कीटनाशक प्रतिरोधी घर मक्खियों में Carboxylesterases के कार्यात्मक लक्षण वर्णन, Musca Domestica

Biochemistry

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Summary

यहां, हम एक baculovirus मध्यस्थता कीट सेल अभिव्यक्ति प्रणाली के साथ इन विट्रो में घर मक्खी carboxylesterase प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है और बाद में कार्यात्मक metabolizing permethrin में अपनी भूमिकाओं को चिह्नित, जिससे, pyrethroid को प्रदान सेल का आयोजन MTT परख और इन विट्रो चयापचय अध्ययन पर आधारित द्वारा प्रतिरोध ।

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Feng, X., Liu, N. Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica. J. Vis. Exp. (138), e58106, doi:10.3791/58106 (2018).

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Abstract

Carboxylesterase-मध्यस्थता चयापचय विभिंन कीड़ों में कीटनाशक प्रतिरोध में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए सोचा है । कई carboxylesterase जीन पाया गया प्रतिरोधी घर मक्खी तनाव में विनियमित, जबकि कीटनाशक प्रतिरोध प्रदान करने में उनकी भूमिका का पता लगाया जा रहे थे । यहां, हम carboxylesterases के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल बनाया । तीन उदाहरण प्रयोग प्रस्तुत हैं: (1) एक baculovirus मध्यस्थता कीट धब् frugiperda (Sf9) कोशिका अभिव्यक्ति प्रणाली के माध्यम से carboxylesterase प्रोटीन की अभिव्यक्ति और अलगाव; (२) एक कोशिका आधारित MTT (३-[४, ५-dimethykthiazol-२-yl]-२, ५-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड) cytotoxicity परख कर कीट कोशिकाओं की सहनशीलता को मापने के लिए विभिन्न permethrin उपचार; और (3) इन विट्रो में चयापचय अध्ययन permethrin की ओर carboxylesterases की चयापचय क्षमताओं का पता लगाने के लिए. carboxylesterase जीन MdαE7 एक प्रतिरोधी घर मक्खी तनाव ALHF से क्लोन और baculovirus कोशिकाओं के संक्रमण के लिए एक रिकॉमबिनेंट Sf9 का निर्माण किया गया था । अलग permethrin उपचार के खिलाफ सेल viabilities MTT परख के साथ मापा गया । प्रयोगात्मक समूह की बढ़ी हुई कोशिका सहिष्णुता (MdαE7-रिकॉमबिनेंट baculovirus संक्रमित कोशिकाओं) नियंत्रण समूहों के उन लोगों के साथ तुलना में (बिल्ली-रिकॉमबिनेंट baculovirus संक्रमित कोशिकाओं और GFP-रिकॉमबिनेंट baculovirus संक्रमित कोशिकाओं) के लिए permethrin उपचार metabolizing कीटनाशकों में MdαE7 की क्षमताओं का सुझाव दिया, जिससे रासायनिक नुकसान से कोशिकाओं की रक्षा । इसके अलावा, carboxylesterase प्रोटीन कीट Sf9 कोशिकाओं में व्यक्त किए गए और अलग करने के लिए एक इन विट्रो चयापचय अध्ययन आचरण । हमारे परिणामों को इन विट्रो में एक महत्वपूर्ण संकेत permethrin की ओर MdαE7 की चयापचय दक्षता, सीधे metabolizing कीटनाशकों में carboxylesterases की भागीदारी का संकेत है और इस तरह घर मक्खियों में कीटनाशक प्रतिरोध प्रदान करते हैं ।

Introduction

कीटनाशक प्रतिरोध वर्तमान में घर मक्खी नियंत्रण दुनिया भर में1,2का एक प्रमुख मुद्दा है । कीटनाशक प्रतिरोध के तंत्र का निर्धारण करने के प्रयास इस मुद्दे की बेहतर समझ की सुविधा है और इस तरह उपंयास रणनीतियों को प्रभावी ढंग से रोकने या प्रतिरोध विकास3के प्रसार को कम करने प्रदान करते हैं । Carboxylesterases, प्रमुख detoxification एंजाइमों में से एक के रूप में, sequestering और विभिंन कीड़ों में metabolizing कीटनाशकों में अपनी भूमिकाओं के लिए ध्यान की एक बहुत आकर्षित किया है4,5,6। हमारे पिछले अध्ययन घर मक्खियों में कई carboxylesterases की पहचान की है और उनकी अभिव्यक्ति के स्तर पर ही constitutively-प्रतिरोधी ALHF तनाव में विनियमित नहीं थे, लेकिन यह भी permethrin उपचार के जवाब में उच्च स्तर के लिए प्रेरित किया जा सकता है7 . हालांकि, metabolizing कीटनाशकों में इन carboxylesterase जीन के कार्यात्मक characterizations का पता लगाया जाना बाकी है.

1980 के दशक में पहली रिपोर्ट के बाद से8, एक baculovirus मध्यस्थता विदेशी जीन अभिव्यक्ति प्रणाली व्यापक रूप से अपने उच्च प्रोटीन उत्पादन दक्षता और eukaryotic प्रोटीन प्रसंस्करण क्षमताओं9के कारण कार्यरत किया गया है । यह द्विआधारी प्रणाली दो आवश्यक तत्वों से बना है: निर्माण रिकॉमबिनेंट मेजबान कोशिकाओं में विदेशी जीन देने baculovirus, और रिकॉमबिनेंट baculovirus द्वारा संक्रमित कोशिकाओं द्वारा रुचि प्रोटीन के बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति । पिछले कुछ दशकों में, baculovirus मध्यस्थता सेल अभिव्यक्ति प्रणाली व्यापक रूप से रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के हजारों का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, cytosolic एंजाइमों से झिल्ली को लेकर कीट और स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन बंधे10. हमारे पिछले अध्ययन सफलतापूर्वक इस प्रणाली11के साथ कीट Sf9 कोशिकाओं में एकाधिक CYP450 एंजाइमों व्यक्त किया है । इस अध्ययन में, हम एक carboxylesterase-रिकॉमबिनेंट baculovirus का निर्माण कीट Sf9 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए, अलग permethrin उपचार के लिए सेल सहिष्णुता का पता लगाया, और कार्यात्मक के लिए इन विट्रो में बड़े पैमाने पर व्यक्त carboxylesterase प्रोटीन अन्वेषण. इसके बजाय पिछले अध्ययनों द्वारा अपनाया के रूप में कीट homogenates से कई carboxylesterase isozyme मिश्रण की जांच के12,13, इस baculovirus-मध्यस्थता कीट कोशिका अभिव्यक्ति प्रणाली विशिष्ट अभिव्यक्ति की अनुमति देता है और उनके जैव रासायनिक और संरचनात्मक गुणों के बेहतर लक्षण वर्णन के लिए लक्षित प्रोटीन का अलगाव ।

tetrazolium नमक आधारित परख (MTT) एक उच्च प्रवाह वर्णमिति विधि विकसित और कोशिका व्यवहार्यता को मापने के लिए अनुकूलित है । यह परख तंत्र है कि केवल जीवित कोशिकाओं metabolizing में सक्षम है पर आधारित है पीले रंग का एक काला बैंगनी रंग formazan हाला, जो colorimetrically किया जा सकता है कार्बनिक सॉल्वैंट्स14में भंग के बाद विश्लेषण के लिए MTT एजेंट, 15. कई और अधिक सटीक लेकिन समय लेने वाले तरीकों, जैसे Trypan नीले अपवर्जन और thymidine अनुमापन परख16,17, हाल के वर्षों में विकसित किया गया है । हालांकि, सेल आधारित MTT परख अभी भी वर्तमान में सबसे तेजी से और आसानी से संचालित विधि के रूप में मांयता प्राप्त करने के लिए जल्दी सेल व्यवहार्यता का पता लगाने । यहां, हम कीटनाशक उपचार के खिलाफ सेल सहिष्णुता का पता लगाने के लिए MTT परख का उपयोग करें । कोशिकाओं की बढ़ी हुई सहनशीलता जब carboxylesterase रिकॉमबिनेंट से संक्रमित baculovirus दृढ़ता से कीटनाशकों, जो बारी में कीटनाशक प्रतिरोध में उनकी भागीदारी का पता चलता है के लिए carboxylesterases की चयापचय भूमिकाओं का समर्थन करता है ।

इसके अतिरिक्त, एक इन विट्रो चयापचय परख भी इस अध्ययन में आयोजित किया गया था । सामान्य carboxylesterase परख है कि α-napthyl एसीटेट (α-na) और β-naphthyl एसीटेट (β-na) hydrolytic की carboxylesterases गतिविधियों को प्रतिबिंबित करने के लिए जैसे आम सब्सट्रेट का उपयोग के साथ तुलना में, इन विट्रो चयापचय अध्ययन एक सही तरीका माना जाता है 18कीटनाशकों की ओर carboxylesterases की गतिविधियों को सीधे मापने के लिए । इस विधि सफलतापूर्वक कीटनाशक प्रतिरोध11,19,20के साथ सहयोग में एकाधिक cytochrome P450s की विशेषता के लिए विभिन्न कीड़ों में कार्यरत किया गया है । हालांकि carboxylesterase स्टडीज में इस पद्धति को अभी तक लागू नहीं किया गया है । carboxylesterase baculovirus द्वारा उत्पादित प्रोटीन की उपलब्धता के साथ-मध्यस्थता अभिव्यक्ति प्रणाली, हम एक इन विट्रो में प्रदर्शन कर सकते हैं carboxylesterases की ओर permethrin की चयापचय का अध्ययन, जो आगे की भागीदारी के मजबूत सबूत प्रदान कर सकते हैं घर मक्खियों में pyrethroid प्रतिरोध को carboxylesterases में ।

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Protocol

1. अभिव्यक्ति और एक Baculovirus-मध्यस्थता कीट कोशिका अभिव्यक्ति प्रणाली के साथ लक्ष्य प्रोटीन की अलगाव

  1. दिशाहीन क्लोन कुंद घर मक्खियों से लक्ष्य प्रोटीन की पीसीआर उत्पादों समाप्त हो गया ।
    1. डिजाइन हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की पीसीआर प्राइमरों (GFP) और घर मक्खी MdαE7 जीन उनके दृश्यों और चुना वेक्टर (तालिका 1) की विशेष आवश्यकताओं के आधार पर ।
    2. एक thermostable का उपयोग करें, डीएनए पोलीमरेज़ और प्राइमरों को ठीक करने के लिए 1.1.1 कदम से एक १५० µ l पीसीआर प्रतिक्रिया (30 µ के एल प्रतिक्रिया बफर, 3 µ एल के 10 मिमी dNTPs, १.५ µ के एल के डीएनए पोलीमरेज़, 6 µ एल के घर मक्खी टेम्पलेट डीएनए, ७.५ µ एल फॉरवर्ड प्राइमरी के , रिवर्स प्राइमर के ७.५ µ एल, एक अंतिम मात्रा १५० µ एल के लिए पानी के साथ) । 30 एस के लिए ९८ ° c के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया गर्मी, ९८ ° c के ३५ चक्र के बाद 10 एस के लिए, ५३ ° c 30 s के लिए, और ७२ ° c ६० s के लिए, और फिर एक अंतिम विस्तार पर ७२ ° c 2 मिनट के लिए).
      1. पीसीआर प्रोडक् ट्स की १५० µ l के साथ 1% agarose जेल चलाएं ।
    3. एक्साइज टारगेट डीएनए अंशों को शार्प, क्लीन स्केलपेल के साथ agarose जेल से: १३१७ MdαE7 के लिए बीपी और GFP के लिए ८५८ बीपी । निर्माता के प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिका) के बाद व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जेल निष्कर्षण किट का उपयोग डीएनए शुद्ध । आसुत जल के 15 µ एल में शुद्ध डीएनए भंग ।
    4. शुद्ध डीएनए के 1 µ एल के साथ एक 1% agarose जेल चलाने के लिए अखंडता की जांच । शुद्ध डीएनए के एक और 1 µ एल का उपयोग करने के लिए spectrophotometer के साथ सांद्रता उपाय ।
  2. लक्ष्य प्रोटीन के लिए एक प्रविष्टि प्लाज्मिड का निर्माण
    1. क्लोनिंग रिएक्शन सेट करें । attl-साइटों (सामग्री की मेज) 1:1 के दाढ़ अनुपात (0.5-2 µ एल ताजा पीसीआर उत्पाद के 70-200 एनजी/µ एल सांद्रता: ०.५ µ एल वेक्टर) पर कदम 1.1.3 और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रवेश वैक्टर से ताजा शुद्ध डीएनए उत्पादों मिश्रण । फिर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नमक समाधान के 1 µ एल जोड़ें (१.२ एम NaCl2 और ०.०६ एम MgCl2) और 6 µ एल मिश्रण धीरे और 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी की एक अंतिम मात्रा में पानी जोड़ें ।
    2. हस्तांतरण 4 µ एल क्लोनिंग की प्रतिक्रिया उत्पादों में कदम 1.2.1 में ५० µ एल में रासायनिक सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं । 30 min. Heat-सदमे के लिए बर्फ पर मशीन झटकों के बिना एक ४२ ° c पानी स्नान में 30 एस के लिए कोशिकाओं ।
    3. बर्फ में एक और 2 मिनट के लिए ट्यूब वापस रखो । २५० µ एल जोड़ें कमरे के तापमान S.O.C. मध्यम (2% tryptone; ०.५% खमीर निकालने; 10 मिमी NaCl; २.५ मिमी KCl; 10 मिमी MgCl2; 10 मिमी MgSO4; 20 मिमी ग्लूकोज) । धीरे मिलाते के साथ 1 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    4. 50-200 के चुनिंदा पौंड प्लेटों पर स्टेप 1.2.3 में बैक्टीरियल कल्चर का स्प्रेड µ एल (1 जी ऑफ tryptone; 1 जी ऑफ NaCl; खमीर निकालने के ०.५ ग्राम; १.५ ग्राम का १०० मिलीलीटर में भंग कर दिया । आटोक्लेव और जोड़ें ०.१% के ५० मिलीग्राम/एमएल कनमीसिन) । कॉलोनी विकास के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 16 एच के लिए पौंड प्लेटें ।
    5. 5-10 कालोनियों उठाओ और फिर से उन्हें व्यक्तिगत रूप से आसुत जल के 5 µ l में निलंबित ।
    6. प्रतिक्रिया बफर के 5 µ एल जोड़कर पीसीआर प्रदर्शन, 10 मिमी dNTPs के ०.५ µ एल, ०.२५ µ l के डीएनए पोलीमरेज़, 1 µ l की गय कालोनियों, १.२५ µ l के 10 µ m M13 फॉरवर्ड प्राइमरी, १.२५ µ l के 10 µ m रिवर्स प्राइमरी के लक्ष्य जीन, और 25 µ के अंतिम मात्रा तक पानी l गर्मी पीसीआर 30 एस के लिए ९८ ° c के लिए प्रतिक्रिया, ९८ डिग्री सेल्सियस के ३५ चक्र के बाद 10 एस के लिए, ५३ ° c 30 s के लिए, और ७२ के लिए ° c ६० s, और फिर एक अंतिम विस्तार पर ७२ ° c 2 मिनट के लिए (तालिका 1).
    7. टीबी मीडिया में स्टेप 1.2.5 से निलंबित कालोनियों की री-कल्चर 3 µ एल (१०० एमएल फॉस्फेट बफर की ०.१७ मीटर KH2पीओ4 और ०.७२ m K2HPO4 के साथ ४५० मिलीलीटर के आधार शोरबा 6 ग्राम के tryptone, खमीर के 12 ग्राम और के 2 मिलीलीटर युक्त ग्लिसरॉल, निष्फल, युक्त ०.१% ५० मिलीग्राम/एमएल कनमीसिन) के लिए 16 एच निकालने अल्ट्रा शुद्ध प्लाज्मिड डीएनए के बाद निर्माता के प्रोटोकॉल ।
    8. M13 आगे और रिवर्स प्राइमरों के साथ वाणिज्यिक सैंज अनुक्रमण के लिए कदम 1.2.7 से २०० एनजी/µ एल अल्ट्रा-शुद्ध प्लाज्मिड का प्रयोग करें । वेक्टर में लक्ष्य जीन की सही प्रविष्टि की जांच करें निर्माता द्वारा प्रदान की अनुक्रम नक्शे पर आधारित है ।
    9. -20 ° c में MdαE7 और GFP के अनुक्रम सत्यापित अल्ट्रा-शुद्ध प्लाज्मिड डीएनए नमूने संग्रहीत करें ।
      नोट: ये हैं MdαE7 और GFP के DNA प्लाज्मिड एंट्री.
  3. लैंब्डा पुनर्संयोजन (LR) प्रतिक्रिया प्रदर्शन द्वारा एक रिकॉमबिनेंट baculovirus का निर्माण ।
    1. क्रमशः, ३०० एनजी/µ एल प्रविष्टि प्लाज्मिड डीएनए के GFP, MdαE7 से कदम 1.2.7 या प्रवेश प्लाज्मिड डीएनए के क्लॉरॅंफेनिकोल acetyltransferase जीन (CAT) के 5 अभिकर्मक एल के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है ( µएल साइटों के) के साथ प्रदान की 1 µ एल मिश्रण सी अवधि रैखिक डीएनए २५० µ एल पीसीआर ट्यूबों में ( attआर साइटों युक्त) । जोड़ें ते बफ़र 8 µ की कुल मात्रा बनाने के लिए l
      नोट: GFP और बिल्ली की प्रतिक्रियाओं नियंत्रण समूहों के रूप में इस्तेमाल किया गया ।
    2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लैंब्डा पुनर्संयोजन (lr) एंजाइम मिश्रण (सामग्री की तालिका) के 2 µ एल कदम 1.3.1 के प्रत्येक मिश्रण में LR प्रतिक्रिया उत्प्रेरित के लिए जोड़ें । धीरे मिश्रण और 25 डिग्री सेल्सियस रात भर में गर्मी (≈ 16 एच) ।
      नोट: LR प्रतिक्रिया एक attएल के संयोजन की सुविधा एक attआर के साथ प्रवेश प्लाज्मिड डीएनए युक्त-सी अवधि के रैखिक डीएनए एक attबी-युक्त वायरस को पैदा करने वाले उत्पंन करने के लिए । यह कदम प्रत्येक लक्ष्य प्रोटीन के लिए रिकॉमबिनेंट baculovirus पैदा करता है ।
    3. कदम 1.3.2 20X से LR प्रतिक्रिया उत्पादों की 1 µ एल पतला । एक Polyhedrin आगे प्राइमर और V5 रिवर्स प्राइमर (तालिका 1) का उपयोग कर पीसीआर प्रदर्शन । एक 1% agarose जेल गुणवत्ता की जांच करने के लिए चलाने के लिए पीसीआर उत्पादों के 5 µ l का उपयोग करें । चित्रा 1 MdαE7 जीन से LR प्रतिक्रिया उत्पाद का एक उदाहरण से पता चलता है ।

Figure 1
चित्रा 1: पीसीआर विश्लेषण द्वारा MdαE7 LR प्रतिक्रिया के उदाहरण के परिणाम । LR प्रतिक्रिया २०० के 2 µ l पतला-गुना और Polyhedrin आगे प्राइमर और V5 रिवर्स प्राइमर के साथ एक साथ कमजोर पड़ने के 2 µ एल का उपयोग करने के लिए एक 25 µ एल पीसीआर प्रदर्शन । LR प्रतिक्रिया की गुणवत्ता की जांच करने के लिए 1% agarose जेल चलाने के लिए पीसीआर उत्पादों के 5 µ एल का प्रयोग करें । ए

  1. Transfect कीट Sf9 कोशिकाएं
    1. संस्कृति कीट Sf9 कोशिकाओं की 5 मिलीलीटर के साथ पूर्ण सेल विकास मध्यम (सीरम मुक्त मध्यम के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)) T25 में कुप्पी इलाज 27 ˚ C.
    2. ताजा पूरा सेल विकास माध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ supernatant और फ्लश नीचे संलग्न कोशिकाओं को निकालें । एक नई कुप्पी इलाज T25 में पुनः निलंबित कोशिकाओं के ०.५ मिलीलीटर स्थानांतरण । ४.५ मिलीलीटर का पूर्ण विकास मध्यम जोड़ें । अगले हस्तांतरण तक 3-4 दिनों के लिए 27 ° c पर मशीन ।
    3. बीज लॉग-चरण वृद्धि कीट Sf9 कोशिकाओं संस्कृति (≈ 3.0-5.0 × 106 कोशिकाओं) के समान रूप से सेल संस्कृति पर अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर । कोशिकाओं को हुड में कमरे के तापमान पर कम से 3 ज के लिए संलग्न करने की अनुमति दें ।
    4. 250X पर एक औंधा चरण माइक्रोस्कोप के साथ देख कर सेल लगाव की जाँच करें । सेल संस्कृति मध्यम निकालें और अनुग्रह कीट मध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें ।
    5. तैयार अभिकर्मक मिश्रण एक समाधान (8 µ वाणिज्यिक उपलब्ध सेल संक्रमण रिएजेंट के एल (सामग्री की मेज) के साथ १०० है अनुग्रह कीट के माध्यम से µ एल) और अभिकर्मक मिश्रण बी प्रत्येक लक्ष्य जीन के समाधान (9 µ के एल LR प्रतिक्रिया उत्पाद से कदम १.३ १०० µ एल के साथ पूरक है अनुग्रह कीट मध्यम) में १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों, क्रमशः ।
    6. धीरे ट्यूबों के दोहन से अभिकर्मक मिश्रण ए और बी एक साथ मिश्रण । हुड में ३५ मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    7. समान रूप से कदम 1.4.4 से बीज उठाया कोशिकाओं पर कदम 1.4.6 dropwise से मिश्रण जोड़ें । 27 डिग्री सेल्सियस रात में टेप और गर्मी के साथ कुओं सील ।
    8. पूर्ण विकास मध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ अनुग्रह कीट मध्यम के 2 मिलीलीटर बदलें । एक अच्छी तरह से गैर-रिकॉमबिनेंट baculovirus के खिलाफ नकारात्मक चयन करने के लिए १०० µ एम ganciclovir जोड़ें । ७२ एच के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर टेप और मशीन के साथ कुओं सील ।
    9. एक अच्छी तरह से और १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों के लिए स्थानांतरण से ७२ एच पोस्ट संक्रमण सेल संस्कृति माध्यम लीजिए । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १,५०० x g पर केंद्रापसारक कोशिकाओं या बड़े मलबे को दूर करने के लिए ।
    10. नए १.५ एमएल केंद्रापसारक ट्यूबों में supernatant स्थानांतरण । प्रकाश से सुरक्षा के साथ उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
      नोट: इन P1 वायरस प्रत्येक लक्ष्य जीन के लिए स्टॉक समाधान कर रहे हैं ।
    11. बढ़ाना कम-titer P1 वायरल स्टॉक (1 × 105-1 × 106 pfu/एमएल) एक उच्च titer P2 वायरल शेयर करने के लिए (5 × 107-1 × 108 pfu/एमएल) ।
    12. बीज लॉग-चरण वृद्धि कीट Sf9 कोशिकाओं संस्कृति (≈ 3.0-5.0 × 106 कोशिकाओं) के समान रूप से सेल संस्कृति पर अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर । कोशिकाओं को हुड में कमरे के तापमान पर कम से 3 ज के लिए संलग्न करने की अनुमति दें ।
    13. Inoculate 5 µ एल P1 वायरस स्टॉक के चरण 1.4.10 में प्राप्त कक्ष में चरण 1.4.12, क्रमशः के अच्छी तरह से बीज । फिर, जोड़ें १०० µ एम ganciclovir प्रत्येक अच्छी तरह से । सील कुओं और ७२ एच के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
    14. ७२ एच पद संक्रमण के P2 वायरस स्टॉक समाधान लीजिए । प्रकाश से सुरक्षा के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
      नोट: इन प्रत्येक लक्ष्य जीन के लिए P2 वायरस स्टॉक समाधान कर रहे हैं ।
    15. वैकल्पिक दोहराएं कदम 1.4.12-1.4.14 P2 वायरस शेयर के 5 µ एल के साथ पी पी पी वायरस स्टॉक समाधान इकट्ठा ।
      नोट: ये प्रत्येक लक्ष्य जीन के लिए पी पी पी वायरस स्टॉक समाधान कर रहे हैं ।
    16. प्रकाश से सुरक्षा के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी निर्माण baculovirus की दुकान ।
      नोट: GFP और कैट जीन नियंत्रण समूह के रूप में कार्य किया गया । चित्रा 2 अलग प्रवर्धन चरणों में GFP-रिकॉमबिनेंट baculovirus द्वारा संक्रमित जब कोशिकाओं के लक्षण दिखाई दिया ।

Figure 2
चित्रा 2: अलग baculovirus प्रवर्धन चरणों में Sf9 कोशिकाओं के संक्रमित लक्षण का उदाहरण । यह आंकड़ा प्राकृतिक प्रकाश और फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत GFP-रिकॉमबिनेंट baculovirus कोशिकाओं को दिखाता है । P1 संक्रमण के स्तर पर, संक्रमण अनुपात कम है । P2 संक्रमण के स्तर पर, संक्रमण अनुपात काफी बढ़ाया गया था । पी पी संक्रमण चरण में, लगभग सभी कोशिकाओं सेल संस्कृति प्लेट से टुकड़ी के लक्षण दिखाई, सेल व्यास के बढ़ जाती है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल विकास की समाप्ति । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. कीट Sf9 कोशिकाओं में लक्ष्य प्रोटीन की बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति
    1. संस्कृति T25 गैर में पूर्ण विकास मध्यम के साथ लॉग चरण वृद्धि कीट Sf9 कोशिकाओं के 10 मिलीलीटर इलाज कुप्पी ।
    2. P2 वायरस स्टॉक समाधान की २०० µ l जोड़ें (चरण 1.4.14 में प्राप्त) के लिए चरण 1.5.1 में संक्रमित सेल संस्कृतियों के लिए ७२ h.
    3. ७२ एच पोस्ट इंफेक्शन सेल कल्चर मीडियम लीजिए. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १,५०० x g पर केंद्रापसारक ।
    4. supernatant और धो छर्रों दो बार ०.१ मीटर पंजाबियों बफर (पीएच ७.५) के 1 मिलीलीटर के साथ त्यागें ।
    5. पूरी तरह से कीट सेल प्रोटीन निष्कर्षण और lysis बफर (सामग्री की तालिका) के 1 मिलीलीटर के साथ सेल छर्रों को भंग । कक्ष lysis में 10% ग्लिसरॉल जोड़ें । पर तुरंत स्टोर-८० ° c ।
    6. दोहराएँ कदम 1.5.1-1.5.5 के साथ P2 वायरस स्टॉक समाधान बिल्ली प्रोटीन के रूप में सेवा करने के लिए नियंत्रण समूह.
      नोट: दोहराएँ चरण १.५ तपसिल में विभिन्न प्रोटीन की तैयारी के लिए.

2. एक सेल आधारित MTT Cytotoxicity परख

  1. संस्कृति लॉग चरण वृद्धि के 5 मिलीलीटर (1.5-2.5 × 106 कोशिकाओं/T25 गैर-इलाज कुप्पी में पूर्ण विकास माध्यम के साथ कीट Sf9 कोशिकाओं ।
  2. जोड़ें 25 µ P1 वायरस स्टॉक समाधान की l (चरण 1.4.14 में प्राप्त) के लिए चरण २.१ में संक्रमित सेल संस्कृतियों के लिए ४८ एच के साथ कोमल मिलाते हुए 27 ˚ C.
  3. acetonitrile में १०० mM permethrin स्टैंडर्ड स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें । ५० mm, 25 mm, १२.५ mm और ६.२५ mm को पतला करने के लिए acetonitrile का प्रयोग करें ५०० µ एल, २५० µ एल, १२५ µ एल और ६२.५ µ एल permethrin स्टॉक सॉल्यूशन को क्रमशः १,००० µ l की कुल मात्रा में जोड़कर ।
  4. समान रूप से बीज २०० संक्रमित सेल संस्कृतियों के µ एल से कदम २.२ के साथ पूरक है ३०० µ एल में पूर्ण विकास मध्यम के 24-अच्छी तरह से थाली में एक घनत्व पर 2 × 105 कोशिकाओं/
  5. permethrin मानक समाधान के 4 µ एल जोड़ें (६.२५ मिमी, १२.५ मिमी, 25 मिमी और ५० मिमी) प्रत्येक अच्छी तरह से एक अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए ५० µ मीटर, १०० µ एम, २०० µ मीटर और ४०० µ एम, क्रमशः. केवल सेल व्यवहार्यता गणना (चित्रा 3) के लिए कुओं में acetonitrile के 4 µ एल जोड़ें ।
  6. प्रकाश से सुरक्षा के साथ ४८ घंटे के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर टेप और गर्मी के साथ प्लेटें सील ।
  7. तैयार 5 मिलीग्राम/एमएल MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium ब्रोमाइड) एजेंट बफर में भंग (NaCl के २.० ग्राम, ०.०५ के g लए KCl, ०.३६ के g लए णः2पो4∙ 2H2O, ०.२८ g के णः2पो4, ०.०५ गाम के KH2PO4 भंग के २०० मिलि में आसुत पानी, पीएच ७.५) ।
  8. सेल संस्कृति माध्यम से चरण २.६ के बाद ४८ एच के लिए नीचे संलग्न कोशिका परत को छूने के बिना मशीन से निकालें । जोड़ें २०० µ एल MTT एजेंट के चरण २.७ में एक अच्छी तरह से । एक अच्छी तरह से (चित्रा 3) में गठित गहरे बैंगनी formazan हाला तक 4 ज के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
  9. 4 एच के लिए ३७ ° c में गर्मी जब तक गहरे बैंगनी formazan एक अच्छी तरह से हाला के रूप में । DMSO के ५०० µ l को पूर्णत: भंग करने वाली हाला (figure 3) में जोड़ें ।

Figure 3
चित्रा 3: MTT परिणाम का उदाहरण । के बाद ४८ कैट रिकॉमबिनेंट baculovirus समाधान के P1 वायरस स्टॉक समाधान के साथ पद संक्रमण, समान रूप से बीज ५०० µ एल एक 24-अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में बिल्ली जीन एक्सप्रेस कोशिकाओं । क्रमशः ५० µ मीटर, १०० µ मीटर, २०० µ मीटर और ४०० µ एम को अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए प्रत्येक पंक्ति में एक अलग खुराक (६.२५ मिमी, १२.५ मिमी, 25 मिमी और ५० मिमी) में 4 µ एल permethrin जोड़ें । नियंत्रण पंक्ति केवल acetonitrile और प्लेट में CK के रूप में चिह्नित के साथ इलाज किया गया था । (A) 27 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के ४८ ज के बाद, ऊपरी परत पर सेल संस्कृति माध्यम त्यागें और पीले रंग के MTT रिएजेंट के २०० µ l से प्रतिस्थापित करें । फिर ३७ ° c में ४८ एच के लिए मशीन । गहरे बैंगनी रंग की कमी प्रत्येक अच्छी तरह से संकेत है कि अस्तित्व की कोशिकाओं को काले बैंगनी रंग के रंगीन वेग में पीले रंग MTT रिएजेंट metabolizing करने में सक्षम है में एक प्रकार की हाला । (ख) DMSO विलायक के ५०० µ एल का गठन हाला को भंग करने के लिए एक अच्छी तरह से जोड़ा गया था । प्रत्येक कुआं का अवशोषक मूल्य ५४० एनएम पर spectrophotometer द्वारा पाया गया । जैसे-जैसे permethrin सांद्रता बढ़ती है वैसे-वैसे ही रंग डार्क रेड से हल्के लाल से धीरे से बदल जाएगा, सुझाव है कि कोशिका viabilities में धीरे-धीरे कमी आए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. ९६-अच्छी तरह से थाली में भंग समाधान के २०० µ एल स्थानांतरण । उपाय ५४० एनएम पर अवशोषक मूल्यों एक microplate रीडर (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर ।
  2. केवल acetonitrile इलाज कोशिकाओं के उन लोगों के साथ permethrin इलाज कोशिकाओं के अवशोषक मूल्यों की तुलना करके सेल व्यवहार्यता की गणना ।
  3. नियंत्रण समूह के लिए, चरण १.४ में प्राप्त क्लॉरॅंफेनिकोल acetyltransferase (CAT) रिकॉमबिनेंट baculovirus के P2 वायरस स्टॉक समाधान के साथ सभी चरणों को दोहराएँ ।
  4. विभिन्न वायरस की तैयारी के लिए 4 बार दोहराएँ.

3. इन विट्रो में मेटाबोलिक परख

  1. acetonitrile में १०० mM permethrin स्टैंडर्ड स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें । ५० mm, 25 mm, १२.५ mm और ६.२५ mm को पतला करने के लिए acetonitrile का प्रयोग करें । HPLC का उपयोग कर प्रत्येक एकाग्रता के तहत इसी चोटी क्षेत्र का पता लगाने । बनाएँ और विभिन्न permethrin सांद्रता के साथ शिखर क्षेत्र के आधार पर permethrin के मानक वक्र की गणना ।
  2. ब्रैडफोर्ड तरीकों21के साथ कदम १.५ में प्रोटीन सांद्रता उपाय ।
  3. ४० µ m permethrin मानक और 1 ०.२ m Tris-HCl बफर (pH ७.४) में भंग १.५ चरण में प्राप्त प्रोटीन की मिलीग्राम के साथ चयापचय प्रतिक्रिया के ७०० µ एल तैयार करें । कोमल मिलाते के साथ 2 एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर मशीन । प्रकाश से रक्षा करना ।
  4. बर्फ-शीत acetonitrile के ७०० µ l को जोड़कर प्रतिक्रिया को बुझाएं । कोमल मिलाते के साथ एक और 30 मिनट के लिए 30 ˚ सी में मशीन । प्रकाश से रक्षा करना ।
  5. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए १६,००० एक्स जी में प्रतिक्रिया मिश्रण केंद्रापसारक । एक ०.४५ µm झिल्ली के माध्यम से supernatant और फिल्टर ले लीजिए । HPLC विश्लेषण के लिए ultraclean ब्राउन ग्लास शीशियों में निस्पंदन स्थानांतरण ।
  6. इष्टतम क्रोमेटोग्राफिक शर्तों के तहत HPLC भागो (मोबाइल चरण एक: ९०% acetonitrile और 10% पानी; मोबाइल चरण बी: 5% acetonitrile ८५% फास्फोरस एसिड के साथ पीएच २.३ के लिए समायोजित) । २३२ एनएम की तरंग दैर्ध्य पर 1 मिलीलीटर/मिन और माप की एक प्रवाह दर के साथ ढाल elute ।
  7. प्रोटीन नमूने के बिना प्रतिक्रियाओं के साथ तुलना द्वारा permethrin के घट प्रतिशत की गणना जोड़ा ।
  8. का प्रयोग करें बिल्ली प्रोटीन कदम 1.5.6 में प्राप्त करने के लिए नियंत्रण के रूप में सेवा ।
  9. चरण 1.5.7 में विभिन्न प्रोटीन तैयारी के साथ सभी चरणों को दोहराएँ ।

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Representative Results

विभिंन permethrin उपचार की ओर सेल व्यवहार्यता (MTT परख)

permethrin के cytotoxicity में MdαE7-रिकॉमबिनेंट baculovirus संक्रमित Sf9 कोशिकाओं (प्रयोगात्मक समूह) और कैट-रिकॉमबिनेंट baculovirus (baculovirus संक्रमित किट द्वारा प्रदत्त) संक्रमित कोशिकाओं (नियंत्रण समूहों) की जांच की गई । MdαE7 व्यक्त कोशिकाओं में permethrin करने के लिए बढ़ाया सेल सहिष्णुता दृढ़ता से कीटनाशकों के खिलाफ इस carboxylesterase की चयापचय भूमिकाओं का समर्थन और इस प्रकार रासायनिक नुकसान से कोशिकाओं की रक्षा. हमारे अध्ययन में, अलग permethrin सांद्रता (५०, १००, २०० और ४०० µ मीटर) के खिलाफ कोशिका व्यवहार्यता की तुलना में अकेले acetonitrile के साथ इलाज कोशिकाओं की गणना की गई । हमारे परिणामों से पता चला है कि MdαE7 व्यक्त कोशिकाओं की व्यवहार्यता काफी अधिक था (८६.००% से १०१.९२% से लेकर) (चित्रा 4B) नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में (६७.५९% से लेकर ८१.४३%) (चित्र 4a) जब विभिंन सांद्रता में permethrin को उजागर, कीट कोशिकाओं में metabolizing permethrin में MdαE7 की महत्वपूर्ण भूमिकाओं का संकेत है ।

Figure 4
चित्रा 4: विभिन्न permethrin उपचार के अंतर्गत कीट Sf9 कोशिकाओं की viabilities. (क) CAT रिकॉमबिनेंट baculovirus द्वारा संक्रमित नियंत्रण कोशिकाओं की व्यवहार्यता (ख) MdαE7 रिकॉमबिनेंट baculovirus से संक्रमित प्रयोगात्मक कोशिकाओं की व्यवहार्यता. प्रत्येक permethrin एकाग्रता के लिए चार प्रतिकृतियां आयोजित की गई । डाटा मतलब ± SEM के रूप में दिखाया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए

इन विट्रो चयापचय permethrin के द्वारा MdαE7

Permethrin चयापचय एक ४० µ एम Permethrin मानक समाधान एक साथ MdαE7 संक्रमित Sf9 कोशिकाओं से निकाले प्रोटीन के साथ मशीन द्वारा परख की थी । बिल्ली प्रोटीन के साथ प्रतिक्रियाओं नियंत्रण के रूप में सेवा की । permethrin के घट प्रतिशत एंजाइम के बिना प्रतिक्रियाओं के साथ तुलना में जोड़ा गणना की गई । प्रतिक्रियाओं एक १२० मिन मशीन अवधि के बाद रिवर्स चरण HPLC द्वारा निगरानी की गई । permethrin मानक के बाद से वास्तव में सीआईएस का एक मिश्रण है और ट्रांस-isomers, दो चोटियों HPLC क्रोमेटोग्राफिक प्रोफाइल में मनाया गया, ट्रांस-permethrin और सीआईएस-permethrin के लिए १०.६७ मिनट और १०.८७ मिनट के रेफरेंस टाइम्स के साथ क्रमशः (चित्रा 5) । MdαE7 प्रोटीन द्वारा permethrin का घट प्रतिशत (39.18 ± 3.78%) कैट प्रोटीन की तुलना में काफी अधिक था (7.29 ± 0.81%) (चित्रा 6), जो न केवल MTT परिणामों के अनुरूप है बल्कि सीधे metabolizing permethrin इन विट्रोमें MdαE7 की क्षमताओं को दर्शाता है ।

Figure 5
चित्रा 5: permethrin मानक के HPLC प्रोफ़ाइल । इस अध्ययन में प्रयुक्त permethrin मानक ट्रांस-permethrin और सीआईएस-permethrin isomers का मिश्रण है । लाल तीर ट्रांस-permethrin isomer और सीआईएस-permethrin isomer, क्रमशः के लिए चोटियों से संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: इन विट्रो MdαE7 और कैट रिकॉमबिनेंट प्रोटीन द्वारा permethrin के चयापचय । MdαE7 और बिल्ली प्रोटीन द्वारा permethrin के घट प्रतिशत की गणना की गई । प्रत्येक permethrin एकाग्रता के लिए तीन प्रतिकृतियां आयोजित की गई । डाटा मतलब ± SEM के रूप में दिखाया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए

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Discussion

हाल के दशकों में, heterologous अभिव्यक्ति प्रणालियों को व्यापक रूप से व्यक्त किया गया है और प्रोटीन की बड़ी मात्रा को अलग, इस प्रकार जैव रासायनिक और कार्यात्मक निर्धारण और इन विट्रो मेंएंजाइमों के लक्षण वर्णन की अनुमति । तारीख करने के लिए, कई अलग ई कोलाई, पिच्या pastoris, Sacccharomyces cerevisiae, और धब् frugiperda सहित मॉडल प्रणालियों रिकॉमबिनेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित किया गया है, और की पसंद इन विट्रो प्रणाली में रुचि प्रोटीन के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है22,23,24,25. हमारे अध्ययन में, baculovirus-मध्यस्थता कीट कोशिका अभिव्यक्ति प्रणाली घर मक्खी carboxylesterases उत्पन्न करने के लिए चुना गया था क्योंकि यह कीट कोशिकाओं के लिए एक समान intracellular वातावरण प्रदान करता है और कुछ महत्वपूर्ण eukaryotic प्रसंस्करण क्षमताओं का कहना है . baculovirus-मध्यस्थता वाली व्यक्त प्रणाली के फायदों के बावजूद उसकी सीमाएँ भी संबोधित की जानी चाहिए. baculovirus-मध्यस्थता कीट कोशिका अभिव्यक्ति प्रणाली लक्ष्य प्रोटीन का उत्पादन कर सकते हैं केवल अगर कीट कोशिकाओं का निर्माण रिकॉमबिनेंट baculovirus से संक्रमित थे. छुरा बदल कीट सेल लाइनों बनाने के मौजूदा विकास यह न केवल constitutively baculovirus संक्रमण के अभाव में रुचि प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए संभव बना दिया है, लेकिन यह भी glycosylating और तह की कोशिका क्षमताओं में सुधार करने के लिए इंजीनियरिंग संशोधनों के माध्यम से प्रोटीन जनित9.

बेहतर कोशिकाओं में metabolizing कीटनाशकों में carboxylesterases की भूमिकाओं की जांच करने और इस प्रकार रासायनिक नुकसान से कोशिकाओं की रक्षा, MTT परख के लिए अलग permethrin उपचार के खिलाफ सेल cytotoxicity उपाय आयोजित किया गया था । इस प्रक्रिया के दौरान, सेल चयापचय के साथ जुड़े प्रयोगात्मक मापदंडों का एक बहुत, जैसे सेल माध्यम रचनाओं, सेल विकास दर, एकाग्रता और खपत ऊर्जा की आपूर्ति चयापचयों, MTT कमी को प्रभावित कर सकते हैं और इस तरह गलत करने के लिए नेतृत्व परिणाम. करने के लिए MTT परख के अधिक/अनुमान को कम करने के लिए, सेल संस्कृति मध्यम, सेल विकास राज्य रखने के लिए, और गर्मी अलग प्रयोगात्मक उपचार के बीच सुसंगत स्थिति26। आदेश में कोशिका व्यवहार्यता baculovirus संक्रमण की वजह से permethrin की वजह से प्रभाव का निर्धारण करने के लिए, हमें पता चला है कि संक्रमण की प्रक्रिया GFP-रिकॉमबिनेंट baculovirus कीट Sf9 कोशिकाओं के लिए, और पाया कि P2 संक्रमण की अवस्था में, कोशिकाओं को सबसे अधिक है अन्य संक्रमण चरणों (चित्रा 2) के साथ तुलना में सबसे कम कोशिका मृत्यु अनुपात के साथ संक्रमण अनुपात. यह बेहतर P2 संक्रमण चरण में कोशिकाओं को चुनने के कारण MTT परख आचरण की व्याख्या कर सकते हैं ।

कोशिकाओं के viabilities की तुलना करके जब MdαE7 से संक्रमित-और बिल्ली-रिकॉमबिनेंट baculovirus एक MTT अध्ययन में, हम कोशिकाओं की एक बढ़ाया व्यवहार्यता जब MdαE7 प्रोटीन व्यक्त, जो बेहतर carboxylesterases की चयापचय भूमिकाओं permethrin के लिए समर्थन कर सकते है पाया कीट कोशिकाओं में और रासायनिक क्षति (चित्रा 4) से कोशिकाओं की रक्षा । इन विट्रो चयापचय अध्ययन, जो एक प्रत्यक्ष विधि के रूप में पहचाना जाता है कीटनाशकों की ओर carboxylesterases की चयापचय क्षमताओं को प्रतिबिंबित करने के लिए, बेहतर निस्र्पक प्रोटीन में MTT परख की सीमाओं की क्षतिपूर्ति करने के लिए भी पता लगाया जाना चाहिए चयापचय कार्यों ।

इस अध्ययन में, एक baculovirus-मध्यस्थता अभिव्यक्ति प्रणाली के साथ कीट Sf9 कोशिकाओं में carboxylesterases की heterologous अभिव्यक्ति, viabilities परख द्वारा विभिन्न permethrin उपचार की ओर कोशिका MTT की माप, और के लक्षण वर्णन carboxylesterases के माध्यम से इन विट्रो चयापचय परख सब एक साथ काम करने के लिए एक व्यवस्थित, वैज्ञानिक और सही रणनीति कीड़ों में detoxification एंजाइमों की भूमिकाओं की जांच प्रदान करने के लिए, इस प्रकार कीटनाशक की एक बेहतर समझ की सुविधा प्रतिरोध तंत्र और इस प्रकार कीट प्रबंधन के लिए अभिनव रणनीतियों का विकास ।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs inc. M0491L
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen by life technology K240020 S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen by life technology K210002
Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits Invitrogen by life technology 11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit Invitrogen by life technology 12562-019 Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit
pENTR-CAT plasmid Invitrogen by life technology Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL
Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified Gibco by Life Technologies 10082-139
Sf9 cells in Sf-900 III SFM Gibco by Life Technologies 12659017
Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer G Biosciences by A Geno Technology Inc 786-411
Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete Gibco by Life Technologies 12658-019
Grace's Insect Medium, unsupplemented Gibco by Life Technologies 11595030
Permethrin (isomers) analytical standard SUPELCO by Solutions WithinTM 442748
Methanol (analytical graded) Sigma-Aldrich 67-56-1
Acetonitrile (analytical graded) Sigma-Aldrich 75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) Pall Life Sciences 21890388
Alliance Waters 2695 HPLC System Waters
T100 Thermal Cycle Bio-Rad Laboratories Inc. 1861096
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek

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References

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