सिंगल सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा Efferocytosis की ठहराव

Immunology and Infection

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Summary

Efferocytosis, अपोप्तोटिक कोशिकाओं के phagocytic हटाने, homeostasis बनाए रखने के लिए आवश्यक है और रिसेप्टर्स और संकेत रास्ते है कि मान्यता, समाई, और internalization कोशिकाओं के अपोप्तोटिक के लिए अनुमति देने के द्वारा की सुविधा है. साथ ही, हम efferocytosis के ठहराव और efferocytic संकेतन रास्ते की गतिविधि के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

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Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G., Heit, B. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58149, doi:10.3791/58149 (2018).

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Abstract

efferocytosis के विनियमन का अध्ययन तरीकों कि सही अपोप्तोटिक कोशिकाओं की तेज मात्रा में और संकेतन और सेलुलर प्रक्रियाओं है कि नियंत्रण efferocytosis जांच करने में सक्षम है की आवश्यकता है । इस ठहराव अपोप्तोटिक कोशिकाओं के रूप में प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हो सकता है अक्सर efferocytosed piecemeal कर रहे हैं, इस प्रकार necessitating तरीकों जो सही रूप से एक चित्रित लक्ष्य के efferocytosed भाग के बीच अपोप्तोटिक कर सकते हैं बनाम अवशिष्ट अनजाना सेलुलर टुकड़े. यहां उल्लिखित दृष्टिकोण दोहरे लेबलिंग दृष्टिकोण को सही ढंग से efferocytosis और efferocytes की efferocytic क्षमता जैसे मैक्रोफेज की गतिशीलता को बढ़ाता है । अपोप्तोटिक कोशिका के cytosol को सभी अपोप्तोटिक सेल-व्युत्पन्न सामग्रियों की निगरानी को सक्षम करने के लिए एक सेल ट्रैकिंग डाई के साथ लेबल है, जबकि अपोप्तोटिक सेल की सतह biotinylation आंतरिक और गैर-आंतरिक के बीच विभेद के लिए अनुमति देता है अपोप्तोटिक कक्ष भिन्न होते हैं. efferocytes की efferocytic क्षमता रहते है या निर्धारित कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवियों को लेकर और आंतरिक लक्ष्य बनाम बंधे की मात्रा बढ़ाता है, के रूप में streptavidin धुंधला द्वारा विभेदित द्वारा निर्धारित किया जाता है । इस दृष्टिकोण ऐसे प्रवाह cytometry के रूप में तरीकों पर कई लाभ प्रदान करता है, अर्थात् गैर के सटीक विefferocytosed बनाम efferocytosed अपोप्तोटिक कोशिका भिन्न, जीने के द्वारा efferocytic गतिशीलता को मापने की क्षमता-सेल माइक्रोस्कोपी, और क्षमता की कोशिकाओं में सेलुलर संकेतन के अध्ययन करने के लिए फ्लोरोसेंट-transgenes लेबल व्यक्त । संयुक्त, इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित तरीकों एक लचीला प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है कि सही efferocytic गतिविधि और सेलुलर संकेत efferocytosis के दौरान सक्रिय रास्ते पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए आधार के रूप में सेवा करते हैं ।

Introduction

Apoptosis, या क्रमादेशित कोशिका मृत्यु, एक अत्यधिक विनियमित शारीरिक प्रक्रिया है कि सबसे कोशिकीय जीवों में होता है और उनके विकास और homeostasis1के लिए महत्वपूर्ण है । सामांय सेल कारोबार और भ्रूण विकास में शामिल होने के अलावा, apoptosis ऊतकों से संक्रमित या क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के उन्मूलन में सक्षम बनाता है और संक्रमण के जवाब में ट्रिगर किया जा सकता है, सूजन, कैंसर, और भी चिकित्सा हस्तक्षेप द्वारा जैसे रेडियोथेरेपी या स्टेरॉयड1. अपोप्तोटिक कोशिकाओं का पर्दाफाश "खाओ मुझे" उनके सेल सतह जो पेशेवर और गैर पेशेवर फ़ैगोसाइट की एक सीमा पर रिसेप्टर्स द्वारा मांयता प्राप्त कर रहे है पर संकेत, सामूहिक रूप से "efferocytes" के रूप में जाना जाता है । इन रिसेप्टर्स की सगाई एक efferocytosis2,3के रूप में जाना जाता प्रक्रिया के माध्यम से efferocyte द्वारा अपोप्तोटिक कोशिका के ऊपर उठाना और क्षरण लाती है । Phosphatidylserine सबसे अच्छा विशेषता खाने मुझे efferocytosis ड्राइविंग संकेत है । यह आम तौर पर प्लाज्मा झिल्ली के भीतरी पत्रक तक ही सीमित है, apoptosis के साथ एक लिपिड scramblase जो इस झिल्ली विषमता को बाधित सक्रिय, इस प्रकार सेल4सतह पर phosphatidylserine उजागर. Phosphatidylserine कुछ नॉन-अपोप्तोटिक कोशिकाओं की extracellular सतह पर पाया जाता है, जैसे परिपक्व मैक्रोफेज और एक्टिवेट प्लेटलेट्स । हालांकि, इन कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण efferocytosed नहीं कर रहे हैं "मुझे न खाओ" सिग्नल, जैसे CD47, अपने सेल सतह पर5,6,7. उजागर phosphatidylserine efferocytic रिसेप्टर्स efferocytes द्वारा व्यक्त की एक सरणी द्वारा मांयता प्राप्त है । phosphatidylserine करने के लिए इन रिसेप्टर्स के बंधन, या तो सीधे या opsonins की सहायता के माध्यम से, संकेत मार्ग है कि एक झिल्ली में अपोप्तोटिक कोशिका की समाई को बढ़ावा देने के vacuole efferosome8करार सक्रिय, 9 , 10 , 11 , 12. efferosome endosomes और lysosomes है, जो आणविक efferosome acidify करने के लिए आवश्यक मशीनरी उद्धार और अपोप्तोटिक सेल कार्गो13,14नीचा के साथ अनुक्रमिक फ़्यूज़ । एक बार नीचा दिखाया, अपोप्तोटिक सेल सामग्री प्राप्त रीसाइक्लिंग endosome-एक प्रक्रिया है जो अपोप्तोटिक सेल-एंटीजन के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं सीमा की तस्करी कर रहे हैं, और जो अपोप्तोटिक सेल13से पोषक तत्वों की वसूली के लिए अनुमति दे सकता है, 15. अपोप्तोटिक कोशिकाओं की ख़राब निकासी में efferocytosis परिणामों में विफलता; ये अस्पष्ट कोशिकाओं अंततः माध्यमिक परिगलन से गुजरना । इस प्रकार संक्रामक, भड़काऊ और स्व-प्रतिरक्षित रोगों की एक सीमा ड्राइविंग, extracellular वातावरण में सूजन कोशिकाओं जारी समर्थक भड़काऊ cytosolic सामग्री, रोगजनकों, और प्रतिजनों16,17। साथ में, apoptosis और efferocytosis मरने और मृत कोशिकाओं को हटाने की सुविधा और ऊतक homeostasis के रखरखाव के लिए अनुमति देते हैं ।

आणविक तंत्र अंतर्निहित efferocytosis की जांच विधियों कि अपोप्तोटिक सेल के एक स्पष्ट ठहराव प्रदान की आवश्यकता है । इस ठहराव तथ्य यह है कि इस तरह के endocytosis और phagocytosis18,19, efferocytosis के रूप में अंय कार्रवाई तंत्र के विपरीत बरकरार लक्ष्य कोशिका की समाई में परिणाम नहीं हो सकता है, piecemeal में जिसके परिणामस्वरूप से जटिल है के अपोप्तोटिक सेल ने efferocyte20. इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल में एक इन विट्रो efferocytosis परख है कि आंतरिक बनाम गैर व्यक्तिगत अपोप्तोटिक कोशिकाओं के आंतरिक भागों के सटीक विरेखांकन प्रदान करता है और तय की एक किस्म के साथ संयुक्त किया जा सकता है वर्णन-सेल और लाइव सेल माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण । पारंपरिक phagocytosis परख प्रयोग के अंत में phagocytic लक्ष्य के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी जोड़ने के क्रम में गैर-आंतरिक लक्ष्य है, जहां के रूप में हमारे विधि लेबलिंग से अलग है covalently के साथ अपोप्तोटिक लक्ष्य-से जुड़े बायोटिन21 , 22. जबकि अपोप्तोटिक सेल विशिष्ट एंटीबॉडी इस परख में इस्तेमाल किया जा सकता है, biotinylation दृष्टिकोण किसी भी प्रोटीन असर लक्ष्य के लिए अनुमति देता है लेबल और माध्यमिक एंटीबॉडी पार-जेट के साथ संभावित मुद्दों से बचा जाता है अगर immunostaining किया जाता है . विशेष रूप से, हम अपोप्तोटिक Jurkat कोशिकाओं है कि दोहरी गया है दोनों एक सेल ट्रैकिंग डाई और बायोटिन के साथ दाग की तैयारी रूपरेखा । सेल ट्रैकिंग डाई अपोप्तोटिक सेल के लिए अनुमति देता है व्युत्पंन सामग्री efferocytosis के दौरान ट्रैक किया जा करने के लिए, जबकि सतह biotinylation गैर से आंतरिक के भेदभाव के लिए अनुमति देता है efferocytosed अपोप्तोटिक कोशिकाओं के आंतरिक भागों । हम भी murine और मानव efferocytes, monocyte-व्युत्पन्न M2 मैक्रोफेज के उदाहरण के रूप में प्राथमिक सेल efferocytosis, और Jurkat के रूप में उपयोग के लिए कोशिकाओं efferocytic लक्ष्य के रूप में उपयोग के लिए 774.2 और THP-1 सेल लाइनों की संस्कृति और तैयारी का वर्णन । इन तरीकों को आसानी से अंय कोशिका लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है, कोशिका मृत्यु के किसी भी रूप (जैसे apoptosis, परिगलन और necroptosis) के दौर से गुजर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए, और माइक्रोन के आकार की नकल करने के लिए जो लिपिड कोटिंग्स के माध्यम से अपोप्तोटिक कोशिकाओं अनुकरण या लाइगैंडों के साथ कोटिंग ब्याज की एक efferocytic रिसेप्टर के लिए विशिष्ट.

इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित विधि आमतौर पर23,24क्षेत्र में इस्तेमाल किया प्रवाह cytometry आधारित तरीकों पर कई फायदे हैं । द्वारा सीधे इमेजिंग phagocyte-अपोप्तोटिक सेल संपर्क, दोनों कुल और गैर आंतरिक अपोप्तोटिक सेल सामग्री के स्पष्ट लेबलिंग के साथ संयुक्त, efferocytosis के मात्रात्मक उपाय किया जा सकता है । इसके अलावा, पीएच असंवेदनशील fluorophores के उपयोग की सीमा ऐसी lysosomal पीएच में FITC और GFP प्रतिदीप्ति के दमन के रूप में कारकों को ढूंढने कि कुछ वैकल्पिक तरीकों25को मिला । अंत में, जबकि विस्तार से वर्णित नहीं है, इन तरीकों को efferocytes का उपयोग कर नियोजित किया जा सकता है फ्लोरोसेंट-लेबल transgenes, या पद निर्धारण immunostaining के साथ, संकेतन अणु गतिविधि और की निगरानी के ठहराव के लिए अनुमति देने के लिए efferocytosis के दौरान सेलुलर प्रक्रियाओं ।

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Protocol

स्वस्थ स्वयंसेवकों से रक्त का संग्रह पश्चिमी ओंटारियो विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य विज्ञान अनुसंधान नैतिकता बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था । Venipuncture मानव अनुसंधान पर त्रिकोणीय परिषद नीति वक्तव्य के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया ।

1. संस्कृति और THP-1 Monocyte सेल लाइन की तैयारी

  1. संस्कृति THP-1 ३७ डिग्री सेल्सियस पर T25 कुप्पी में एक निलंबन संस्कृति के रूप में monocytes + 5% सह2. कोशिकाओं रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान १६४० (RPMI १६४०) + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 5 मिलीलीटर में उगाया जाना चाहिए ।
  2. प्रत्येक दिन धीरे कुप्पी मिलाते हुए विकास मीडिया भर में समान रूप से कोशिकाओं को निलंबित, तो तुरंत एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गणना. कोशिकाओं को पारित किया जाना चाहिए एक बार सेल घनत्व तक पहुँच जाता है 1 x 106 कोशिकाओं/
    1. पूर्व गर्म RPMI १६४० + 10% एक ३७ ° c पानी स्नान में FBS ।
    2. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब या एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब, और गोली कोशिकाओं में 2 एक्स 105 कोशिकाओं स्थानांतरण ।
    3. सेल गोली परेशान बिना supernatant निकालें और 1 मिलीलीटर (१.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब) या 5 मिलीलीटर (15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब) फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के में गोली पुनः स्थगित ।
    4. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ५०० x g पर ट्यूब के बारे में । सेल गोली परेशान बिना पंजाबियों को हटा दें ।
    5. ताजा RPMI के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend १६४० + 10% FBS ।
    6. एक नया T25 कुप्पी जगह गर्म मीडिया के 4 मिलीलीटर में, और यह 1.2.5 से resuspend कोशिकाओं को जोड़ने के लिए । एक ३७ ° c + 5% CO2 मशीन में संस्कृति जब तक कोशिकाओं passaging की आवश्यकता होती है (आम तौर पर 3 दिन), या जब तक कोशिकाओं को एक प्रयोग के लिए आवश्यक हैं ।
  3. THP-1-व्युत्पंन मैक्रोफेज के साथ एक प्रयोग के लिए, passaging करने से पहले कुप्पी और प्लेट से कोशिकाओं की आवश्यक संख्या को हटा दें:
    1. 18 मिमी परिपत्र ग्लास coverslips (#1 .5 मोटाई) की एक 12-अच्छी तरह से प्लेट के कुओं में आवश्यक संख्या प्लेस-आमतौर पर शर्त के अनुसार 1 coverslip और/ प्रत्येक में अच्छी तरह से aliquot 5 x 104 THP-1 monocytes । प्रत्येक कुआं में जोड़े गए कक्षों की संख्या, यदि आवश्यक हो तो परिवर्तित किया जा सकता है ।
    2. RPMI का उपयोग कर 1 मिलीलीटर के लिए अच्छी तरह से युक्त प्रत्येक कोशिका की कुल मात्रा को लाओ + 10% ३७ ° c करने के लिए गर्म FBS.
    3. जोड़ें १०० एनएम phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) एक अच्छी तरह से और संस्कृति के लिए 3 दिनों के लिए THP के विभेद पैदा-1 monocytes में मैक्रोफेज की तरह कोशिकाओं ।

2. j 774.2 मैक्रोफेज सेल लाइन की संस् कृति और तैयारी

  1. संस्कृति जंमू ३७ में T25 कुप्पी में 774.2 कोशिकाओं ° + 5% सह2। कोशिकाओं Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) + 10% FBS के 5 मिलीलीटर में उगाया जाना चाहिए और एक बार पारित संस्कृति 80-90% प्रवाह तक पहुंचता है । कक्ष बीतने के लिए:
    1. सभी मीडिया की कुप्पी से निकालें और एक बार पंजाब के 5 मिलीलीटर के साथ वृद्धि ।
    2. पंजाब की कुप्पी से निकालें और ताजा DMEM के 5 मिलीलीटर + 10% FBS के साथ बदलें ।
    3. एक सेल खुरचनी का प्रयोग, कुप्पी के नीचे परिमार्जन करने के लिए मीडिया में कोशिकाओं को निलंबित । सख्ती से कोशिकाओं को कई बार पिपेट किसी भी कोशिका समुच्चय को तोड़ने के लिए ।
    4. सेल की कुप्पी से 4 मिलीलीटर से निकाल कर 1:5 कोशिकाओं को पतला और ताजा मीडिया के 4 मिलीलीटर के साथ की जगह । शेष कोशिका निलंबन छोड़ दिया जा सकता है, एक ताजा T25 कुप्पी में एक नया सेल संस्कृति शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया, या एक प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया ।
  2. जंमू 774.2 कोशिकाओं का उपयोग कर एक efferocytosis परख के लिए स्थापित करने के लिए:
    1. एक दिन पहले प्रयोग की शुरुआत करने के लिए, जंमू 774.2 कोशिकाओं ताजा मीडिया के 5 मिलीलीटर में निलंबित, कदम के अनुसार 2.1.1 – 2.1.3 । एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती और कोशिकाओं की एक एकाग्रता पर आवश्यक मात्रा तैयार 5 x 104 कोशिकाओं/
    2. 18 मिमी परिपत्र ग्लास coverslips (#1 .5 मोटाई) के एक 12-खैर प्लेट के कुओं में आवश्यक संख्या प्लेस । प्रत्येक अच्छी तरह से aliquot में 1 मिलीलीटर 5 x 104 कोशिकाओं/एमएल सेल निलंबन ।
    3. रातोंरात संस्कृति की अनुमति के लिए कोशिकाओं coverslip का पालन करने के लिए और passaging से उबरने ।

3. प्राथमिक मानव M2 मैक्रोफेज की संस्कृति

  1. M2 मैक्रोफेज की आवश्यकता के हर 12 अच्छी प्लेट के लिए heparinized मानव रक्त की 10 मिलीलीटर लीजिए ।
  2. एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में, परत 5 पूर्व के 5 मिलीलीटर के शीर्ष पर मानव रक्त की मिलीलीटर-गरम Lympholyte-पाली सेल जुदाई मध्यम । एकाधिक ट्यूबों तैयार अगर प्रसंस्करण > खून की 5 मिलीलीटर बजाय बड़ी मात्रा ट्यूबों का उपयोग कर ।
  3. ३५ मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक, मध्यम त्वरण और कोई तोड़ का उपयोग कर ।
  4. ध्यान से ऊपरी mononuclear-सेल रिच बैंड एक प्लास्टिक pipettor और एक ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण का उपयोग कर हटा दें । यदि एकाधिक ट्यूबों चरण ३.२ में तैयार किए गए थे, बैंड एक एकल ५० मिलीलीटर ट्यूब में परित किया जा सकता है । पंजाबियों के साथ ५० मिलीलीटर तक ट्यूब की मात्रा लाओ ।
  5. 8 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक और supernatant हटा दें । इस चरण के दौरान जगह autoclaved 18 मिमी व्यास परिपत्र coverslips (#1 .5 मोटाई) एक अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में ।
  6. ३०० µ एल में सीरम मुक्त RPMI १६४० कुओं की वांछित संख्या के अनुसार सेल गोली resuspend; जैसे, अगर रक्त की 10 मिलीलीटर एक पूर्ण 12 अच्छी तरह से थाली तैयार करने के लिए संसाधित किया गया था, मीडिया के ३.६ मिलीलीटर में सेल गोली सस्पेंड ।
  7. 12-well थाली में प्रत्येक coverslip-युक्त अच्छी तरह से सेल निलंबन के ३०० µ एल जोड़ें । ३७ ° c + 5% CO2पर 1 h के लिए मशीन ।
  8. धीरे गर्म पंजाबियों के 1 मिलीलीटर के साथ coverslip 3x धो किसी भी गैर अनुयाई कोशिकाओं को दूर करने के लिए ।
  9. RPMI १६४० की 1 मिलीलीटर जोड़ें + 10% FBS + 10 एनजी/एमएल रिकॉमबिनेंट मानव एम-सीएसएफ + सेल कल्चर एंटीबायोटिक/antimycotic । 5 दिनों के लिए ३७ ° c + 5% सह2 पर मशीन ।
  10. RPMI १६४० के साथ मीडिया बदलें + 10% FBS + 10 एनजी/एमएल रिकॉमबिनेंट मानव एम-सीएसएफ + 10 एनजी/एमएल रिकॉमबिनेंट मानव आईएल-4 + सेल कल्चर एंटीबायोटिक/antimycotic । ३७ ° c + 5% CO 2 में 2 दिनों के लिए पूर्ण M2 ध्रुवीकरण के लिए मशीन ।
  11. ध्रुवीकरण मैक्रोफेज अगले 3 दिनों के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

4. अपोप्तोटिक Jurkat कोशिकाओं की तैयारी

  1. RPMI १६४० के 5 मिलीलीटर में संस्कृति Jurkat कोशिकाओं + 10% FBS पर ३७ ° c + 5% CO2. Jurkats एक निलंबन सेल लाइन रहे है और passaging 1:5 द्वारा ताजा, पूर्व में हर 3-5 दिनों में मीडिया गर्म द्वारा बनाए रखा जा सकता है ।
  2. अपोप्तोटिक कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, Jurkat संस्कृति उच्च घनत्व को विकसित करने की अनुमति (4-5 दिन passaging के बाद) । Aliquot एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और गोली कोशिकाओं में १.५ एमएल द्वारा 5 मिनट के लिए ५०० x जी में केंद्रापसारक ।
  3. supernatant त्यागें और सीरम मुक्त RPMI १६४० 1 µ मीटर staurosporine युक्त मध्यम के 1 मिलीलीटर में फिर से निलंबित सेल गोली ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस + 5% सह2 में अपोप्तोटिक कोशिकाओं को रेंडर करने के लिए 16 घंटे की मशीन ।
  5. यदि वांछित, Annexin वी के साथ धुंधला द्वारा apoptosis की प्रेरण की पुष्टि:
    1. Aliquot १०० µ एल के staurosporine-इलाज Jurkat सेल संस्कृति में एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब । 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं, supernatant त्यागें, और फिर से १०० सीरम मुक्त RPMI १६४० माध्यम के µ एल में सेल गोली सस्पेंड ।
    2. fluorescein isothiocyanate (FITC) के 1 µ l जोड़ें-संयुग्मित Annexin V और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
    3. //पंजाब के ९०० µ जोड़ें और पूरी मात्रा एक 12-अच्छी तरह से एक 18 मिमी परिपत्र ग्लास coverslip (#1.5 मोटाई) युक्त थाली के एक एकल के लिए स्थानांतरण । coverslip का पालन करने के लिए कोशिकाओं को मजबूर करने के लिए 1 मिनट के लिए २०० x g पर एक प्लेट अनुकूलक के साथ सुसज्जित एक केंद्रापसारक में नीचे स्पिन । वैकल्पिक रूप से, कक्ष इमेजिंग के लिए एक कक्षीय स्लाइड में रखा जा सकता है ।
    4. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि ।

5. बढ़ाता Efferocytic और गतिशीलता एक निश्चित सेल Efferocytosis परख और अंदर-बाहर धुंधला का उपयोग

  1. क्रमशः 1-3 वर्गोंमें वर्णित के रूप में THP-1, जंमू 774.2 या M2 मानव मैक्रोफेज तैयार करें ।
  2. प्रयोग की शुरुआत से पहले शाम को अपोप्तोटिक Jurkat कोशिकाओं के रूप में खंड 4में वर्णित तैयार करते हैं ।
  3. तुरंत प्रयोग करने से पहले, एक hemocytometer का उपयोग कर अपोप्तोटिक कोशिकाओं गिनती । एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में अपोप्तोटिक कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या स्थानांतरण-हम आम तौर पर जोड़ने के 5 x 105 कोशिकाओं/खैर, एक लक्ष्य: 10:1 के efferocyte अनुपात प्रदान करते हैं ।
  4. गोली Jurkat सेल द्वारा ५०० x g पर 5 मिनट के लिए और पंजाब के ५०० μL में resuspend ।
  5. इस केंद्रापसारक के दौरान, aliquot 10 µ एल DMSO के एक नए १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में । N-hydroxysuccinimidobiotin (एन एच-बायोटिन) की एक ंयूनतम राशि DMSO में भंग । 5-10 क्रिस्टल (~ ०.००५ मिलीग्राम) पर्याप्त है ।
  6. DMSO/एन एच-बायोटिन युक्त ट्यूब के लिए ५०० μL अपोप्तोटिक सेल/ फिर अपोप्तोटिक सेल निलंबन में निर्माता की सिफारिश की एकाग्रता के लिए एक सेल ट्रैकिंग डाई पतला । बनाने के लिए एक सेल ट्रैकिंग डाई कि FITC-Streptavidin के साथ वर्णक्रम पर ओवरलैप नहीं है का चयन करें (जैसे लाल या दूर लाल सेल ट्रैकिंग डाई) ।
  7. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन सस्पेंशन । RPMI १६४० के एक समान मात्रा + 10% FBS और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए किसी भी प्रतिक्रिया डाई बुझाने के लिए मशीन जोड़ें ।
  8. 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं, supernatant त्यागें, और पुनः RPMI १६४० के १०० µ l में सना हुआ अपोप्तोटिक कोशिकाओं को निलंबित + 10 FBS के प्रति अच्छी तरह से% मैक्रोफेज ।
  9. मैक्रोफेज के प्रत्येक कुआं पर सना अपोप्तोटिक सेल सस्पेंशन dropwise के १०० µ l को जोड़ें । एक प्लेट अनुकूलक के साथ सुसज्जित करने के लिए मैक्रोफेज और अपोप्तोटिक कोशिकाओं के बीच संपर्क बल के एक केंद्रापसारक में 1 मिनट के लिए २०० x g केंद्रापसारक ।
  10. ३७ डिग्री सेल्सियस पर समय की वांछित अवधि के लिए थाली मशीन + 5% एक ऊतक संस्कृति मशीन में2 CO । मैक्रोफेज के लिए, efferocytosed सामग्री आमतौर पर पहले detectable है के बाद 20 – 30 मिनट, और के बाद पूरा हो गया है 120 – 180 मिनट.
  11. वांछित समय बिंदु (ओं) में मशीन से कोशिकाओं को हटा दें । efferocytosis बंद करने और गैर-efferocytosed अपोप्तोटिक कक्षों को निकालने के लिए कक्ष तापमान पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें ।
  12. जोड़ें FITC-संयुग्मित streptavidin पर एक 1:1000 कमजोर पड़ने के लिए एक अच्छी तरह से और गर्मी अंधेरे में 20 मिनट के लिए । यह किसी भी गैर efferocytosed अपोप्तोटिक सेल सामग्री पर उजागर बायोटिन लेबल जाएगा ।
    नोट: यदि वांछित, सेल नाभिक 1 के अलावा इस कदम के दौरान दाग किया जा सकता है: Hoechst ३३३४२ या 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) के 20000 कमजोर पड़ने ।
  13. धो कोशिकाओं 1 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ 3 बार, धीरे मिलाते हुए या कुल्ला प्रति 5 मिनट के लिए नमूने कमाल । कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए पंजाब में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें । अतिरिक्त पीएफए हटाने के लिए पंजाबियों के साथ एक बार कुल्ला कोशिकाओं ।
  14. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के लिए इमेजिंग और स्थानांतरण के लिए एक स्लाइड पर माउंट coverslips. कब्जा z-सटीक ठहराव के लिए कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या के ढेर-आमतौर पर 10 – शर्त प्रति 30 कोशिकाओं. गैर आंतरिक अपोप्तोटिक सेल सामग्री कोशिका ट्रैकिंग डाई के रूप में परिणामी छवि में स्पष्ट हो जाएगा FITC-streptavidin धुंधला से घिरा सामग्री लेबल, जबकि efferocytosed सामग्री रूपों असतत सेल ट्रैकिंग डाई puncta किसी भी streptavidin से मुक्त धुंधला.
  15. उपायों की एक किस्म के माध्यम से जिसके परिणामस्वरूप छवियों में efferocytosis यों तो:
    1. मैक्रोफेज प्रति असतत efferosomes (सेल ट्रैकिंग डाई+/streptavidin- puncta) की औसत संख्या का निर्धारण करके efferocytic सूचकांक की गणना । यों ही एक अपोप्तोटिक कोशिका के लिए बाध्य मैक्रोफेज या ≥ 1 दिखाई efferosomes युक्त । रिकॉर्ड मैक्रोफेज एक अपोप्तोटिक सेल के लिए बाध्य है, लेकिन असतत efferosomes कमी, 0 के एक efferocytic सूचकांक होने के रूप में ।
    2. ≥ 1 efferosome वाले मैक्रोफेज के अंश को मापने के द्वारा efferocytic दक्षता की गणना करें ।
    3. स्थिर और एकाधिक समय-बिंदुओं पर दाग इमेजिंग कोशिकाओं द्वारा efferocytosis की दर की गणना । केवल छवि मैक्रोफेज अपोप्तोटिक कोशिकाओं के लिए बाध्य, या युक्त दिखाई efferosomes, जेड के साथ प्रत्येक कोशिका के ढेर पर कब्जा कर लिया । एक बार imaged, efferocytosis की दर निर्धारित करें:
      1. एक गाइड के रूप में धुंधला streptavidin का उपयोग करना, और मुक्तहस्त या बहुभुज चयन उपकरण में फिजी/ImageJ26 (या अंय छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज), सेल ट्रैकिंग डाई के सभी सर्कल+/streptavidin- (जैसे आंतरिक) z-पोट के एक एकल विमान में सामग्री । सेल ट्रैकिंग डाई इस क्षेत्र की एकीकृत तीव्रता को मापने । प्रत्येक efferosome के लिए व्यक्तिगत उपाय (जैसे व्यास, सेल सीमा या नाभिक, आदिके सापेक्ष स्थिति)15,27 आसानी से इन माप के साथ एक साथ प्राप्त किया जा सकता है, बहुत विश्लेषण के दौरान एकत्र डेटा में वृद्धि.
      2. एक ही z-खंड पर, एक गाइड के रूप में धुंधला streptavidin का उपयोग कर और मुक्तहस्त या बहुभुज चयन उपकरण, सेल ट्रैकिंग डाई+/streptavidin के सभी सर्कल+ (उदा गैर आंतरिक) जेड के एक एकल विमान में सामग्री-ढेर . केवल phagocyte के साथ संपर्क में अपोप्तोटिक कोशिकाओं से धुंधला शामिल हैं । इस क्षेत्र की एकीकृत तीव्रता को मापने ।
      3. चरण 4.2.3.1 छवि के शेष z-वर्गों के लिए 4.2.3.2 करने के लिए दोहराएँ । efferocytosed (Σeff) और गैर-efferocytosed (Σne) सामग्रियों की एकीकृत तीव्रता का योग करें । अपोप्तोटिक कक्ष जो efferocytosed किया गया है के अंश के रूप में कक्ष के लिए परिकलित किया जा सकता है:
        Equation
      4. सभी समय बिंदुओं पर सभी कक्षों के लिए भिंन efferocytosed को बढ़ाता है । ध्यान दें कि अपोप्तोटिक कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट तीव्रता/efferosomes अलग अपोप्तोटिक कोशिकाओं के द्वारा सेल ट्रैकिंग रंजक के ऊपर में बदलाव के कारण छवियों के बीच भिन्न हो सकते हैं, और इस तरह के जोखिम समय के रूप में छवि अधिग्रहण मापदंडों में परिवर्तन के कारण. जैसे, केवल भिन्न Efferocytosed, या तीव्रता-स्वतंत्र मानों जैसे efferocytic अनुक्रमणिका और efferocytic कुशलता, छवियों के बीच, प्रायोगिक स्थितियों के बीच, और दोहराने वाले प्रयोगों के बीच जैसे सामान्यीकृत मानों की तुलना करें.
    4. यह सुनिश्चित करने के लिए कि परिणामी डेटासेट कक्षों के बीच efferocytosis में भिंनता को प्रतिबिंबित करता है, प्रत्येक प्रयोग में संभावित कक्षों की अधिकतम संख्या पर इन विश्लेषणों का संचालन करें ।
      नोट: Efferocytic दक्षता और Efferocytic सूचकांक तेजी से (कुछ सेकंड/सेल) की गणना कर सकते हैं, और हम आम तौर पर प्रयोग के प्रति कम १०० कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए, प्रत्येक प्रयोग दोहरा कम से कम 3 बार उद्देश्य । efferocytosed सामग्री के अंश की गणना, और efferosome-विशिष्ट उपायों और अधिक श्रमसाध्य हैं, आमतौर पर 2-3 मिनट के लिए एक अनुभवी विश्लेषक के लिए/ इन गणनाओं के लिए हम प्रति प्रयोग के अनुसार, शर्त प्रति 15 कोशिकाओं की एक ंयूनतम बढ़ाता है ।
    5. प्रति-कोशिका के आधार पर efferocytic इंडेक्स, भिन्न efferocytosed और वैयक्तिक efferosome डेटा रिकॉर्ड करें.
      नोट: यह एकल-कक्ष दृष्टिकोण का उपयोग करके डेटा विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, जिससे अंतर-कक्ष रूपांतरों को quantified जा सके. व्यक्तिगत प्रयोगों में प्राप्त एकल-कक्ष डेटा का औसत करके इन डेटासेट पर जनसंख्या-स्तर विश्लेषण अभी भी किए जा सकते हैं. Efferosome-विशिष्ट माप जनसंख्या स्तर, एकल सेल स्तर पर विश्लेषण किया जा सकता है, और पहनावा के रूप में (जैसे उन कोशिकाओं से स्वतंत्र efferosomes की आबादी के रूप में)15

6. लाइव सेल Efferocytosis परख अपोप्तोटिक कोशिकाओं का उपयोग

  1. THP-1, j 774.2 या M2 मैक्रोफेज चरणों 1-3, क्रमशः में वर्णित के रूप में तैयार करें । यदि आवश्यक हो, तो कोशिकाओं को किसी भी प्रयोग प्रदर्शन करने से पहले transgenes या अंय आनुवंशिक निर्माण के साथ transfected से कम 18 ज होना चाहिए ।
  2. प्रयोग की शुरुआत से पहले शाम, अपोप्तोटिक Jurkat कोशिकाओं के रूप में निंनलिखित संशोधनों के साथ 4 और 5 वर्गों में वर्णित तैयार:
    1. कोशिकाओं को पतला और 4.1-4.3 के अनुसार apoptosis प्रेरित, और अपोप्तोटिक कोशिकाओं की आवश्यक संख्या के अनुसार इकट्ठा 5.3 – 5.4 ।
    2. अपोप्तोटिक सेल निलंबन के लिए निर्माता की सिफारिश की एकाग्रता पर एक सेल ट्रैकिंग डाई जोड़ें । अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन सस्पेंशन । RPMI १६४० के एक समान मात्रा + 10% FBS और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए किसी भी प्रतिक्रिया डाई बुझाने के लिए मशीन जोड़ें । इन प्रयोगों के लिए एन एच-बायोटिन मत जोड़ें ।
    3. 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं, supernatant त्यागें, और पुन: RPMI १६४० के १०० µ l में सना हुआ अपोप्तोटिक कोशिकाओं को निलंबित + 10% FBS के प्रति अच्छी तरह से मैक्रोफेज ।
  3. यदि आवश्यक हो, एक अच्छी तरह से संस्कृति मीडिया को हटाने के द्वारा मैक्रोफेज लेबल और ५०० के निर्माताओं से युक्त पंजाबियों की µ एल जोड़ने एक सेल ट्रैकिंग डाई कि वर्णक्रम के साथ सेल ट्रैकिंग डाई के साथ ओवरलैप नहीं करता है की सिफारिश की कमजोर पड़ने अपोप्तोटिक कोशिकाओं या किसी भी जोड़ा फ्लोरोसेंट transgenes मैक्रोफेज द्वारा व्यक्त की है । अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन, तो DMEM के एक समान मात्रा + 10% FBS और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए किसी भी प्रतिक्रिया डाई बुझाने के लिए गर्मी जोड़ें ।
  4. मैक्रोफेज-युक्त coverslip को एक Leiden कक्ष में स्थानांतरित करें । Add ४०० µ l के DMEM + 10% FBS, के बाद १०० µ l के लेबल्ड अपोप्तोटिक सेल सस्पेंशन. धीरे से pipetting मीडिया 2-3 बार मिक्स ।
  5. एक गर्म और सह2-एक लाइव सेल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के perfused चैंबर के लिए Leiden चैंबर स्थानांतरण ।
    नोट: माइक्रोस्कोप setups कि कमी सह2 छिड़काव क्षमताओं के लिए, ऊतक संस्कृति माध्यम का उपयोग 1 मिमी 4 के साथ बफर-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) के बजाय सोडियम बिकारबोनिट शारीरिक पीएच बनाए रखने के लिए जबकि संस्कृति की हवा सामने आ रही है ।
  6. एक समय चूक एक सफेद प्रकाश (चरण कंट्रास्ट या उद्योग) छवि, और सभी फ्लोरोसेंट लेबल की छवियां युक्त श्रृंखला पर कब्जा:
    1. प्रयोगों के लिए एक 100X उद्देश्य लेंस का प्रयोग करें जहां ठीक विवरण की आवश्यकता है (जैसे phagocyte-अपोप्तोटिक सेल इंटरैक्शन की झिल्ली गतिशीलता) । इस बीच, और अधिक सामांय उपाय (अपोप्तोटिक सेल के ऊपर की दर, मैक्रोफेज और अपोप्तोटिक कोशिकाओं के बीच बातचीत के समय, आदि) सबसे अच्छा एक 60X या 63X उद्देश्य का उपयोग कर रहे है imaged ।
    2. यदि उपलब्ध हो, एक एकल अर्जन के दौरान छवि एकाधिक फ़ील्ड्स-दृश्य देखने के लिए पॉइंट-विजिटिंग का उपयोग करें, इस प्रकार किसी एकल प्रयोग में कैप्चर किए गए efferocytic ईवेंट्स की संख्या बढ़ाना
    3. क्योंकि efferocytes अक्सर अपोप्तोटिक कोशिकाओं के छोटे टुकड़े निगल, के बजाय बरकरार कोशिकाओं, यह जेड पर कब्जा करने के लिए सबसे अच्छा है ढेर । phototoxicity को कम करने के लिए, अपने सूक्ष्मदर्शी उद्देश्य (आमतौर पर 0.5-1.0 µm) के फोकल गहराई से अलग z-वर्गों पर कब्जा, सेल की मोटाई के माध्यम से (आमतौर पर मैक्रोफेज के लिए 8-10 µm, जैसे 8-20 स्लाइस/ यह सुनिश्चित करता है कि सभी समाई और तस्करी की घटनाओं में कम से एक z-विमान में दिखाई जाएगी । वैकल्पिक रूप से, बड़े (1 – 5 µm व्यास) का उपयोग करें अपोप्तोटिक सेल नकल या अपोप्तोटिक कोशिकाओं है कि efferocytosis के दौरान ंयूनतम विखंडन से गुजरना (जैसे गर्मी चौंक न्यूट्रोफिल) के बजाय z-stacking बिना । हम दोनों की नकल और अपोप्तोटिक न्यूट्रोफिल पहले28की तैयारी का वर्णन किया है ।
    4. photobleaching को कम करने के लिए, चमकीले fluorophores का उपयोग करें और अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग कर छवियों पर कब्जा photobleaching कम से कम- उदाहरण के लिए उच्च कैमरा लाभ और कम जोखिम समय के साथ संयुक्त उत्तेजना29। हम दृढ़ता से एक उच्च संवेदनशीलता विद्युत चुम्बकीय आरोप-युग्मित डिवाइस (EM-सीसीडी) कैमरा या कताई-डिस्क फोकल, और इमेजिंग के इस रूप के लिए एक उच्च गति piezoelectric यांत्रिक चरण के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की सलाह देते हैं ।
  7. संभव विश्लेषण विधियों कि इन समय चूक वीडियो के लिए लागू किया जा सकता है की संख्या व्यापक और हमारे यहां की समीक्षा करने की क्षमता से परे है । कुछ उदाहरण के रूप में, का उपयोग करें मैनुअल या स्वचालित ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर संलयन, विखंडन और efferosomes के आंदोलन15कोशिकाओं के भीतर ट्रैक करने के लिए, efferosome फ्यूजन गतिशीलता endolysosomes के साथ colocalization विश्लेषण द्वारा मैक्रोफेज में व्यक्त डिब्बे-विशिष्ट फ्लोरोसेंट transgenes13, की निगरानी के रूप में इस तरह की जांच और कप गठन30, सिग्नलिंग और efferosome13के लिए तस्करी प्रोटीन की भर्ती गतिशीलता का निर्धारण, और/ pH-संवेदी, ऑक्सीडेंट-संवेदी या degradative-सक्रिय fluorophores31के साथ लेबल किए गए अपोप्तोटिक कक्षों का उपयोग करके efferosomes की गतिविधि को बढ़ाता है ।

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Representative Results

1 µ मीटर staurosporine के साथ Jurkat कोशिकाओं के रातोंरात संस्कृति > कोशिकाओं के 95% है, जो Annexin वी धुंधला (चित्रा 1) के साथ पुष्टि की जा सकती है की apoptosis में परिणाम । अंय प्रकार के सेल इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि staurosporine की एकाग्रता और staurosporine उपचार की अवधि के लिए प्रत्येक सेल लाइन के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी । विश्वसनीय पता लगाने और efferocytosis के ठहराव के लिए, > कोशिकाओं के 80% efferocytes के लिए उन्हें जोड़ने से पहले अपोप्तोटिक किया जाना चाहिए. apoptosis के अंय उत्प्रेरण (जैसे हीट शॉक, etoposide और यूवी प्रकाश) भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन हमारे अनुभव में, इन apoptosis की एक और विषम प्रेरण उत्पादन अपोप्तोटिक, माध्यमिक और मिश्रित युक्त कोशिका आबादी में परिणाम गैर-अपोप्तोटिक लक्ष्य कक्ष ।

फिक्स्ड सेल इमेजिंग के लिए अंदर-बाहर धुंधला के साथ, बारीकी से apposed efferocyte-अपोप्तोटिक सेल बातचीत स्पष्ट रूप से delineated गैर efferocytosed (streptavidin+/cell ट्रैकिंग डाई+) के साथ, सभी समय बिंदुओं पर मनाया जाना चाहिए और efferocytosed (streptavidin-/cell ट्रैकिंग+) दृश्य सामग्री (चित्रा 2) । यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि synapse कि efferocyte और अपोप्तोटिक सेल के बीच रूपों अक्सर काफी तंग करने के लिए streptavidin बाहर है, और इस तरह किसी भी सेल ट्रैकिंग अपनी परिधि पर किसी भी बिंदु पर असर streptavidin एक विचार किया जाना चाहिए एक डाई दाग वस्तु बाउंड सेल और नहीं एक efferosome । अधिकांश प्रयोगों में अपोप्तोटिक कोशिकाओं है कि efferocytosed एक समय पर निर्भर फैशन में वृद्धि होगी के अंश, या तो जब तक कोई गैर आंतरिक अपोप्तोटिक सेल सामग्री रहते हैं, या जब तक phagocyte अपनी अधिकतम efferocytic क्षमता तक पहुँचता है (चित्रा 3). विश्लेषण आम तौर पर किया जाता है और व्यक्तिगत कोशिकाओं (चित्र 3ए) के लिए दर्ज की गई है, तथापि, डेटा व्यक्तिगत प्रयोगों के भीतर कोशिकाओं में औसत और कई प्रयोगात्मक दोहराता से औसत मूल्य हो सकता है पारंपरिक के साथ विश्लेषण सांख्यिकीय दृष्टिकोण (चित्र बी) । इस मानकीकृत प्रोटोकॉल के संशोधनों के प्राथमिक सेल प्रकार, वैकल्पिक efferocytic लक्ष्य के उपयोग के लिए अनुमति देने के लिए किया जा सकता है, और अतिरिक्त दाग के लिए शामिल किया जाना है । उदाहरण के लिए, चित्रा 4 एक प्राथमिक M2-ध्रुवित मानव मैक्रोफेज है कि efferocytosed अपोप्तोटिक सेल 3 µm व्यास सिलिका phosphatidylserine और28phosphatidylcholine, के एक मिश्रण में लेपित मोतियों की नकल शामिल है से पता चलता है, जिसके बाद बाद के निर्धारण, रीसाइक्लिंग endosome मार्कर Rab17 के लिए permeabilization और immunostaining ।

लाइव सेल इमेजिंग efferocytic व्यावसायिक फ़ैगोसाइट के दौरान एक प्रक्रिया में छोटी प्रक्रियाओं को विस्तार और वापस लेने के लिए मनाया जाएगा "जांच"30 (चित्रा 5, टी = 0); जब इन प्रक्रियाओं एक लक्ष्य वे दृढ़ता से लक्ष्य का पालन करें और यह phagocyte को आकर्षित मुठभेड़ । इस गतिविधि की जांच गैर-पेशेवर फ़ैगोसाइट जैसे उपकला कोशिकाओं के साथ स्वीकार्य नहीं किया जा सकता है । efferocyte तो खुद को और अपोप्तोटिक सेल के बीच एक तंग "efferocytic synapse"३२ फार्म, इस synapse अक्सर अपोप्तोटिक सेल के एक बड़े हिस्से को ढंक (5 चित्रा, टी = 10) के साथ होगा । efferocyte उसके cytosol (चित्रा 5, 10-30 मिनट) में इस synapse से अपोप्तोटिक सेल के टुकड़ों को फिर आकर्षित करेगा । उनके गठन के तुरंत बाद, इन नवजात efferosomes synapse से दूर है और पेरि-नाभिकीय क्षेत्र, Rab7/RILP/dynein-dynactin मध्यस्थता परिवहन३३का एक परिणाम की ओर से तस्करी कर रहे हैं । समय के साथ efferosomes हटना होगा और जिसके परिणामस्वरूप नीचा पदार्थ सेल, जहां वे होने की संभावना है अवशोषित या पुनर्नवीनीकरण13,15भर में redistributeded सामग्री । इन प्रक्रियाओं का पता लगाने की क्षमता अधिग्रहण फ्रेम दर और प्रयोग की अवधि पर अत्यधिक निर्भर है । इस तरह की जांच के रूप में तेजी से प्रक्रियाओं को कम फ्रेम दर पर नहीं देखा जा सकता है, जबकि धीमी घटनाओं (efferosome तस्करी और अवशोषण) अब इमेजिंग समय की आवश्यकता-दोनों मामलों में, इन बड़ी छवि अधिग्रहण अक्सर कम तीव्रता छवियों का कब्जा की आवश्यकता photobleaching और phototoxicity (चित्रा 5) को सीमित करने के लिए । निश्चित सेल परख के साथ के रूप में, इस परख के रहते सेल संस्करण अंवेषक की जरूरतों के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है । चित्रा 6 मैक्रोफेज transgenes जो फ्लोरोसेंट प्लाज्मा झिल्ली (प्रधानमंत्री-GFP) और जो चुनिंदा संकेत लिपिड PI (3) पी (FYVE-आरएफपी) बांध के demark व्यक्त की एक जीवित सेल अधिग्रहण के एक एकल फ्रेम से पता चलता है 774.2 । PI की जनरेशन (3) efferosome झिल्ली पर P-GFP+ efferosome झिल्ली के साथ FYVE-आरएफपी के सह-स्थानीयकरण के रूप में पता लगाया जा सकता है । efferosome पर FYVE-आरएफपी की तीव्रता को बढ़ाता है, PI की गतिशीलता (3) P संकेतन efferosome पर quantified (चित्रा 6) हो सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: अपोप्तोटिक और गैर अपोप्तोटिक Jurkat कोशिकाओं के Annexin वी धुंधला । Annexin वी लेबल phosphatidylserine "खाओ मुझे" अपोप्तोटिक कोशिकाओं द्वारा उजागर संकेत । शीर्ष अनुपचारित (यूटी) Jurkat कोशिकाओं को एक स्वस्थ (चिकनी और गोल) आकृति विज्ञान (उद्योग) प्रदर्शन और Annexin V. (नीचे) Jurkat कोशिकाओं के साथ दाग नहीं है 1 µ एम staurosporine (अनुसूचित जनजातियों) के साथ रातोंरात संस्कृति एक अपोप्तोटिक आकृति विज्ञान पर ले (अनियमित और blebbed) और दाग के साथ Annexin वी. स्केल बार = 10 µm, छवि तीव्रता एक रंग मानचित्र के रूप में प्रदर्शित किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: जंमू 774.2 मैक्रोफेज द्वारा अपोप्तोटिक Jurkat कोशिकाओं के प्रारंभिक और देर से समाई । छवियां मैक्रोफेज के एक प्रारंभिक (६० मिनट) और देर (१२० मिनट) efferocytosis की अवस्था में है । व्हाइट-लाइट (उद्योग) छवि मैक्रोफेज (mφ) और अपोप्तोटिक सेल (एसी) के बीच तंग इंटरफेस दिखाता है । सेल ट्रैकिंग डाई (सीटीडी, लाल) सभी अपोप्तोटिक सेल-व्युत्पन्न सामग्रियों के स्थान का पता चलता है । FITC-Streptavidin धुंधला (Str, हरे) अपोप्तोटिक सेल है कि अभी तक मैक्रोफेज द्वारा नहीं किया गया है के भाग को पहचानता है । मैक्रोफेज नाभिक पूर्व DAPI (नीला) के साथ दाग थे । Efferosomes (लाल) बनाम गैर अपोप्तोटिक सेल के आंतरिक भाग (हरा/आसानी से Streptavidin और सेल ट्रैकिंग डाई छवियों के एक ओवरले में पहचाने जाते हैं । मैक्रोफेज-अपोप्तोटिक सेल इंटरफेस पर जल्दी timepoint, कसकर गठित streptavidin efferocytic (*) से synapse के बहिष्कार के द्वारा बनाई गई पर धुंधला streptavidin के अभाव नोट । मैक्रोफेज नाभिक Hoechst धुंधला (नीला) द्वारा पहचाना जाता है । स्केल बार = 10 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 3
चित्रा 3: जे 774.2 मैक्रोफेज द्वारा अपोप्तोटिक सेल Efferocytosed के अंश का समय-पाठ्यक्रम । Efferocytosis परख संकेत बार के लिए प्रदर्शन किया, और अपोप्तोटिक सेल हर समय सेल ट्रैकिंग डाई/Streptavadin धुंधला का उपयोग कर बिंदु पर निर्धारित सामग्री के अंश थे । () वैयक्तिक मैक्रोफेज के भीतर efferocytosed सामग्रियों के अंश, व्यक्तिगत कोशिकाओं से डेटा प्रस्तुत किया जाता है, क्षैतिज पट्टी माध्य को इंगित करती है. 12-हालत प्रति 17 कोशिकाओं, 5 स्वतंत्र प्रयोगों में से 1 से डेटा । () efferocytosed सामग्रियों के अंश, औसत रूप से 5 स्वतंत्र प्रयोगों में, न्यूनतम 10 कक्ष/ * p < 0.05 की तुलना में 30 min, डन करेक्शन के साथ Kruskal-वालिस test. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्राथमिक मानव मैक्रोफेज में Efferosomes को Rab17 भर्ती का विश्लेषण । एक M2-ध्रुवीकरण मैक्रोफेज घिरा अपोप्तोटिक सेल नकल (तीर) और Rab17 के लिए immunostained था (हरा) ६० मिनट के बाद समाई । स्केल बार = 5 µm. सेल नाभिक Hoeschst के साथ दाग है, उद्योग की छवि सेल आकृति विज्ञान से पता चलता है और अपोप्तोटिक सेल की नकल की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: लाइव सेल efferocytosis परख । एक सेल ट्रैकिंग डाई labeledj 774.2 मैक्रोफेज (mφ, ग्रीन) दर्ज की गई क्योंकि यह एक अलग रंग सेल ट्रैकिंग डाई (एसी, लाल) के साथ लेबल एक अपोप्तोटिक Jurkat सेल घिरा हुआ था । अपोप्तोटिक सेल internalization प्रक्रिया के दौरान कई टुकड़ों में टूट जाता है, जिसके परिणामस्वरूप piecemeal और कई efferosomes (तीरों) का निर्माण होता है । स्केल बार = 10 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 6
चित्रा 6: Efferocytic संकेतन की जांच करने के लिए फ्लोरोसेंट Transgenes का उपयोग करना । एक जंमू 774.2 मैक्रोफेज एक GFP-टैग प्लाज्मा झिल्ली मार्कर (प्रधानमंत्री, ग्रीन) और FYVE-आरएफपी निर्माण, जो संकेत लिपिड PI (3) पी (लाल) बांध के साथ transfected था । Efferocytosis रूपों एक नवजात प्लाज्मा झिल्ली-व्युत्पंन efferosome कि PI (3) पी, के रूप में FYVE-आरएफपी भर्ती (तीर) द्वारा पता चला है । PI की गतिशीलता (3) पी संकेतन efferosome बंद करने (टी = 0, ग्राफ) के बिंदु पर मौजूद FYVE-आरएफपी संकेत के सापेक्ष गुना तीव्रता के रूप में quantified था. यह प्रयोग अपोप्तोटिक कोशिकाओं के बजाय एक अपोप्तोटिक सेल नकल उतार मनका (तीर, डिक) का इस्तेमाल किया । स्केल बार = 5 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित विधियों इमेजिंग और गतिशील efferocytic प्रक्रिया के ठहराव सक्षम करें, दोनों निश्चित-कक्ष और लाइव-सेल दृष्टिकोण का उपयोग कर । इन तरीकों पर आमतौर पर कार्यरत प्रवाह cytometry-23,24तरीकों आधारित कई लाभ प्रदान करते हैं । अंदर-बाहर तय नमूनों के साथ धुंधला के उपयोग की दर और efferocytosis की हद तक एक और अधिक मजबूत और सटीक ठहराव प्रदान करता है-वास्तव में, कई प्रवाह cytometry आधारित तरीकों बस अपोप्तोटिक कोशिकाओं और मैक्रोफेज अलग fluorophores के साथ लेबल, और मैक्रोफेज सह के अंश के रूप में efferocytosis स्कोर अपोप्तोटिक सेल मार्कर के साथ धुंधला, इस प्रकार की क्षमता को बाध्य बनाम आंतरिक अपोप्तोटिक सेल सामग्री के बीच अंतर की कमी । वैकल्पिक प्रवाह cytometry दृष्टिकोण उन अपोप्तोटिक कोशिकाओं24लेबल pHrodo का उपयोग कर शामिल हैं । pHrodo एक पीएच संवेदनशील fluorophore अंलीय पीएच पर चमक में बढ़ जाती है । हालांकि इस fluorophore आंतरिक सामग्री बनाम आंतरिक के बीच बेहतर समाधान प्रदान करता है, के रूप में प्रतिदीप्ति अपोप्तोटिक कोशिका और अंलीकरण के efferosome के internalization के बाद विशेष रूप से बढ़ता है, परिणाम हो सकता है रोग प्रक्रियाओं जो efferosome अंलीकरण३४,३५ख़राब है, और इस विधि efferosomes जल्दी (पूर्व अंलीकरण) efferocytosis३६, अंलीकरण में स्थित के चरणों में याद करेंगे द्वारा स्थापित-गरीब क्षेत्रों के सेल27, या कोशिकाओं में जो कमजोर acidify उनके lysosomes३७। इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि का एक दूसरा लाभ है लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग करने के लिए efferocytosis की गतिशीलता को मापने, जैसे प्रक्रियाओं के रूप में जांच, efferocytic synapse के गठन, और efferosomes के intracellular ्े नहीं किया जा सकता प्रवाह cytometry-आधारित approaches का उपयोग कर पाया ।

हालांकि इस विधि कई लाभ प्रदान करता है, कोशिकाओं के कई सैकड़ों के ठहराव की आवश्यकता प्रयोग- उदाहरण के लिए दुर्लभ घटनाओं का पता लगाने के प्रयोगों, या अत्यधिक चर प्रक्रियाओं को बढ़ाता है-मुश्किल हो सकता है, इन बड़े डेटासेट के विश्लेषण के साथ समय की एक अत्यधिक राशि ले रही है । इमेजिंग प्रवाह cytometry३८ जैसे उच्च प्रवाह इमेजिंग दृष्टिकोण पारंपरिक माइक्रोस्कोपी की तुलना में उच्च प्रवाह के लिए अनुमति दे सकता है, हालांकि हमारे अनुभव वर्तमान स्वचालित छवि विश्लेषण कार्यक्रमों में हमेशा सही विभाजन के लिए सक्षम नहीं हैं गैर आंतरिक सामग्री बनाम आंतरिक । विशेष रूप से, तंग efferocytic synapse जो अपोप्तोटिक सेल और efferocyte के बीच रूपों streptavidin धुंधला बाहर कर सकते हैं, और जैसे एक बाध्य अपोप्तोटिक कोशिका अक्सर सेल ट्रैकिंग डाई चैनल में एक ठोस द्रव्यमान के रूप में प्रकट होता है, कि आंशिक रूप से लिफाफा है streptavidin धुंधला (चित्रा 2) । इस प्रकार, जबकि efferosomes आसानी से पहचाने जाते है एल्गोरिदम, अपोप्तोटिक कोशिका के बंधे हिस्से अक्सर एक efferosome आंशिक streptavidin धुंधला के लिए लेखांकन की कठिनाई के कारण के रूप में पहचाना जाता है । जब तक हम अभी तक एक प्रोग्राम है कि सही की पहचान कर सकते है और मानव सहायता के बिना अपोप्तोटिक कोशिकाओं के piecemeal तेज मात्रा का पता लगाने के लिए, हमने पाया है कि ट्रेनी अर्द्ध स्वचालित सिस्टम३९ बहुत विश्लेषण को तेज कर सकते हैं, अंश को कम करने efferocytosed माप से 2 – 3 मिनट के लिए < 60 s प्रति कक्ष । वैकल्पिक रूप से, गैर पच अपोप्तोटिक सेल नकल या सेल प्रकार जो apoptosis पर ंयूनतम टुकड़ा, इसके बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है । यह एकल, बड़ा संरचनाओं, जो और अधिक स्वचालित दृष्टिकोण के लिए उत्तरदाई हो सकता है और जेड के लिए की आवश्यकता को समाप्त कर सकते है का पता लगाने सरल । यहां तक कि इन अग्रिमों के साथ, अधिग्रहण और इस पद्धति के विश्लेषण की गति सीमित रहता है, और जैसे प्रवाह cytometry सबसे व्यवहार्य तरीका रहता है जब बड़े सेल संख्या के विश्लेषण23की आवश्यकता है ।

यद्यपि हमने इस विधि का उपयोग कक्ष-पंक्ति और प्राथमिक मानव मैक्रोफेज के रूप में efferocytes और अपोप्तोटिक Jurkat कक्षों (a T कक्ष पंक्ति) के रूप में लक्ष्य के रूप में किया है, यह विधि किसी भी efferocytic कक्ष प्रकार या अपोप्तोटिक कक्ष लक्ष्य पर लागू की जा सकती है । दरअसल, इसी तरह के दृष्टिकोण हेपैटोसाइट्स और उपकला कोशिकाओं9,४०,४१में efferocytosis की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और ट्यूमर कोशिकाओं४२के रूप में नैदानिक प्रासंगिक लक्ष्यों की efferocytosis. यह गैर-प्रतिरक्षा efferocytes, या जब विशिष्ट efferocytic ईवेंट्स मॉडलिंग का उपयोग करते समय इस प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए आवश्यक हो सकता है । उदाहरण के लिए, Jurkat कोशिकाओं गैर अनुयाई है और इसलिए पूरी तरह से दोहराऊंगा यांत्रिक बलों और स्थानिक सीमाओं efferocytes मुठभेड़ जब अनुयाई अपोप्तोटिक कोशिकाओं या ठोस ऊतकों के भीतर अपोप्तोटिक कोशिकाओं के साथ बातचीत करने के लिए संभावना नहीं है । कई सेल प्रकार apoptosis के दौरान आसंजन को बनाए रखने और इसलिए अनुयाई लक्ष्य के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है; एक उदाहरण के रूप में, हेला कोशिकाओं reproducibly staurosporine प्रेरित apoptosis से गुजरना, phosphatidylserine पांव मार, और एक 4-6 एच अवधि में blebbing जबकि सेल शरीर४३के आसंजन को बनाए रखने । कोशिकाओं को एक कोलेजन मैट्रिक्स या स्टेम सेल में निलंबित-organoids४४ व्युत्पंन ठोस ऊतकों में efferocytosis अध्ययन के लिए संभावित मॉडल हो सकता है, हालांकि हम किसी भी अध्ययन है जो इन तरीकों का इस्तेमाल किया है से अनजान हैं । कुछ मॉडलों के लिए ऐसी Jurkat कोशिकाओं और न्यूट्रोफिल के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं अपोप्तोटिक लक्ष्य के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए, के रूप में इन कोशिकाओं को जारी कर सकते हैं cytokine-आधारित "find-me" संकेतों जैसे CX3CL1 जो मॉडल में एक प्रकारक हो सकता है जहां भड़काऊ या प्रवासी प्रक्रियाओं४५की जांच कर रहे हैं । इस प्रकार, जबकि इस परख की बहुमुखी प्रतिभा के लिए यह सेल प्रकार और मॉडल प्रणाली की एक सीमा के पार efferocytosis का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है, देखभाल के लिए उपयुक्त efferocytes, लक्ष्य कोशिकाओं का चयन करें, और संस्कृति की स्थिति का सबसे अच्छा मॉडल शारीरिक लिया जाना चाहिए जांच के तहत प्रक्रिया ।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित विश्लेषण विधियों केवल एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, इन प्रयोगों के विश्लेषण की एक विस्तृत श्रृंखला को सक्षम करने की इमेजिंग आधारित प्रकृति के साथ इरादा कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, efferosome पोजिशनिंग और व्यास माप एकत्र किया जा सकता है जब अंश efferocytosed माप प्रदर्शन, या लाइव सेल समय पाठ्यक्रमों के भीतर मापा, के क्रम में इस तरह की intracellular तस्करी के रूप में प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए efferosomes और अपोप्तोटिक कोशिका ह्रास की दर१३,१५. Immunostaining (चित्रा 4) efferosomes करने के लिए प्रोटीन की भर्ती की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि लाइव सेल इमेजिंग रूपात्मक विश्लेषण के साथ संयुक्त ऐसी प्रक्रियाओं बाध्यकारी प्रभावकारिता और समाई की दर30 , ४६. हम अक्सर efferocytosis (चित्रा 6) के दौरान अणु सक्रियण या सेलुलर घटनाओं की गतिविधि का संकेत है कि रिपोर्ट फ्लोरोसेंट transgenes व्यक्त मैक्रोफेज में इन परख प्रदर्शन करते हैं । ये रिपोर्टर efferocytosis के दौरान सिग्नलिंग प्रक्रियाओं की निगरानी सक्षम करते हैं; उदाहरण के लिए, हम फ्लोरोसेंट-टैग ऄब GTPases का इस्तेमाल किया है मध्यस्थता efferosome प्रसंस्करण में Rab5, Rab7 और Rab17 की भूमिका का पता लगाने के लिए और अपोप्तोटिक सेल के बाद के अवैध प्रतिजनों व्युत्पंन13,15। इसी तरह, सेल मौत, efferosome पीएच, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन के पत्रकारों के शामिल है, और अंय सेलुलर प्रक्रियाओं रहते सेल प्रयोगों में 31 efferosomes के क्षरण मध्यस्थता प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता ,४७. इन प्रयोगों में एक आम चुनौती संगत fluorophores के साथ transgenes या पत्रकारों की पहचान है; अक्सर, हम इमेजिंग अंय fluorophores के लिए मुक्त चैनल के लिए सेल पर नज़र रखने डाई और/ कुछ प्रयोगों के लिए यह एक गैर-खंडित नकल के साथ अपोप्तोटिक सेल को प्रतिस्थापित करने के लिए फायदेमंद है । यह एक एकल अपोप्तोटिक सेल से व्युत्पंन एकाधिक efferosomes ट्रैकिंग की जटिलता के बिना संकेतन गतिशीलता और सेलुलर प्रक्रियाओं के ठहराव के लिए अनुमति देता है । देखें इवांस एट अल. अपोप्तोटिक सेल की तैयारी पर निर्देशों के लिए नकल28.

सबसे आम कठिनाई जब इन प्रयोगों डिजाइनिंग fluorophores का एक संयोजन है कि वांछित प्रक्रियाओं के लिए अनुमति देने के लिए छवि हो रही है, जबकि photobleaching और phototoxicity29ंयूनतम । Fluorophore चयन मोटे तौर पर पराबैंगनीकिरण/उत्तेजना फिल्टर, dichroics/cubes और माइक्रोस्कोप के उत्सर्जन फिल्टर द्वारा तय है, और इसलिए fluorophores के विकल्प अक्सर व्यक्तिगत सूक्ष्मदर्शी के लिए विशिष्ट है । आम तौर पर, अब तरंग दैर्ध्य fluorophores (नारंगी दूर तक लाल, जैसे उत्सर्जन maxima > 580 एनएम) कम photobleaching करने के लिए प्रवण है और इन तरंग दैर्ध्य कोशिकाओं को कम विघटनकारी हैं । ग्रीन fluorophores (उत्सर्जन maxima ~ ५२५ एनएम) इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन देखभाल के लिए कोशिकाओं को phototoxicity सीमा लिया जाना चाहिए । Fluorophores कि तरंग दैर्ध्य से कम ४८० एनएम (बैंगनी और नीला) उत्तेजित करने के लिए अपने उच्च phototoxicity और ब्लीच अंय Fluorophores29के लिए इन उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए प्रवृत्ति के कारण बचा जाना चाहिए । जहाँ संभव हो, उच्च-चमक और स्थिर fluorophores का चयन किया जाना चाहिए. इसी तरह, छवि अधिग्रहण मानकों photobleaching और phototoxicity को कम करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए- उदाहरण के लिए कम उत्तेजना तीव्रता पर अब जोखिम उच्च उत्तेजनाता४८से अधिक पसंद कर रहे हैं. ऐसे rutin और कुछ मीडिया घटकों को हटाने के रूप में antioxidants के अलावा दोनों photostability में सुधार और४९phototoxicity कम कर सकते हैं । यहां तक कि fluorophores और इमेजिंग शर्तों के सावधान चयन के साथ, photobleaching सीमा की जरूरत अक्सर कम संकेत करने वाली शोर अनुपात के साथ छवियों के कब्जा की आवश्यकता है (एक उदाहरण के लिए चित्र 5 देखें) । यदि प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ाता है, महान देखभाल की जरूरत छवि प्रसंस्करण कलाकृतियों को सीमित करने के लिए लिया जाना है; आदर्श रूप में, प्रसंस्करण के किसी भी रूप के बिना कच्चे छवियों का विश्लेषण किया जाना चाहिए । यदि deconvolving छवियों ठहराव करने से पहले, फ्लोरोसेंट तीव्रता को बरकरार रखता है कि एक deconvolution एल्गोरिथ्म५०,५१इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

लाइव सेल अधिग्रहण उत्तेजना तीव्रता, जोखिम समय, फ्रेम दर, और प्रयोग अवधि के बीच एक सावधान संतुलन की आवश्यकता सफल प्रयोगों के साथ विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है । उत्तेजना तीव्रता और जोखिम समय के रूप में ऊपर वर्णित phototoxicity को कम करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए, चेतावनी है कि अब जोखिम समय सेल आंदोलन के कारण गति कलाकृतियों में परिणाम या अधिग्रहण की सीमा फ्रेम दर के साथ हो सकता है । फ्रेम दर प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर भिन्न हो सकते हैं । कम फ़्रेम दर (5-30 फ्रेम के बीच मिनट) इमेजिंग समय की लंबी अवधि (12 ज या अधिक) के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन इस तरह की झिल्ली गतिशीलता और पोस्ट-efferocytosis efferosomes के नलए के रूप में घटना पर ंयूनतम डेटा प्रदान करते हैं । उच्च फ़्रेम दर (के रूप में के रूप में तेजी से 1 प्रति सेकंड फ्रेम) efferocytic घटनाओं और efferosome तस्करी के उत्कृष्ट लौकिक संकल्प प्रदान-लेकिन भी fluorophores, उत्तेजना तीव्रता और जोखिम समय के सावधान चयन के साथ-photobleaching या phototoxicity आमतौर पर इन प्रयोगों को अवधि में एक घंटे से कम समय तक सीमित कर देगा । हमारे अनुभव में, छवियों को प्राप्त करने के हर 1-2 मिनट, 2 की प्रयोगात्मक अवधि-6 एच पर, एक स्वीकार्य समझौता है कि efferocytic घटनाओं की एक पर्याप्त संख्या के quantifiable छवियों प्रदान करता है, उचित लौकिक संकल्प के साथ कर रहे हैं ।

बदल और विफल efferocytosis कैंसर, atherosclerosis और एकाधिक स्व-प्रतिरक्षित विकारों की विकृति में शामिल होने के लिए जाना जाता है efferocytosis के साथ लक्ष्यीकरण महान नैदानिक वादा7,५२ दिखा चिकित्सा, ५३,५४,५५. इन क्षेत्रों में आगे विकास की पहचान और सेलुलर प्रक्रियाओं, रिसेप्टर्स और संकेत रास्ते जो efferocytosis विनियमित के लक्षण वर्णन की आवश्यकता होगी । इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत परख इन अध्ययनों के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है और सेलुलर और संकेतन प्रक्रियाओं efferocytosis विनियमन के कई यों तो संशोधित किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं की ।

Acknowledgements

इस अध्ययन के स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडा के संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया था (CIHR) आपरेटिंग अनुदान-१२३४१९, प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान कनाडा डिस्कवरी अनुदान ४१८१९४ परिषद, और एक ओंटारियो अनुसंधान और नवाचार के प्रारंभिक अनुसंधान के मंत्रालय बिहार को पुरस्कार । DGW प्रस्तुत छवियों के कुछ योगदान दिया, प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए और पांडुलिपि के लेखन के लिए; वह लिवरपूल विश्वविद्यालय से एक पंप भड़काना अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया । CY एक वाणी स्नातक छात्रवृत्ति और CIHR एमडी द्वारा वित्त पोषित है/ अनुदान एजेंसियों के अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Media Wisent 3500-000-EL
DMEM Media Wisent 319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-150
PBS Wisent 311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness Electron Microscopy Sciences 72290-08 Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine Cayman Chemical 81590 Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488 ThermoFisher R37174
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217 Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO Sigma-Aldrich D2650
CellTrace FarRed ThermoFisher C34572
CellTrace Orange ThermoFisher C34851
Hoescht 33342 ThermoFisher 62249
FITC-Streptavadin ThermoFisher SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium Cedarlane Labs CL5071
Recombinant Human M-CSF Peprotech 200-04
Recombinant Human IL-4 Peprotech 300-25
J774.2 Macrophage Cell Line Sigma-Aldrich 85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line ATCC TIB-202
Jurkat T Cell Line ATCC TIB-152

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