כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G., Heit, B. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58149, doi:10.3791/58149 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

לומד ברגולציה של efferocytosis דורש שיטות שבהן ניתן לכמת במדויק את ספיגת בתאים אפופטוטיים להיפגע וכדי לחקור את התהליכים איתות וסלולריות השולטים efferocytosis. כימות זה יכול להיות קשה לביצוע כמו מוות תאים הם לעתים קרובות efferocytosed תקנה, ובכך המחייב שיטות אשר יכול ניסחו באופן מדויק בין החלק efferocytosed של מטרה אפופטוטיים להיפגע לעומת שיורית סלולרי unengulfed שברי. הגישה המתוארים במסמך זה מנצל כפול-תיוג גישות לכמת במדויק את הדינמיקה של קיבולת efferocytosis ו- efferocytic של efferocytes כגון מקרופאגים. ציטוזול התא מוות מסומן עם צבע התא-מעקב כדי לאפשר פיקוח על כל מוות נגזר תא החומרים, בעוד biotinylation פני השטח של התא אפופטוטיים להיפגע מאפשר בידול בין למביטה והפנמתי הלא מוות תא שברים. יכולת efferocytic של efferocytes נקבע על-ידי לקיחת תמונות פלורסנט של תאים חיים או קבוע לכימות כמות מאוגד נגד מטרות למביטה, כפי מובחנת על ידי צביעת streptavidin. גישה זו מציעה מספר יתרונות על פני שיטות כגון cytometry זרימה, כלומר את התיחום מדויק של הלא-efferocytosed לעומת efferocytosed מוות תא שברים, היכולת למדוד דינמיקה efferocytic על ידי מיקרוסקופ לחיות תאים, ו היכולת לבצע מחקרים של איתות בתאים המבטאים שכותרתו fluorescently transgenes. משולב, השיטות המתוארות ב פרוטוקול זה תשמש כבסיס לגישה ניסויית גמיש יכול לשמש כדי לכמת במדויק את פעילות efferocytic ולחקור הסלולר איתות המסלולים פעיל במהלך efferocytosis.

Introduction

אפופטוזיס, או מוות תאים מתוכנת, היא תהליך פיזיולוגי מאוד מווסתות מתרחשת אצל רוב אורגניזמים רב תאיים, הוא קריטי עבור שלהם ופיתוח הומאוסטזיס1. בנוסף להיות מעורב תחלופת תאים נורמליים ופיתוח עובריים, אפופטוזיס מאפשר חיסול של תאים נגועים או פגומים של רקמות, יכולה להיות מופעלת בתגובה זיהום, דלקת, סרטן, וגם על ידי התערבויות רפואיות כגון הקרנות או סטרואידים1. מוות תאים לחשוף "לאכול-לי" אותות על פני השטח של התא, אשר מוכרים על ידי רצפטורים על מגוון של phagocytes מקצועי, בלתי מקצועיים, המכונות במקובץ "efferocytes". האירוסין של רצפטורים אלו המניע את ספיגת והשפלה של התא אפופטוטיים להיפגע על ידי efferocyte באמצעות תהליך המכונה efferocytosis2,3. Phosphatidylserine הוא הטוב ביותר מאופיין לאכול-לי אות efferocytosis נהיגה. זה בדרך כלל מוגבל העלעל הפנימי של קרום פלזמה, עם אפופטוזיס הפעלה של scramblase שומנים בדם אשר משבש סימטריה קרום זה, ובכך חושף בפני phosphatidylserine על פני השטח התא4. Phosphatidylserine נמצא על פני השטח חוץ-תאי של כמה תאים שאינם אפופטוטיים להיפגע, כגון מקרופאגים בוגרת ומופעל טסיות. עם זאת, תאים אלה אינם efferocytosed בשל נוכחותם של "אל תאכל אותי" אותות, כגון CD47,6,שלהם משטח5,תא7. Phosphatidylserine חשוף מזוהה על ידי מערך של קולטני efferocytic לידי ביטוי efferocytes. איגוד של רצפטורים אלו כדי phosphatidylserine, ישירות או באמצעות הסיוע של opsonins, הפעלת איתות המסלולים המקדמים את היבלעות של התא אפופטוטיים להיפגע לתוך חלולית ממברנה מכורך כינה את efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. efferosome ולספות ברצף עם endosomes ו lysosomes, אשר מספקים את המנגנון המולקולרי הדרושים כדי acidify את efferosome וכדי לבזות את מוות תא המטען13,14. ברגע מושפל, החומרים הנגזרות תא אפופטוטיים להיפגע הם הנסחר אנדוזום מיחזור – תהליך אשר מגביל את תגובות מערכת החיסון כדי מוות נגזר תא אנטיגנים, אשר עשוי לאפשר התאוששות של חומרים מזינים מוות תא13, 15. כישלון efferocytosis תוצאות סיקול לקוי של מוות תאים; תאים אלה שלא סולק בסופו של דבר עוברים נמק משנית. תאים עם נמק לשחרר תוכן cytosolic פרו דלקתיים, פתוגנים, autoantigens לתוך חצרו חוץ-תאית, ובכך גרמה מגוון של מחלות זיהומיות, דלקתית אוטואימונית16,17. יחד, אפופטוזיס ועל efferocytosis להקל על הסרת תאים מתים וכל מת וגם מאפשרים שמירה על הומאוסטזיס רקמות.

לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס efferocytosis דורש שיטות המספקים כימות ברורה של ספיגת תא אפופטוטיים להיפגע. כימות הזה, זה מורכב על ידי העובדה כי בניגוד אחרים ספיגת מנגנונים כגון אנדוציטוזה phagocytosis18,19, efferocytosis לא עלולה היבלעות של תא היעד ללא פגע, והתוצאה היא תפיסה טיפין טיפין התא אפופטוטיים להיפגע על-ידי efferocyte20. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מתאר של במבחנה efferocytosis assay המספק תיחום מדויק של למביטה לעומת הלא-הפנימו חלקים של תאים בודדים אפופטוטיים להיפגע, יכול להיות משולב עם מגוון תאים קבוע, גישות לחיות תאים במיקרוסקופ. מבחני phagocytosis מסורתי להוסיף נוגדנים ספציפיים אל היעד phagocytic בסוף הניסוי כדי לתייג לא הפנימו את המטרות, בעוד השיטה שלנו שונה בכך labelling המטרה אפופטוטיים להיפגע עם ביוטין מקושר covalently21 , 22. בזמן מוות תא נוגדנים ספציפיים שיכולים לשמש זה וזמינותו, הגישה biotinylation מאפשר עבור כל מטרה חלבון מניבי להיות מתויגת, מונע בעיות אפשריות עם נוגדנים משניים אשיג אם immunostaining מתבצע . באופן ספציפי, אנחנו חלוקה לרמות את הכנת אפופטוטיים להיפגע Jurkat תאים שעברו שהוכתמו כפול עם צבע מעקב תא והן ביוטין. מעקב אחר לצבוע את התא מאפשר אפופטוטיים להיפגע חומרים נגזר התא להיות במעקב במהלך efferocytosis, ואילו biotinylation משטח מאפשר האפליה של הפנימו מחלקים שאינם הפנימו efferocytosed מוות תאים. אנו מתארים גם את התרבות והכנה של שורות תאים J774.2 ו- THP-1 עבור שימוש כמו efferocytes מאתר ואנושי, נגזר מונוציט מקרופאגים M2 כדוגמה efferocytosis התא הראשי ותאים Jurkat לשימוש כמטרות efferocytic. שיטות אלה ניתן להחיל בקלות שורות תאים או ראשי תאים, התאים היעד שעברו כל צורה של מוות תאי (אפופטוזיסלמשל , נמק, necroptosis), וכדי מחקה בגודל מיקרון שידמה מוות תאים דרך השומנים ציפויים אחרים או ציפוי עם ליגנדים ספיציפית הקולטן efferocytic עניין.

השיטה המתוארות ב פרוטוקול זה יש כמה יתרונות על פני שיטות cytometry מבוסס זרימה נפוץ23,שדה24. על ידי הדמיה ישירות את האינטראקציה תא פגוציט-מוות, בשילוב עם תיוג ברור של שני חומר תא הכולל והפנמתי הלא מוות, מדדים כמותיים של efferocytosis יכול להתבצע. יתר על כן, מגביל השימוש fluorophores pH-רגישות גורמים מבלבלים כגון הדיכוי של זריחה FITC ו- GFP ב- pH lysosomal שמבלבלת כמה שיטות אלטרנטיביות25. לבסוף, בעוד לא תיאר בפירוט, שיטות אלה יכול להיות מועסק באמצעות efferocytes לבטא שכותרתו fluorescently transgenes, או עם קיבוע שאחרי immunostaining, כדי לאפשר על כימות של פעילות מולקולת איתות וניטור של תהליכים תאיים במהלך efferocytosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אוסף של דם מתנדבים בריאים אושרה על ידי הלוח אתיקה של אוניברסיטת מערב אונטריו מחקר מדעי בריאות. Venipuncture בוצעה בהתאם לקווים המנחים של הצהרת מדיניות Tri-המועצה על מחקר אנושי.

1. תרבות והכנה של הקו הסלולרי מונוציט THP-1

  1. תרבות ומונוציטים THP-1 כתרבות התלוי ב- T25 מבחנות ב- C ° 37 + 5% CO2. תאים צריך לגדול ב 5 מ של רוזוול פארק אנדרטת המכון 1640 (RPMI 1640) + 10% סרום שור עוברית (FBS).
  2. כל התאים מושהה יום באופן אחיד ברחבי התקשורת גדילה ע י ניעור בעדינות את הבקבוק, ואז מיד לספור תאים עם hemocytometer. צריך להיות passaged תאים, ברגע תא צפיפות מגיע עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל...:
    1. לחמם RPMI 1640 + 10% FBS באמבט מים 37 º C.
    2. העברת 2 x 105 תאים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL או צינור חרוטי 15 מ"ל, ותאים צניפה מאת צריך שתוציאו ב 500 g x בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    3. הסר את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא, resuspend בגדר 1 מ"ל (1.5 mL microcentrifuge tube) או 5 מ"ל (צינור חרוטי 15 מ"ל) של באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
    4. צנטריפוגה הצינור ב 500 g x בטמפרטורת החדר במשך 5 דק. להסיר את PBS מבלי להפריע בגדר תא.
    5. Resuspend צנפה ב 1 מ"ל של טרי RPMI 1640 + 10% FBS.
    6. לתוך מקום הבקבוק T25 חדש 4 מ"ל של מדיה ומחוממת, וכדי זה להוסיף את התאים resuspended 1.2.5. תרבות ב 37 ° C + 5% CO2 החממה עד התאים דורשים passaging (בדרך כלל 3 ימים), או עד תאים נדרשים עבור ניסוי.
  3. עבור ניסוי עם THP 1-נגזר מקרופאגים, להסיר את המספר הנדרש של תאים מן הבקבוק צלחת לפני passaging:
    1. להכניס את המספר הנדרש של 18 מ מ ז coverslips זכוכית עגול דקה (עובי #1.5) בתוך הבארות של צלחת 12-ובכן — coverslip בדרך כלל 1 לכל תנאי ו/או timepoint. לתוך כל טוב aliquot ומונוציטים4 THP-1 5 x 10. מספר התאים הוסיף אז כל אחד יכול להשתנות, אם נדרש.
    2. מעלה את הנפח הכולל של כל תא המכיל גם כדי 1 מ"ל באמצעות RPMI + 10% FBS התחמם עד 37 מעלות צלזיוס.
    3. להוסיף 100 ננומטר phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA) מכל קידוח, תרבות במשך 3 ימים לזירוז הבידול של monocytes THP-1 לתוך תאי מקרופאג דמוי.

2. תרבות והכנה של הקו הסלולרי Macrophage J774.2

  1. התרבות התאים J774.2 T25 מבחנות ב- C ° 37 + 5% CO2. תאים צריך לגדול ב 5 מ של Dulbecco בינוני נשר שונה (DMEM) + 10% FBS ו passaged, ברגע התרבות מגיע 80-90% confluency. מעבר תאים:
    1. הסר כל המדיה הבקבוקון ואת עליית פעם אחת עם 5 מ של PBS.
    2. להסיר הבקבוקון PBS ולהחליף עם 5 מ של טרי DMEM + 10% FBS.
    3. באמצעות המגרד של התא, לגרד את תחתית הבקבוק להשעות את התאים בתקשורת. נמרצות pipette התאים מספר פעמים כדי לשבור את כל אגרגטים התא.
    4. לדלל תאים 1:5 על ידי הסרת 4 מ"ל של התליה תא הבקבוקון והחלפתו 4 מ"ל של מדיה חדשה. התליה תא הנותרים יכול להיות, המשמשים להפעלת תרבות חדשה תא בבקבוקון T25 טריים, או משמשות עבור ניסוי.
  2. כדי להגדיר עבור וזמינותו efferocytosis באמצעות J774.2 תאים:
    1. יום אחד לפני תחילת הניסוי, להשעות J774.2 תאים לתוך 5 מ של מדיה חדשה, לפי שלבים 2.1.1–2.1.3. לספור תאים באמצעות hemocytometer ולהכין את אמצעי האחסון הדרושים של תאים על ריכוז של 5 x 104 תאים/מ ל....
    2. למקם את המספר הדרוש של 18 מ מ ז coverslips זכוכית עגול דקה (עובי #1.5) הבארות של צלחת 12-. טוב. לתוך כל טוב aliquot 1 מ"ל של 5 x 104 תאים למ"ל תא ההשעיה.
    3. תרבות הלילה נעשה כדי לאפשר את התאים כדי לדבוק coverslip ולהתאושש ממנה passaging.

3. תרבות של מקרופאגים M2 אנושי ראשוני

  1. לאסוף 10 מ"ל של דם אנושי heparinized עבור כל צלחת 12-טוב של מקרופאגים M2 הנדרש.
  2. בשפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל, שכבה 5 מ"ל של דם אנושי מעל 5 מ של טרום ומחוממת פולי Lympholyte תא הפרדה בינוני. הכן טורפדו מרובים אם עיבוד > 5 מ"ל של דם, ולא באמצעות צינורות נפח גדול יותר.
  3. צנטריפוגה ב g x 300 במשך 35 דקות, באמצעות האצת בינונית ובלי הפסקה.
  4. הסר בזהירות את תאי-תא עליון עשיר הלהקה באמצעות pipettor פלסטיק להעברת שפופרת צנטרפוגה 50 מ. אם צינורות רבים היו מוכנים בשלב 3.2, הלהקות יכול להיות איחדו לתוך צינור בודד 50 מ. להביא את עוצמת הקול של הרכבת התחתית עד 50 מ עם PBS.
  5. צנטריפוגה ב g x 300 במשך 8 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע. במהלך שלב זה למקם בלוק 18 מ מ קוטר עגול coverslips (עובי #1.5) כל טוב של צלחת 12-. טוב.
  6. Resuspend בגדר תא ב- 300 µL של ללא סרום RPMI 1640 לכל מספר הרצוי בארות; למשל, אם 10 מ"ל של דם עיבדה כדי להכין צלחת טוב מלא 12, להשעות תא גלולה ב 3.6 מ של מדיה.
  7. להוסיף 300 µL של התליה תא המכילים כל אחד coverslip-טוב בצלחת 12-. טוב. תקופת דגירה של 1 h ב- C ° 37 + 5% CO2.
  8. לשטוף בעדינות את coverslip 3 x עם 1 מ"ל של PBS ומחוממת כדי להסיר תאים שאינם מחסידי.
  9. להוסיף 1 מ"ל של RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ננוגרם למ"ל רקומביננטי האנושי M-CSF + תא תרבות אנטיביוטיקה/antimycotic. דגירה ב- C ° 37 + 5% CO2 במשך 5 ימים.
  10. החלף מדיה RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ננוגרם למ"ל רקומביננטי האנושי M-CSF + 10 ננוגרם למ"ל רקומביננטי האנושי IL-4 + תא תרבות אנטיביוטיקה/antimycotic. דגירה ב- C ° 37 + 5% CO2 2 ימים להשלמת M2 קיטוב.
  11. מקרופאגים מקוטב אמור לשמש בתוך בשלושת הימים הבאים.

4. הכנת בתאים אפופטוטיים להיפגע Jurkat

  1. התרבות התאים Jurkat ב 5 מ של RPMI 1640 + 10% FBS ב- C ° 37 + 5% CO2. Jurkats קו תא ההשעיה, יכול להישמר על ידי passaging 1:5 לתוך המדיה טריים, ומחוממת מראש כל 3-5 ימים.
  2. כדי להכין בתאים אפופטוטיים להיפגע, לאפשר את התרבות Jurkat לגדול צפיפות גבוהה (4-5 ימים לאחר passaging). Aliquot 1.5 mL 1.5 mL microcentrifuge צנפה ובשעות תאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות.
  3. למחוק את תגובת שיקוע, מחדש להשעות תא גלולה ב 1 מ"ל RPMI 1640 בינוני ללא סרום המכיל 1 מיקרומטר staurosporine.
  4. דגירה 16 h ב- C ° 37 + 5% CO2 לעיבוד בתאים אפופטוטיים להיפגע.
  5. אם רצונך בכך, לאשר אינדוקציה של אפופטוזיס על ידי צביעת עם Annexin v:
    1. µL 100 aliquot של תרבית תאים Jurkat שטופלו staurosporine לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר מחדש להשעות תא גלולה ב 100 µL בינוני RPMI 1640 ללא סרום.
    2. להוסיף 1 µL של fluorescein isothiocyanate (FITC)-מצומדת Annexin V ו תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    3. הוסף µL 900 ל- PBS, להעביר האחסון כולו טוב יחיד של צלחת 12-ובכן המכיל coverslip זכוכית עגול של 18 מ מ (עובי #1.5). ספין למטה ומפרידה מצויד עם מתאם צלחת-200 g x עבור 1 דקות לאלץ את התאים לדבוק coverslip. לחלופין, ניתן להציב תאים לתוך שקופית chambered עבור הדמיה.
    4. התמונה באמצעות מיקרוסקופ זריחה.

5. לכימות ספיגת Efferocytic ואת הדינמיקה באמצעות תא קבוע Efferocytosis Assay מבפנים ומבחוץ מכתים

  1. להכין THP-1, J774.2 או M2 מקרופאגים האנושי כפי שמתואר בסעיפים 1-3, בהתאמה.
  2. ערב לפני תחילת הניסוי להכין מוות תאים Jurkat כמתואר בסעיף4.
  3. מיד לפני הניסוי, נחשב מוות תאים באמצעות hemocytometer העברת מספר מספיק של מוות תאים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL – אנו בדרך כלל מוסיפים 5 x 105 תאים/טוב, מתן יחס היעד: efferocyte של 10:1.
  4. גלולה Jurkat תאים על ידי צנטריפוגה ב 500 g x במשך 5 דקות, resuspend ב μL 500 ל- PBS.
  5. במהלך צנטריפוגה, µL 10 aliquot של דימתיל סולפוקסיד לתוך צינור 1.5 מ ל microcentrifuge. יתמוסס דימתיל סולפוקסיד כמות מזערית של N-hydroxysuccinimidobiotin (NHS-ביוטין). 5-10 קריסטלים (~0.005 mg) מספיקה.
  6. להעביר את המתלים תא/PBS אפופטוטיים להיפגע μL 500 דימתיל סולפוקסיד/NHS-ביוטין המכילה צינור. ואז לדלל תא מעקב לצבוע את הריכוז המומלץ של היצרן לתוך התליה תא אפופטוטיים להיפגע. לוודא לבחור תא מעקב צבע שאינו חופף spectrally עם FITC-Streptavidin (למשל אדום או מרחיקת אדום תא מעקב צבע).
  7. דגירה השעיה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הוסף אמצעי שווה RPMI 1640 + 10% FBS דגירה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר בחושך כדי להרוות את כל צבע unreacted.
  8. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע, וכן להשעות מחדש בתאים אפופטוטיים להיפגע מוכתמים µL 100 RPMI 1640 + 10% FBS לכל טוב של מקרופאגים.
  9. להוסיף 100 µL של השעיה תא אפופטוטיים להיפגע מוכתם dropwise כל טוב של מקרופאגים. צנטריפוגה g x 200 עבור 1 דקות ומפרידה מצויד עם מתאם צלחת לכפות קשר בין מוות תאים מקרופאגים.
  10. תקופת דגירה צלחת של תקופת הזמן ב- C ° 37 + 5% CO2 בחממה תרביות רקמה הרצוי. עבור מקרופאגים, חומר efferocytosed הוא בדרך כלל הראשון לזיהוי לאחר 20-30 דקות, ולאחר השלמת לאחר 120-180 דקות.
  11. בזמן הרצוי כרשם להסיר תאים של החממה. רחץ תאים פעמיים עם 1 מ"ל של טמפרטורת החדר PBS להפסיק efferocytosis, להסיר תאים מוות בלתי-efferocytosed.
  12. להוסיף streptavidin מצומדת FITC לדילול 1:1,000 כדי מכל קידוח, תקופת דגירה של 20 דקות בחושך. זה תווית של ביוטין חשוף על חומר תא מוות בלתי-efferocytosed.
    הערה: אם רצונך בכך, גרעין התא יכול להיות מוכתמת במהלך שלב זה תוספת של 1:20,000 לדילול Hoechst 33342 או 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (דאפי).
  13. רחץ תאים 3 פעמים עם 1 מ"ל PBS, בעדינות טלטולים או נדנדה הדגימות למשך 5 דקות לכל שטיפה. לתקן תאים עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף תאים פעם אחת עם PBS כדי להסיר עודפי מחברים.
  14. הר coverslips בשקופית עבור הדמיה והעברת מיקרוסקופ זריחה. ללכוד את z-ערימות של מספר מספיק של תאים על כימות מדויק — בדרך כלל 30-10 תאים לכל תנאי. Non-הפנימו מוות תא חומר יהיה ניכר בתמונה המתקבלת כתא מעקב צבען מתויג חומר עטוף FITC-streptavidin מכתים, בעוד efferocytosed חומר טפסים תא דיסקרטית מעקב puncta צבע ללא כל streptavidin מכתים.
  15. לכמת efferocytosis של תמונות הנוצרת באמצעות מגוון רחב של אמצעים:
    1. חישוב מדד efferocytic על-ידי קביעת המספר הממוצע של efferosomes בדידה (תא מעקב לצבוע+/streptavidin puncta) לכל מקרופאג. לכמת רק מקרופאגים מאוגדים לתא אפופטוטיים להיפגע או המכיל ≥1 efferosomes גלויה. מקרופאגים הרשומה מאוגדים מוות תאים, אך חסר efferosomes דיסקרטית, כבעלי מדד efferocytic של 0.
    2. חישוב יעילות efferocytic על ידי מדידת השבר של מקרופאגים המכילים ≥1 efferosome.
    3. לחשב את הקצב של efferocytosis על ידי תאים הדמיה קבוע והמוכתמות בנקודות זמן מרובים. רק התמונה מקרופאגים מאוגד בתאים אפופטוטיים להיפגע, או המכיל efferosomes לעין, עם z-במחסן בשבי של כל תא. ברגע שעברה דימות, לקבוע את הקצב של efferocytosis:
      1. באמצעות ההכתמה streptavidin כמו מדריך, ואת הכלי בחירה ביד חופשית או מצולע פיג ' י/ImageJ26 (או חבילת תוכנה אחרים ניתוח התמונה), להקיף את כל התא מעקב לצבוע+/streptavidin (למשל הפנימו) חומר מטוס בודד של הערימה-z. למדוד עוצמת משולב של התא מעקב צבע באזור זה. אמצעים נפרדים עבור כל15,(למשל קוטר, מיקום יחסית גבול התא או גרעין, וכו ') efferosome27 ניתן בקלות לרכוש בו זמנית עם מדידות אלה, במידה רבה הגדלת את הנתונים שנאספו במהלך ניתוח.
      2. ב- z אותו-הסעיף, באמצעות את streptavidin מכתים בתור מדריך ואת הכלי בחירה ביד חופשית או מצולע, להקיף את כל התא מעקב לצבוע+/streptavidin+ (למשל -הפנימו) גשמי במטוס יחיד של הערימה-z . רק כוללים מכתים מתאי אפופטוטיים להיפגע בקשר עם פגוציט. למדוד את עוצמת משולב של האזור.
      3. חזור על הצעדים 4.2.3.1 כדי 4.2.3.2 z-הסעיפים הנותרים של התמונה. לסכם את עוצמת משולב efferocytosed (סיגמאeff) וחומרים שאינם-efferocytosed (סיגמאne). ניתן לחשב את השבר של התא אפופטוטיים להיפגע אשר היה efferocytosed של התא כמו:
        Equation
      4. לכמת את השבר efferocytosed עבור כל התאים בנקודות כל הזמן. שימו לב כי עוצמת פלורסנט מוות תאים/efferosomes יכול להשתנות בין תמונות בשל הבדלים בתפיסה של תא מעקב צבע על ידי תאים בודדים אפופטוטיים להיפגע, ולאור שינויים בפרמטרים רכישת התמונה כגון זמן החשיפה. ככזה, השווה היחידה מנורמל ערכים כגון שבר Efferocytosed, או שאינו תלוי בעוצמה ערכים כגון efferocytic אינדקס ויעילות efferocytic, בין תמונות, בין תנאי הניסוי, ובין לחזור על הניסויים.
    4. כדי להבטיח שערכת הנתונים המתקבל משקף באופן מדויק את הוריאציה efferocytosis בין התאים, לבצע ניתוחים אלה על המספר המרבי של תאים אפשרי ניסוי.
      הערה: אינדקס יעילות, efferocytic Efferocytic ניתן במהירות לחשב (כמה שניות/תא), אנו בדרך כלל שואפים לנתח תאים לפחות 100 לכל ניסוי, לחזור על ניסוי לפחות 3 פעמים. חישוב השבר של efferocytosed חומר, ואמצעים ספציפיים efferosome הם יותר מפרך, בדרך כלל לוקח 2-3 דקות/נייד עבור אנליסט מנוסים. עבור חישובים אלה אנחנו לכמת מינימום של 15 תאים לכל מצב, לכל ניסוי.
    5. אינדקס efferocytic שיא, efferocytosed שבר ונתונים efferosome בודדים על בסיס לכל תא.
      הערה: זה מאפשר ניתוח נתונים באמצעות גישות מתא בודד, ובכך מאפשר וריאציות הבין-תאית ניתן לכמת. ניתוחים ברמת האוכלוסייה עדיין מתבצעים datasets אלה על-ידי חישוב ממוצע הנתונים בתא יחיד רכשה בניסויים בודדים. מדידות Efferosome ספציפי ניתן לנתח ברמת האוכלוסיה, רמת תא יחיד, וכן הרכבים (למשל כמו אוכלוסיות של efferosomes עצמאית של התאים המכילים אותם)15.

6. חיים תא Efferocytosis Assay באמצעות מוות תאי

  1. להכין THP-1, J774.2 או M2 macrophages כפי שמתואר שלבים 1-3, בהתאמה. אם נדרש, תאים צריך להיות transfected עם transgenes או אחרים גנטי בונה לפחות 18 h לפני ביצוע ניסוי מדעי.
  2. ערב לפני תחילת הניסוי, הכן מוות תאים Jurkat כפי שמתואר בסעיפים 4 ו-5 עם השינויים הבאים:
    1. תאים למהול ו לגרום אפופטוזיס לפי 4.1 – 4.3, ולאסוף את המספר הנדרש של מוות תאים לפי 5.3 – 5.4.
    2. להוסיף תא במעקב לצבוע על הריכוז המומלץ של היצרן התליה תא אפופטוטיים להיפגע. דגירה השעיה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הוסף אמצעי שווה RPMI 1640 + 10% FBS דגירה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר בחושך כדי להרוות את כל צבע unreacted. אל תוסיף NHS-ביוטין לניסויים אלה.
    3. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע, וכן להשעות מחדש בתאים אפופטוטיים להיפגע מוכתמים µL 100 RPMI 1640 + 10% FBS לכל טוב של מקרופאגים.
  3. אם יש צורך, להוסיף התווית המקרופאגים על-ידי הסרת תרבות המדיה מכל קידוח והוספת µL 500 ל- PBS המכיל היצרנים מומלצים דילול של תא מעקב צבע שאינו חופף spectrally עם התא מעקב לצבוע בתאים אפופטוטיים להיפגע או כל transgenes פלורסנט שביטאו את המקרופאגים. תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, ולאחר מכן להוסיף אמצעי שווה של DMEM + 10% FBS דגירה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר בחושך כדי להרוות את כל צבע unreacted.
  4. להעביר את coverslip המכילים מקרופאג לתא ליידן. להוסיף 400 µL של DMEM + 10% FBS, ואחריו µL 100 של התליה תא שכותרתו אפופטוטיים להיפגע. מערבבים על-ידי pipetting בעדינות מדיה 2 – 3 פעמים.
  5. להעביר את התא ליידן מחוממת ו- CO2-תא perfused של מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא חי.
    הערה: עבור setups מיקרוסקופ זה חסר יכולות זלוף2 CO, להשתמש רקמות תרבות בינוני באגירה מלאה עם 1 מ מ חומצה-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 4 (HEPES) במקום סודיום ביקרבונט כדי לשמור על pH פיזיולוגית בזמן תרבות חשוף לאוויר.
  6. לכידת סדרה זמן לשגות המכיל תמונת אור לבן (שלב חדות או DIC), ותמונות של כל התוויות פלורסנט:
    1. להשתמש עדשה המטרה X 100 ניסויים לפתרון פרטים עדינים איפה הדרושים (למשל קרום הדינמיקה של אינטראקציות תא פגוציט-מוות). בינתיים, אמצעים כללי יותר (שיעור ספיגת תא מוות, זמן האינטראקציה בין מוות תאים, מאקרופאגים וכו) הטוב ביותר הם עם תמונה באמצעות 60 X או המטרה X 63.
    2. אם הוא זמין, השתמש בנקודה-הביקור כדי תמונה מספר שדות-of-view במהלך רכישה יחיד, ובכך מגדילים את מספר האירועים efferocytic בשבי ניסוי יחיד
    3. כי efferocytes לעיתים קרובות לבלוע רסיסי בתאים אפופטוטיים להיפגע, יותר מאשר תאים שלמים, עדיף ללכוד את z-במחסן. כדי למזער את phototoxicity, ללכוד את z-מקטעים המופרדים באמצעות מוקד עומק מטרתך מיקרוסקופים (בדרך כלל – 1.0 0.5 מיקרומטר), דרך העובי של התא (בדרך כלל 8-10 מיקרומטר עבור מקרופאגים, למשל 8 – 20 פרוסות/תא). פעולה זו מבטיחה כי כל היבלעות ואירועים סחר יהיה גלוי ב- z-מטוס אחד לפחות. לחלופין, השתמש גדולים (1 – 5 מיקרומטר קוטר) מוות תא מחקה או בתאים אפופטוטיים להיפגע עוברים פיצול מינימלי במהלך efferocytosis (למשל חום נויטרופילים בהלם) במקום ללא z-לערום. תארנו את הכנת מחקה והן אפופטוטיים להיפגע נויטרופילים בעבר28.
    4. כדי למזער את photobleaching, להשתמש fluorophores בהיר, לכידת תמונות באמצעות הגדרות רכישה למזער photobleaching — למשל בעוצמה נמוכה עירור בשילוב עם חשיפה קצרה ורווח המצלמה גבוהה פי29. אנו ממליצים בחום באמצעות מיקרוסקופ מצויד עם מצלמה רגישות גבוהה אלקטרומגנטית תשלום מצמידים מכשיר (EM-CCD) או ספינינג-דיסק קונאפוקלית, במהירות גבוהה פיזואלקטריים מכני במה, עבור סוג זה של הדמיה.
  7. מספר שיטות ניתוח אפשרי שניתן להחיל על סרטוני זמן לשגות הוא נרחב ומעבר ליכולת שלנו לסקור כאן. כמו כמה דוגמאות, להשתמש ידנית או אוטומטית תוכנת מעקב כדי לעקוב אחר פיוז'ן, ביקוע והתנועה של efferosomes בתוך תאים15, לכמת efferosome פיוז'ן דינאמיקה endolysosomes על ידי ניתוח colocalization של מקרופאגים לבטא transgenes פלורסנט תא ספציפי13, צג תהליכים ספיגת כגון חיטוט וכוס היווצרות30, לקבוע את הדינמיקה גיוס של איתות וסחר חלבונים-efferosome13, ו/או לכמת את פעילות degradative efferosomes שימוש בתאים אפופטוטיים להיפגע המסומנת fluorophores pH רגיש, חמצון רגיש או מופעל פרוטאז31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לילה של תאים Jurkat עם תוצאות staurosporine 1 מיקרומטר אפופטוזיס של תרבות > 95% של תאים, אשר יכולים להיות מאושרות עם Annexin V מכתים (איור 1). סוגי תאים אחרים יכול לשמש לניסויים אלה, למרות הריכוז של staurosporine, משך הטיפול staurosporine יצטרכו להיות ממוטבים עבור כל קו תא. זיהוי אמין, כימות של efferocytosis, > 80% של תאים צריך להיות אפופטוטיים להיפגע לפני הוספתן ל efferocytes. אחרים inducers של אפופטוזיס (למשל חום-הלם, etoposide, UV-אור) יכול לשמש גם, אך מניסיוננו, אלה לייצר של אינדוקציה יותר הטרוגנית של אפופטוזיס והתוצאה אוכלוסיות מעורבות לתאים המכילים אפופטוטיים להיפגע, משני נמק, התאים היעד הלא-מוות.

עבור קבוע-תא הדמיה עם צביעת מבפנים ומבחוץ, מקרוב אני בטוחה efferocyte-מוות תא אינטראקציות להתייחס בנקודות זמן כל, עם לחדיה הלא-efferocytosed (מעקב אחר צבע+/cell streptavidin+), efferocytosed (/cell streptavidinמעקב+) חומרים גלויים (איור 2). חשוב לציין כי הסינפסה המהווה את efferocyte בין התא אפופטוטיים להיפגע לעתים קרובות מספיק חזק כדי לא לכלול streptavidin, ולכן יש לקחת בחשבון תא כלשהו מעקב צבע מוכתם אובייקט הנושאת את streptavidin בכל נקודה על ההיקף שלה תא מאוגדים, לא של efferosome. בניסויים רוב השבר של תאים אפופטוטיים להיפגע efferocytosed יגדיל באופן תלוי-זמן, עד להישאר בלי חומרים בתא שאינו הפנימו אפופטוטיים להיפגע, או עד פגוציט מגיע הקיבולת שלו efferocytic המרבי (איור 3). ניתוח הוא בדרך כלל ביצע הקליטה עבור תאים בודדים (איור 3 א), עם זאת, נתונים ייכללו בממוצע על פני תאים בתוך ניסויים הפרט ואת הערכים הממוצע מ מרובים חזרה ניסיוני ניתח עם קונבנציונלי גישות סטטיסטיות (איור 3B). שינויים של הפרוטוקול מתוקננת יכולים להתבצע כדי לאפשר לשימוש סוגי התא הראשי, מטרות efferocytic אלטרנטיבי, והן עבור צביעת נוספים כדי להיכלל. לדוגמה, באיור 4 מציג העיקרי מקוטב-M2 macrophage אנושי בעל efferocytosed מוות תא מחקה מורכבת של 3 מיקרומטר קוטר סיליקה חרוזים מצופה בתערובת של phosphatidylserine, phosphatidylcholine28, ואחריו קיבוע עוקבות, permeabilization ו- immunostaining עבור דה מרקר אנדוזום מיחזור Rab17.

במהלך תא חי הדמיה efferocytic המקצועי phagocytes יתקיימו כדי להרחיב ומשכו תהליכים קטן בתהליך הנקרא 'למשוך'30 (איור 5, t = 0); כאשר תהליכים אלה נתקלים מטרה הם לדבוק במטרה וביציבות לצייר זה פגוציט. הפעילות החקרנית לא ייבחנו עם-המקצועי phagocytes כגון תאים אפיתל. Efferocyte אז יהוו זמן "סינפסה efferocytic"32 בין עצמו לבין התא אפופטוטיים להיפגע, עם זה סינפסה לעיתים קרובות כעוטפת חלק גדול של התא אפופטוטיים להיפגע (איור 5, t = 10). Efferocyte אז תצייר חתיכות של התא אפופטוטיים להיפגע מן סינפסה הזה לתוך ציטוזול שלה (איור 5, 10-30 דקות). זמן קצר לאחר הקמתה, אלה efferosomes המתהווה בילנאומיים הרחק הסינפסה, לכיוון האזור גרעיני פרי, תוצאה של Rab7/RILP/דינאין-dynactin מתווכת תחבורה33. במשך הזמן יכווץ efferosomes ואת החומרים מפורק וכתוצאה מכך וליידע ברחבי התא, איפה הן הסבירות נספג או ממוחזר13,15. היכולת לזהות תהליכים אלה תלויה מאוד קצב הפריימים רכישה והמשך של הניסוי. תהליכים מהירים כגון חיטוט לא ייבחנו על מסגרת-נמוכים, בעוד אירועים איטי (efferosome סחר וספיגה) דורשים פרקי זמן ממושכים הדמיה – בשני המקרים, אלה רכישות תמונה גדולה לעיתים קרובות דורשים לכידת תמונות נמוך עוצמה כדי להגביל את photobleaching ו- phototoxicity (איור 5). כמו עם תאים קבוע וזמינותו, הגירסה לחיות תאים של assay הזה יכול להיות שונה בהתאם לצרכים של החוקר. איור 6 מציג מסגרת אחת רכישת תא בשידור חי של מקרופאגים J774.2 לבטא transgenes אשר fluorescently demark קרום פלזמה (PM-GFP), אשר נקשר באופן סלקטיבי את השומנים איתות PI (3) P (FYVE-RFP). דור של PI (3) P על קרום efferosome ניתן יהיה מזוהה כמו שיתוף לוקליזציה של FYVE-RFP עם קרום efferosome PM-GFP+ . מאת לכימות האינטנסיביות של FYVE-RFP-efferosome, ניתן לכמת את הדינמיקה של PI (3) P איתות על efferosome (איור 6).

Figure 1
איור 1: Annexin V מכתים של מוות ותאים שאינם - אפופטוטיים להיפגע Jurkat. Annexin V מתייג את phosphatidylserine "לאכול-לי" אות שנחשפו על ידי מוות תאים. (למעלה) תאים Jurkat (UT) לא מטופל להציג בריא (מעוגלת וחלקה) מורפולוגיה (DIC), אינו מכתים עם Annexin נ' (למטה) Jurkat תאים תרבותי בין לילה עם מיקרומטר 1 staurosporine (STS) לקחת על מורפולוגיה של מוות (לא סדיר ו- blebbed), כתם עם בר annexin נ' סולם = 10 מיקרומטר, עוצמת התמונה מוצגת כמפה צבע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: מוקדמות ומאוחרות היבלעות של Jurkat מוות תאים על-ידי מקרופאגים J774.2. התמונות הן של מקרופאגים מוקדם (60 דקות), בשלב מאוחר (120 דקות) של efferocytosis. אור לבן (DIC) התמונה ממחישה את ממשק הדוק בין מקרופאג (mφ) לבין מוות התא (AC). תא מעקב צבען (CTD, אדום) מגלה את מיקומו של כל החומרים הנגזרות תא אפופטוטיים להיפגע. FITC-Streptavidin מכתים (Str, ירוק) מזהה את החלק של התא אפופטוטיים להיפגע יש לא עדיין היה נבלע על ידי מקרופאג. מקרופאג הגרעינים היו מוכתמים מראש עם דאפי (כחול). Efferosomes (אדום) מול החלק שאינו הפנימו של התא אפופטוטיים להיפגע (ירוק/צהוב) מזוהים בקלות על כיסוי של Streptavidin ושל תא מעקב תמונות צבע. הערה העדר streptavidin מכתים-הממשק תאי מקרופאג-מוות בבית timepoint מוקדמת, שנוצרו על-ידי הכללת streptavidin של הסינפסה efferocytic בנוי היטב (*). גרעין מקרופאג מזוהה על ידי Hoechst מכתים (כחול). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: זמן-קורס של השבר של Efferocytosed תא אפופטוטיים להיפגע על ידי מקרופאגים J774.2. מבחני Efferocytosis בוצעו עבור הצביעו פעמים, לבין השבר של מוות אפף תא חומר נחושה בכל נקודה בזמן באמצעות הנייד מעקב לצבוע/Streptavadin מכתים. שבר (A) של חומרים efferocytosed בתוך המקרופאגים בודדים, הנתונים מוצגים תאים בודדים, פס אופקי מעיד על הממוצע. 12-17 תאים לכל תנאי, נתונים מ 1 של 5 ניסויים עצמאית. שבר (B) של חומרים efferocytosed, בממוצע לאורך 5 ניסויים עצמאית, לפחות 10 תאים/מצב/חזור. p < 0.05 בהשוואה ל- 30 דקות, מבחן Kruskal-איי ווליס עם דן תיקון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: ניתוח של הגיוס Rab17 Efferosomes ב מקרופאגים האנושי העיקרית. Macrophage מקוטב-M2 נבלע אפופטוטיים להיפגע תא מחקה (חיצים) והיה immunostained עבור Rab17 (ירוק) 60 דקות בעקבות היבלעות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. גרעין התא הוא מוכתם Hoeschst, DIC תמונת מראה תא מורפולוגיה, משמש לזיהוי מחקה תא אפופטוטיים להיפגע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: תא חי efferocytosis assay. תא מעקב לצבוע labeledJ774.2 מקרופאג (mφ, ירוק) נרשמה כמות שכילתה תא Jurkat אפופטוטיים להיפגע המסומנת תא צבע שונה מעקב צבען (AC, אדום). התא אפופטוטיים להיפגע שבורה לחלקים מרובים במהלך תהליך הפנמה, וכתוצאה מכך ספיגת טיפין טיפין היווצרות efferosomes מרובים (חיצים). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: שימוש Transgenes פלורסנט לחקור איתות Efferocytic. J774.2 macrophage היה transfected עם סמן מתויג GFP קרום פלזמה (PM, ירוק), לבנות FYVE-RFP, אשר מאגד את השומנים איתות PI (3) P (אדום). Efferocytosis טפסים nascent קרום פלזמה, נגזר efferosome המכילה פאי (3) P, כפי שזוהו על-ידי גיוס FYVE-RFP (חץ). הדינמיקה של PI (3) P איתות הייתה לכמת כמו לקפל בעוצמה ביחס האות FYVE-RFP נוכח בעת סגירת מעגל efferosome (t = 0, גרף). הניסוי הזה משמש חרוז מחקה-תא (חץ, DIC) של מוות ולא בתאים אפופטוטיים להיפגע. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטות המתוארות ב פרוטוקול זה לאפשר הדמיה כימות של תהליך דינמי efferocytic, שימוש בגישות תא קבוע והן תאים חיים. גישות אלה מציעים כמה יתרונות על פני23,שיטות מבוססות cytometry זרימה הנפוצות24. השימוש מבפנים ומבחוץ מכתים עם דגימות קבוע מספק של כימות מדויק ועמיד יותר של קצב וההיקף של efferocytosis – אכן, שיטות מבוססות cytometry זרימה רבות פשוט תווית מוות תאים ו מקרופאגים עם fluorophores שונים, ו ציון efferocytosis כמו השבר של מקרופאגים מכתים שיתוף עם הסמן תא אפופטוטיים להיפגע, ולכן חסר את היכולת להבדיל בין מאוגד לעומת חומר תא למביטה אפופטוטיים להיפגע. גישות cytometry זרימה אלטרנטיבית כוללים את אלה באמצעות pHrodo הנקרא מוות תאי24. pHrodo הוא fluorophore pH רגיש זה מגביר הבהירות ב- pH חומצי. בזמן הזה fluorophore מספקים רזולוציה טובה יותר בין הלא-הפנימו לעומת חומרים למביטה, כמו עליות פלורסצנטיות במיוחד בעקבות הפנמה של התא אפופטוטיים להיפגע לחומצי efferosome, התוצאה עלולה להיות מבולבל על ידי תהליכי מחלה אשר לפגום efferosome acidification34,35, שיטה זו לא יתגעגע efferosomes בשלבים המוקדמים (acidification מראש) של efferocytosis36, הממוקמים באזורים acidification עלוב של תא27, או בתאים אשר בחולשה acidify שלהם lysosomes37. יתרון נוסף של השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה הוא השימוש של תאים חיים הדמיה כדי למדוד את הדינמיקה של efferocytosis, כמו תהליכים כגון חיטוט, היווצרות של הסינפסה efferocytic, ואין אפשרות וגדילת של efferosomes זוהה באמצעות גישות מבוססות cytometry זרימה.

שיטה זו מציעה יתרונות רבים, ניסויים הדורשים כימות של מאות רבות של תאים – למשל ניסויים זיהוי אירועים נדירים או לכימות תהליכים משתנה מאוד — יכול להיות קשה, עם ניתוח של אלה אלגוריתמית לוקח כמות מופרזת של הזמן. הדמיה גישות כגון הדמיה זרימה תפוקה גבוהה cytometry38 עשוי לאפשר תפוקה גבוהה יותר מאשר מיקרוסקופ רגיל, למרות בדמותנו הנוכחית אוטומטית חוויית ניתוח תוכניות אינן תמיד מסוגל במדויק הממיין הלא-הפנימו לעומת חומרים למביטה. באופן ספציפי, הסינפסה efferocytic חזק המהווה בין מוות תא efferocyte באפשרותך לא לכלול streptavidin מכתים, ומופיע ככזה תא מאוגד אפופטוטיים להיפגע לעתים קרובות גוש מוצק בתא מעקב ערוץ צבע, זה והעיבודים חלקית על ידי streptavidin מכתים (איור 2). לכן, בעוד efferosomes ברצון מזוהים algorithmically, בחלק מאוגדת של התא אפופטוטיים להיפגע הוא לעיתים קרובות טעינו בזיהוי כמו efferosome בשל הקושי של הנהלת חשבונות עבור צביעת streptavidin חלקית. אמנם לא הצלחנו למצוא תוכנית ניתן לזהות ולכמת את ספיגת טיפין טיפין של מוות תאים ללא סיוע אנושי במדויק, מצאנו שאת מערכות אוטומטיות למחצה לומד מהר39 במידה רבה יכולים להאיץ את ניתוח, צמצום שברים efferocytosed מידות 2-3 דקות ל- < 60 s בכל תא. לחלופין, מוות שאינו לעיכול תא מחקה או סוגי תאים אשר קטע מינימלית על אפופטוזיס, ניתן להשתמש במקום זאת. פעולה זו מפשטת איתור מבנים יחיד, גדול יותר, אשר עשוי להיות יותר בעניין גישות אוטומטיות עשוי לבטל את הצורך z-לערום. אפילו עם ההתפתחויות הללו, מהירות הרכישה וניתוח של שיטה זו נשארת הגבלת ונותרו ככזה cytometry זרימה בשיטת המעשי ביותר כאשר ניתוחים של תאים גדולים המספרים הדרושים23.

למרות שתיארנו בשיטה זו באמצעות קו תא ומקרופגים אנושי ראשוני כמו efferocytes מוות Jurkat תאים (קו תא T) כמטרות, ניתן ליישם שיטה זו כל efferocytic תא סוג או מוות תא מטרה. אכן, גישות דומות שימשו כדי לחקור efferocytosis hepatocytes, תאים אפיתל-9,-40,-41, את efferocytosis של מטרות הרלוונטית קלינית כגון תאים סרטניים42. יתכן צורך לשנות בפרוטוקול זה בעת שימוש efferocytes-החיסון, או כאשר מידול אירועים ספציפיים efferocytic. לדוגמה, Jurkat התאים הם שאינו חסיד, ולכן סביר להניח באופן מלא לסכם את הכוחות מכני, מגבלות המרחבי efferocytes נתקל בעת אינטראקציה עם תאים חסיד אפופטוטיים להיפגע או מוות תאים בתוך רקמות מוצק. סוגי תאים רבים ישמרו על הדבקות במהלך אפופטוזיס, ולכן יכול לשמש כמטרות חסיד; דוגמה אחת, הלה תאים reproducibly עוברים אפופטוזיס staurosporine-induced phosphatidylserine ערבול, blebbing על פני תקופה 4 – 6 h תוך שמירה על היצמדות גוף התא43. תאים מושעה מטריצת קולגן או תאי הגזע, נגזר organoids44 ייתכן דגמים פוטנציאליים ללמוד efferocytosis ברקמות מוצק, למרות שאיננו מודעים כל מחקרים אשר השתמשו הגישות האלה. עבור כמה מודלים תאים חיסוניים כגון תאים Jurkat, נויטרופילים לא אמור לשמש כמטרות אפופטוטיים להיפגע, כמו תאים אלה יכולים לשחרר ציטוקינים מבוסס "למצוא-לי" אותות כגון CX3CL1 אשר עשוי להיות גורם מבלבלים במודלים איפה דלקתית או נודדים התהליכים הם ובדוקים45. לכן, בעוד צדדיות של assay הזה מאפשר על מנת לשמש כדי לחקור את efferocytosis על פני מגוון של סוגי תאים ומערכות מודל, חייבים להקפיד לבחור efferocytes המתאים, התאים היעד והתנאים תרבות למודל הכי טוב פיזיולוגיים תהליך תחת חקירה.

ניתוח בשיטות המתוארות פרוטוקול זה מיועדות רק כנקודת התחלה, עם הטבע מבוססת הדמיה של ניסויים אלה המאפשרים מגוון רחב של ניתוחים. לדוגמה, מדידות מיצוב, קוטר efferosome שניתן הנאסף בעת ביצוע מדידות efferocytosed שבר או נמדד בתוך תאים חיים זמן-קורסים, במטרה לחקור תהליכים כגון וגדילת של efferosomes, הקצב של מוות התא השפלה13,15. Immunostaining (איור 4) יכול לשמש כדי לחקור הגיוס של חלבונים efferosomes, בעוד הדמיה לחיות תאים בשילוב עם המורפולוגיים יכול לשמש כדי לכמת תהליכים כאלה מחייב יעילות ומחירים של היבלעות30 , 46. אנחנו לעתים קרובות לבצע מבחני אלה ב מקרופאגים לבטא transgenes פלורסנט כי הדו ח איתות של מולקולה או מפעילות הסלולר אירועים במהלך efferocytosis (איור 6). העיתונאים האלה מאפשרים בקרה של איתות תהליכים במהלך efferocytosis; לדוגמה, השתמשנו מתויג fluorescently ראב GTPases לחקור את התפקיד של Rab5, Rab7, Rab17 מתווכים efferosome עיבוד וסחר עוקבות של מוות נגזר תא אנטיגנים13,15. באופן דומה, שילוב של כתבים של מוות של תאים, efferosome pH, ייצור מינים חמצן תגובתי ותהליכים הסלולר אחרים לתוך תאים חיים ניסויים יכול לשמש כדי לחקור את התהליכים מתווכים ההשפלה של efferosomes31 ,47. אתגר משותף בניסויים אלה הוא זיהוי transgenes או עיתונאים עם fluorophores תואם; לעתים קרובות, נסיר את התא מעקב צבע ו/או streptavidin חינם ערוצי הדמיה אחרות fluorophores. עבור ניסויים זה מועיל להחליף את התא אפופטוטיים להיפגע לחקות שאינם מזימות. דבר זה מאפשר כימות של איתות dynamics ותהליכים הסלולר ללא המורכבות של מעקב efferosomes מרובים נגזר תא יחיד אפופטוטיים להיפגע. לראות את אוונס. et al. לקבלת הוראות על הכנת אפופטוטיים להיפגע תא מחקה28.

הקושי הנפוץ ביותר בעת תכנון ניסויים אלה הוא מציאת שילוב של fluorophores המאפשרים התהליכים הרצויים לדימות, תוך מזעור photobleaching ו- phototoxicity29. הבחירה Fluorophore מוכתב במידה רבה על ידי המסננים לייזרים/עירור, dichroics/קוביות, מסננים פליטה של המיקרוסקופ, ולכן הבחירה של fluorophores היא לעתים קרובות ספיציפית מיקרוסקופים בודדים. באופן כללי, fluorophores אורך גל ארוך יותר (כתום כדי מרחיקת אדום, למשל פליטה maxima > 580 nm) הן פחות מועדים photobleaching אורכי גל אלה הם פחות משובש לתאים. Fluorophores הירוק (פליטת maxima ~ 525 ננומטר) יכול לשמש, אך טיפול צריך לקחת כדי להגביל את phototoxicity על התאים. Fluorophores אשר מעוררים באורכי גל פחות מ 480 ננומטר (סגול וכחול) להימנע בגלל phototoxicity גבוהה שלהם נטייה אורכי גל אלה עירור להלבין אחרים fluorophores29. במידת האפשר, כדאי לבחור fluorophores בהירות, יציבים. באופן דומה, הפרמטרים רכישת התמונה צריך להיות מותאם כדי למזער את photobleaching ואת phototoxicity — למשל יותר חשיפות בעוצמה נמוכה עירור עדיפות על עירור גבוה בעוצמות48. התוספת של נוגדי חמצון כגון רוטין והסרה של רכיבי מדיה מסוימים יכולים לשפר את שניהם פוטוסטביליטי ולהפחית phototoxicity49. אפילו עם בחירה זהירה של fluorophores ובתנאים הדמיה, בצורך להגביל photobleaching לעיתים קרובות דורשת לכידתו של תמונות עם יחס אות לרעש נמוך (לקבלת דוגמה, ראה איור 5 ). אם לכימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית, זהירות רבה צריך לקחת כדי להגביל את חפצי עיבוד תמונה; באופן אידיאלי, תמונות raw ללא כל צורה של עיבוד צריך להיות מנותח. אם deconvolving תמונות לפני כמת, באלגוריתם deconvolution ששומרת עוצמות פלורסנט חייב להיות בשימוש50,51.

חיים תא רכישות יכול להיות במיוחד מאתגר, עם ניסויים מוצלחים הדורשים איזון זהיר בין עירור העוצמה, זמן החשיפה, במסגרת שיעור ומשך ניסוי. עוצמת עירור וזמן החשיפה צריך להיות מותאם כדי למזער את phototoxicity כפי שתוארה לעיל, עם אזהרה כי פעמים חשיפה ארוך יותר עשוי לגרום חפצי אמנות תנועה עקב תנועת התא או להגביל את קצב המסגרות של רכישת. קצב המסגרות יכול להשתנות בהתאם לדרישות ניסיוני. מסגרת נמוכים (5-30 דקות בין מסגרות) לאפשר עבור הדמיה במשך תקופות ממושכות של זמן (12 שעות או יותר), אך מספקים נתונים מינימלית על תופעות כמו קרום dynamics וסחר פוסט-efferocytosis של efferosomes. מסגרת-שיעור גבוה (מהר ככל 1 מסגרות לשנייה) מספקים רזולוציה טמפורלית מעולה של efferocytic אירועים וסחר efferosome – אבל גם עם בחירה זהירה של fluorophores, עירור העוצמה פעמים חשיפה – photobleaching או phototoxicity בדרך כלל יגביל ניסויים אלה פחות שעה משך. מניסיוננו, רכישת תמונות כל 1-2 דקות, במהלך תקופות ניסיוני של h 2-6, הם פשרה מקובלת המספק תמונות לכימות של מספר מספיק של אירועים efferocytic, עם רזולוציה טמפורלית סבירה.

Efferocytosis שינו וכושלות ידוע להיות מעורב הפתולוגיה של סרטן, טרשת עורקים והפרעות אוטואימוניות מרובים, עם טיפולים פילוח efferocytosis הגדול מראה קליני מבטיח7,52, 5354,,55. המשך הפיתוח בתחומים אלה דורש זיהוי ואפיון של התהליכים הסלולר, רצפטורים, איתות המסלולים המסדירה efferocytosis. וזמינותו הוצג פרוטוקול זה מייצג כלי רב עוצמה עבור מחקרים אלה, יכול להיות שונה כדי לכמת רבים מהתהליכים הסלולר, איתות ויסות efferocytosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי קנדי מוסדות הבריאות מחקר (CIHR) הפועלים גרנט מגב-123419, מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה גילוי גרנט 418194, ואת משרד אונטריו של המחקר, פרס החדשנות מחקר מוקדם BH. DGW תרמו את חלקם של התמונות שהוצגו, אופטימיזציה של הפרוטוקולים, הכתיבה של כתב היד; הוא מומן על ידי מענק משאבת-לקרקע מן האוניברסיטה של ליברפול. CY ממומן על-ידי מלגה לתואר שני וניהר CIHR MD/PhD Studentship. סוכנויות מימון היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Media Wisent 3500-000-EL
DMEM Media Wisent 319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-150
PBS Wisent 311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness Electron Microscopy Sciences 72290-08 Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine Cayman Chemical 81590 Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488 ThermoFisher R37174
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217 Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO Sigma-Aldrich D2650
CellTrace FarRed ThermoFisher C34572
CellTrace Orange ThermoFisher C34851
Hoescht 33342 ThermoFisher 62249
FITC-Streptavadin ThermoFisher SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium Cedarlane Labs CL5071
Recombinant Human M-CSF Peprotech 200-04
Recombinant Human IL-4 Peprotech 300-25
J774.2 Macrophage Cell Line Sigma-Aldrich 85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line ATCC TIB-202
Jurkat T Cell Line ATCC TIB-152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35, (4), 495-516 (2007).
  2. Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32, (1), 118-125 (2012).
  3. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: Progress and conundrums. The Journal of Experimental Medicine. 207, (9), 1807-1817 (2010).
  4. Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., Henson, P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. Journal of Immunology. 148, (7), 2207-2216 (1992).
  5. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. European Journal of Biochemistry. 122, (2), 429-436 (1982).
  6. Callahan, M. K., Williamson, P., Schlegel, R. A. Surface expression of phosphatidylserine on macrophages is required for phagocytosis of apoptotic thymocytes. Cell Death and Differentiation. 7, (7), 645-653 (2000).
  7. Kojima, Y., et al. CD47-blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature. 536, 86-90 (2016).
  8. Seitz, H. M., Camenisch, T. D., Lemke, G., Earp, H. S., Matsushima, G. K. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells. Journal of Immunology. 178, 5635-5642 (2007).
  9. Ichimura, T., Asseldonk, E. J. P. V., Humphreys, B. D., Gunaratnam, L., Duffield, J. S., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 118, (5), 1657-1668 (2008).
  10. Flannagan, R. S., Canton, J., Furuya, W., Glogauer, M., Grinstein, S. The phosphatidylserine receptor TIM4 utilizes integrins as coreceptors to effect phagocytosis. Molecular Biology of the Cell. 25, (9), 1511-1522 (2014).
  11. Park, D., et al. BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module. Nature. 450, (7168), 430-434 (2007).
  12. Elliott, M. R., Koster, K. M., Murphy, P. S. Efferocytosis Signaling in the Regulation of Macrophage Inflammatory Responses. Journal of Immunology. 198, (4), 1387-1394 (2017).
  13. Yin, C., Kim, Y., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates differential antigen sorting following efferocytosis and phagocytosis. Cell Death & Disease. 7, (12), e2529 (2016).
  14. Kinchen, J. M., et al. A pathway for phagosome maturation during engulfment of apoptotic cells. Nature Cell Biology. 10, (5), 556-566 (2008).
  15. Yin, C., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates intermixing of phagocytosed apoptotic cells with recycling endosomes. Small GTPases. 0, (0), 1-9 (2017).
  16. Silva, M. T. Secondary necrosis: The natural outcome of the complete apoptotic program. FEBS letters. 584, (22), 4491-4499 (2010).
  17. Thorp, E. B. Mechanisms of failed apoptotic cell clearance by phagocyte subsets in cardiovascular disease. Apoptosis. 15, (9), 1124-1136 (2010).
  18. Sarantis, H., Grinstein, S. Monitoring phospholipid dynamics during phagocytosis: application of genetically-encoded fluorescent probes. Methods in Cell Biology. 108, 429-444 (2012).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Wang, J., Hossain, M., Thanabalasuriar, A., Gunzer, M., Meininger, C., Kubes, P. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358, (6359), 111-116 (2017).
  21. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. The Journal of Cell Biology. 169, (1), 139-149 (2005).
  22. Greenlee-Wacker, M. C., Rigby, K. M., Kobayashi, S. D., Porter, A. R., DeLeo, F. R., Nauseef, W. M. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human neutrophils prevents macrophage efferocytosis and induces programmed necrosis. Journal of Immunology. 192, (10), 4709-4717 (2014).
  23. Wootton, D. G., et al. Recovery from pneumonia requires efferocytosis which is impaired in smokers and those with low body mass index and enhanced by statins. Thorax. 71, (11), 1052-1054 (2016).
  24. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342, (1-2), 71-77 (2009).
  25. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophysical Journal. 74, (3), 1591-1599 (1998).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  27. Johnson, D. E., Ostrowski, P., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The position of lysosomes within the cell determines their luminal pH. The Journal of Cell Biology. 212, (6), 677-692 (2016).
  28. Evans, A. L., Blackburn, J. W. D., Yin, C., Heit, B. Quantitative efferocytosis assays. Methods in Molecular Biology. 1519, 25-41 (2017).
  29. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, (8), (2017).
  30. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. The Journal of Cell Biology. 191, (6), 1205-1218 (2010).
  31. Joshi, G. N., Gilberti, R. M., Knecht, D. A. Single cell analysis of phagocytosis, phagosome maturation, phagolysosomal leakage, and cell death following exposure of macrophages to silica particles. Methods in Molecular Biology. 1519, 55-77 (2017).
  32. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, (DEC), 1863 (1863).
  33. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology. 23, (18), 6494-6506 (2003).
  34. Reiners, J. J., Kleinman, M., Kessel, D., Mathieu, P. A., Caruso, J. A. Nonesterified cholesterol content of lysosomes modulates susceptibility to oxidant-induced permeabilization. Free Radical Biology & Medicine. 50, (2), 281-294 (2011).
  35. Boya, P., et al. Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of Experimental Medicine. 197, (10), 1323-1334 (2003).
  36. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends in Immunology. 1-9 (2012).
  37. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, (21), 3330-3341 (2014).
  38. Phanse, Y., et al. Analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (64), e3884 (2012).
  39. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. 230-233 (2011).
  40. Davies, S. P., Reynolds, G. M., Stamataki, Z. Clearance of apoptotic cells by tissue epithelia: A putative role for hepatocytes in liver efferocytosis. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  41. Ismail, O. Z., Zhang, X., Bonventre, J. V., Gunaratnam, L. G protein α12(Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310, (7), F607-F620 (2016).
  42. Vaught, D. B., Stanford, J. C., Cook, R. S. Efferocytosis creates a tumor microenvironment supportive of tumor survival and metastasis. Cancer Cell & Microenvironment. 2, (1), (2015).
  43. Heit, B., Yeung, T., Grinstein, S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 300, (1), C33-C41 (2011).
  44. Múnera, J. O., Wells, J. M. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1597, 167-177 (2017).
  45. Truman, L. A., et al. CX3CL1/fractalkine is released from apoptotic lymphocytes to stimulate macrophage chemotaxis. Blood. 112, (13), 5026-5036 (2008).
  46. Evans, A. L., et al. Antagonistic Coevolution of MER Tyrosine Kinase Expression and Function. Molecular Biology and Evolution. (2017).
  47. Flannagan, R. S., Heit, B., Heinrichs, D. E. Intracellular replication of Staphylococcus aureus in mature phagolysosomes in macrophages precedes host cell death, and bacterial escape and dissemination. Cellular Microbiology. (2015).
  48. Mubaid, F., Brown, C. M. Less is More: Longer Exposure Times with Low Light Intensity is Less Photo-Toxic. Microscopy Today. 25, (06), 26-35 (2017).
  49. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PloS One. 7, (12), e53004 (2012).
  50. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166, (1), 11-15 (2004).
  51. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  52. Ma, G. Z. M., Stankovich, J., Kilpatrick, T. J., Binder, M. D., Field, J. Polymorphisms in the receptor tyrosine kinase MERTK gene are associated with multiple sclerosis susceptibility. PloS One. 6, (2), e16964 (2011).
  53. Thorp, E., Cui, D., Schrijvers, D. M., Kuriakose, G., Tabas, I. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe-/- mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28, (8), 1421-1428 (2008).
  54. Nguyen, K. -Q. N., et al. Overexpression of MERTK Receptor Tyrosine Kinase in Epithelial Cancer Cells Drives Efferocytosis in a Gain-of-Function Capacity. The Journal of Biological Chemistry. 289, (37), 25737-25749 (2014).
  55. Morimoto, K., et al. Lovastatin enhances clearance of apoptotic cells (efferocytosis) with implications for chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Immunology. 176, (12), 7657-7665 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics