זיהוי של וירוסים Bioaerosols באמצעות אניון Exchange שרף

JoVE Journal
Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אניון להחליף שיטה מבוססת-שרף, הותאם לנוזל הוכח bioaerosol מבוסס-impingement דגימה של וירוסים. כאשר יחד עם זיהוי מולקולרי במורד הזרם, השיטה מאפשרת גילוי נתיישב ורגיש של וירוסים bioaerosols.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Schaeffer, J. W., Chandler, J. C., Davidson, M., Magzamen, S. L., Pérez-Méndez, A., Reynolds, S. J., Goodridge, L. D., Volckens, J., Franklin, A. B., Shriner, S. A., Bisha, B. Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin. J. Vis. Exp. (138), e58111, doi:10.3791/58111 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

פרוטוקול זה מדגים שיטת הדגימה bioaerosol מותאם אישית עבור וירוסים. במערכת זו, אניון exchange שרף הוא ביחד עם התקני הדגימה האוויר מבוסס-impingement נוזלי ריכוז אפקטיבי של אניון וירוסים bioaerosols. לפיכך, השרף מגישה כשלב נוסף ריכוז בזרימת העבודה bioaerosol הדגימה. חומצת גרעין החילוץ של חלקיקי נגיפי ואז מבוצעת ישירות מן השרף exchange אניון, עם הדגימה וכתוצאה מכך מתאים ניתוחים מולקולריים. יתרה מזאת, פרוטוקול זה מתאר תא bioaerosol לפי הזמנה מסוגל לייצר וירוס עמוסי bioaerosols תחת מגוון תנאים סביבתיים, המאפשר ניטור רציף של משתנים סביבתיים כגון טמפרטורה, לחות, מהירות הרוח, ריכוז מסה תרסיס. היתרון העיקרי של שימוש בפרוטוקול זה הוא רגישות מוגברת של איתור נגיפי, כפי העריך באמצעות השוואה ישירה impinger נוזלי קונבנציונאלי שלא שונתה. יתרונות נוספים כוללים את היכולת להתרכז מגוונים-אניון וירוסים, עלות נמוכה של אניון exchange שרף (~$0.14 עבור דגימה), וקלות השימוש. החסרונות כוללים חוסר היכולת של פרוטוקול זה כדי להעריך את infectivity של שרף-הספוחה נגיפים, שעשוי להיות לצורך אופטימיזציה של המאגר דגימה נוזלית שישמש impinger.

Introduction

מטרת שיטה זו היא לספק פלטפורמה דגימה רגישה מאוד bioaerosol כדי להקל על זיהוי מולקולרי של אניון וירוסים bioaerosols. מיקרואורגניזמים, כולל חלקיקים נגיפיים, יכול לשרוד bioaerosols לתקופות ממושכות של זמן1. Bioaerosols ניתן לנסוע על פני מרחקים ארוכים יחסית, לשמור על יכולת הקיום של infectivity, כפי שמעידים על התפרצות מחלת הליגיונרים כי מקורם התעשייה ממוקם במרחק של 6 ק מ אנשים מושפעים במגדלי הקירור ו כתוצאה 18 הרוגים2. שידור ישיר של וירוסים לבני מתווכת על-ידי bioaerosols יכול להתרחש במסגרות מרובות, הוכח עבור norovirus התפרצויות3,של בתי ספר, מסעדות-4. באופן דומה, bioaerosol שידור של וירוסים יכול להתרחש אצל חקלאי הגדרות כגון בחוות חזירים ועופות, עם המסלול לשידור להיחשב כגורם מרכזי בתנועה של וירוסים בין מתקני הייצור5, 6 , 7 , 8 , 9.

הדגימה האפקטיבי של bioaerosols עמוסי וירוס מאפשר שיפור איבחונים ומוכנות למניעת התפרצות, כפי שמוצג בהפגנות ב H5 אילו שפעת וירוסים התגלו מ bioaerosols ב החי משווקת בסין ו ארצות הברית10,11. טכנולוגיות הנוכחי של הדגימה bioaerosol לערב מספר עקרונות ללכוד חלקיקים שונים, ניתן לסווג בהרחבה לתוך impingers, הציקלונים, impactors, מסננים12. . זה מעבר הטווח של פרוטוקול זה לכסות ממצה את כל היתרונות והחסרונות של פלטפורמות אלה עבור דגימה של וירוסים מן bioaerosols; עם זאת, ניתן לקבוע כי הרוב המכריע של התקנים אלה דגימה שלא להיות ממוטבות עבור האוסף של וירוסים ותוכנות bacteriophages13. יתר על כן, infectivity של נגיפים לעיתים קרובות מושפעים לרעה, עם impingers נוזלי נחשב כדי לשמור על infectivity ויראלי בצורה יעילה יותר מאשר דגימה התקנים כגון impactors או מסננים מוצק14. אולם חיסרון אחד של impingement נוזלי הוא האפקט דילול המטרה, אשר מתרחשת מפני וירוסים הם שנאספו בכמויות גדולות יחסית (בדרך כלל ≥ 20 מ"ל) של נוזל בתוך הכלי אוסף. חיסרון חשוב נוסף כרוך יעילות שיוצרת impingers נוזלי להתרכז חלקיקים < 0.5 מיקרומטר גודל15. עם זאת, ניתן לשפר יעילות לכידה של התקנים אלה מאת הנייח על מטריצות מוצק, כפי הנייח יכול לשפר את שימור של חומצות גרעין נגיפיות,16,infectivity ויראלי17.

בעבר הראו כי אניון exchange שרף הוא כלי יעיל עבור לכידת וריכוז של וירוסים של מטריצות נוזלי, לרבות F-RNA bacteriophages, וירוס הפטיטיס A, אדנו אדם בנגיף18,19 ,20. כפי שהוגדרו על ידי היצרן, השרף exchange אניון מנוצל בעבודה זו הוא שרף macroreticular פוליסטירן אניון בסיס חזק exchange האטרקציה התחלקות של קבוצות functionalized אמין רבעוני, לכידתו של אניונים בינוני נוזלי21 . כתוצאה מכך, צפוי השרף exchange אניון ללכוד וירוסים עם חיובים השטח נטו שלילי, לרבות וירוסים המעית רבים, שפעת וירוסים, וירוסים אחרים הנוגעים לבריאות הציבור ובעלי חיים.

בפרוטוקול הנוכחי כולל התוספת של אניון exchange לשרף impinger נוזלי. במערכת זו, משמש השרף צעד ריכוז משניות עבור חלקיקים נגיפיים שנלכדו בתוך הנוזל impinger. חומצות גרעין יכול אז להיות ישירות eluted בכמויות קטנות, מתן דגימת מרוכז עבור ניתוחים מולקולריים. לפיכך, היתרון העיקרי של שיטה זו הוא לשיפור הרגישות לאיתור נגיפי, בעיקר באמצעות צמצום נפח דגימה. בנוסף, בשל התפיסה שאינם ספציפיים הטבועה של וירוסים אניון, השיטה זו סביר ישימה עבור זיהוי של מספר גדול של וירוסים עניין. כאן, השיטה הוא הפגין עבור חיסון זנים של סוג A, וירוסים שפעת מסוג B, את coliphage FRNA MS2 (MS2). וירוסים אלה מאותרים לאחר מכן באמצעות מבחני לרביעיית סטנדרטי-PCR כמו שתואר לעיל22. המשתמש מובילים לא צריך לצפות למפגש קשיים בביצוע שיטה זו, כי השינויים הקיימים כיום ציוד אינם מהווים מרכזי שיבושים לזרימה המקובלת של bioaerosol דיגום וניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הגדרת החדר Bioaerosol (ראה איור 2)

  1. לטעון מראש את impingers נוזלי 20 מ של 0.01 M פוספט buffered מלוחים, pH 7.5 (PBS).
    1. להוסיף 0.5 g של אניון exchange שרף, השעיה בתוך מגניב של אחד impingers נוזלי, עם עוד impinger נוזלי הגשה פקד.
  2. מיקום impingers נוזלי במקביל בתוך החדר bioaerosol באמצעות מלחציים עומד עם תרסיס אינלטס מול של מפוחים.
    הערה: ראה איור 2 לפרטים נוספים.
  3. בשיתוף אתר צג תרסיס ישיר-קריאה ליד impingers נוזלי כדי למדוד ריכוז מסה (מ ג/ז3) של bioaerosol.
  4. אתר שיתוף ישיר-קריאה נוספים ומכשור (אוויר מקורה איכות צג ותרמית מד רוח) ליד impingers נוזלי לעקוב אחר משתני סביבה, כגון טמפרטורה, לחות יחסית רוח מהירות, בתוך תא bioaerosol.
  5. הפעל מאווררים ציריים בפינות החדר bioaerosol כדי להקל על ערבוב של תרסיס.
    הערה: מאווררים ציריים לרוץ במהירות קבועה והם אינם מתכווננת.

2. מודל Bioaerosolization ניסויים (ראה איור 3)

  1. לבצע יציאה טורית, 10-fold דילולים bacteriophage MS2 חיסון שפעת ריכוזי הרצוי בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS).
    הערה: כדי להדגים את השיטה פה, 103.5 ffu ב/mL של סוג A ו- B שפעת וירוס חיסון זנים ו-105 PFU/mL של bacteriophage MS2 מנוצלים. כדי לקבוע titers עבור inocula, bacteriophages הופץ ב- HS Escherichia coli (pFamp) R, לספור כפי שתואר לעיל20. החיסון המסחרי מכיל כמויות ידוע של ארבעה זנים של וירוס שפעת הקלוש בשידור חי, שניים הקלד שפעת ווירוסים שני וירוסים שפעת מסוג B, שבאה לידי ביטוי המוקד פלורסנט יחידות או ffu.
  2. להכין inocula בתוך הכלי זכוכית של לתת לה משאף 6-סילון התנגשות על-ידי יצירת המתלים של ריכוזים הרצוי של נגיפים ב- 100 מ של PBS ולהתקין בתוך תא bioaerosol מותאם אישית.
  3. ליזום מכשור כדי למדוד את משתני בתוך תא bioaerosol, כגון טמפרטורה, לחות יחסית %, ריכוז פחמן דו-חמצני, ורוח מהירות (נוצר באמצעות של מפוח). השתמש צג תרסיס ישיר-קריאה כדי לעקוב אחר ריכוז מסה בתוך תא bioaerosol ולהקים עקביות בתוך ובין ניסויים.
  4. לאטום את התא bioaerosol ולטהר 10 דקות באוויר HEPA-מסוננים.
  5. לספק אוויר מסונן, מיובשים מפוחים פועלים ב 6.9 kPa.
  6. הפקת ריכוז היעד של bioaerosols ויראלי (באמצעות מפוחים) בכל אחד bioaerosol למשפט. לצורך ההדגמה, bioaerosols עם ריכוז של 5 מ"ג/m3 נוצרים.
  7. לאחר שהגעת היעד ריכוז מסה בתרסיס, עוצרים nebulization.
  8. פועלים משאבת אוויר דגימה עבור כל impinger נוזלי זה כוילה כדי קצב זרימה של 12.5 L לדקה כיול התנהגות באמצעות תקן הזרימה הראשי לפני ואחרי כל אירוע הדגימה כדי להבטיח עקביות דגימה נפח. דילול אספקת אוויר באמצעות שורת HEPA-מסוננים הממוקמים על יד מפוחים, לשמור על לחץ קבוע בבית הבליעה.
  9. פעיל לדגום את האווירה תא bioaerosol לתקופה של 40 דקות כדי להשיג נפח דגימה של 500 ליטר לכל דגימה.
    הערה: דגימה למשך 40 דקות ב- 12.5 L/דקה עם שתי משאבות במקביל מאפשר דגימה של 1,000 ליטר של bioaerosol. לכן, בתום הניסוי, הוא צפוי כי רוב האוויר נוכח בבית הבליעה bioaerosol שנדגמו, שוחרר לתוך הסביבה דרך מערכת סינון HEPA. עדות לכך היא על ידי הירידה בריכוז החלקיקים. שלאחר הניסוי, משטחים הם ושוקמו עם 10% אתנול ביתי מלבין ו- 70%. נעשה שימוש במחוונים בהפגנה זו; עם זאת, אם ידוע אורגניזמים פתוגניים משמשים במערכת זו, אמצעי אבטחה נוספים ניתן ליישם בהתאם לצורך.

3. חומצות גרעין חילוץ וזיהוי לרביעיית-PCR

  1. לבודד חומצות גרעין ישירות מאניון exchange שרף, למטרות השוואתי, מן הנוזל שישמש את impingers נוזלי. בדוגמה זו, מתואר הליך בידוד ה-RNA, אך פרוטוקול דומה יכול לשמש לייצור DNA וירוסים.
    1. חומצת גרעין בידוד מן השרף exchange אניון.
      1. העברת כל של אניון exchange המכילים שרף הנוזל של impinger נוזלי צינור חרוטי סטרילי 50 מ.
      2. לאפשר שרף להתיישב, לאט decant את דגימת נוזל מן השרף exchange אניון. השתמש טיפ פיפטה 1 מ"ל כדי להסיר את כל הנוזל הנותר מן השרף exchange אניון.
      3. ערכה בידוד RNA נגיפי, להוסיף µL 560 פירוק ויראלי מאגר המכיל נושא RNA ישירות כדי שרף exchange אניון, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב תקופתיים.
      4. באמצעות טיפ פיפטה 1 מ"ל, להעביר את נגיפי lysate (המאגר פירוק ויראלי) סטרילי 1.5 מ ל חרוט צינור ולהמשיך עם RNA בידוד באמצעות בידוד RNA נגיפי של קיט (ראה טבלה של חומרים) בהתאם להוראות היצרן, למעט כי ה-RNA eluted, הנפח הכולל של µL 60 • תנאי המאגר.
    2. חומצת גרעין בידוד של impingers נוזלי.
      1. פיפטה µL 140 המדגם נוזלי לתוך צינור חרוטי mL 1.5 סטרילי ולבצע בידוד RNA באמצעות ערכת בידוד RNA נגיפי בהתאם להוראות היצרן, חוץ eluting רנ א ב הנפח הכולל של µL 60 • תנאי המאגר.
        הערה: 140 µL היא אמצעי האחסון מדגם מקסימלית ניתן לעבד עם ספציפי נגיפי RNA בידוד ערכת המועסקים כאן הכנה צעד אחר צעד.
  2. לבצע לרביעיית-PCR לזיהוי של MS2, שפעת A ו- B וירוסים כמו שתואר לעיל23,24. בהפגנה הזו, 5 µL של חומצות גרעין eluates משמשים לרביעיית-PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מדגים את העיקרון שמאחורי מבוסס תשלום לכידתו של וירוסים מ- bioaerosols באמצעות הכללת שרף בנוזל impingers. איור 2 מציג את ההתקנה של תא bioaerosol לפי הזמנה. איור 3 מתאר את השלבים הכרוכים בהקמת חשוד ניסוי של אמצעים כדי להבטיח בקרת איכות. איור 4 מציגה עקומות הגברה עבור לרביעיית-PCR לזיהוי וירוסים אניון שנלכד bioaerosols. טבלה 1 מציגה את תחל הגששים המשמש לרביעיית-PCR עבור וירוסים למשל השתמשו במחקר זה.

באמצעות וירוסים MS2 וגם שפעת הנכלל חיסון שפעת כמודלים בבית הבליעה bioaerosol מותאם אישית, ששינה impingers נוזלי עם אניון exchange שרף המותר עבור 3 x ל x 9, בשיפור זיהוי ויראלי, בהתאם הספציפית וירוס, לעומת בדיקה ישירה של נוזל impingement22. כפי שמוצג לרביעיית נציג-PCR הגברה עקומות (איור 4), זיהוי סוג שוירוסים שפעת יכולה להיות מושגת עד 3.26 מחזורים קודם כאשר אניון exchange שרף שימש לעומת בדיקה ישירה של הנוזל impingement. בהתחשב בכך כי לרביעיית-PCR זה יעילות של 100%, רווח של Ct אחד מתאים כדי עלייה 2-fold בריכוז היעד, ההבדל זה שווה ערך ל שיפור 9.58 x בזיהוי.

Figure 1
איור 1: impingement נוזלי בשילוב עם אניון exchange שרף. כל אחד מההתקנים דגימה שונה bioaerosol מובהקים של שרף exchange אניון העיצוב שלה. כל חרוז שרף הוא כדור 0.5 עד 1.0 מ מ עם משטח נקבובי, תכונה המגבירה את exchange אניון פני השטח. קבוצות פונקציונליות אמוניום רבעוני לאפשר לכידת יונים בתקשורת נוזלי, מתווכים לכידתו של וירוסים עם חיובים השטח נטו שלילי, כולל MS2 coliphages וגם שפעת וירוסים, אשר נמצאים בשימוש פרוטוקול זה כמו מודל אורגניזמים (זנב bacteriophage מצויר כאן כדוגמה שנתפסו וירוסים). חומצת גרעין בידוד מתבצע ואז ישירות מן השרף (באמצעות ערכות זמינים מסחרית), עם הדגימה מתאים לזיהוי מולקולרי ביותר אסטרטגיות (לרביעיית-PCR מועסק כאן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: מותאם אישית bioaerosol קאמרית סכמטי. ת: 6-סילון מפוחים שסופק עם אוויר מסונן ויבשים, בלחץ ייצור של 6.9 kPa; ב': האוהדים צירית כדי להקל על תערובת אחידה bioaaerosol; ג': צג תרסיס לזיהוי הריכוזים היחסיים bioaerosol; D: impinger נוזלי עם שרף; : E impinger נוזלי ללא שרף; F: מד רוח תרמית כדי למדוד את מהירות הרוח; ז' צג באיכות אייר למדוד משתנים סביבתיים אחרים כולל טמפרטורה, פחמן דו-חמצני, אחוז לחות יחסית; ח': משאבות דגימה פעיל המכויל 12.5 L/דקה; I: הכפפות אטומה pneumatically יציאות עבור מיקום הדגימה ציוד בתוך תא bioaerosol; J: חלון תצפית. איור זה נעשה שימוש חוזר מהעבודה הקודמת, ברשות המו ל22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: זרימת העבודה של הניסוי bioaerosolization. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: שרף exchange אניון משפר לרביעיית-PCR המבוסס על זיהוי של וירוסים אניון bioaerosols. בדוגמה זו, שפעת מסוג A לווירוסים ריכוז inoculum של 103.5 ffu ב/mL היו aerosolized אל החדר bioaerosol מותאם אישית עד ריכוז מסה bioaerosol הגיעו 5 מ"ג/m3. Impingers נוזלי עם ובלי שרף מאורסים בו זמנית כל דגימה (500 ליטר) של bioaerosol. RNA נגיפי שהושג השרף exchange אניון או לנוזל-impinger, לבדיקה על ידי לרביעיית-PCR. הניסוי היה חוזר על עצמו דולר. חומצות גרעין המתקבל שרף דגימות אותרו ב- Ct ממוצע של 26.76, ואילו דגימות נוזלים impinger התגלו ב- Ct ממוצע של 30.02 (ΔCt של 3.26). ההפרש בין Ct שווה ל שיפור 9.58 x בזיהוי באמצעות שרף exchange אניון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

וירוסים פריימר שם פריימר רצף הפניה
MS2 Fwd העיכול 5'-ATCCATTTTGGTAACGCCG-3' 23
בדיקה העיכול 5'-(6-FAM)-TAGGCATCTACGGGGACGA-(BBQ)-3'
Rev העיכול 5'-TGCAATCTCACTGGGACATAT-3'
IAC Fwd (46F) 5'-GACATCGATATGGGTGCCG-3'
בדיקה IAC 5'-(Cy5) - CACATTCACCAGGGAGACGCATGAGA-(מנגל)-3'
Rev IAC (186R) 5'-CGAGACGATGCAGCCATTC-3'
שפעת סוג של וירוסים CDC אוניברסלי שפעת וירוס פריימר לפנים 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3' 24
ה-CDC אוניברסלי שפעת וירוס הפוך פריימר 5'-קנאה GCA TTY TGG ACA '-אק מס רווחי הון CTA-3'
בדיקה וירוס שפעת אוניברסלי לבקרת מחלות 5'-(FAM) - TGC של AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG-(BHQ1)-3'
וירוסים שפעת מסוג B ה-CDC אוניברסלי שפעת B וירוס פריימר לפנים 5'-TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG-3' 24
ה-CDC אוניברסלי שפעת B וירוס פריימר הפוכה 5'-CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3'
ה-CDC אוניברסלי שפעת B וירוס בדיקה 5'-(ג'ו) - CCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTG-(BHQ1)-3'

טבלה 1: תחל וזונדים השתמשו במחקר זה. כל צבעי יסוד של הגששים היו. ואח 2011 פרידמן23 ו- Selvaraju & Selvarangan 201024.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור לכידת ויראלי רגיש bioaerosols משתמש ששונה impingers נוזלי. השיטה ממוטבת זיהוי, כימות המטען הנגיפי ב- bioaerosols. השינוי מסוימות המודגמות כאן כרוכה התוספת של אניון שרף exchange לנוזל הנכלל של impinger נוזלי נפוצות. שיטה זו פותחה עבור פשטותו בעיבוד מדגם במורד הזרם, ואילו דוגמת עיבוד טכניקות טיפול נוספות צנטריפוגה, סינון ושיטות מבוססות משקעים לא מציעים יתרון כזה. מיצוי של חומצות גרעין מתבצע ישירות מהשרף, obviating את הצורך בנפח גבוה elutions ו מרובי שלבים הכנת המדגם, בסופו של דבר לתרום רגישות זיהוי משופרת של השיטה באמצעות הפחתת הדגימה יעיל נפח. יתר על כן, הוכח באותו קיבעון של נגיפים על מוצק משטחים יכול לתרום ליציבות מוגברת של חומצת גרעין נגיפיות או שמירה של נגיפי infectivity17,25. הנייח עשוי נוספת לתרום יעילות לכידת מוגברת על ידי צמצום הפסדים בשל reaerosolization16. השיטה יכולה להיות יחד בקלות עם הזרם ניתוחים מולקולריים (לרביעיית-PCR המודגמות כאן). השרף exchange אניון עשוי להיות שדה, חילוץ, נשלח למעבדה הפניה לניתוח, בעוד ציוד הדגימה האוויר יכול להישאר המוקדש ניטור באזור הדגימה. כפי העיקרון שמאחורי ההליך כרוך התפיסה שאינם ספציפיים של וירוסים נושאת מטען השטח נטו שלילי, השיטה צפוי להיות מקובל זיהוי וירוסים פתוגניים מרובים חשיבות בריאות האדם והרפואה הווטרינרית. כפי שנסקרו על ידי Michen ו- Graule26, מספר גדול של וירוסים חשוב לבריאות הציבור ובעלי חיים יש חיובים השטח נטו שלילי, עם כמה יוצאים מהכלל הידוע, כמו זנים מסוימים של rotaviruses ו- polioviruses.

פרוטוקול זה לא ישירות להעריך את השפעת תנאי הסביבה על הרגישות של זיהוי; עם זאת, כאשר הדגימה האוויר מבוצע במסגרת הגדרות שדה, זה מתקבל על הדעת כי משתנים כגון חום ולחות יחסית עשוי להשפיע על יעילות איסוף על-פני מספר סוגים של אוויר דוגמי12. לפיכך, ניתן לשנות תנאים בתוך תא bioaerosol כדי להתאים את הפרמטרים הסביבתיים האלה כנדרש. השיטה שרף exchange אניון הוכח ביעילות להתרכז וירוסים מרובים של דגימות מים עם מגוון רחב של מאפיינים physicochemical, המציין את ההפרעה הזו חלקיקי החומר, חיידקים, סביבתיים אחרים מזהמים צפוי להיות מינימלי18. בנוסף, האוסף מאגרי עשויות לדרוש אופטימיזציה עבור וירוסים מסוג מסוים, כמו במקרים מסוימים הוכח זה אופטימיזציה של המאגר אוסף יכול להוביל השמירה משופרת של יציבות ויראלי27. חיסרון העיקרי של השיטה כפי שהוצג היא העובדה כי אין באפשרותו לקבוע infectivity ויראלי. חיסרון נוסף של פרוטוקול זה הוא חוסר היכולת להעריך את פוטנציאל השליליות של nebulization, אוויר דגימה על יציבות ויראלי, כולל לייבוש, הטיה של שאינם ספציפיים ספיחה כדי bioaerosol קאמרית משטחים22.

המכשירים bioaerosol ששונה הדגימה יכול להיות נוטה דגימה שדה הגדרות מרובות, כולל בתי חולים, בתי ספר, פעולות חקלאיות, ומקומות אחרים. כי השינויים נעשים לציוד הדגימה האוויר הקיים, הוא צפוי שהמכשירים ששונה יהיה בקלות לאימוץ על ידי מפעילי כעת דגימה bioaerosols לאיתור וירוסים. הפרוטוקול זה שמוצג כאן בתוך תא bioaerosol לפי הזמנה באמצעות וירוסים MS2, שפעת, שהן מטרות שימושי עבור פיתוח שיטות בשל העובדה כי הם מייצגים דוגמאות של וירוסים מעטפת שאינו אפוף, MS2 מזוהה כמספר הפונדקאית של וירוסים המעית והם מועסקים בדרך כלל בהערכה של impingers22,26,27,28,29.

העבודה העתידי יכלול אופטימיזציה של תנאים דגימה (קרי, מהירות דגימה של אוויר, אוסף מאגרים) והכללה של וירוסים רלוונטיים נוספים בבדיקת הפרוטוקולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מימון של ה-CDC/NIOSH גבוהה המישורים Intermountain המרכז החקלאי בריאות ובטיחות (5U54OH008085) ואת קולורדו Bioscience גילוי הערכה גרנט התוכנית (14BGF-16).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) American Type Culture Collection ATCC 15597-B1
FluMist Quadrivalent AstraZeneca Contact manufacturer Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855195
Primers and probes Integrated DNA Technologies NA
0.2 µM sterile filter NA NA
1 L pyrex bottles or equivalent NA NA
1 mL pipet tips NA NA
1 mL pipettor NA NA
50 mL serological pipet NA NA
PCR tubes NA NA
Pipet-aid or equivalent NA NA
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904
QuantiTect Probe RT-PCR Kit Qiagen 204443
Amberlite IRA-900 chloride form Sigma-Aldrich 216585-500G
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368-10PAK
Water (molecular biology grade) Sigma-Aldrich W4502-1L
Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher 13-698-791
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes  ThermoFisher 14-432-22
Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher 05-538-62
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX ThermoFisher 11745100
SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set SKC Inc. 225-9593
Vac-u-Go sample pumps SKC Inc. 228-9695
Collison nebulizer (6-jet) BGI Inc. NA
HEPA capsule PALL 12144
Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 TSI Inc. NA
Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A TSI Inc. NA
SidePak AM510 personal aerosol monitor TSI Inc. NA
Bioaerosol chamber NA NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pirtle, E. C., Beran, G. W. Virus survival in the environment. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 10, (3), 733-748 (1991).
  2. Nguyen, T. M., et al. A community-wide outbreak of legionnaires disease linked to industrial cooling towers--how far can contaminated aerosols spread? The Journal of Infectious Diseases. 193, (1), 102-111 (2006).
  3. Marks, P. J., et al. Evidence for airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant. Epidemiology and Infection. 124, (3), 481-487 (2000).
  4. Marks, P. J., et al. A school outbreak of Norwalk-like virus: Evidence for airborne transmission. Epidemiology and Infection. 131, (1), 727-736 (2003).
  5. Corzo, C. A., Culhane, M., Dee, S., Morrison, R. B., Torremorell, M. Airborne detection and quantification of swine influenza a virus in air samples collected inside, outside and downwind from swine barns. PLoS One. 8, (8), e71444 (2013).
  6. Anderson, B. D., et al. Bioaerosol sampling in modern agriculture: A novel approach for emerging pathogen surveillance. The Journal of Infectious Diseases. 214, (4), 537-545 (2016).
  7. Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 17, (2), 198-200 (2005).
  8. Jonges, M., et al. Wind-mediated spread of low-pathogenic avian influenza virus into the environment during outbreaks at commercial poultry farms. PLoS One. 10, (5), e0125401 (2015).
  9. Otake, S., Dee, S. A., Jacobson, L., Torremorell, M., Pijoan, C. Evaluation of aerosol transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus under controlled field conditions. The Veterinary Record. 150, (26), 804-808 (2002).
  10. Wu, Y., et al. Aerosolized avian influenza A (H5N6) virus isolated from a live poultry market, China. The Journal of Infection. 74, (1), 89-91 (2017).
  11. Choi, M. J., et al. Live animal markets in Minnesota: A potential source for emergence of novel influenza A viruses and interspecies transmission. Clinical Infectious Diseases. 61, (9), 1355-1362 (2015).
  12. Haig, C. W., Mackay, W. G., Walker, J. T., Williams, C. Bioaerosol sampling: Sampling mechanisms, bioefficiency and field studies. The Journal of Hospical Infection. 93, (3), 242-255 (2016).
  13. Anderson, B. D., Lednicky, J. A., Torremorell, M., Gray, G. C. The use of bioaerosol aampling for airborne virus surveillance in swine production facilities: A mini review. Frontiers in Veterinary Science. 4, 121 (2017).
  14. Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72, (3), 413-444 (2008).
  15. Hogan, C. J. Jr Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles. Journal of Applied Microbiology. 99, (6), 1422-1434 (2005).
  16. Yu, K. -P., Chen, Y. -P., Gong, J. -Y., Chen, Y. -C., Cheng, C. -C. Improving the collection efficiency of the liquid impinger for ultrafine particles and viral aerosols by applying granular bed filtration. Journal of Aerosol Science. 101, 133-143 (2016).
  17. Perez-Mendez, A., et al. Evaluation of a simple and cost effective filter paper-based shipping and storage medium for environmental sampling of F-RNA coliphages. J Virol Methods. 194, (1-2), 60-66 (2013).
  18. Chandler, J. C., et al. Field-based evaluation of a male-specific (F+) RNA coliphage concentration method. Journal of Virological Methods. 239, 9-16 (2017).
  19. Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Concentration of enteric viruses from tap water using an anion exchange resin-based method. Journal of Virological Methods. 206, 95-98 (2014).
  20. Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Evaluation of an anion exchange resin-based method for concentration of F-RNA coliphages (enteric virus indicators) from water samples. Journal of Virological Methods. 204, 109-115 (2014).
  21. Kammerer, J., Carle, R., Kammerer, D. R. Adsorption and ion exchange: Basic principles and their application in food processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59, (1), 22-42 (2011).
  22. Chandler, J. C., et al. A method for the improved detection of aerosolized influenza viruses and the male-specific (F+) RNA coliphage MS2. Journal of Virological Methods. 246, 38-41 (2017).
  23. Friedman, S. D., Cooper, E. M., Calci, K. R., Genthner, F. J. Design and assessment of a real time reverse transcription-PCR method to genotype single-stranded RNA male-specific coliphages (Family Leviviridae). Journal of Virological Methods. 173, (2), 196-202 (2011).
  24. Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of three influenza A and B real-time reverse transcription-PCR assays and a new 2009 H1N1 assay for detection of influenza viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, (11), 3870-3875 (2010).
  25. Cademartiri, R., et al. Immobilization of bacteriophages on modified silica particles. Biomaterials. 31, (7), 1904-1910 (2010).
  26. Michen, B., Graule, T. Isoelectric points of viruses. Journal of Appled Microbiology. 109, (2), 388-397 (2010).
  27. Turgeon, N., Toulouse, M. J., Martel, B., Moineau, S., Duchaine, C. Comparison of five bacteriophages as models for viral aerosol studies. Applied and Environmental Microbiology. 80, (14), 4242-4250 (2014).
  28. Vergara, G. G., et al. Evaluation of FRNA coliphages as indicators of human enteric viruses in a tropical urban freshwater catchment. Water Research. 79, 39-47 (2015).
  29. Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L. 3rd, Jaykus, L. A. Aerosolization of a human norovirus surrogate, bacteriophage MS2, during simulated vomiting. PLoS One. 10, (8), e0134277 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics