陰イオン交換樹脂を用いるバイオエアロゾルからのウイルスの検出

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Summary

陰イオン交換樹脂ベース方法、ウイルスのバイオエアロゾルの衝突によるサンプリングを示した液体に適応します。下流分子の検出と相まって、メソッドはバイオエアロゾルからのウイルスの簡便かつ高感度検出できます。

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Schaeffer, J. W., Chandler, J. C., Davidson, M., Magzamen, S. L., Pérez-Méndez, A., Reynolds, S. J., Goodridge, L. D., Volckens, J., Franklin, A. B., Shriner, S. A., Bisha, B. Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin. J. Vis. Exp. (138), e58111, doi:10.3791/58111 (2018).

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Abstract

このプロトコルは、ウイルスのカスタマイズされたバイオエアロゾル サンプリング メソッドを示します。このシステムでは、負荷電のウイルスの効果的な濃度の液体の衝突に基づく空気サンプリング装置をバイオエアロゾルから陰イオン交換樹脂が結合されます。したがって、樹脂はバイオエアロゾル サンプリング ワークフローの添加濃度ステップとして機能します。ウイルス粒子の核酸抽出が陰イオン交換樹脂、分子解析に適した結果サンプルから直接実行されます。さらに、このプロトコル記述特注バイオエアロゾルの商工会議所の様々 な環境条件や温度、湿度などの環境変数の連続的な監視を可能にするの下でウイルスを含んだバイオエアロゾルを生成する能力が風の速度、およびエアロゾル質量濃度。このプロトコルを使用しての主な利点は、そのまま従来液体リンカーンインピン ジャーへの直接比較によって評価ウイルス検出の感度の向上です。その他の利点には、多様な負荷電ウイルス、陰イオン交換樹脂 (サンプルあたり ~$0.14)、使いやすさと低コストを集中する可能性があります。デメリットがこのプロトコルの樹脂に吸着したウイルス粒子の感染性を評価できないと液体サンプリング バッファーの最適化の必要性が、インピン内で使用される可能性があります。

Introduction

このメソッドの目的は、バイオエアロゾルからのウイルスの負荷電の分子の検出を容易にする高感度バイオエアロゾル サンプリング プラットフォームを提供することです。微生物、ウイルス粒子を含むバイオエアロゾルの時間1の長時間生き残ることができます。バイオエアロゾル比較的長距離移動し、冷却塔の影響を受けた個人から 6 km の距離に位置する工業に由来するレジオネラ症の発生によって証明されるように発芽力と感染力を維持し、18 死亡者2で起因しました。人間バイオエアロゾルを介したウイルスの間接感染は複数の設定で発生することができ、学校やレストランの3,4におけるノロウイルス感染アウトブレイクの実証されています。同様に、ウイルスのバイオエアロゾル伝送生産設備5,間のウイルスの動きの主要な要因と見なされているこの経路で豚や家禽農場で農業設定で発生する可能性6,7,8,9

どの h5 型インフルエンザ ウイルスが検出された生きている動物のバイオエアロゾル市場中国でのデモで示すように、迅速な診断と発生防止のための対策の改善のためウイルスを含んだバイオエアロゾルの効果的なサンプリングを可能とアメリカ合衆国の1011。現在バイオエアロゾル サンプリング技術は異なるパーティクル キャプチャ原則の数を含む、インピン、サイクロン、インパクター、およびフィルター12に広く分類することができます。それはこのプロトコルのすべての利点を余すところなくカバーするの範囲とバイオエアロゾル; からウイルスのサンプリングのためのこれらのプラットフォームのデメリットを超えてただし、これらのサンプリング デバイスの大半がウイルスやバクテリオファージ13コレクションの最適化されていない記述できます。さらに、液体のインピン固体インパクターやフィルター14などのデバイスのサンプリングよりもより効果的にウイルスの感染性を維持するために考えと、ウイルス粒子の感染はしばしば否定的影響します。液体の衝突の 1 つの欠点はターゲットの希釈効果、ウイルスにコレクションの容器内の液体の比較的大きなボリューム (通常 ≥20 mL) で収集するために発生します。もう一つの重要な欠点を含む粒子を濃縮する液体インピンの最適効率 < サイズ150.5 μ M。ただし、固定は、ウイルス核酸とウイルス感染16,17の保存を高めることができるとこれらの装置の捕集効率を固体マトリックスに固定化によって改善できます。

我々 は以前陰イオン交換樹脂がキャプチャと F RNA バクテリオファージ、A 型肝炎ウイルス、ヒト アデノ ウイルスやロタウイルス18,19 を含む液体の行列からのウイルスの集中のための効果的なツールであることを示しています。 ,20。製造元によって定義された、本研究で陰イオン交換樹脂は機能性第四紀アミン グループの仲介する魅力と21液中の陰イオンのキャプチャ用いたポリスチレン強基本陰イオン交換樹脂.その結果、陰イオン交換樹脂は、net 負の表面電荷、多く腸管系ウイルス、インフルエンザ ウイルス、公共と動物の健康に関連するその他のウイルスなどのウイルスをキャプチャする予定です。

現在のプロトコルは、液体インピンに陰イオン交換樹脂の付加を含みます。このシステムでは、樹脂はインピン液体で捕獲したウイルス粒子のセカンダリ濃度ステップとして機能します。核酸は、小さなボリューム、分子解析の集中のサンプルを提供することで直接溶出することができます。したがって、このメソッドの主な利点は、主にサンプル量の削減を通じて、ウイルス検出感度の改善です。さらに、ウイルスの負荷電の固有の非特異的キャプチャ、ためメソッドは可能性があります興味のあるウイルスの大規模な数の検出のために適当。ここでは、メソッドは、ワクチン株の A 型と B 型のインフルエンザ ウイルスと FRNA ファージ MS2 (MS2) に示されています。これらのウイルスでは、前述の22として標準 qRT PCR の試金を使用して検出されます後。エンドポイント ユーザーは困難に遭遇、このメソッドを実行するために期待しないでください現在既存の修正装置はバイオエアロゾル サンプリング及び分析の従来の流れに大きな混乱を構成しません。

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Protocol

1. バイオエアロゾルの部屋のセットアップ (図 2参照)

  1. 20 ml の 0.01 M リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.5 (PBS) の液体のインピンのスプリングプリ ロードします。
    1. 陰イオン交換樹脂の 0.5 g を追加し、1 つのコントロールとして別の液体インピンに液体のインピン PBS 中に一時停止します。
  2. クランプ スタンドを用いたネブライザーに直面してエアロゾル入り江バイオエアロゾル チャンバ内の並行位置液体インピン。
    注: 詳細については図 2を参照してください。
  3. ダイレクト読み取りエアロゾル モニター、バイオエアロゾルの質量濃度 (mg/m3) を測定する液体インピンの近くを共存します。
  4. 追加のダイレクト読み取りインストルメンテーション (室内空気質モニターと熱風速計) を共存環境変数、温度などを監視する液体インピンに近い湿度と風速度、バイオエアロゾル チャンバー内。
  5. エアロゾルの混合を容易にするバイオエアロゾル室の隅に軸流ファンを実行します。
    注: 軸流ファンは一定のスピードで走る、調節可能ではないです。

2. モデル Bioaerosolization 実験 (図 3参照)

  1. シリアル、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で必要な濃度に MS2 バクテリオファージとインフルエンザ ワクチンの 10 倍希釈を行います。
    注: 103.5型 A と B インフルエンザ ウイルス ワクチン株の FFU/mL と 10 をここでは、メソッドを示す5 Pfu/ml MS2 バクテリオファージが利用されています。抗体は、接種を判断するには、ファージが大腸菌HS (pFamp) R で伝達され、前述20として列挙します。商業ワクチン 4 ライブ弱毒ウイルス インフルエンザの知られている数量が含まれている、2 つはインフルエンザ ウイルスや FFU または蛍光フォーカス単位で表される、2 つの B 型インフルエンザ ウイルスを入力します。
  2. 100 mL の PBS でウイルス粒子の希望濃度の懸濁液を作成することによって 6 噴流衝突ネブライザーのガラス容器内で接種を準備し、カスタム バイオエアロゾル チャンバ内でインストールします。
  3. 温度、% の相対湿度、炭酸ガス濃度などのバイオエアロゾル チャンバー内の変数を測定し、(軸流ファンを使用して生成された) 風速の計測を開始します。ダイレクト読み取りエアロゾル モニターを使用して、バイオエアロゾル チャンバ内でマスの集中化を追跡し、内と試験間の一貫性を確立します。
  4. バイオエアロゾル チャンバーを密封し、HEPA フィルターの空気と 10 分のためのパージします。
  5. 6.9 kPa でネブライザーにフィルター処理された、乾燥した空気を提供します。
  6. 各バイオエアロゾル チャンバー試験でウイルス バイオエアロゾル (ネブライザー) を経由してターゲット濃度を生成します。このデモでは、5 mg/m3の濃度とバイオエアロゾルが生成されます。
  7. エアロゾルの対象質量濃度に達している、一度止めます。
  8. サンプリング ボリュームの一貫性を確保するため各サンプリング イベント前後に一次流量標準を用いた行動校正の 12.5 L/分の流量を調整して各の液体インピンの空気サンプリング ポンプを動作します。供給希釈は噴霧器の近くにある HEPA フィルターの行を使用して空気し、商工会議所で一定の圧力を維持します。
  9. 積極的にバイオエアロゾル炉内雰囲気のサンプル 1 サンプルあたり 500 L の採取量を達成するために 40 分の期間の。
    注: サンプリング、並列に 2 つのポンプで 12.5 L/分の 40 分間、バイオエアロゾルの 1,000 L のサンプリングのためことができます。したがって、実験終了でバイオエアロゾル チャンバー内の空気の大半のサンプリングし、HEPA フィルターのシステムを通じて、地球環境に放出ことが期待されます。これは、粒子濃度の減少によって証明されます。後の実験では、表面は 10% 家庭用漂白剤と 70% エタノールで除染します。指標は、このデモで使用されます。ただし、病原体はこのシステムで使用される知られている、その他バイオ セーフティ対策は必要に応じて実装可能性があります。

3. 核酸抽出と qRT PCR 検出

  1. 陰イオン交換樹脂から直接と、液体インピンの内で使用される液体からの比較の目的のための核酸を分離します。この例では、RNA の隔離プロシージャを説明すると、しかし、DNA ウイルスに類似したプロトコルを使用できます。
    1. 陰イオン交換樹脂からの核酸の分離。
      1. 滅菌 50 mL の円錐管に液体インピンの陰イオン交換樹脂を含む液体のすべてを転送します。
      2. 解決、樹脂と陰イオン交換樹脂から液体のサンプルをゆっくりとデカントします。陰イオン交換樹脂から残りの液体のすべてを削除するのにには、1 mL ピペット チップを使用します。
      3. ウイルス RNA 分離キットから陰イオン交換樹脂に直接キャリア RNA を含むウイルスの換散バッファーの 560 μ L を追加し、周期的な混合を室温で 10 分間インキュベートします。
      4. 1 mL のピペット チップを使用して転送ウイルス ライセート (ウイルスの換散バッファー) 滅菌 1.5 ml コニカル チューブし、RNA を続行ウイルス RNA の隔離を使用して分離キット (材料の表を参照してください) 製造元の指示に従ってを除いてその RNA は 60 μ L の溶出バッファーの総量で溶離されます。
    2. 液体インピンから核酸分離。
      1. 滅菌 1.5 mL の円錐管に液体のサンプルの 140 μ L をピペット、RNA を量 60 μ L の溶出バッファーで溶出を除いて、製造元の指示に従ってウイルス RNA 分離キットを使用しての RNA の隔離を実行します。
        注: 140 μ L は、シングル ステップの準備に従事する特定のウイルス RNA 分離キットで処理できる最大サンプル ボリュームです。
  2. QRT PCR 前述23,24MS2 とインフルエンザ A、B ウイルスの検出を実行します。このデモでは、核酸の波の 5 μ L、qRT PCR のため使用されます。

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Representative Results

図 1は、インピンの液状樹脂の含有によりバイオエアロゾルからウイルスのキャプチャを充電ベースの背後にある原理を示しています。図 2は、特注のバイオエアロゾルの部屋のセットアップを示しています。図 3では、エアロゾル化実験と措置の設定品質管理を確保するために必要な手順について説明します。QRT PCR 検出バイオエアロゾルからキャプチャされた負荷電のウイルスの増幅曲線を図 4に示します。表 1は、プライマーと本研究で用いた例ウイルス qRT PCR 用プローブを示します。

カスタム バイオエアロゾル チャンバーでモデルとしてインフルエンザ ワクチンに含まれる MS2 とインフルエンザのウイルスを使用して、液体のインピン変更約 3 x 9 x 改善によって、ウイルスの検出のため許可されて陰イオン交換樹脂ウイルスは、直接的な衝突液体22のテストと比較して。代表 qRT PCR 増幅曲線 (図 4) のように、インフルエンザ ウイルスは、3.26 まで達成できるタイプの検出サイクル早くを衝突液体を直接テストする陰イオン交換樹脂を用いるとき。100% の効率である qRT pcr、1 Ct のゲインされ、ターゲット濃度の 2 倍の増加に対応することを考えると、この違いは、検出で 9 秒 58 x 改善と同等です。

Figure 1
図 1: 陰イオン交換樹脂と相まって液体衝突。各変更されたバイオエアロゾル サンプリング デバイスはそのデザインに陰イオン交換樹脂を組み込みます。それぞれの樹脂ビーズは多孔性の表面、陰イオン交換表面積を増加させる特性を持つ 0.5 〜 1.0 mm 球です。Net 負の表面電荷、(、尾のモデル生物としてこのプロトコルで使用されている MS2 coliphages およびインフルエンザ ウイルスを含むウイルスのキャプチャを仲介する液体培地におけるイオンの捕獲のため機能的な第四級アンモニウム グループを使用します。バクテリオファージが描画されるここではキャプチャされたウイルスの例として)。核酸の分離が最も分子検出戦略 (qRT PCR がここに採用) に適したサンプル (市販のキットを使用して)、ガレージから直接実行されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: カスタム バイオエアロゾルの商工会議所のスケマティック。A: 6 ジェット噴霧器生成 6.9 kPa の圧力でフィルター処理および乾燥空気を供給B: 制服 bioaaerosol 混合を容易にする軸流ファンC: 相対バイオエアロゾル濃度; を識別するためにエアロゾル モニターD: 樹脂; 液体インピンE: 樹脂なし液体インピンF: 風の速度を測定するための熱風速計G: % の相対湿度、二酸化炭素、温度を含むその他の環境変数を測定する空気質モニターH: アクティブ サンプリング ポンプ 12.5 L/分の校正I: 空気圧シール バイオエアロゾル チャンバ; サンプリング装置を位置決め用グローブ ポートJ: 観測窓。この図はだった前作から22出版社の許可を得て再利用。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: bioaerosolization 実験ワークフローこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 陰イオン交換樹脂は、バイオエアロゾルの負荷電のウイルスの qRT PCR による検出を向上させる。この例では 103.5 FFU/mL の接種濃度型のインフルエンザ ウイルスは、バイオエアロゾル質量濃度 5 mg/m3に達するまでカスタム バイオエアロゾル室に吸入されました。液体インピン樹脂と同時に、バイオエアロゾルの各サンプル (500 L) に従事していた。ウイルス RNA は陰イオン交換樹脂、インピンの液から得られた、qRT PCR によって試金されます。3 通で実験を繰り返していた。インピン液体試料は 30.02 (3.26 の ΔCt) の平均 Ct で検出されたに対し、26.76 の平均 Ct 樹脂標本から得られる核酸が検出されました。この Ct の違いは、陰イオン交換樹脂を用いた検出の 9 秒 58 x 改善と同等です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

ウイルス プライマー名 プライマー シーケンス 参照
MS2 GI Fwd 5'-ATCCATTTTGGTAACGCCG-3' 23
GI プローブ 5'-(6-FAM)-TAGGCATCTACGGGGACGA-(BBQ)-3'
消化管の回転 5'-TGCAATCTCACTGGGACATAT-3'
IAC Fwd (46F) 5'-GACATCGATATGGGTGCCG-3'
IAC プローブ 5'-(Cy5) - CACATTCACCAGGGAGACGCATGAGA-(バーベキュー)-3'
IAC Rev (186R) 5'-CGAGACGATGCAGCCATTC-3'
A 型インフルエンザ ウイルス CDC の普遍的なインフルエンザ ウイルスを転送プライマー 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3' 24
CDC の普遍的なインフルエンザ ウイルス逆プライマー 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3'
CDC 普遍的なインフルエンザ A ウイルス プローブ 5'-(FAM) - TGC AGT CCT シージーシー TCA CTG GGC ACG-(BHQ1)-3'
B 型インフルエンザ ウイルス CDC 万能インフルエンザ B ウイルス前方プライマー 5'-TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG-3' 24
CDC 万能インフルエンザ B ウイルス逆プライマー 5'-CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3'
CDC 万能インフルエンザ B ウイルス プローブ 5'-(ジョー) - CCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTG-(BHQ1)-3'

表 1: プライマーと本研究で使用されるプローブします。すべてのプライマーとプローブは、フリードマン201123から Selvaraju

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Discussion

このプロトコルは、使用変更された液体インピン バイオエアロゾルから機密のウイルス キャプチャする方法をについて説明します。メソッドは、バイオエアロゾルのウイルス負荷の検出と定量に最適です。ここに示す特定の変更は、一般的な液体インピンに含まれる液体を陰イオン交換樹脂の付加を含みます。このメソッドは、遠心分離、ろ過、沈殿法などサンプル加工技術は、このような利点を提供していないに対し、下流のサンプル処理の単純さのため開発されました。核酸の抽出は高ボリューム有害の溶出の必要性と複数のサンプル準備のステップは、最終的に削減で効果的なサンプル方法の改善された検出感度に貢献がなくなります、ガレージから直接実行します。ボリューム。さらに、それは固体のウイルス粒子の固定化を示されている表面は、ウイルス核酸の安定性の向上やウイルス感染17,25の保持に貢献できます。固定化は可能性がありますさらに、reaerosolization16による損失を軽減増加キャプチャ効率に貢献します。メソッドは簡単に下流分子解析 (qRT PCR 紹介) と結合することができます。陰イオン交換樹脂をフィールド抽出し、空気サンプリング装置できるサンプリング領域におけるモニタリング専用まま参照実験室の分析のために出荷される可能性があります。手順の背後にある原理は、純負電荷を運ぶウイルスの非固有のキャプチャを含む、メソッドは人間の健康と獣医学の重要性の複数の病原性ウイルスの検出に対応しやすいを想定します。Michen と Graule26見直し、公共と動物の健康に重要なウイルスの数が多い純負の表面電荷、いくつかの知られている例外を除いて、特定の菌株のロタウイルス、ポリオ ウイルスなどがあります。

このプロトコルは直接検出の感度に及ぼす環境条件を評価します。ただし、フィールドの設定の空気のサンプリングが行われているとき相対湿度や温度などの変数に影響すること集効率空気サンプラー12のさまざまなタイプが考えられます。したがって、バイオエアロゾル チャンバー内の条件は、必要に応じてこれらの環境パラメーターに合わせて修正されるかもしれません。物性、粒子状物質、細菌、および他の環境から、干渉を示す広い範囲で水試料から複数のウイルスを効果的に集中する陰イオン交換樹脂法が示されています。汚染物質は、最小限の18をする予定です。さらに、コレクションのバッファーは、示されているコレクション バッファーの最適化ウイルス安定27の定着化につながることができるいくつかのケースのように、特定のウイルスの最適化を必要があります。提示はメソッドの主な欠点は、ウイルス感染を判断できない事実です。このプロトコルの別の欠点は、ネブライザーの潜在的に否定的な影響を評価し、ウイルスの安定性、乾燥、シャーリング、バイオエアロゾル チャンバー面22の非特異吸着などに採取できません。

変更されたバイオエアロゾル サンプリング デバイスは、病院、学校、農業の操作、他の会場など複数の設定でフィールド ベースのサンプリングに従うことができます。既存の空気サンプリング装置に変更を加えるのでによって期待される修正されたデバイスに容易に採用可能ななる演算子は現在のウイルスのバイオエアロゾルをサンプリングします。MS2 はプロトコルは非エンベロープやエンベロープ ウイルスの例を表すという事実のために法の開発のための便利なターゲットを MS2 およびインフルエンザ ウイルスを用いた特注バイオエアロゾル室の紹介として認識されて、インピン22,26,27,28,29の評価における腸管系ウイルスのサロゲートを採用します。

サンプリング条件 (すなわち空気のサンプリング速度、コレクション バッファー) の最適化とプロトコルのテストに追加の関連するウイルスの包含、今後の作業が含まれます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作業は、農業の保健及び安全性 (5U54OH008085) の CDC/NIOSH 高平原 Intermountain センターとコロラド州バイオ検出評価助成プログラム (14BGF 16) からの資金によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) American Type Culture Collection ATCC 15597-B1
FluMist Quadrivalent AstraZeneca Contact manufacturer Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855195
Primers and probes Integrated DNA Technologies NA
0.2 µM sterile filter NA NA
1 L pyrex bottles or equivalent NA NA
1 mL pipet tips NA NA
1 mL pipettor NA NA
50 mL serological pipet NA NA
PCR tubes NA NA
Pipet-aid or equivalent NA NA
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904
QuantiTect Probe RT-PCR Kit Qiagen 204443
Amberlite IRA-900 chloride form Sigma-Aldrich 216585-500G
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368-10PAK
Water (molecular biology grade) Sigma-Aldrich W4502-1L
Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher 13-698-791
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes  ThermoFisher 14-432-22
Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher 05-538-62
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX ThermoFisher 11745100
SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set SKC Inc. 225-9593
Vac-u-Go sample pumps SKC Inc. 228-9695
Collison nebulizer (6-jet) BGI Inc. NA
HEPA capsule PALL 12144
Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 TSI Inc. NA
Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A TSI Inc. NA
SidePak AM510 personal aerosol monitor TSI Inc. NA
Bioaerosol chamber NA NA

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References

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