Количественная оценка Efferocytosis по микроскопии флуоресцирования одноклеточного

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Efferocytosis, фагоцитарной удаление apoptotic клеток, необходимых для поддержания гомеостаза и облегчается рецепторов и сигнальных путей, которые позволяют для распознавания, поглощения и интернализация apoptotic клеток. Здесь мы представляем протокол микроскопии флуоресцирования для количественной оценки efferocytosis и активность efferocytic сигнальные пути.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G., Heit, B. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58149, doi:10.3791/58149 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Изучение правил efferocytosis требует методы, которые способны точно подсчитать поглощение apoptotic клеток и датчик сигнализации и клеточных процессов, которые управляют efferocytosis. Эта количественная оценка может быть трудным для выполнения как apoptotic клетки часто efferocytosed по частям, таким образом создавая необходимость методы, которые можно точно описать между efferocytosed часть целевого объекта apoptotic против остаточного unengulfed сотовых фрагменты. Подход, изложенный в настоящем документе использует двойной маркировки подходы к точно количественно оценить динамику развития потенциала efferocytosis и efferocytic efferocytes, такие как макрофаги. Помечены цитозоль клетки apoptotic клетки отслеживания краситель, чтобы включить мониторинг всех apoptotic клеток, полученных материалов, в то время как поверхности biotinylation apoptotic клетки позволяет для дифференциации между внутренним и не учитываются apoptotic клеток дробей. Объем efferocytic efferocytes определяется принимая флуоресцентного изображения клеток живых или фиксированной и количественной количество связанного против внутренней цели, как дифференцированные по окрашиванию стрептавидина. Этот подход обеспечивает несколько преимуществ над методы, такие как проточной цитометрии, а именно точное разграничение не efferocytosed против efferocytosed apoptotic клеток фракций, возможность измерения динамики efferocytic, микроскопия живой клетки и способность выполнять исследования клеточной сигнализации в клетках, выражая дневно меченых трансгенов. Комбинированные, методы, изложенные в настоящем Протоколе служат основой для гибкого экспериментальный подход, который может использоваться для точного количественного определения efferocytic активности и допросить сотовой сигнальных путей, активные во время efferocytosis.

Introduction

Apoptosis или запрограммированная смерть клетки, является высоко регулируется физиологический процесс, который происходит в большинстве многоклеточных организмов и имеет решающее значение для их развития и гомеостаза1. Помимо участия в нормальной клетки оборота и эмбрионального развития, апоптоз позволяет ликвидации зараженных или поврежденных клеток тканей и может срабатывать в ответ на инфекции, воспаления, рак, а также медицинских вмешательств Например, лучевой терапии или стероидов1. Apoptotic клетки разоблачить «едят-me» сигналы на их поверхности клетки, которые признаны рецепторов на широкий спектр профессиональных и непрофессиональных фагоцитов, именуемые далее «efferocytes». Участие этих рецепторов вызывает поглощения и деградации apoptotic клетки, efferocyte через процесс, известный как efferocytosis2,3. Фосфатидилсерин лучше всего характеризуется едят-мне сигнал вождения efferocytosis. Обычно ограничивается внутренним листовка плазматической мембраны, с apoptosis, активация скрамблаза липидов, которая нарушает этой асимметрии мембраны, тем самым подвергая Фосфатидилсерин на поверхности клеток4. Фосфатидилсерин находится на поверхности внеклеточного-apoptotic клеток, таких как зрелые макрофаги и активации тромбоцитов. Однако эти клетки являются не efferocytosed из-за присутствия «не ешь меня» сигналов, таких как CD47, на их клеток поверхности5,6,7. Подвергаются Фосфатидилсерин признается массив efferocytic рецепторов, выраженную efferocytes. Связывание этих рецепторов к Фосфатидилсерин, либо непосредственно, либо через помощи опсонины, активирует сигнальных путей, способствующих сплошным apoptotic клеток в вакуоль мембраны прыгните называют efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. efferosome предохранители последовательно с endosomes и лизосомы, которые доставляют молекулярный механизм, необходимый для подкислять efferosome и ухудшить apoptotic клетки грузов13,14. После того, как деградация, apoptotic клеток производные материалы продаются в утилизации endosome — процесс, который ограничивает иммунных реакций к apoptotic клеток антигены, и которая может позволить для восстановления питательных веществ из клетки apoptotic13, 15. Неудача в efferocytosis результаты в нарушение Распродажа apoptotic клеток; в конечном итоге эти необезвреженные клетки претерпевают вторичные некрозы. Отмершие клетки релиз про воспалительных цитозольной содержимое, патогенов и autoantigens в внеклеточной окружение, таким образом, движущей широкий спектр инфекционный, воспалительных и аутоиммунных заболеваний16,17. Вместе, апоптоз и efferocytosis облегчить удаление мертвых и умирающих клеток и для поддержания гомеостаза ткани.

Изучение молекулярных механизмов лежащих в основе efferocytosis требует методы, которые обеспечивают четкую количественную оценку apoptotic клеток поглощения. Эта количественная оценка осложняется тем, что в отличие от других поглощения таких механизмов, как эндоцитоза и фагоцитоз18,19, efferocytosis не может привести к сплошным нетронутыми целевой ячейки, в результате частичного поглощения apoptotic клетки efferocyte20. Протокол, описываемые описывает в пробирке efferocytosis assay который обеспечивает точное разграничение интернализированных против-внутреннюю часть индивидуальных apoptotic клеток и могут быть объединены с целым рядом-клеток и микроскопия живой клетки подходы. Традиционные фагоцитоза анализов добавить антитела специфические фагоцитарной цели в конце эксперимента для того, чтобы называть не учитываются цели, где наш метод отличается маркировки apoptotic цель с ковалентно связан биотина21 , 22. в то время как apoptotic клеток специфические антитела могут использоваться в этом assay, biotinylation подход позволяет для любого целевого белка подшипник быть помечены и избегает потенциальных проблем с перекрестной реактивности вторичные антитела, если выполняется иммуноокрашивания . В частности мы наметим подготовки apoptotic клеток Jurkat, которые были двойной окрашенных клеток отслеживания красителя и биотин. Ячейка, отслеживания краситель позволяет для apoptotic клеток, полученных материалов быть считано во время efferocytosis, тогда как поверхности biotinylation позволяет для дискриминации внутреннюю от-внутреннюю часть efferocytosed apoptotic клеток. Мы также описывают культуру и подготовка J774.2 и THP-1 клеточных линий для использования в качестве мышиных и человеческого efferocytes, моноцитарных м2 макрофагов в качестве примера главной ячейки efferocytosis, и Jurkat клетки для использования как efferocytic целей. Эти методы легко может применяться для других клеточных линий или первичной клетки, клетки-мишени любой форме клеточной смерти (например апоптоза, некроз и necroptosis) и имитирует микронного размера, имитирующие apoptotic клетки через липидного покрытия или покрытие с лигандами, специфичные для efferocytic рецептор интерес.

Метод, изложенные в настоящем Протоколе имеет ряд преимуществ над методами цитометрии на основе потока, широко используется в области23,24. Непосредственно визуализации фагоцитарной apoptotic клеток взаимодействия, в сочетании с четкой маркировки как общая и не учитываются apoptotic клеток материала, можно сделать количественные показатели efferocytosis. Кроме того использование рН нечувствительным флуорофоров ограничивает отягощающих факторов, таких, как подавление FITC и GFP флуоресценции в лизосомальных рН, который смешивает некоторые альтернативные методы25. И наконец, хотя не подробно, эти методы могут быть использованы с помощью efferocytes, выражая дневно меченых трансгенов, или с иммуноокрашивания после фиксации, для количественной оценки сигнальные молекулы деятельность и мониторинг клеточные процессы во время efferocytosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Сбор крови от здоровых добровольцев был одобрен Советом здравоохранения этики научных исследований науки в университете Западного Онтарио. Венепункции была выполнена в соответствии с руководящими принципами изложения политики Tri-Совет по исследований человеческого.

1. Культура и подготовка клеточной линии Моноцит THP-1

  1. Моноциты THP-1 в культуре как подвеска культуры в колбах T25 при 37 ° C + 5% CO2. Клетки должны быть выращены в 5 мл Розуэлл парк Мемориальный институт 1640 (RPMI 1640) + 10% плода Bovine сыворотки (ФБС).
  2. Затем каждый день приостановить ячейки равномерно на протяжении роста СМИ, осторожно встряхивая колбу, немедленно подсчитать ячейки с Горяева. Клетки должны быть пассированной плотность клеток при достижении 1 х 106 клеток/мл:
    1. Предварительно теплой RPMI 1640 + 10% FBS в ванну воды 37 ° C.
    2. Передача 2 x 105 клетки в пробки microcentrifuge 1,5 мл или 15 мл Конические трубки и Пелле клетки центрифугированием на 500 x g при комнатной температуре в течение 5 мин.
    3. Удалить супернатант не нарушая Пелле клеток и Ресуспензируйте Пелле в 1 мл (1,5 мл пробки microcentrifuge) или 5 мл (15 мл Конические трубки) фосфат амортизированное saline (PBS).
    4. Центрифуга трубки на 500 x g при комнатной температуре на 5 мин удалить PBS не нарушая Пелле ячейки.
    5. Ресуспензируйте Пелле в 1 мл свежего RPMI 1640 + 10% FBS.
    6. В новое место колбу T25 4 мл утепленные средств массовой информации и к этому добавьте ресуспензированы клетки от 1.2.5. Культура в 37 ° C + 5% CO2 инкубатора до тех пор, пока клетки требуют пассированый (обычно 3 дня), или до тех пор, пока клетки необходимы для эксперимента.
  3. Для эксперимента с THP-1-производные макрофагов удалите необходимое количество клеток из фляги и пластины до пассированый:
    1. Поместите необходимое количество 18 мм круглые стекло coverslips (#1.5 толщина) в лунки 12-ну плиты — обычно 1 coverslip за состояние и/или timepoint. В каждом хорошо аликвота моноциты4 THP-1 5 x 10. Количество клеток добавил к каждой скважины могут быть изменены, если требуется.
    2. Воспитывать общий объем каждой ячейки содержащих хорошо для 1 мл с помощью RPMI + 10% FBS прогреты до 37 ° C.
    3. Добавьте 100 Нм phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) для каждой скважины и культуры для 3 дней, чтобы побудить дифференцировки моноцитов THP-1 в Макрофаг подобных клеток.

2. Культура и подготовка линии клетки макрофагального J774.2

  1. Культура J774.2 клеток в колбах T25 при 37 ° C + 5% CO2. Клетки должны быть выращены в 5 мл Дульбекко изменение средних орла (DMEM) + 10% FBS и пассированной после того, как культура достигает 80-90% confluency. Для прохода клетки:
    1. Удалите все средства массовой информации из фляги и подъем раз с 5 мл PBS.
    2. Вынуть колбу PBS и заменить с 5 мл свежего DMEM + 10% FBS.
    3. С помощью скребка ячейки, выскабливаю дно колбы приостановить клетки в средствах массовой информации. Энергично Пипетка клетки несколько раз разрушить любой ячейки агрегатов.
    4. Разбавьте клетки 1:5, удалив 4 мл суспензии клеток из колбы и заменив его с 4 мл свежего средств массовой информации. Оставшиеся суспензию клеток можно отказаться, используется для запуска новой культуры клеток в свежий настой T25 или для эксперимента.
  2. Чтобы настроить для assay efferocytosis с использованием J774.2 клеток:
    1. Один день до начала эксперимента, приостановите J774.2 клетки в 5 мл свежего средств массовой информации, в соответствии с 2.1.1–2.1.3 шаги. Подсчитать ячейки с помощью Горяева и подготовить необходимый объем клеток в концентрации 5 х 104 клеток/мл.
    2. Поместите необходимое количество 18 мм круглые стекло coverslips (#1.5 толщина) в лунки 12-ну плиты. В каждом хорошо аликвота 1 мл суспензии клеток клеток/мл4 5 x 10.
    3. Культура в одночасье разрешить клетки присоединиться к coverslip и оправиться от пассированый.

3. Культура макрофагов первичного человека м2

  1. Собирайте 10 мл крови гепаринизированным человека за каждый 12-ну пластины макрофаги м2 требуется.
  2. В 15 мл пластиковых пробирок слой 5 мл крови человека на вершине 5 мл подогретым Lympholyte поли клетки разделения среды. Подготовить несколько трубок, если обработка > 5 мл крови вместо использования большего объема трубы.
  3. Центрифуга на 300 g x 35 мин, с использованием средних ускорение и без перерыва.
  4. Осторожно удалите Верхняя полоса богатые мононуклеарных клеток с использованием пластиковых дозаторов и передачи 50 мл пластиковых пробирок. Если в шаге 3.2 были подготовлены несколько трубок, полосы можно объединить в единый 50 мл трубки. Довести объем трубки до 50 мл с PBS.
  5. Центрифуга на 300 x g 8 мин и удалить супернатант. Во время этого шага место газобетона 18 мм диаметр круговой coverslips (толщина #1.5) в каждую лунку 12-ну плиты.
  6. Ресуспензируйте Пелле клеток в 300 мкл сыворотки бесплатно RPMI 1640 за желаемое количество скважин; например, если 10 мл крови было обработано подготовить полный 12 хорошо пластины, приостановить Пелле клеток в 3,6 мл средства массовой информации.
  7. Добавьте 300 мкл суспензии клеток coverslip содержащих хорошо в пластине 12-хорошо. Инкубируйте в течение 1 ч при 37 ° C + 5% CO2.
  8. Осторожно промыть coverslip 3 x с 1 мл раствора утепленные PBS для удаления любой non сторонник клеток.
  9. Добавьте 1 mL RPMI 1640 + 10% FBS + 10 нг/мл рекомбинантного человеческого M-CSF + клетки культуры антибиотик/противогрибковое. Инкубируйте на 37 ° C + 5% CO2 на 5 дней.
  10. Заменить СМИ RPMI 1640 + 10% FBS + 10 нг/мл рекомбинантного человеческого M-CSF + 10 нг/мл человеческого рекомбинантного ИЛ-4 + клетки культуры антибиотик/противогрибковое. Инкубируйте на 37 ° C + 5% CO2 на 2 дня для завершения м2 поляризации.
  11. Поляризованные макрофаги следует использовать в течение 3 дней.

4. Подготовка Apoptotic Jurkat клеток

  1. Культура клетки Jurkat в 5 мл RPMI 1640 + 10% FBS при 37 ° C + 5% CO2. Jurkats подвеска клеток линии и может поддерживаться пассированый 1:5 в свежие, подогретым СМИ каждые 3 – 5 дней.
  2. Чтобы подготовить apoptotic клетки, позволяют Jurkat культуры вырастет до высокой плотности (4 – 5 дней после пассированый). Аликвота 1,5 мл в 1,5 мл microcentrifuge трубки и Пелле клетки центрифугированием на 500 x g за 5 мин.
  3. Отменить супернатант и вновь приостановить Пелле клеток в 1 мл сыворотки бесплатно RPMI 1640 носитель, содержащий 1 мкм staurosporine.
  4. Инкубируйте 16 ч при 37 ° C + 5% CO2 для отображения apoptotic клетки.
  5. При необходимости подтвердите индукции апоптоза, окрашивание с Annexin V:
    1. Аликвота 100 мкл staurosporine лечение Jurkat клеточной культуры в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Пелле клетки центрифугированием на 500 x g 5 минут, удалить супернатант и вновь приостановить Пелле клеток в 100 мкл сыворотки свободной среды RPMI 1640.
    2. 1 мкл флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-конъюгированных Annexin V и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре в темноте.
    3. 900 мкл PBS и передача весь объем на один колодец 12-ну пластины, содержащие coverslip круглые стекло 18 мм (толщина #1.5). Спин вниз в центрифуге оснащены пластины адаптера на 200 x g за 1 мин заставить клетки присоединиться к coverslip. Кроме того клетки могут быть помещены в камерных слайд для воображения.
    4. Изображение с помощью микроскопа флуоресценции.

5. Количественная оценка Efferocytic поглощения и динамика, с помощью Efferocytosis Assay фиксированные клетки и пятнать наизнанку

  1. Подготовьте THP-1, J774.2 или м2 человека макрофагов, как описано в разделах 1-3, соответственно.
  2. Вечером перед началом эксперимента Подготовьте apoptotic клетки Jurkat, как описано в разделе 4.
  3. Непосредственно перед экспериментом граф apoptotic клеток с помощью Горяева. Перевести достаточное количество apoptotic клеток в пробки microcentrifuge 1,5 мл-мы обычно добавить 5 x 105 клеток/Ну, обеспечивая цель: efferocyte соотношении 10:1.
  4. Пелле Jurkat клетки центрифугированием на 500 g x 5 мин и Ресуспензируйте в 500 мкл PBS.
  5. Во время центрифугирования, кратные 10 мкл ДМСО в новые пробки microcentrifuge 1,5 мл. Растворяются в ДМСО минимальное количество N-hydroxysuccinimidobiotin (ГСЗ-биотин). достаточно 5-10 кристаллов (~0.005 мг).
  6. Передать 500 мкл apoptotic клеток/PBS подвеска ДМСО/ГСЗ биотин содержащие трубки. Затем разбавьте отслеживания краситель для производителя рекомендуемая концентрация в суспензию клеток apoptotic клетки. Убедитесь в том выбрать ячейку, отслеживание краска, которая не перекрываются спектрально с FITC-стрептавидина (например красный или far-red ячейки отслеживания краситель).
  7. Инкубируйте подвеска для 20 мин при комнатной температуре в темноте. Добавить равное количество RPMI 1640 + 10% FBS и проинкубируйте 5 мин при комнатной температуре в темноте, чтобы утолить любой непрореагировавшего красителя.
  8. Пелле клетки центрифугированием на 500 x g 5 минут, удалить супернатант и вновь приостановить окрашенных apoptotic клетки в 100 мкл RPMI 1640 + 10% FBS за хорошо макрофагов.
  9. Добавьте 100 мкл суспензии клеток окрашенных apoptotic каплям в каждой скважине макрофагов. Центрифуга 200 x г за 1 мин в центрифуге оснащены пластины адаптера может заставить контакта между макрофагами и apoptotic клетки.
  10. Инкубируйте плита за желаемый период времени при 37 ° C + 5% CO2 в инкубатор культуры ткани. Макрофаги, efferocytosed материал является обычно первым обнаружить после 20-30 мин и завершена после 120-180 мин.
  11. В нужный момент точек удалить ячейки из инкубатора. Вымойте клетки дважды с 1 мл раствора комнатной температуре PBS остановить efferocytosis и удалить не efferocytosed apoptotic клетки.
  12. В 1:1,000 разрежения в каждую лунку добавить FITC-конъюгированных стрептавидина и проинкубируйте втечение 20 мин в темноте. Это будет ярлык подвергаются биотина на любой материал клетки apoptotic non-efferocytosed.
    Примечание: При желании, клеточных ядер могут быть окрашены во время этого шага путем добавления топографической разрежения Hoechst 33342 или 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, дигидрохлорид (DAPI).
  13. Вымойте клетки 3 раза с 1 мл PBS, аккуратно покачивая или качалка образцы для 5 мин на полоскание. Исправить клетки с параформальдегида 4% (PFA) в PBS для 20 мин при комнатной температуре. Промойте клетки один раз с PBS для удаления избыточных PFA.
  14. Гора coverslips на слайде для изображений и передачи флуоресцентным микроскопом. Захват z стеки достаточное количество клеток для точной количественной оценки — обычно 10 – 30 ячеек на условие. Non внутреннюю apoptotic клеток материал будет очевидным в результирующий образ как ячейки отслеживания краситель, помечены материал, окруженная FITC-стрептавидина окрашивания, в то время как efferocytosed материал образует дискретные ячейки отслеживания краситель puncta свободной от любой стрептавидина пятнать.
  15. Количественно efferocytosis в результате изображения через целый ряд мер:
    1. Рассчитайте индекс efferocytic, определяя среднее количество дискретных efferosomes (ячейка отслеживания puncta краситель+/streptavidin ) за макрофагов. Количественно только макрофаги привязан к apoptotic клеток или содержащие ≥1 видимой efferosomes. Запись макрофаги привязан к apoptotic клеток, но не хватает дискретных efferosomes, как efferocytic индекс 0.
    2. Рассчитайте efferocytic эффективность путем измерения доли макрофагов, содержащих ≥1 efferosome.
    3. Вычислить скорость efferocytosis клетками изображения фиксированной и витражи на несколько моментов времени. Только изображение макрофаги привязаны к apoptotic клетки, или содержащие видимых efferosomes, с z стеки захватили каждой ячейки. После записи образа, определите скорость efferocytosis:
      1. С помощью окрашивания стрептавидина как руководство и средство выбора произвольной или многоугольника в Фиджи/ImageJ26 (или другой пакет программного обеспечения анализа изображений), круг все ячейки отслеживания краситель+/streptavidin (например внутреннюю) материал в одной плоскости z-стека. Измерьте интенсивность комплексной ячейки отслеживания краска этот регион. Отдельные меры для каждого efferosome (например , диаметр, позиционирования относительно границы ячейки или ядра и т.п.)15,27 может легко быть приобретены одновременно с этими измерениями, значительно увеличение данных собранных в ходе анализа.
      2. На том же z секции, используя стрептавидина, окрашивание и средство выбора произвольной или многоугольник, круг все ячейки отслеживания /streptavidin краска++ (например не учитываются) материала в одной плоскости z-стека . Включайте только окрашивания apoptotic клеток при контакте с фагоцитов. Измерьте интенсивность комплексной этого региона.
      3. Повторите шаги 4.2.3.1 для 4.2.3.2 для оставшихся z участков изображения. Сумма интенсивность комплексной efferocytosed (ΣРЭ) и не efferocytosed (Σne) материалов. Фракция apoptotic клеток, который был efferocytosed может быть вычислено для ячейки как:
        Equation
      4. Количественно фракция efferocytosed для всех ячеек во всех точках времени. Обратите внимание, что интенсивности флуоресценции apoptotic клеток/efferosomes может варьироваться между изображениями, вследствие изменений в поглощение ячейки отслеживания красителями отдельных apoptotic клеток и из-за изменения параметров получения изображений, таких как время экспозиции. Таким образом только сравнить нормализованные значения как часть Efferocytosed, или интенсивности независимые значения, такие как индекс efferocytic и efferocytic эффективности, между изображениями, между экспериментальных условиях, а также между повторить эксперименты.
    4. Чтобы убедиться, что результирующий набор данных точно отражает различия в efferocytosis между ячейками, проводят эти анализы на максимальное количество ячеек можно в каждом эксперименте.
      Примечание: Индекс эффективности и efferocytic Efferocytic может быть рассчитана быстро (через несколько секунд/клетка), и мы обычно стремятся проанализировать по меньшей мере 100 ячеек на эксперимент, повторяя каждый эксперимент по крайней мере 3 раза. Расчёт брались efferocytosed материал и efferosome конкретные меры более трудоемкий, обычно с 2 – 3 мин/cell для опытный аналитик. Для этих расчетов мы количественно минимум 15 ячеек на условие, на эксперимент.
    5. Индекс записи efferocytic, efferocytosed фракция и отдельных efferosome данных на основе в клеток.
      Примечание: Это позволяет для анализа данных с использованием одной ячейки подходов, таким образом позволяя вариации между клеток быть количественно. Анализ уровня населения по-прежнему может проводиться на эти наборы данных путем усреднения одной ячейки данных, полученных в отдельных экспериментов. Efferosome конкретных измерений могут быть проанализированы на уровне населения, одной ячейки и как ансамбли (например как населения независимо от клетки, содержащие их efferosomes)15.

6. живут Efferocytosis Assay клетки Apoptotic клетки

  1. Подготовьте THP-1, J774.2 или м2 макрофагов, как описано в шагах 1-3, соответственно. При необходимости следует transfected клеток с трансгенов или другие генетические конструкции по крайней мере в 18 h до выполнения каких-либо экспериментов.
  2. Вечером перед началом эксперимента, подготовьте apoptotic клетки Jurkat, как описано в разделах 4 и 5, со следующими изменениями:
    1. Разбавить клетки и индуцировать апоптоз согласно 4.1 – 4.3 и собрать необходимое количество apoptotic клеток согласно 5.3-5.4.
    2. Добавление ячейки отслеживания красителя на производителя рекомендуемая концентрация суспензию apoptotic клеток. Инкубируйте подвеска для 20 мин при комнатной температуре в темноте. Добавить равное количество RPMI 1640 + 10% FBS и проинкубируйте 5 мин при комнатной температуре в темноте, чтобы утолить любой непрореагировавшего красителя. Не добавляйте ГСЗ биотина для этих экспериментов.
    3. Пелле клетки центрифугированием на 500 x g 5 минут, удалить супернатант и вновь приостановить окрашенных apoptotic клетки в 100 мкл RPMI 1640 + 10% FBS за хорошо макрофагов.
  3. При необходимости, лейбл порекомендованное макрофаги, удалив культуры средств массовой информации из каждой скважины и добавив 500 мкл PBS, содержащих производители разрежения ячейки отслеживания красителя, не перекрываются спектрально с ячейкой, отслеживание краситель добавляется apoptotic клетки или любой Флуоресцентный трансгенов выраженные макрофаги. Проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре в темноте, а затем добавить равное количество DMEM + 10% FBS и проинкубируйте 5 мин при комнатной температуре в темноте, чтобы утолить любой непрореагировавшего красителя.
  4. Передача Макрофаг содержащих coverslip в Лейден камеру. Добавить 400 мкл DMEM + 10% FBS, следуют 100 мкл суспензии помечены apoptotic клеток. Смешайте нежно закупорить СМИ 2 – 3 раза.
  5. Передать Лейден камере нагревается и CO2-перфузии палаты флуоресцентный Микроскоп живой клетки.
    Примечание: Для Микроскоп установок, которые не имеют возможности перфузии CO2 , использовать ткани культуры среднего буферизацией с 1 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES) вместо бикарбоната натрия для поддержания физиологических pH во время Культура, подвергается воздействию воздуха.
  6. Захват покадровой серии, содержащий белый свет (Фазовый контраст или ДВС) изображения и изображения всех флуоресцентные метки:
    1. Используйте 100 X объектив для экспериментов при урегулировании мелких деталей (например мембраны динамика фагоцитарной apoptotic клеток взаимодействий). Между тем, более общих мер (ставка apoptotic клеток поглощения, время взаимодействия между макрофагами и apoptotic клетки, и т.д.) лучше всего отражаются с помощью 60 X или 63 X цели.
    2. Если доступна, используйте точки посещение для нескольких полей Просмотр изображений во время одного приобретения, тем самым увеличивая количество событий efferocytic, захваченные в одном эксперименте
    3. Потому что efferocytes часто поглотит небольшие фрагменты apoptotic клетки, а не нетронутыми клетки, то лучше захватить z стеки. Чтобы свести к минимуму Фототоксичность, захватить z разделов, разделенных глубины очага вашей цели микроскопы (обычно 0.5-1.0 мкм), через толщину клетки (обычно 8-10 мкм для макрофагов, например 8 – 20 ломтиков/клеток). Это гарантирует, что все сплошным и людьми события будут видны в по крайней мере одной плоскости z. Можно также использовать крупные (диаметром 1-5 мкм) apoptotic клеток имитирует или apoptotic клетки, которые подвергаются минимальной фрагментации во время efferocytosis (например тепла потрясен нейтрофилов) вместо без укладки z-. Мы описали подготовки мимики и apoptotic нейтрофилов ранее28.
    4. Чтобы свести к минимуму Фотообесцвечивание, использовать яркие флуорофоров и захват фото с помощью приобретения параметры, которые сводят к минимуму Фотообесцвечивание — например низк интенсивности возбуждения, в сочетании с Камера высокой прибыли и экспозиции раз29. Мы настоятельно рекомендуем использовать микроскоп с высок чувствительности электромагнитного зарядовой (ЭМ-CCD) камеры или спиннинг диск конфокальный и высокоскоростной пьезоэлектрический механические стадии, для этой формы визуализации.
  7. Количество возможных анализа методов, которые могут быть применены к эти покадровой видео является обширной и вне нашей способности для обзора здесь. В качестве некоторых примеров использование ручного или автоматического отслеживания программного обеспечения для отслеживания fusion, деления и движение efferosomes внутри клетки15, количественную оценку динамики фьюжн efferosome с endolysosomes colocalization анализа в макрофагах выражая Флуоресцентный трансгенов отсек конкретных13, процессы поглощения монитора например зондирующего и Кубок формирования30, определить динамику набора сигнализации и оборотом белки efferosome13, и/или количественно деструктивные действия efferosomes с помощью apoptotic клетки с pH фактора, окислитель чувствительных или протеаз активированный флуорофоров31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Культура клеток Jurkat с 1 мкм staurosporine результаты в апоптоз в одночасье > 95% клеток, которые могут быть подтверждены с Annexin V окрашивание (рис. 1). Другие типы клеток может использоваться для этих экспериментов, хотя концентрация staurosporine и продолжительность лечения staurosporine должны быть оптимизированы для каждой ячейки строки. Для надежного обнаружения и количественного определения efferocytosis > 80% клеток должно быть apoptotic до добавления их к efferocytes. Могут также использоваться другие индукторов апоптоза (например теплового шока, этопозида и УФ света), но по нашему опыту, эти производят более разнородной индукции апоптоза и результат в смешанных клеточных популяций, содержащие apoptotic, средней некротические и -apoptotic клетки-мишени.

Для изображений в-клеток с наизнанку окрашивание, тесно соединенный efferocyte-apoptotic клеток взаимодействия должен соблюдаться во всех точках времени, с четко определенной non-efferocytosed (стрептавидина+/cell отслеживания краситель+) и efferocytosed (стрептавидина/cell отслеживания+) материалы видно (рис. 2). Важно отметить, что синапса, который формирует между efferocyte и apoptotic клетки часто достаточно жесткой, чтобы исключить стрептавидина, и таким образом следует рассматривать любую ячейку, отслеживание краситель, окрашенных объектов, принимая стрептавидина в любой точке на его окружности связанные ячейки и не efferosome. В большинстве экспериментов фракция apoptotic клеток, которые efferocytosed будет увеличиваться в зависимости от времени моды, пока никаких материалов не учитываются apoptotic клеток остаются, либо до тех пор, пока фагоцитов достигает своей максимальной efferocytic емкости (Рисунок 3). анализ обычно исполненные и записанные для отдельных ячеек (Рисунок 3А), однако, данные можно среднем ячейках внутри отдельных экспериментов и средние значения из нескольких экспериментальных повторяется, проанализированы с обычными статистическими подходами (рис. 3B). Можно внести изменения этого стандартного протокола для использования типов клеток первичного, альтернативные efferocytic цели, и дополнительные окрашивания необходимо включить. Например на рисунке 4 показано первичных M2-поляризованных человека макрофагов, имеющий efferocytosed apoptotic клеток имитирует входят 3 мкм диаметром кремнезема бусины с покрытием в смеси Фосфатидилсерин и фосфатидилхолина28, следуют последующие фиксации, permeabilization и иммуноокрашивания для переработки endosome маркера Rab17.

Во время живых клеток изображений efferocytic профессиональных фагоцитов будет соблюдаться для расширения и отозвать малых процессов в процесс называется «прощупывания»30 (Рисунок 5, t = 0); когда эти процессы сталкиваются цели они твердо придерживаться целевого и привлечь его к фагоцитов. Этот проницательный активность не может наблюдаться с непрофессиональными фагоцитами например эпителиальные клетки. Efferocyte, затем, образуют плотную32 «efferocytic СИНАПС» между собой и apoptotic клетки, с этой синапса, часто обертывающей большую часть apoptotic клеток (Рисунок 5, t = 10). Efferocyte, затем, нарисуйте куски apoptotic клетки от этого синапса в цитозоле (рис. 5, 10-30 мин). Вскоре после их формирования эти нарождающиеся efferosomes продают от синапсе и к Пери ядерной области, в результате Rab7/RILP/dynein-dynactin при посредничестве транспорта33. Со временем сократится efferosomes и результате деградированных материалы, переделена всей ячейки, где они, вероятно, всасывается или рециркулированных13,15. Способность обнаруживать эти процессы зависят от приобретения частоту и продолжительность эксперимента. Быстрое процессы, такие как проверка не может наблюдаться на нижней-кадров, в то время как медленно события (efferosome людьми и поглощение) требуют длительного изображений — в обоих случаях эти приобретения большого изображения часто требуют захвата изображения нижней интенсивности чтобы ограничить Фотообесцвечивание и Фототоксичность (рис. 5). Как с-cell assay, жить клеток версию этот assay могут быть изменены в соответствии с потребностями следователя. На рисунке 6 показан один кадр живой клетки приобретения J774.2 макрофагов, выражая трансгенов который дневно Демарк плазматической мембраны (PM-GFP) и который селективно связывает сигнализации липидов PI (3) P (FYVE-RFP). Поколение Пи (3) P на мембране efferosome могут быть обнаружены как сопредседатель локализация FYVE-ЗП с вечера-GFP+ efferosome мембраны. Путем определения количественных показателей интенсивность FYVE-ЗП на efferosome, может быть определена количественно динамика PI (3) P сигналов на efferosome (рис. 6).

Figure 1
Рисунок 1: Annexin V пятнать Apoptotic Jurkat клеток и Apoptotic. Annexin V этикетки Фосфатидилсерин «едят-me» сигнал, предоставляемые apoptotic клеток. (Вверху) Неочищенные (UT) Jurkat клетки отображения здоровым (гладкие и округлые) морфологии (DIC) и не оставляет пятен с Annexin V. (внизу) Jurkat клетки культивировали в ночь с 1 мкм staurosporine (STS) взять на себя apoptotic морфологии (нерегулярные и blebbed) и пятна с Annexin V. Шкала бар = 10 мкм, интенсивность изображение отображается в виде цветовой карте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: ранней и поздней поглощения Apoptotic Jurkat клеток макрофагами J774.2. Изображения являются макрофагов в начале (60 мин) и поздней стадии (120 мин) efferocytosis. Белый свет (DIC) изображение иллюстрирует жесткой взаимосвязи между макрофагов (mφ) и apoptotic клеток (AC). Ячейки, отслеживание краситель (КТР, красный) показывает расположение всех apoptotic клеток, полученных материалов. FITC-стрептавидина окрашивание (Str, зеленый) идентифицирует часть apoptotic клеток, которая еще не была охвачена макрофагов. Макрофагов ядра были предварительно окрашенные с DAPI (синий). Efferosomes (красный) по сравнению с не внутреннюю часть apoptotic клеток (зеленый/желтый) легко идентифицируются в оверлей стрептавидина и ячейки отслеживания красителя изображений. Обратите внимание на отсутствие стрептавидина пятнать в интерфейсе Макрофаг apoptotic клеток в начале timepoint, созданные исключения стрептавидина из синапса плотно сформированных efferocytic (*). Ядром макрофагов идентифицируется Hoechst, окрашивание (синий). Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: время курс фракции Efferocytosed Apoptotic клеток макрофагами J774.2. Efferocytosis анализы были проведены для указанного раза, а доля охватившего apoptotic клеток материала определяется в каждый момент времени с помощью отслеживания краска/Streptavadin окрашивания клеток. (A) доля efferocytosed материалов в рамках отдельных макрофагов, представлены данные из отдельных клеток, горизонтальная полоса показывает среднее. 12 – 17 ячеек на состояние, данные от 1 5 независимых экспериментов. (B) часть материалов efferocytosed, в среднем через 5 независимых экспериментов, по крайней мере 10 клеток/состояние/повтор. p < 0,05, по сравнению с 30 мин, Крускала-Уоллиса тест с коррекцией Данн. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: анализ набора Rab17 к Efferosomes в первичных человеческих макрофагов. М2 поляризованных макрофагов охватил apoptotic клеток имитирует (стрелки) и был immunostained для Rab17 (зеленый) 60 мин после поглощения. Шкалы бар = 5 мкм. клеточное ядро запачкается с Hoeschst, DIC изображение показывает морфологии клеток и используется для идентификации apoptotic клеток мимики. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: assay живой клетки efferocytosis. Клетки, отслеживание краситель labeledJ774.2 макрофагов (mφ, зеленый) был записан как он охватил apoptotic клеток Jurkat, помечены с другой цвет ячейки отслеживания краситель (AC, красный). Apoptotic клеток разбит на несколько фрагментов во время процесса интернализации, в результате частичного поглощения и формирование нескольких efferosomes (стрелки). Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: использование флуоресцентных трансгенов расследовать сигнализации Efferocytic. J774.2 макрофагов был transfected с маркером GFP-тегами плазматической мембраны (PM, зеленый) и FYVE-ЗП конструкцию, которая связывает сигнализации липидов PI (3) P (красный). Efferocytosis формирует зарождающейся плазматической мембраны производные efferosome, который содержит PI (3) P, как определяется набор FYVE-RFP (стрелка). Динамика PI (3) P сигнализации была количественно оценена как складывать интенсивности относительно настоящий момент закрытия efferosome сигнал FYVE-ЗП (t = 0, граф). Этот эксперимент используется apoptotic клеток подражая шарик (стрелка, DIC) вместо apoptotic клетки. Шкалы бар = 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы, изложенные в настоящем Протоколе позволяют изображений и количественной оценки процесса динамического efferocytic, используя подходы в-клеток и клеток. Эти подходы предлагают несколько преимуществ над обычно занятых потока методы на основе цитометрии23,24. Использование наизнанку окрашивание с фиксированной образцы обеспечивает более надежную и точную количественную оценку скорости и степени efferocytosis — действительно, многие методы, основанные на цитометрии потока просто ярлык apoptotic клеток и макрофагов с различными флуорофоров, и Оценка efferocytosis как часть макрофагов, совместно пятнать маркером apoptotic клеток, таким образом не хватает способности различать между связанными против интернализированных apoptotic клеток материал. Альтернативный поток цитометрии подходы включают в себя тех, кто с помощью pHrodo, помечены apoptotic клетки24. pHrodo является Флюорофор pH фактора, который увеличивает яркость на кислой рН. Хотя этот Флюорофор обеспечивают лучшее разрешение между не внутреннюю против интернализированных материалы, как рост флуоресценции, специально после интернализации apoptotic клеток и подкисление efferosome, результаты могут быть осложняется процессов болезни, которые ухудшают efferosome подкислением34,35, и этот метод будет не хватать efferosomes на ранних стадиях (предварительно подкисления), efferocytosis36, расположенных в регионах подкисления бедных клетки,27, или в ячейках, которые слабо подкисляет их лизосомы37. Второе преимущество метода, описанного в настоящем Протоколе является использование-клеток imaging для измерения динамики efferocytosis, как процессы, такие как зондирование, формирование efferocytic синапсе, и внутриклеточных торговлей efferosomes не может быть обнаружен с помощью подходов на основе цитометрии потока.

Хотя этот метод имеет много преимуществ, экспериментов требующих количественного определения многих сотен клеток — например эксперименты выявления редких событий, или количественной оценки высоко вариабельные процессов — может быть трудно, с анализом этих больших наборов данных принимая слишком много времени. Высок объём изображений подходы например визуализации потока цитометрии38 может позволить более высокую пропускную способность, чем обычные микроскопии, хотя в наш опыт текущего изображения автоматизированных программ анализа не всегда способны точно сегментации не внутреннюю против интернализированных материалы. Конкретно туго efferocytic синапсе, который формирует между apoptotic клеток и efferocyte можно исключить стрептавидина окрашивание, и таким образом связанный apoptotic клетки часто появляется как сплошной массы в ячейке, отслеживание краситель канал, который частично окутан стрептавидина окрашивание (рис. 2). Таким образом в то время как efferosomes легко определяются алгоритмически, связанный часть apoptotic клетки часто ошибочно как efferosome из-за сложности учета для частичного стрептавидина пятнать. Хотя нам еще предстоит найти программу, которая может точно определить и количественно поэтапное освоение apoptotic клеток без помощи человека, мы нашли что обучаемый полуавтоматических систем39 может значительно ускорить анализ, сокращение дроби efferocytosed измерения от 2-3 мин до < 60 s в клетку. Кроме того имитирует неперевариваемых apoptotic клеток или типы клеток, которые минимально фрагментации при апоптоза, может использоваться вместо. Это упрощает обнаружение для единого, более крупные структуры, которые могут быть более пригодным для автоматизированных подходов и может устранить необходимость для z укладки. Даже с этими достижениями сбора и анализа данных скорость этого метода остается ограничивающим, и как таковой проточной цитометрии остается наиболее жизнеспособным методом, когда анализ числа крупных клеток требуется23.

Хотя мы описали этот метод с помощью линии клетки и первичных макрофаги человека как efferocytes и apoptotic клетки Jurkat (линия Т-клеток) как цели, этот метод может применяться к любой efferocytic ячейки типа или apoptotic клетки цели. Действительно аналогичные подходы использовались для изучения efferocytosis гепатоцитов и эпителиальных клеток9,40,41и efferocytosis клинически значимых целей, таких как опухолевые клетки42. Это может быть необходимо изменить этот протокол при использовании неиммунизированных efferocytes, или когда моделирования конкретных efferocytic события. К примеру Jurkat клетки не сторонник и поэтому вряд ли полностью пилки механических сил и пространственные ограничения efferocytes сталкиваются при взаимодействии с приверженцами apoptotic клеток и apoptotic клетки в твердых тканях. Многие типы клеток будет поддерживать сцепления во время апоптоз и поэтому может использоваться как сторонником целей; например клетки HeLa можно воспроизвести пройти staurosporine индуцированного апоптоза, Фосфатидилсерин скремблирования и блеббинг в течение 4-6 ч, при сохранении сцепления в клетки тела43. Клетки, приостановлено в коллагеновой матрицы или стволовых клеток, полученных organoids44 могут быть потенциальные модели для изучения efferocytosis в твердых тканях, хотя мы не знаем о каких-либо исследований, которые использовали эти подходы. Для некоторых моделей иммунных клеток, таких как клетки Jurkat и нейтрофилов не должны использоваться как apoptotic целей, как эти клетки можно освободить на основе цитокина «найти-me» сигналов, таких как CX3CL1, который может быть смешанным фактором в моделях, где воспалительных или мигрирующих исследованы45являются процессы. Таким образом хотя универсальность этот assay позволяет для того чтобы использоваться для изучения efferocytosis различных типов клеток и модели систем, следует выбрать соответствующие efferocytes, клетки-мишени и культуры условий лучшей модели физиологических процесс проводится расследование.

Анализ методов, описанных в настоящем Протоколе предназначены только в качестве отправной точки, с характером этих экспериментов, позволяя широкий спектр анализов на основе изображений. Например, efferosome позиционирования и диаметр измерения может быть собраны при выполнении измерений efferocytosed доли или измеряется в живой клетке время курсы, для того чтобы исследовать процессы как внутриклеточных торговлей efferosomes и скорость apoptotic клетки деградации13,15. Иммуноокрашивания (рис. 4) может использоваться набор белков в efferosomes, в то время как изображений клеток в сочетании с морфологический анализ может использоваться для количественной оценки процессов такие привязки эффективность и расследовать темпы поглощения30 , 46. Мы часто выполняют эти анализы в макрофагах, выражая флуоресцентные трансгенов, что доклад, сигнальные молекулы активации или активности клеточных событий во время efferocytosis (рис. 6). Эти репортеры включить мониторинг сигнализации процессов во время efferocytosis; Например мы использовали Rab GTPases дневно тегами для изучения роли Rab5, Rab7 и Rab17 в посредничестве efferosome обработки и последующего торговлей apoptotic клеток антигены13,15. Аналогичным образом включение Репортеры смерти клетки, efferosome рН, реактивнооксигенных видов производства и других клеточных процессов в живой клетки эксперименты могут использоваться для исследовать процессы посредничества деградации efferosomes31 ,47. Общей проблемой в этих экспериментах выявление трансгенов или Репортеры с совместимыми флуорофоров; часто мы будет устранить ячейки отслеживания красители и/или стрептавидина Бесплатные каналы для визуализации других флуорофоров. Для некоторых экспериментов это выгодно заменить apoptotic клеток-фрагментации мнемосхемы. Это позволяет для количественного определения сигналов динамика и клеточных процессов без сложность отслеживания, несколько efferosomes, полученных от одного apoptotic клетки. Смотреть Evans et al. инструкции по подготовке apoptotic клеток имитирует28.

Наиболее распространенные трудности при разработке этих экспериментов является нахождение сочетание флуорофоров, которые позволяют для желаемого процессов для записи образа, при сведении к минимуму Фотообесцвечивание и Фототоксичность29. Флюорофор выбор во многом диктуется лазеры/возбуждения фильтры, дихроичными/кубики и выбросов фильтры микроскопа и поэтому выбор флуорофоров часто для отдельных микроскопы. Как правило больше длины волны флуорофоров (оранжевый far-red, например выбросов Максима > 580 Нм) являются менее склонны к Фотообесцвечивание и эти волны менее разрушительными для клеток. Зеленые флуорофоров (выбросов Максима ~ 525 Нм) могут быть использованы, но ухода необходимо ограничить фототоксичности на ячейки. Флуорофоров, которые возбуждают на длинах волн меньше, чем 480 Нм (фиолетовый и синий) следует избегать из-за их высокой Фототоксичность и склонность для этих волн возбуждения для отбеливания других флуорофоров29. Там, где это возможно, высокой яркости и стабильной флуорофоров должен быть выбран. Аналогично, параметров получения изображений следует скорректировать для сведения к минимуму Фотообесцвечивание и Фототоксичность — например больше воздействия на низкой возбуждения интенсивности предпочтительней более высокой интенсивности возбуждения48. Добавление антиоксидантов, таких как рутин и удаления некоторых СМИ компонентов можно улучшить как светостойкость и уменьшить Фототоксичность49. Даже с тщательного отбора изображений условий и флуорофоров необходимость ограничить Фотообесцвечивание часто требует захвата изображений с низким соотношением сигнал шум (см. рис. 5 приведен пример). Если количественной оценки интенсивности флуоресценции, большой осторожностью необходимо принять для ограничения обработки изображений предметов; в идеале должны быть проанализированы raw изображений без какой-либо обработки. Если deconvolving изображения до количественной оценки, деконволюции алгоритм, который сохраняет флуоресцентного света должны быть используется50,51.

Живой клетки, которую поглощения может быть особенно сложным, с успешных экспериментов, требующих тщательного баланса между интенсивности возбуждения, выдержка, частоту и продолжительность эксперимента. Возбуждения интенсивности и выдержка времени следует скорректировать для сведения к минимуму Фототоксичность, как описано выше, с той оговоркой, что больше времени экспозиции может привести в движение артефакты из-за движения клеток или ограничить частоту приобретения. Частота кадров может варьироваться в зависимости от экспериментальных требования. Нижняя рама цены (5 – 30 мин между кадрами) позволяют для обработки изображений в течение длительного времени (12 ч или больше), но обеспечивают минимальные данные о таких явлений, как мембраны динамика и пост efferocytosis торговля efferosomes. Высокая частота кадров (так быстро, как 1 кадр в секунду) обеспечивают отличную временное разрешение событий efferocytic и efferosome людьми — но даже с тщательный отбор флуорофоров, возбуждения интенсивности и длительности выдержки — Фотообесцвечивание или Фототоксичность будет обычно ограничивают эти эксперименты для менее чем за час в продолжительности. В нашем опыте, приобретения изображения каждые 1 – 2 мин, над экспериментальных периодов 2-6 ч, являются приемлемым компромиссом, который обеспечивает количественной изображения достаточное количество efferocytic событий, с разумной временное разрешение.

Изменены и не efferocytosis, как известно, быть вовлечены в патологии рака, атеросклероз и несколько аутоиммунных расстройств, с efferocytosis таргетинг терапии показаны большой клинический обещают7,52, 53,54,55. Дальнейшее развитие в этих областях потребует идентификации и характеризации клеточных процессов, рецепторы и сигнальных путей, которые регулируют efferocytosis. Представленные в настоящем Протоколе представляет собой мощный инструмент для этих исследований и могут быть изменены для количественного определения многих клеточных и сигнальных процессов, регулирующих efferocytosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Acknowledgements

Это исследование финансировалось Канадским институтов медицинских исследований (КНИИЗ) действующих грантов СС-123419, естественных наук и инженерных исследований Совет из Канады обнаружения Грант 418194 и Онтарио Министерство исследований и инноваций ранних исследований премии для BH. DGW способствовали некоторые из изображений, представленных, оптимизации протоколов и написания манускрипта; Он финансировался насоса грунтование грант от Ливерпульского университета. CY финансируется Ванье Магистратура стипендии и КНИИЗ MD/PhD студенчества. Финансирующие учреждения имели никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Media Wisent 3500-000-EL
DMEM Media Wisent 319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-150
PBS Wisent 311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness Electron Microscopy Sciences 72290-08 Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine Cayman Chemical 81590 Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488 ThermoFisher R37174
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217 Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO Sigma-Aldrich D2650
CellTrace FarRed ThermoFisher C34572
CellTrace Orange ThermoFisher C34851
Hoescht 33342 ThermoFisher 62249
FITC-Streptavadin ThermoFisher SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium Cedarlane Labs CL5071
Recombinant Human M-CSF Peprotech 200-04
Recombinant Human IL-4 Peprotech 300-25
J774.2 Macrophage Cell Line Sigma-Aldrich 85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line ATCC TIB-202
Jurkat T Cell Line ATCC TIB-152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35, (4), 495-516 (2007).
  2. Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32, (1), 118-125 (2012).
  3. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: Progress and conundrums. The Journal of Experimental Medicine. 207, (9), 1807-1817 (2010).
  4. Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., Henson, P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. Journal of Immunology. 148, (7), 2207-2216 (1992).
  5. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. European Journal of Biochemistry. 122, (2), 429-436 (1982).
  6. Callahan, M. K., Williamson, P., Schlegel, R. A. Surface expression of phosphatidylserine on macrophages is required for phagocytosis of apoptotic thymocytes. Cell Death and Differentiation. 7, (7), 645-653 (2000).
  7. Kojima, Y., et al. CD47-blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature. 536, 86-90 (2016).
  8. Seitz, H. M., Camenisch, T. D., Lemke, G., Earp, H. S., Matsushima, G. K. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells. Journal of Immunology. 178, 5635-5642 (2007).
  9. Ichimura, T., Asseldonk, E. J. P. V., Humphreys, B. D., Gunaratnam, L., Duffield, J. S., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 118, (5), 1657-1668 (2008).
  10. Flannagan, R. S., Canton, J., Furuya, W., Glogauer, M., Grinstein, S. The phosphatidylserine receptor TIM4 utilizes integrins as coreceptors to effect phagocytosis. Molecular Biology of the Cell. 25, (9), 1511-1522 (2014).
  11. Park, D., et al. BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module. Nature. 450, (7168), 430-434 (2007).
  12. Elliott, M. R., Koster, K. M., Murphy, P. S. Efferocytosis Signaling in the Regulation of Macrophage Inflammatory Responses. Journal of Immunology. 198, (4), 1387-1394 (2017).
  13. Yin, C., Kim, Y., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates differential antigen sorting following efferocytosis and phagocytosis. Cell Death & Disease. 7, (12), e2529 (2016).
  14. Kinchen, J. M., et al. A pathway for phagosome maturation during engulfment of apoptotic cells. Nature Cell Biology. 10, (5), 556-566 (2008).
  15. Yin, C., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates intermixing of phagocytosed apoptotic cells with recycling endosomes. Small GTPases. 0, (0), 1-9 (2017).
  16. Silva, M. T. Secondary necrosis: The natural outcome of the complete apoptotic program. FEBS letters. 584, (22), 4491-4499 (2010).
  17. Thorp, E. B. Mechanisms of failed apoptotic cell clearance by phagocyte subsets in cardiovascular disease. Apoptosis. 15, (9), 1124-1136 (2010).
  18. Sarantis, H., Grinstein, S. Monitoring phospholipid dynamics during phagocytosis: application of genetically-encoded fluorescent probes. Methods in Cell Biology. 108, 429-444 (2012).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Wang, J., Hossain, M., Thanabalasuriar, A., Gunzer, M., Meininger, C., Kubes, P. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358, (6359), 111-116 (2017).
  21. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. The Journal of Cell Biology. 169, (1), 139-149 (2005).
  22. Greenlee-Wacker, M. C., Rigby, K. M., Kobayashi, S. D., Porter, A. R., DeLeo, F. R., Nauseef, W. M. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human neutrophils prevents macrophage efferocytosis and induces programmed necrosis. Journal of Immunology. 192, (10), 4709-4717 (2014).
  23. Wootton, D. G., et al. Recovery from pneumonia requires efferocytosis which is impaired in smokers and those with low body mass index and enhanced by statins. Thorax. 71, (11), 1052-1054 (2016).
  24. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342, (1-2), 71-77 (2009).
  25. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophysical Journal. 74, (3), 1591-1599 (1998).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  27. Johnson, D. E., Ostrowski, P., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The position of lysosomes within the cell determines their luminal pH. The Journal of Cell Biology. 212, (6), 677-692 (2016).
  28. Evans, A. L., Blackburn, J. W. D., Yin, C., Heit, B. Quantitative efferocytosis assays. Methods in Molecular Biology. 1519, 25-41 (2017).
  29. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, (8), (2017).
  30. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. The Journal of Cell Biology. 191, (6), 1205-1218 (2010).
  31. Joshi, G. N., Gilberti, R. M., Knecht, D. A. Single cell analysis of phagocytosis, phagosome maturation, phagolysosomal leakage, and cell death following exposure of macrophages to silica particles. Methods in Molecular Biology. 1519, 55-77 (2017).
  32. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, (DEC), 1863 (1863).
  33. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology. 23, (18), 6494-6506 (2003).
  34. Reiners, J. J., Kleinman, M., Kessel, D., Mathieu, P. A., Caruso, J. A. Nonesterified cholesterol content of lysosomes modulates susceptibility to oxidant-induced permeabilization. Free Radical Biology & Medicine. 50, (2), 281-294 (2011).
  35. Boya, P., et al. Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of Experimental Medicine. 197, (10), 1323-1334 (2003).
  36. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends in Immunology. 1-9 (2012).
  37. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, (21), 3330-3341 (2014).
  38. Phanse, Y., et al. Analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (64), e3884 (2012).
  39. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. 230-233 (2011).
  40. Davies, S. P., Reynolds, G. M., Stamataki, Z. Clearance of apoptotic cells by tissue epithelia: A putative role for hepatocytes in liver efferocytosis. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  41. Ismail, O. Z., Zhang, X., Bonventre, J. V., Gunaratnam, L. G protein α12(Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310, (7), F607-F620 (2016).
  42. Vaught, D. B., Stanford, J. C., Cook, R. S. Efferocytosis creates a tumor microenvironment supportive of tumor survival and metastasis. Cancer Cell & Microenvironment. 2, (1), (2015).
  43. Heit, B., Yeung, T., Grinstein, S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 300, (1), C33-C41 (2011).
  44. Múnera, J. O., Wells, J. M. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1597, 167-177 (2017).
  45. Truman, L. A., et al. CX3CL1/fractalkine is released from apoptotic lymphocytes to stimulate macrophage chemotaxis. Blood. 112, (13), 5026-5036 (2008).
  46. Evans, A. L., et al. Antagonistic Coevolution of MER Tyrosine Kinase Expression and Function. Molecular Biology and Evolution. (2017).
  47. Flannagan, R. S., Heit, B., Heinrichs, D. E. Intracellular replication of Staphylococcus aureus in mature phagolysosomes in macrophages precedes host cell death, and bacterial escape and dissemination. Cellular Microbiology. (2015).
  48. Mubaid, F., Brown, C. M. Less is More: Longer Exposure Times with Low Light Intensity is Less Photo-Toxic. Microscopy Today. 25, (06), 26-35 (2017).
  49. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PloS One. 7, (12), e53004 (2012).
  50. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166, (1), 11-15 (2004).
  51. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  52. Ma, G. Z. M., Stankovich, J., Kilpatrick, T. J., Binder, M. D., Field, J. Polymorphisms in the receptor tyrosine kinase MERTK gene are associated with multiple sclerosis susceptibility. PloS One. 6, (2), e16964 (2011).
  53. Thorp, E., Cui, D., Schrijvers, D. M., Kuriakose, G., Tabas, I. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe-/- mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28, (8), 1421-1428 (2008).
  54. Nguyen, K. -Q. N., et al. Overexpression of MERTK Receptor Tyrosine Kinase in Epithelial Cancer Cells Drives Efferocytosis in a Gain-of-Function Capacity. The Journal of Biological Chemistry. 289, (37), 25737-25749 (2014).
  55. Morimoto, K., et al. Lovastatin enhances clearance of apoptotic cells (efferocytosis) with implications for chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Immunology. 176, (12), 7657-7665 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics