殺虫剤抵抗性イエバエ、イエバエのカルボキシルエステラーゼの機能特性

Biochemistry

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Summary

ここでは、プロトコルを提案家フライ カルボキシルエステラーゼ タンパク質の in vitroバキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系を生成し、後で機能的、それにより代謝ペルメトリンの役割を特徴づけるピレスロイドを授与セルベースの MTT アッセイと体外代謝研究を行うことにより抵抗。

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Feng, X., Liu, N. Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica. J. Vis. Exp. (138), e58106, doi:10.3791/58106 (2018).

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Abstract

カルボキシルエステラーゼを介した代謝は、さまざまな昆虫の殺虫剤抵抗性に大きな役割を果たすと考えられます。いくつかのカルボキシルエステラーゼ遺伝子は、探検するために殺虫剤耐性での役割が残っているに対し、抵抗性イエバエ フライひずみの調整を発見されました。ここでは、我々 はカルボキシルエステラーゼの機能解析のためのプロトコルを設計しました。3 つの例の実験を紹介する: (1) 式とバキュロ ウイルス媒介昆虫ハスモンヨトウ frugiperda (Sf9) セル式システムによるカルボキシルエステラーゼ タンパク質の分離(2) の細胞ベースの MTT (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-イル]-2, 5-diphenyltetrazolium ブロマイド) 異なるペルメトリン治療昆虫細胞の耐性を測定する細胞毒性アッセイ(3)の in vitro代謝の研究ペルメトリンに向かってカルボキシルエステラーゼの代謝機能を調査します。MdαE7 抵抗性イエバエから複製されたカルボキシルエステラーゼ遺伝子系統 ALHF を飛ぶし、Sf9 細胞感染の組換えバキュロ ウイルスを作成するために使用します。異なるペルメトリン治療に対してセル目は、MTT アッセイを測定しました。パーメスリン抵抗性制御グループ (猫組換えバキュロ ウイルス感染細胞と GFP 遺伝子組換えバキュロ ウイルス感染細胞) の比較実験グループ (MdαE7 組換えバキュロ ウイルス感染細胞) の高められた細胞トレランス治療は、それにより化学損傷から細胞を保護する殺虫剤の代謝で MdαE7 の機能を提案しました。それに加えて、カルボキシルエステラーゼ蛋白質は昆虫 Sf9 細胞で発現され分離体外代謝研究を行うこと。かなりの in vitro代謝効率 MdαE7 のペルメトリン、殺虫剤の代謝でカルボキシルエステラーゼの関与を示す直接の方が示唆し、飛ぶため殺虫剤抵抗性の家を授与します。

Introduction

殺虫剤抵抗性は現在家はえ制御世界中1,2の主要な問題であります。殺虫剤抵抗性のメカニズムを容易にこの問題のより良い理解を決定するため、新しい戦略を効果的に防止したり、抵抗の開発3の拡散を最小限に努力。カルボキシルエステラーゼ、主要な解毒酵素の一つとして、多くの隔離と様々 な昆虫4,5,6の殺虫剤の代謝における役割のため注目を集めています。私たちの以前の研究は家のハエで複数カルボキシルエステラーゼを識別しているの発現量恒常耐性 ALHF 株にまで規制がありませんがまたペルメトリン治療7 への応答で高い誘導のレベルをすることができます。.ただし、殺虫剤の代謝におけるこれらのカルボキシルエステラーゼ遺伝子の機能的な特徴は、探検するために残ります。

初期の 1980 年代8の最初のレポート以来高蛋白質生産効率性真核生物のタンパク質のプロセッシング機能9バキュロ ウイルスを介する遺伝子発現システムに広く採用されています。このバイナリ システムは 2 つの本質的な要素で構成される: 構築された組換えバキュロ ウイルスの宿主細胞と遺伝子組換えバキュロ ウイルスによる感染細胞による興味のあるタンパク質の大量発現に外国の遺伝子を提供します。過去十年にわたってバキュロ ウイルス媒介電池式システムは、組換えタンパク質、細胞質酵素から昆虫の膜結合型蛋白質に至るまでの数千を生成する広く使用されています、哺乳類細胞の10。私たちの以前の研究は正常にこのシステム11Sf9 昆虫細胞での複数の CYP450 酵素を表明しています。本研究で我々 は Sf9 昆虫細胞に感染するカルボキシルエステラーゼ組換えバキュロ ウイルスを構築、異なるペルメトリン治療し、大規模な表現カルボキシルエステラーゼ タンパク質の in vitroの免疫寛容を検討機能探査。以前研究12,13で採択された「昆虫ホモジュネートからの複数のカルボキシルエステラーゼ アイソザイムの混合物を調査して、代わりこのバキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系により特定の式とターゲットタンパク質の生化学的および構造特性より良い評価のための分離。

テトラゾリウム塩を用いた測定 (MTT) は、高スループットの比色定量法を開発し、細胞生存率を測定するために最適化されました。このアッセイは、生細胞のみがこの分析できる有機溶剤14に溶解した後、暗い紫色着色された塩の沈殿物に黄色の MTT の試薬を代謝できるメカニズムに基づいています 15。トリパン ブルー色素排除とチミジン滴定分析16,17などの時間のかかる方法がより正確なのいくつかは近年開発されています。ただし、MTT の細胞に基づく試金はまだ現在、細胞生存率を迅速に検出する最も迅速かつ簡単に操作の方法として認識されます。ここでは、MTT の試金を使用殺虫剤の治療に対して免疫寛容を探索します。強くカルボキシルエステラーゼ組換えバキュロ ウイルスに感染している場合に、セルの強化されたトレランスは、順番で殺虫剤抵抗性への関与を示唆している殺虫剤、カルボキシルエステラーゼの代謝の役割をサポートします。

さらに、体外代謝アッセイは、この研究も行われました。カルボキシルエステラーゼの加水分解の活動を反映するように α ラウリン酢酸 (α-NA) と β-ナフチル酢酸 (β-NA) などの一般的な基材を使用して一般的なカルボキシルエステラーゼの試金と比較して、体外代謝研究は正確な方法とみなされる殺虫剤18に向かってカルボキシルエステラーゼの活動を直接測定します。このメソッドは正常に様々 な昆虫の殺虫剤抵抗11,19,20協会における複数チトクロム p450 の特性評価に採用されています。ただし、このメソッドがまだ適用されていないカルボキシルエステラーゼの研究。バキュロ ウイルスによる発現システムによって生成するカルボキシルエステラーゼ タンパク質の可用性、我々 の関与の強力な証拠を提供することができます。 さらにペルメトリンに向かってカルボキシルエステラーゼの体外代謝研究を実行できます。ピレスロイド耐性を家の中でカルボキシルエステラーゼのハエします。

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Protocol

1 式とバキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系が付いているターゲット蛋白質の分離

  1. 方向家のハエからターゲット蛋白質の鈍終了 PCR の製品をクローンします。
    1. 緑色蛍光タンパク質 (GFP) の PCR プライマーとその系列と選択したベクトル (表 1) の特別な要件に基づく家フライ MdαE7 遺伝子をデザインします。
    2. 耐熱性、校正の DNA ポリメラーゼとステップ 1.1.1 からのプライマーを使用して 150 μ L の PCR 反応 (30 μ L 反応バッファーの 10 mM dNTPs、DNA ポリメラーゼの 1.5 μ L、家フライ テンプレート DNA、前方のプライマーの 7.5 μ L の 6 μ 3 μ L を実行、最終巻 150 μ L を水の逆プライマーの 7.5 μ L)。30 98 ° C まで PCR 反応を熱 10 98 ° C の 35 サイクルに続いて s s、53 ° C、30 s、および 60 のための 72 ° C s、および、2 分のための 72 ° C で最後の拡張)。
      1. PCR の製品の 150 μ L で 1% の agarose のゲルを実行します。
    3. シャープ、きれいなメスとゲルの agarose からターゲット DNA のフラグメントの物品税: 1317 bp MdαE7、858 の GFP の bp。次の製造元のプロトコル (材料表) 市販ゲル抽出キットを使用して DNA を浄化します。15 μ L の蒸留水に精製した DNA を溶解します。
    4. 整合性をチェックする浄化された DNA の 1 μ L で 1% の agarose のゲルを実行します。分光光度計で濃度を測定するため精製 DNA の別の 1 μ L を使用します。
  2. ターゲット蛋白質のエントリ プラスミドを構築します。
    1. クローンの反応を設定します。ミックス新鮮な精製ステップ 1.1.3 から DNA 品と市販のエントリは、1:1 のモル比で含むattL サイト (材料表) をベクトル (0.5-2 μ L 70-200 ng/μ L の濃度で新鮮な PCR の製品の: 0.5 μ L ベクトル)。(1.2 M NaCl2と 0.06 M MgCl2) 市販の塩溶液 1 μ L を追加し、6 μ L の最終巻に水を加え軽く混合し、1 時間室温で孵化させなさい。
    2. 1.2.1 ステップイン化学的に有能なエシェリヒア属大腸菌の 50 μ L で反応生成物をクローンの 4 μ L を転送細胞。氷上で 30 分間熱ショック 30 細胞をインキュベートを振ることがなく 42 ° C の水浴の s。
    3. 部屋の温度まで媒体 (2% トリプトン 0.5% 酵母エキス 10 mM NaCl; 2.5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4; 20 mM グルコース) の別の 2 分追加 250 μ L の氷にチューブを置きます。優しく揺れで 1 h の 37 ° C で孵化させなさい。
    4. 選択的な LB の版 (1 g トリプトンの; 塩化ナトリウム 1 g; 酵母エキスの 0.5 g の 100 mL の蒸留水に溶解した寒天 1.5 g ステップ 1.2.3 で細菌培養の 50-200 μ L を広めます。オートクレーブ 50 mg/mL カナマイシンの 0.1% を追加)。コロニーの成長のための 37 ° C で 16 時間の LB の版を孵化させなさい。
    5. 5-10 コロニーをピックアップし、再 5 μ L の蒸留水にそれらを個別に中断します。
    6. 反応バッファーの 5 μ L、10 mM の dNTPs の 0.5 μ L、DNA ポリメラーゼ、中断されたコロニーの 1 μ、10 μ M M13 前方プライマーの 1.25 の μ L の 0.25 μ L を追加することによって PCR を実行、ターゲット遺伝子の水 25 μ L の最終巻を 10 μ M の逆プライマーの 1.25 μ L 熱 PCR30 98 ° C への反応 10 98 ° C の 35 サイクルに続いて s s、53 ° C、30 s、および 60 のための 72 ° C s、し 2 分 (表 1) のための 72 ° C で最終的な拡張。
    7. TB メディア (100 mL の 0.17 M KH2PO4と 0.72 M K2HPO4トリプトン 12 g 酵母、2 mL の 6 g を含むスープのベース媒体の 450 mL を含むリン酸バッファーのステップ 1.2.5 から中断されたコロニーの 3 μ L を再培養します。グリセリン、滅菌、0.1 %50 mg/mL カナマイシンを含む) 16 h. の製造元のプロトコルに続く超純粋なプラスミッド DNA を抽出します。
    8. 商業サンガーの 1.2.7 の手順から使用 200 ng/μ L の超純粋なプラスミドによる M13 の前方および逆のプライマー シーケンスします。製造元によって提供されるシーケンス図に基づいたベクトルのターゲット遺伝子の正しい挿入を確認します。
    9. -20 ° C で MdαE7 と GFP のシーケンス確認超純粋なプラスミッド DNA のサンプルを格納します。
      注: これらは、エントリ プラスミド DNA の MdαE7 と GFP。
  3. ラムダ (LR) を再結合反応を実行することにより、組換えバキュロ ウイルスを構築します。
    1. それぞれ、300 ng/μ L のエントリのプラスミド DNA の GFP、1.2.7 のステップから MdαE7 またはクロラムフェニ コール アセチルトランスフェラーゼ遺伝子 (猫) を市販 (含むattL サイト) の 5 μ L 細胞トランスフェクション キットによって付属のエントリ プラスミド DNA の 1 μ L を混合します。C 言葉線形 DNA ( attR サイトを含む) の 250 μ L の PCR チューブします。8 μ L の総ボリュームに TE バッファーを追加します。
      注: GFP と猫の反応は制御グループとして使用されました。
    2. 2 μ L の市販ラムダ (LR) 組換え酵素 (材料表) にミックス LR 反応を触媒する 1.3.1 のステップのそれぞれの混合物を追加します。慎重にミックス、25 ° c 一晩 (≈16 h) 孵化させなさい。
      注: LR 反応、 attL 含むエントリ プラスミッド DNA のatt attB を含む発現ウイルスを生成する R を含む C 言葉線形 DNA の組み換えが容易になります。この手順では、各ターゲット蛋白質の組換えバキュロ ウイルスを生成します。
    3. 1.3.2 のステップから LR 反応生成物の 1 μ L を希釈 20 X。ポリヘドリン前方プライマーを用いた PCR を行い、V5 逆プライマー (表 1)。5 μ L の PCR の製品を使用して、品質をチェックする 1% の agarose のゲルを実行します。MdαE7 遺伝子から LR 反応生成物の例を図 1に示します。

Figure 1
図 1: PCR 解析による MdαE7 LR 反応の結果の例です。200-fold LR 反応の 2 μ L を希釈し、25 μ L の PCR を行うポリヘドリン前方プライマーと V5 逆プライマー希釈の 2 μ L を使用します。LR 反応の品質をチェックするのに 1% の agarose のゲルを実行するのに 5 μ L の PCR の製品を使用します。、

  1. Sf9 昆虫細胞を transfect します。
    1. T25 の完全な細胞成長培地 (無血清培地に 10% 牛胎児血清 (FBS)) の 5 ml 昆虫 Sf9 細胞は 27 ° C でフラスコを扱われます。
    2. 上澄みを除去し、新鮮な完全な細胞成長培地 3 mL で底付けセルをフラッシュします。新しい処理 T25 フラスコに再浮遊細胞の 0.5 mL を転送します。完全な成長媒体の 4.5 mL を追加します。27 ° C で次の転送まで 3-4 日間インキュベートします。
    3. シード 2 mL ログ相成長昆虫 Sf9 細胞文化 (≈3.0-5.0 × 106セル) よく細胞培養を均等に配分します。フードに室温で少なくとも 3 h を付けるセルを許可します。
    4. 250 X で倒立位相差顕微鏡で観察することによって細胞の接着を確認してください。細胞培養培地を削除し、グレースの昆虫培地 2 mL に置き換えます。
    5. トランスフェクション混合物 A ソリューション (8 μ L 市販細胞感染試薬 (材料表) のグレースの昆虫媒体の 100 μ L) と各ターゲット遺伝子 (手順 1.3 から LR 反応生成物の 9 μ L のトランスフェクション混合物 B のソリューションを準備します。培のグレースの昆虫媒体の 100 μ L) で 1.5 ml 遠心チューブ、それぞれ。
    6. 軽くチューブを叩くことによってトランスフェクション混合物 A と B を一緒に混ぜます。フードで 35 分間室温でインキュベートします。
    7. 均等に 1.4.4 のステップからシード細胞に滴下ステップ 1.4.6 から混合物を追加します。テープと井戸をシールし、27 ° C で一晩インキュベートします。
    8. グレースの昆虫培地 2 mL を完全な成長培地 2 mL に置き換えます。非遺伝子組換えバキュロ ウイルスに対して悪影響を選択するを各ウェルに 100 μ M ガンシクロビルを追加します。テープで井戸を密封し、72 h の 27 ° C で孵化させなさい。
    9. 72 h ポスト感染細胞培養液を各ウェルから収集し、1.5 mL 遠心チューブに転送します。セルまたは大きい残骸を削除する 4 ° C で 5 分間 1,500 × g で遠心分離機します。
    10. 新しい 1.5 mL 遠心チューブに上清を移します。光からの保護と 4 ° C で保存します。
      注: これらは各ターゲット遺伝子する P1 ウイルス ストック ソリューションです。
    11. 高価 P2 ウイルス株 (5 × 107-1 × 108 pfu/mL) に低価 P1 ウイルス ストック (1 × 10 の5-1 × 106 pfu/mL) を増幅します。
    12. シード 2 mL ログ相成長昆虫 Sf9 細胞文化 (≈3.0-5.0 × 106セル) よく細胞培養を均等に配分します。フードに室温で少なくとも 3 h を付けるセルを許可します。
    13. 手順 1.4.10 セルにそれぞれステップ 1.4.12 のもシードで取得した P1 ウイルス ストックの 5 μ L を接種します。その後、各ウェルに 100 μ M ガンシクロビルを追加します。井戸をシールし、27 ° C 72 時間インキュベートします。
    14. 72 h ポスト感染の P2 ウイルス ストック ソリューションを収集します。光からの保護と 4 ° C で保存します。
      注: これらは各ターゲット遺伝子の P2 ウイルス原液です。
    15. (省略可能)P3 ウイルス ストック ソリューションを収集する P2 ウイルス ストックの 5 μ L での手順 1.4.12-1.4.14 を繰り返します。
      注: これらは各ターゲット遺伝子の P3 ウイルス原液です。
    16. 光からの保護と 4 ° C で構築されたすべてのバキュロ ウイルスを格納します。
      注: GFP と猫の遺伝子は、対照群として出されました。図 2は、異なる増幅段階で GFP 遺伝子組換えバキュロ ウイルスに感染している場合に、セルの兆候を示した。

Figure 2
図 2: 異なるバキュロ ウイルス増幅段階で細胞の Sf9 の感染兆候の例。図では、明るい自然光と蛍光灯の下で GFP 遺伝子組換えバキュロ ウイルスの細胞です。P1 感染期の感染率は低いです。P2 感染期の感染率を有意に向上しました。P3 感染段階で細胞の成長停止と同様、セル径の増加ほとんどすべての細胞は細胞培養プレートから剥離の症状を示した。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

  1. Sf9 昆虫細胞内標的タンパク質の大量発現
    1. 文化ログ相成長昆虫 Sf9 細胞 T25 無処理フラスコの完全な成長培地 10 mL。
    2. ステップ 1.5.1 72 h で培養細胞に感染するウイルス P2 (1.4.14 の手順で得られた) 原液 200 μ L を追加します。
    3. 72 h ポスト感染細胞培養液を収集します。4 ° C で 5 分間 1,500 × g で遠心します。
    4. 1 mL の 0.1 M PBS バッファー (pH 7.5) で 2 回上清および洗浄のペレットを破棄します。
    5. 昆虫の細胞蛋白質の抽出 (材料表) の換散バッファーの 1 ml の細胞ペレットを完全に溶解します。セル換散の 10% グリセロールを追加します。すぐに-80 ° C で保存します。
    6. 対照群として機能する猫蛋白質の P2 ウイルス原液と手順 1.5.1-1.5.5 を繰り返します。
      注: は、異なった蛋白質の準備のため 3 通で 1.5 手順を繰り返します。

2. MTT の細胞を用いた細胞毒性アッセイ

  1. 文化ログ相成長 (1.5-2.5 × 106セル/mL) 昆虫 Sf9 細胞 T25 無処理フラスコの完全な成長培地 5 mL。
  2. ステップ 2.1 27 ° C で穏やかな揺れで 48 時間の培養細胞に感染する P1 ウイルス原液 (1.4.14 の手順で得られた) の 25 μ L を追加します。
  3. 100 mM のアセトニ トリルにペルメトリン標準溶液を準備します。50 mM、25 mM、12.5 mM、6.25 mM をそれぞれ 1,000 μ L の容量で 500 μ L、250 μ L、125 μ および 62.5 μ L ペルメトリン原液を追加して希釈するアセトニ トリルを使用します。
  4. ステップ 2.2 2 × 105セル/ml の密度で 24 ウェル プレートに完全な成長媒体の 300 μ L を添加したから感染した細胞培養の 200 μ L を均等にシードします。
  5. 最終濃度 50 μ M、100 μ M、200 μ M、400 μ M、それぞれを各ウェルにペルメトリン標準溶液 (6.25 mM、12.5 mM、25 mM と 50 mM) の 4 μ L を追加します。細胞生存率計算 (図 3) の井戸にアセトニ トリルの 4 μ L を追加だけです。
  6. テープでプレートをシールし、27 ° C の光からの保護と 48 時間で孵化させなさい。
  7. バッファーに溶解 5 mg/mL MTT (チアゾリル ブルー テトラゾリウム ブロマイド) 試薬の準備 (NaCl、KCl、0.05 g の 2.0 g 200 mL に溶解し2PO4∙2H2O、NaH2PO4、0.05 g の 0.28 g KH2PO4 の NaH の 0.36 g の蒸留水、pH 7.5)。
  8. 48 時間培養後のステップ 2.6 からは底をついた細胞層に触れることがなく細胞培養培地を削除します。各ウェルに手順 2.7 で MTT 試薬 200 μ L を追加します。各ウェル (図 3) で暗い紫塩沈殿が形成されるまでは、4 h の 37 ° C で孵化させなさい。
  9. 暗い紫塩析出各ウェル内のフォームまで 4 時間 37 ° C で孵化させなさい。(図 3) の沈殿物を完全に溶解する DMSO の 500 μ L を追加します。

Figure 3
図 3: MTT 結果の例です。48 時間後種子 500 μ L のセル 24 ウェル細胞培養プレートで猫の遺伝子を表現する均等に猫組換えバキュロ ウイルス ソリューションの P1 ウイルス原液使用感染症を記事します。それぞれ、最終濃度を 50 μ M、100 μ M、200 μ M、400 μ M にする各行の異なる用量 (6.25 mM、12.5 mM、25 mM と 50 mM) で 4 μ L ペルメトリンを追加します。コントロールの行は、アセトニ トリルだけで治療され、プレートで CK とマークされています。(A) 27 ° C で培養 48 時間後上層の細胞培養液を破棄し、黄色着色された MTT 試薬 200 μ L に置き換えます。濃い紫の色の沈殿物には、48 h. 濃い紫色色還元析出各もことを示す細胞の生存、黄色の色を代謝できるフォームの 37 ° C で MTT 試薬をインキュベーションしています。(DMSO 溶媒 B) 500 μ L を各ウェルに形成された沈殿物を溶解するために追加しました。それぞれの吸光度値がよく 540 で分光光度計による検出された nm。ペルメトリン濃度増加に伴い、色が濃い赤からセル目が徐々 に減少することを示唆して、明るい赤に徐々 に変化します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

  1. 96 ウェル プレートに溶解した溶液 200 μ L を転送します。540 で吸光度を測定 (材料表) マイクロ プレート リーダーを使用して nm。
  2. アセトニ トリルの処理セルだけのものとペルメトリン処理セルの吸光度の値を比較することによって細胞の生存率を計算します。
  3. コントロール グループのクロラムフェニ コール アセチルトランスフェラーゼ (CAT) 1.4 の手順で得られた組換えバキュロ ウイルスの P2 ウイルス原液ですべての手順を繰り返します。
  4. 別のウイルスの準備のための 4 回を繰り返します。

3体外代謝アッセイ。

  1. 100 mM のアセトニ トリルにペルメトリン標準溶液を準備します。50 mM、25 mM、12.5 mM、6.25 mM を希釈するアセトニ トリルを使用します。高速液体クロマトグラフィーを用いた各濃度の下で対応するピーク領域を検出します。作成し、異なるペルメトリンの濃度とピーク面積に基づくペルメトリン標準曲線を計算します。
  2. ブラッドフォード方法21ステップ 1.5 タンパク質の濃度を測定します。
  3. 40 μ M のペルメトリン標準と代謝反応の 700 μ L と手順 1.5 0.2 M トリス塩酸バッファー (pH 7.4) に溶解で得られる蛋白質の 1 mg を準備します。穏やかな揺れで 2 h 30 ° C で孵化させなさい。光から保護します。
  4. 冷たいアセトニ トリルの 700 μ L を追加することによって反応を抑制します。穏やかな揺れで別の 30 分の 30 ° C で孵化させなさい。光から保護します。
  5. 常温で 2 分間 16,000 x g で反応混合物を遠心分離機します。上澄みと 0.45 μ m 膜を介してフィルターを収集します。高速液体クロマトグラフィー分析用ウルトラクリーン茶色からす容器に濾過を転送します。
  6. 最適なクロマト グラフ条件 (移動相 a: 90% アセトニ トリルと 10% 水で HPLC を実行します。移動相 b: 5% アセトニ トリルは 85% のリン酸の pH 2.3 に調整されます。)1 mL/分の 232 の波長で測定流量勾配溶出 nm。
  7. 蛋白質のサンプル追加せず反応と比較することによってペルメトリンの減少割合を計算します。
  8. コントロールとして使用するには、手順 1.5.6 で得られる猫のタンパク質を使用します。
  9. 1.5.7 の手順で異なる蛋白質の準備のすべての手順を繰り返します。

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Representative Results

異なるペルメトリン トリートメント (MTT の試金) に向かって細胞生存率

MdαE7 組換えバキュロ ウイルス感染 Sf9 細胞 (実験群) と猫組換えバキュロ ウイルス感染 (感染するバキュロ ウイルス キット提供) 細胞 (群) のペルメトリンの細胞毒性を調べた。拡張セル許容範囲が MdαE7 強く発現細胞を用いたペルメトリンには、殺虫剤と化学損害からこうして保護セルに対してこのカルボキシルエステラーゼの代謝の役割をサポートします。我々 の研究は、異なるペルメトリン濃度に対する細胞生存率で (50、100、200、400 μ M) アセトニ トリルだけで細胞と比較して計算されました。結果 MdαE7 の発現細胞の生存率が有意に高かった (101.92% 86.00% に至るまで)(図 4 b) 制御の細胞 (67.59% に至る 81.43%) よりも(図 4 a) 異なる濃度でペルメトリンに露出されたとき昆虫細胞を用いたペルメトリンの代謝における MdαE7 の重要な役割を示します。

Figure 4
図 4: 異なるペルメトリン治療の下の昆虫 Sf9 細胞の目。(A) 制御の細胞の生存率は、(B) MdαE7 組換えバキュロ ウイルスによる感染実験細胞の生存率を猫組換えバキュロ ウイルスによって感染します。各ペルメトリン濃度 4 レプリケーションを行った。データは、平均 ± SEM. として示されたこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

MdαE7 によってペルメトリンのin vitro代謝

ペルメトリン代謝感染 Sf9 細胞から抽出された MdαE7 タンパク質と共に 40 μ M ペルメトリン標準溶液を培養によって検定しました。猫のタンパク質が関与する反応は、コントロールとして提供しています。ペルメトリンの枯渇率は酵素を追加することがなく反応と比較して求めた。反応は、120 分潜伏期間後逆相高速液体クロマトグラフィーによって監視されました。2 つのピークがそれぞれ 10.67 と 10.87 最小トランス ペルメトリンと cis-パーメスリン、溶出時、HPLC クロマトで観察されたペルメトリン標準は実際に混合物のシスとトランスの異性体、ので (図 5)。MdαE7 蛋白質 (39.18±3.78%) によってペルメトリンの枯渇率は有意に高かった猫蛋白質 (7.29±0.81%) よりも(図 6) では MTT と一貫性のある結果しますが、できないも直接ペルメトリンの in vitro代謝における MdαE7 の機能を示します。

Figure 5
図 5: ペルメトリン標準の HPLC プロファイル。本研究で用いたペルメトリン標準トランス ペルメトリン、cis-パーメスリン異性体の混合であります。赤矢印は、それぞれペルメトリン トランス異性体と cis-パーメスリン異性体のピークを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: MdαE7 と猫の組換え蛋白質によってペルメトリンのIn vitro代謝します。MdαE7 と猫の蛋白質によってペルメトリンの枯渇率を求めた。各ペルメトリン濃度の 3 つのレプリケーションを行った。データは、平均 ± SEM. として示されたこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

最近数十年で表現し、大量の蛋白質の生化学的, 機能的定量法と体外酵素の特性をこのように分離異種発現システムに広く使用されています。日には、大腸菌・組成分析Sacccharomyces 酵母ハスモンヨトウ frugiperdaなどいくつかの別のモデル システムは組換え蛋白質の表現との選択に適応されている、興味の蛋白質22,23,24,25の大規模な生成のための in vitroシステムが欠かせません。昆虫細胞に似た細胞内環境を提供し、いくつかの重要な真核生物処理機能を維持するために選ばれた我々 の研究家フライ カルボキシルエステラーゼを生成するバキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系9. バキュロ ウイルスによる発現システムの利点にもかかわらずその限界はまた対処すべき。バキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系は、昆虫細胞構築された組換えバキュロ ウイルスに感染していた場合にのみ、ターゲット蛋白質を生成できます。安定して変換された昆虫の細胞ラインの作成の現在の開発は恒常バキュロ ウイルス感染の有無に興味の蛋白質を作り出すだけでなく、glycosylating と折りたたみの細胞機能を改善するためにも可能な限りしました。エンジニア リング変更9によるタンパク質を生成されます。

セルの殺虫剤の代謝とこうして化学損傷から細胞を保護するカルボキシルエステラーゼの役割をよりよく調べるためには、異なるペルメトリン治療に対して細胞毒性を測定する MTT アッセイを行った。このプロセス中に多くの細胞の代謝、細胞培地成分、細胞成長率、濃度、エネルギー供給の代謝産物の消費などに関連付けられている実験的パラメーターことができます MTT 削減に影響を与えるし、不正確にそれによりつながる結果。以上を最小限に抑える/MTT の試金の過小評価を維持細胞培養培地、細胞成長の状態、および培養条件さまざまな実験的治療法26の間で一貫性のあります。バキュロ ウイルス感染ではなく、ペルメトリンによって引き起こされる細胞生存率の効果を決定するために我々 は Sf9 昆虫細胞への GFP 遺伝子組換えバキュロ ウイルスの感染過程が示唆された、P2 感染段階で、細胞が最も高いあることを発見他の感染時期 (図 2) に比較して最も低いセル死亡率と感染率です。これは良い、MTT の試金を行なう P2 感染段階でセルを選択する理由を説明できます。

MTT 研究で MdαE7 と猫組換えバキュロ ウイルスに感染している場合に、セルの目を比較すると、細胞の強化された生存方法を見つけたよりペルメトリンするカルボキシルエステラーゼの代謝の役割がサポートする MdαE7 蛋白質を表現するとき昆虫細胞で化学損傷 (図 4) から細胞を守ると。体外代謝研究は、殺虫剤に対するカルボキシルエステラーゼの代謝機能を反映するように直接法として認識されている必要がありますもされて良い MTT の試金の制限を補正するために探検された蛋白質を特徴付ける代謝機能。

この研究では、バキュロ ウイルスによる発現システム、MTT の試金によって異なるペルメトリン治療に向かってセル目の測定との評価を持つ昆虫 Sf9 細胞でカルボキシルエステラーゼの異種発現カルボキシルエステラーゼの in vitro代謝を通して昆虫、従って殺虫剤のよりよい理解を促進する解毒酵素の役割を調査するための体系的で科学的で正確な戦略を提供する一緒にすべての作業を試金します。抵抗性機構と害虫管理のためのそれにより開発の革新的な戦略。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs inc. M0491L
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen by life technology K240020 S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen by life technology K210002
Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits Invitrogen by life technology 11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit Invitrogen by life technology 12562-019 Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit
pENTR-CAT plasmid Invitrogen by life technology Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL
Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified Gibco by Life Technologies 10082-139
Sf9 cells in Sf-900 III SFM Gibco by Life Technologies 12659017
Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer G Biosciences by A Geno Technology Inc 786-411
Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete Gibco by Life Technologies 12658-019
Grace's Insect Medium, unsupplemented Gibco by Life Technologies 11595030
Permethrin (isomers) analytical standard SUPELCO by Solutions WithinTM 442748
Methanol (analytical graded) Sigma-Aldrich 67-56-1
Acetonitrile (analytical graded) Sigma-Aldrich 75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) Pall Life Sciences 21890388
Alliance Waters 2695 HPLC System Waters
T100 Thermal Cycle Bio-Rad Laboratories Inc. 1861096
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek

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References

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