-3
EDTA Sigma-Aldrich 60-00-4
ATP Sigma-Aldrich 34369-07-8
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
DMAPP Caymen Chemical 1186-30-7
Super RNaseIN ThermoFisher Scientific AM2694
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich 60-24-2
Ethanol Sigma-Aldrich 64-17-5
Sodiume acetate Sigma-Aldrich 127-09-3
Rnase T1 ThermoFisher Scientific EN0541
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5
Xylene cyanol Sigma-Aldrich 2650-17-1
Equipment and Supplies
Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) The Gel Company
Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) The Gel Company
Vertical gel apparatus The Gel Company S2-3040
50 mL disposable syringe Fisher Scientific 03-377-26
Stainless steel binder clips Idea Scientific 1066
Phosphoscreen Sigma-Aldrich 28-9564-74
Plastic wrap (local grocery store)

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References

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