ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פרוטוקול זה מתאר גישה ללא כיול עבור לכימות חלבון ההומו-oligomerization במבחנה מבוסס על קרינה פלואורסצנטית תנודות ספקטרוסקופיה באמצעות סריקה מיקרוסקופ אור מסחרי. שיטות ניתוח וההגדרות רכישה נכונה מוצגים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nolan, R., Alvarez, L. A., Griffiths, S. C., Elegheert, J., Siebold, C., Padilla-Parra, S. Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software. J. Vis. Exp. (137), e58157, doi:10.3791/58157 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מספר ובהירות היא טכניקה ספקטרוסקופיה (FFS) תנודות פלורסצנטיות ללא כיול לגילוי חלבון ההומו-oligomerization. זה יכול להיות מועסק באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי מצויד עם גלאי דיגיטלי. פרוטוקול עבור השימוש הטכניקה במבחנה מוצג על-ידי מקרה שימוש שבו מספר והבהירות ניתן לראות במדויק לכמת המדינה oligomeric של FKBP12F36V mVenus-מתויג לפני ואחרי התוספת של התרופה dimerizing AP20187. החשיבות של שימוש הפרמטרים רכישה מיקרוסקופ הנכונה ואת השיטות preprocessing וניתוח הנתונים הנכונים הם דנו. בפרט, הדגיש את חשיבות הבחירה של תיקון photobleaching. שיטה זולה זו יכול להיות מועסק ללמוד אינטראקציות חלבון בהקשרים ביולוגיים רבים.

Introduction

חלבון אינטראקציות אני חוץ גופית n

באופן מסורתי, קריסטלוגרפיה וניסויים תהודה מגנטית גרעינית בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה (cryoEM) הם הטכנולוגיות שבחרת לתאר במדויק את הארכיטקטורה תלת-ממדי של חלבונים, להסיק שלהם פונקציה על ידי המתחקה אחר פרטיהם מבניים ברזולוציה גבוהה. חלבונים, לעומת זאת, אינם מבנים סטטי ולא ניתן לעבור מגוון של התנודות והשינויים הסתגלותי בזמן ובמרחב. זו הסיבה מדוע מבניים מידע לחקר הגבישים או נתונים CryoEM צריך השלמה עם טכניקות אחרות (למשל, דינמיקה מולקולרית סימולציות וטכניקות מולקולה בודדת): הפונקציה של חלבון קשורה שלה הסתגלותי שינויים אינטראקציות, ואת המידע הזה אינו נוכח בתוך מבנה סטטי. על מנת לחקור דינמיקה מולקולרית התוך, טכניקות בהתבסס על מולקולה בודדת פורסטר תהודה להעביר אנרגיה (smFRET) הן יעיל מאוד1. גישות אלה מסוגלים להעריך subpopulations שונים של מולקולות מורכבות בתקשורת. זה חשוב מאוד, כמו שינויים אלה מהירים להתרחש במהלך רכישת הנתונים (קרי, הננו לטווח השני).

שתי גישות עיקריות מועסקים בדרך כלל כדי לזהות ולכמת שינויים אלה: חלבונים פתרון ואת השטח-הנייח. איתור של האינטראקציות הבין-מולקולריות ובמיוחד, התהליך של dimerization המושרה על ידי ליגנדים, smFRET אינה תמיד הכלי הטוב ביותר. אכן, סריג תלוי לא רק על המרחק (≈10 ננומטר), אלא גם על הכיוון של שני הדיפולים (התורם ולא מקבל, χ2) ונמצא החפיפה של הפליטה תורם עם ספקטרום הבליעה של מקבל2, אבל אולי המצב האחרון הזה חשוב ובלבד experimentalist יכולה בחרה הזוג סריג הנכון. חיסרון מסוים של smFRET דורשים בדיקה ההומו-dimerization נובע תיוג של החלבון עניין: עבור הטרו smFRET, dimerization ניתן רק זוהה עד 50% (קרי, הטרו-סריג יהיו רק יכול לזהות את התורם-מקבל, התורם מקבל הומו-הדימרים אך לא תורם-תורם או מקבל-מקבל, המהווה השני 50% הדימרים). השימוש של קרינה פלואורסצנטית המתאם ספקטרוסקופיה (FCS) נגזרים (FCCS, ועוד3) כדי לברר חלבון דיפוזיה קבועים, איגוד קבועים במבחנה הוא חלופה אחרת. גישות אלה אינם מסוגלים לחלוטין לכמת ההומו-dimerization גם, כמו FCS אחד האמצעים מקדם ריכוז, דיפוזיה, ואת רדיוס דיפוזיה של חלקיק באמצעי תלויים בצורה לא טובה המשקל המולקולרי; עלייה 10-fold משקל מולקולרי רק לרמוז לדוגמה שינוי 2.15 לקפל מקדם דיפוזיה4. במקרה של FCS שני צבעים או FCCS, רק 50% של הומו-הדימרים יראו מאותה סיבה כמפורט לעיל. גישות מעשיות ביותר כמותיים כדי לזהות הומו-dimerization במבחנה וב -vivo הם הומו-סריג5 , מספר, בהירות (N & B)6. בהתחשב בעובדה הומו-סריג דורש שחזור במכשור ספציפי של הערך חיזקו (קרי, אופטי/אנלייזרים יסודות לשחזר את קיטוב מקבילים, בניצב), N & B מוצג כאן כמו טכניקה חיובית מזהים חלבון ההומו-dimerization, צבירה. זה יכול להיות מועסק גם במבחנה וגם ויוו עם תחבולה מסחרית.

מספר ובהירות

N & B כבר שנסקרה לאחרונה7. הביקורת התמקדה ביישום הטכניקה תאים חיים. זה משתלם כדי לשכפל פורמליזם מתמטי כאן משוואות אלה יוחלו על הנתונים שנאספו בתוך חוץ גופית. ראשית, יש צורך להגדיר כמה מונחים וכמויות מתמטי:

  • ישות היא קבוצת מולקולות אשר קשורים אחד לשני.
  • חדוה הבהירות של ישות הוא המספר של פוטונים שהוא פולט ליחידת זמן (לכל מסגרת).
  • n הוא המספר של ישויות הנוכחי.
  • של פיקסל נתון במהלך סדרות התמונה, < I > הוא שלה כלומר עוצמת ו σ2 הוא השונות בעוצמתה.

לאחר מכן, עם ספירת פוטון גלאי, בהנחה ישויות ניידים, ללא רקע,

Equation 1
Equation 2

כאשר N הוא מספר לכאורה ו- B זה בהירות נראית לעין. התוצאה היא

Equation 3
Equation 4

דלאל. et al. 8 הראה כי עם ציוד אנלוגי, אחד צריך תיקון 3 תנאים: על גורם S, על רקע היסט, רעש readout σ02. לאחר מכן, שוב בהנחה ישויות ניידים,

Equation 5
Equation 6

נותן

Equation 7
Equation 8

שימו לב כי המשוואה הנ עבור שונה זה נתון דלאל. et al. 8 וסקירה עוקבות. 7 ב דלאל. ואח ה- S במכנה הושמט בשל טעות דפוס, שגיאה זו שוכפלה על הסקירה. המשוואה הנ ל היא הנכונה. הנחיות למדידת S, σ והיסט02 - יחד עם הסבר על משמעותם - ניתנים על-ידי דלאל. et al. 8

חדוה הבהירות הוא יחסי המדינה oligomeric של הישויות באמצעי: חדוה יהיה פעמיים גדול עבור הדימרים כמו זה מונומרים, גדולה פי שלוש עבור trimers כפי שהיא מונומרים, פעמיים גדול עבור hexamers כפי שהוא trimers וכן הלאה. בדרך זו, מודדים את הבהירות חדוה, אחד יכול לכמת כל סוג של multimerization.

אם יש תערובת של oligomeric הברית הנוכחי, מספר והבהירות אינה מסוגלת להתאושש הברית oligomeric בודדים הנוכחי. זוהי מגבלה של הטכניקה.

Detrend אלגוריתם ותוכנות nandb

החשיבות של תיקון עבור photobleaching כבר הדגיש בעבר9. Photobleaching באופן בלתי נמנע מתרחשת במהלך הניסויים מיקרוסקופ אור במצב זמן לשגות; שניהם תאים חיים, חוץ גופית בתוך. גישות רבות תוארו בספרות לתיקון הלבנת7. טכניקת סינון מעריכית עם בחירה אוטומטית של פרמטר detrending T הוא הטוב ביותר הנוכחי. היא משולבת לתוך nandb תוכנה חופשית, קוד פתוח9. אכן, תוכנה הדורשים מהמשתמש לבחור באופן ידני את הפרמטר detrending שלהם יכול לגרום תוצאות שגויות בגלל בחירה פרמטר זו צפויה להיות שרירותי של שגוי. האלגוריתם אוטומטיים בודק את הנתונים וקובע את הפרמטר המתאים, ללא צורך התערבות המשתמש9. אפילו עם הבחירה הטובה ביותר של פרמטר המחליק, detrending יש מגבלות משלו ועובד היטב רק עם photobleaching אחוזים נמוכים יותר 25%, כפי שמוצג עם סימולציות9. מעניין, בעת שימוש השגרה detrending אוטומטי, רמת הדיוק שלה היא כזאת אחד יכול לעבוד עם ערכי בהירות נמוכה (אפילו B < 1.01), ומכאן עוצמות, והנמוכות עדיין להיות מדויק מספיק כדי לכמת את ההומו-dimerization.

Photobleaching גורם גם בעיה נוספת: הנוכחות של photobleached fluorophores ב multimer מורכבים. זה עושה למשל, trimer נראות דיימר כאשר אחד של שלוש יחידות ב trimer הלא-פלורסנט. עובד, מולר10 הראה כיצד לתקן בשביל זה, תיקון זה הודגש גם ב- סקירה עוקבות7. התוכנה nandb כולל תיקון זה9.

FKBP12 F36V מערכת

FKBP12F36V הוא חלבון אשר לא oligomerize באופן טבעי אך ידוע dimerize עם התוספת של AP20187 סמים (המכונה בפיהם BB dimerizing ליגנד)11,12. זה עושה את זה מקרה מבחן אידיאלי עבור מספר והבהירות: עם FKBP12F36V עם תוויות ברורות, הכפלה של מדינת oligomeric צריך להקפיד על תוספת של BB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. FKBP12 F36V - mVenus טיהור

  1. להפוך תאים pLysS (DE3) עם וקטור pET22b המכיל monomerized FKBP12F36V האנושי12 ו- His6 N-מסוף ותגי mVenus (וקטורית זמינים על פי בקשה). צלחת תאים על גבי אגר LB בתוספת 50 µg/mL אמפיצילין, 34 µg/mL כלורמפניקול.
  2. העברת המושבות טרנספורמציה לתוך התרבות סטרטר 100 מ ל LB ולגדול 16-20 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס ברעידות.
  3. לדלל starter צפופה התרבות (OD600 > 1) מטריים במדיום ליברות (2 x 500 מ"ל אצוות) לגדול במשך 2-3 שעות כדי OD600 = 0.6 - 0.8 (37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד).
  4. תרבויות מגניב על קרח. זירוז עם 250 מיקרומטר IPTG ולגדול 16-20 שעות ב 21 ° C, 200 סל ד.
  5. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 2,000 x g במשך 20 דקות.
  6. Resuspend צנפה ב- 40 מ של מאגר ה-IMAC (20 מ מ סודיום פוספט pH 7.5, 500 מ מ NaCl, imidazole 3 מ מ, מ מ 1 β-mercaptoethanol) בתוספת EDTA נטול מעכבי פרוטאז (1 טבליה לכל תא גלולה).
  7. Sonicate תאים (500 וואט, 20 kHz, 40% משרעת, 9 עליך, 11 s. למשך 15 דקות) על חומר מסיס קרח ו הקציר על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x g.
  8. העברת מסיסים lysate אל בקבוק חרוט ולהוסיף 2 מ"ל של שרף (ראה טבלה של חומרים). תקופת דגירה של שעה עם סל"ד 105 סיבוב
    הערה: sepharose ניקל עשוי לשמש גם בשלב זה IMAC.
  9. הקציר שרף, לשטוף עם 250 מ ל IMAC מאגר A ואחריו 500 מ ל IMAC מאגר B (20 מ מ סודיום פוספט pH 7.5, 500 מ מ NaCl, imidazole 7 מ מ, מ מ 1 β-mercaptoethanol).
    הערה: להגדיל את imidazole 50 מ מ, אם באמצעות שרף sepharose ניקל.
  10. Elute מתויג His6 חלבון באמצעות מאגר IMAC C (20 מ מ סודיום פוספט pH 7.5, 500 מ מ NaCl, imidazole 300 מ"מ, 1 מ מ β-mercaptoethanol).
  11. מזריקים על הדרה גודל עמודה (ראה טבלה של חומרים) equilibrated ב- 10 מ מ HEPES pH 7.5, 150 מ מ NaCl, 1 מ"מ DTT. FKBP12F36V יש שלה • תנאי שיא mL 87.71 על העמודה השתמשנו.
  12. להעריך את טוהר דרך עמוד מרחביות ובריכה, להתרכז כנדרש.

2. הכנת מערך צלחת Multiwell

  1. להפשיר את FKBP12F36V מטוהרים (או הנקרא חלבון עניין) מ-80 מעלות צלזיוס.
  2. להכין פתרון של 100 ננומטר מטוהר FKBP12F36V (בינונית, 10 מ מ HEPES pH 7.5, 150 מ מ NaCl, 1 מ"מ DTT). Sonicate, צנטריפוגה (מהיר הספין של 13,000 סל ד) כדי למנוע היווצרות של אגרגטים.
  3. Pipette µL 100-200 לתוך חדר התצפית טוב 8 עם חלק תחתון זכוכית.
  4. הוסף את dimerizer BB ריכוזים הסופי של 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 ו- 500 ננומטר12,13.
  5. כאסמכתא, להכין פתרון של 100 ננומטר של mVenus לבד כדי להעריך את תופעות אפשריות צבירת והמשקעים ולשחזר את ערך הבהירות מונומר את אותן הגדרות רכישה.

3. רכישת כיול ללא קונפוקלי

  1. להפעיל את מערכת קונאפוקלית (איור 1). כל האור מיקרוסקופ קונפוקלי מערכת סריקה מצויד עם גלאי דיגיטלי או אנלוגי מאופיין היטב גלאי8, מסוגל להחזיק זמן להתעכב קבוע עבור כל פיקסל רכש יעבוד.
  2. להגדיר את נתיב קרן עירור:
    1. הפעל את ננומטר לייזר 514 ואת ערכת זה ב 20-100 nW כוח ביציאה של המטרה (עבור FKBP12F36V-mVenus).
    2. בחר את המטרה 63X1.4NA או צווארון תיקון מים טבילה מטרה מיועד FCS.
    3. הפעל אחד HyD, APD או גלאי PMT מכוילת. גלאי מסוגל לספור-פוטון עדיפים, כמו במקרה זה, החישוב של S, היסט ו σ02 אינם נחוצים.
    4. בחר חלון פליטה nm 520-560
    5. להגדיר את חריר 1 יחידה אוורירי עבור nm התואם פליטת ~ 545.
    6. הגדר את מצב רכישה-16x16 פיקסלים
    7. להגדיר את הפיקסל להתעכב זמן tלשכון כך היא מספקת את tמסגרת >> TD >> tלהתעכב, איפה D זמן מגורים של פעולות ה באמצעי חלבון ו- -t מסגרת היא קצב המסגרות. התאים כדי הגדרת הזמן להתעכב µs ~ 13.
      הערה: חלק מהיצרנים המסחרי היה סורקים כי לא שמרתם הזמן להתעכב לפיקסל מתמדת. קביעות זו חיונית עבור פעולת השירות לעבודה.
    8. להגדיר את גודל פיקסל-~ 120 ננומטר.
    9. בחר את מצב רכישת xyt ובחר מספר המסגרות כדי לרכוש לכל רכישה ומכירה היטב (לדוגמה 5,000).
    10. אם המערכת מצויד מצב תפוקה גבוהה, מציגים את נקודות הציון של כל טוב ואת מספר רכישות לכל טוב כדי להפוך את התהליך לאוטומטי.
      הערה: להיות זהירים כדי להבטיח הנוכחות של מתקן מים עבור אם משתמש אובייקטיבית טבילה.
    11. אם המערכת הינו מצויד עם מערכת זלוף, לטעון את הפתרון BB, לתכנת זלוף להתחיל נכון-אחרי המסגרתth 5000 כדי להעריך את קינטיקה של dimerization בעת רכישת למשל, 10,000 תמונות.
  3. להוסיף טיפה של שמן לתוך המטרה טבילה בשמן / מים אם ניצול צווארון תיקון מים טבילה מטרה מיועד FCS.
  4. הר לחדר התצפית טוב 8 אל הבמה.
  5. בחר את הבאר הנכון ולהתמקד על הפתרון.
    הערה: חשוב: להימנע מיקוד קרוב הזכוכית התחתונה כדי למנוע השתקפות פיזור. בעת התמקדות עמוק יותר לתוך הפתרון, נתק את האפשרות פוקוס אוטומטי.
  6. להתחיל הרכישה ולשמור את ערימת תמונות שנוצר בתבנית TIFF.

4. detrend וניתוח בהירות באמצעות nandb את החבילה R

  1. כמו בדיקת איכות preprocessing, להשתמש ImageJ14 כדי להעיף מבט התמונות ולשחזר לפרופיל בעוצמה, כפי שמוצג באיור 2. פעולה זו שימושית לקבוע אם לאו photobleaching מדי. אם יש יותר מדי מלבין, הנתונים אינו מתאים ניתוח נוסף.
    הערה: ImageJ ניתן גם שימושי להמרת תמונות TIFF מתבניות מסחרי. התוכנה nandb המתוארים להלן יכול לעבוד רק עם קבצי TIFF.
  2. הורד והתקן15,R ו- RStudio16. מומלץ להוריד ולהתקין R קודם, ואז RStudio.
    הערה: להלן הוא תיאור של כיצד להשתמש בחבילת nandb R. ידיעת השפה R לא נדרש להשתמש nandb, אולם זה יהפוך את החיים קלים יותר.
  3. התקן את החבילה nandb.
    1. פתח את RStudio ואת במסוף, הקלד install.packages("nandb") והמתן ההתקנה.
  4. להכיר nandb
    1. סקירת ה-17ידנית.
    2. עיין בעזרה RStudio מובנה של פונקציות שונות. הפונקציה סביר כדי לשמש יהיה שימוש יהיה brightness(). הצג את קובץ העזרה עבור פונקציה זו על-ידי הקלדת? brightness() במסוף.
  5. לחשב את הבהירות
    1. נגיד יש קובץ התמונה על שולחן העבודה שנקרא img001.tif (שים לב 'nandb' עובד רק עם קובצי TIFF). ניתן לחשב את הבהירות של התמונה:
      b <-בהירות ("~/Desktop/img001.tif", טאו = "אוטומטי")
      1. זה מקצה את הבהירות של התמונה b משתנה ב- R. טאו = "אוטומטי" מבטיחה כי התמונה כראוי detrended לפני חישוב בהירות. הדבר השכיח ביותר לעשות מכאן היא לחשב את ממוצע או החציוני הבהירות של התמונה. אחד ניתן לעשות זאת על-ידי הקלדת mean(b) או median(b). אחד יכול גם לכתוב את בהירות התמונה לשימוש שולחני
        ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")
    2. אומרים יש תיקיה של תמונות images_folder על שולחן העבודה, צריך לחשב את brightnesses של אלה תמונות ולכתוב את התמונות בהירות כקובצי TIFF. ואז רואה? brightness_folder(). פונקציה זו מעבד תיקייה שלמה בבת אחת:
      brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", טאו = "אוטומטי")
      . זה טוב במיוחד למי יש תוכנה שהם מעדיפים R, כי כל הקבצים יעובדו לפי פקודה יחידה אחת ולאחר מכן אחת יכולה להמשיך. לעבוד עם תמונות TIFF בהירות פלט בתוכנה שבחרת שלהם, אם זה ImageJ14 , פיתון או משהו אחר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detrending ובהירות monomeric

לאחר הנתונים הושגה אחד יכול להפעיל את החישובים בהירות כדי לקבוע את מצב oligomeric של החלבון עניין בהפתרון. גם אם ההשפעה של הלבנת בפתרון לא יכול להיות קיצוני כמו זה ניתן ויוו, המעקב בעוצמה עדיין כנראה לא יהיה אומר נייח, כנראה עקב השפעות photophysical הקשור את fluorophore,18 , אבל הסיבות מאחורי זה אינם מובנים במלואם. יש לזה השפעה בעת חישוב הבהירות; בעת ניסיון לקבוע מונומר-דיימר מעברים, היבט זה הוא מכריע. על-ידי החלת אוטומטית detrend אלגוריתם לנתונים שמוצג באיור 2, המעקב בעוצמה כראוי מתוקן, מתן ערך מדויק יותר הבהירות של FKBP12F36V-mVenus בתמיסה. לפני חיבור של BB, בלי detrending, B = 1.026, ואילו לאחר detrending, B = 1.005 (איור 2b).

קביעת FKBP12 F36V מעברים מונומר-דיימר-mVenus במבחנה

רצפים של 20,000 תמונות של מטוהרים FKBP12F36V mVenus - 100 ננומטר בפתרון נרכשו כמו שצוין במקטע פרוטוקול. לאחר מסגרות 10,000 נרכשו, התרופה homodimerizer BB נוספה הפתרון תוך רכישת. ניתחנו את כל סדרת מסגרות 5,000 רצופים (איור 3). הזוהר אומר 5 דקות אחרי תוספת BB B = 1.010, אשר הוא עלייה 2-fold, המציינת דיימר FKBP12F36V. קינטיקה של התהליך מוצג באיור 3b; ההשהיה בין BB תוספת מלאה FKBP12F36V dimerization היה כ- 2 דקות.

זיהוי של אגרגטים חלבון

מספר של אגרגטים חלבון התגלו במספר מוגבל של מסגרות והן גם את עוצמת מעקב (איור 4). אגרגטים אלה להתרחש באופן טבעי בפתרון בעבודה עם חלבונים, ניתן לסלק sonicating ו/או הגדלת דילול חלבון. עם זאת, על בעיות ביולוגיות, אחד צריך לזהות מעברים בין מונומרים אגרגטים גדולים. איור 4 מראה דוגמה איפה חלבון FKBP12F36V צבירה ' מאטום לשקוף ' דרך התבוננות נפח (תמונות 16 x 16); לחישובים הקודם שלנו שאלה נתונים שנמחקו, אולם, למשל מוצג באיור 4 להראות כי אלה ניתן להבחין אגרגטים מאופיין באמצעות אותן הגדרות הגישה. במבט ראשון, בעת הערכת 5000 תמונות, אחד יכול לשחזר את בהירות ממוצעת עבור FKBP12F36V-mVenus שטופלו BB (B = 1.010). הצגת תמונת raw בהירות, אחד ניתן לראות בבירור, אבל אזור עניין של 8 פיקסלים עם ערך גבוה של B ≈ 1.080. אזור זה של ריבית עולה בקנה אחד עם כמה מסגרות ב- t = s 34-37 איפה צבירה FKBP12F36V לפזר מסביב לאזור התצפית. הנוסעים לא השתהה באמצעי תצפית לאורך זמן מספיק כדי לקבוע באופן מדויק את גודלו.

Figure 1
איור 1 . יישום של N & B כדי לזהות מעברים מונומר-דיימר החלבון בתמיסה. (א) פשוטה של לייזר מיקרוסקופ (LSM) מצוידים עם מקור לייזר סורק אופטי (להגדיר ב- 514 nm במקרה של mVenus שכותרתו חלבונים) מכוון (חיצים כחולים) אובייקטיבית טבילה (במקרה שלנו שמן 63X1.4NA) מאיר פתרון 100 ננומטר של פתרון FKBP12F36V-mVenus. פליטת קרינה פלואורסצנטית (החצים הירוקים) עובר דרך מראה ודיקרואיק זוהר בטאה מסנן bandpass שמנקה את האור פליטה ו הקדמוניות שוכן בגובה 1 יחידה אוורירי ממוקם ממש לפני גלאי דיגיטלי נקודת מסוגל לספור פוטון. (b) נפח קונאפוקלית של תאורה נסרק באמצעות 16x16 פיקסלים מאירה יחיד מולקולות FKBP12F36V-mVenus להיכנס ולצאת האחסון בצורה גאוסיאנית קונאפוקלית לייצר מערך של תנודות עוצמת קרינה פלואורסצנטית. סדרת תמונות (ג) רכשה לאורך זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . Detrending אוטומטי יש צורך למדוד במדויק אוכלוסיה של מונומרים בפתרון. (א) ערימה של תמונות פיקסל 16 5000 נרכשה כמתואר בסעיף פרוטוקול. האינטנסיביות של המסגרת הראשונה מוצג יחד עם הפרופיל ממוצע עוצמת זמן לפתור, אשר מציג זמן לתנודות המונח עלול להיות קשור הלבנת ואחרים ממס ו/או תופעות photophysic. לא משנה מה הגורם עבור אלה תנודות ארוכות, הם השפעת החישובים בהירות, ולכן דורשים detrending. בלי אוטומטי detrend, אחד מקבל B = 1.026, ואילו לאחר אוטומטי detrending, B = 1.005. בנוסף, הבהירות בלי (שמאל פאנלים, השני שורה) ועם (נכון פאנלים, שורה שנייה) סינון חלקה מוצג. (b) באותם הנתונים המוצגים detrended היה (א) ואת התוצאות מבחינת עוצמת והבהירות המוצגת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . הפריה N & B הוא מסוגל לפתור את המעבר בין מונומרים FKBP12F36V הדימרים בזמן אמת. התוספת של הסם dimerizer BB הביאו עלייה כפולה בהירות נכון מיד אחרי 2 דקות (מ- 0.005 כדי 0.010 נכון הבהירות מולקולרי). (א) עוצמת המסגרת הראשונה מוצג יחד עם הפרופיל רשע בעוצמה של תמונת detrended. הבהירות בלי (שמאל פאנלים, השני שורה) ועם (נכון פאנלים, שורה שנייה) סינון חלקה מוצג. (b) מתכוון בהירות מותווים (5000 כל מסגרות) באמצעות של חדוה אמיתי בהירות מולקולרית. Dimerization מתרחשת 2 דקות לאחר תוספת BB (t = 1 דקות) ב- t = 4 דקות. העקומה מצויד היא פונקציה sigmoidal להדגיש את הנטייה לכיוון dimerization לאחר תוספת של התרופה dimerizer (BB). קווי שגיאה מייצגים שגיאת התקן של ההתפלגות בהירות בכל נקודה בזמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . אין ויטרו N & B כדי לפתור את גודל אגרגטים חלבון בתמיסה. (א) זמן לפתור בעוצמה detrended מעקב לצורך רכישת FKBP12F36V-mVenus מוצגים יחד עם תמונות בהירות (שורה שנייה). (b) המעקב זמן לפתור את detrended בעוצמה מראה מקסימום בעוצמתם זה מסומן בעיגול אדום מנוקד (החלונית השמאלית העליונה). המסגרת בעוצמה הראשונה שמתאים דווקא בזמן הזה (t = 34 שניות) מוצג חץ אדום מראה של צבירה FKBP12F36V-mVenus כניסה לשטח תאורה. מבט מקרוב אל תוך התמונה בהירות מוחלקים מראה אזור עניין המכיל הברית oligomeric גבוהה ומכיל שאר התמונה שילוב בין מונומרים הדימרים עם ממוצע של B = 1.008. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

N & B היא טכניקה לגילוי multimerization באמצעות אור מסחרי סריקה מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד עם גלאי דיגיטלי. גישה זו הוא אטרקטיבי למדי בהשוואה ל נקודה אחת FCS, FCCS ו- smFRET כי זה חינם וניסוי בחישוב בהירות היא פשוטה וריכוז עצמאית6. זה חשיבות רבה, עם זאת, לתיקון הלבנת ולטווח עוצמת תנודות לפני ביצוע חישובים בהירות9; עלייה קלה של בהירות בשל הלבנת וממצאים אחרים עלול להיפרש כצעד שינוי במצב oligomeric (כפי שניתן לראות באיור 2) אם detrending מוזנח או לבצע באופן שגוי. השימוש האוטומטי detrend אלגוריתם מאפשר חישובים מדויקים בהירות.

. זה חשוב לעקוב אחר מספר כללים בעת רכישת התמונות. ראשית, יש לדעת את זמן מגורים של המולקולות של אמצעי האחסון קונאפוקלית, ולכן קבוע דיפוזיה שלהם כדי להגדיר את הפרמטרים הנכון של מערכת קונאפוקלית; זמן מגורים לצרכי מולקולות שכותרתו לשכון בין הפיקסל לשכון את מסגרת הזמן7וזמן. בוחרים את fluorophore נכון חיוני. Fluorophore מבריק ויציב יש צורך לסימן טוב רעש, photobleaching מינימלי. עוצמת הלייזר יש לשמור נמוכה יחסית כדי למנוע הלבנת. פוטון סעיפים של 1 או 2 לפיקסל מספיקים. שמירת נחשב נמוך גם הוא חיוני כדי להימנע ההערמות גלאי. הטכניקה, המתמודד יפה עם תקציבים פוטון נמוך יותר טוב זה המתמודד יפה עם הלבנה. ב פרוטוקול זה כבר מועסקים mVenus; וזה fluorophore בהיר יחסית, להשוות eGFP19. חלופה אחת היא שימוש nanoboosters זה באופן סלקטיבי היעד החלבון הניאון; אלה יכולים להיות בהיר יותר fluorophores מסורתיים20...

מבחינת חומרה, גלאי ספירת פוטון דיגיטלי להקל כימות, אבל N & B הוא אפשרי עם גלאי אנלוגי, ובלבד שיחזר אחד מספר פרמטרים רכישה. 8

אף-על-פי השני מתקרב כאילו חיזקו יכול לזהות הומו-dimerization, עם כניסתו של תוכנה חדשה כדי לפשט ניתוח, N & B עומד לבד כמו גישה נגיש כדי לזהות ולכמת אינטראקציות חלבון ו- oligomerization, שני במבחנה , תאים חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו היא נתמכה על ידי טרסט להעניק 105278/ת/14/2 R.N. Wellcome אמון המרכז גנטיקה אנושית ממומן על ידי Wellcome אמון הליבה פרס 203852/ת/16/2. העבודה בקבוצה C.S. נתמך על ידי לחקר הסרטן בבריטניה (C20724/A14414), המועצה האירופית למחקר תחת אופק 2020 מחקר של האיחוד האירופי, חדשנות תוכנית גרנט 647278.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RosettaTM (DE3) pLysS cells Novagen 70956-3
Ampicillin Sigma Aldrich PubChem Substance ID 329824407
Chloramphenicol Sigma Aldrich PubChem Substance ID: 24892250
LB starter culture QIAGEN
LB medium QIAGEN https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif
IPTG Sigma Aldrich PubChem Substance ID 329815691
IMAC buffer Medicago 09-1010-10
EDTA-free protease inhibitors  Sigma Aldrich 11873580001
TALON resin Clonetech
Nickel sepharose GE Healthcare
S200 16/60 column GE Healthcare
Glass bottom 8 well observation dish Ibidi 80827

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics. BioEssays. 40, (2018).
  2. Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
  3. Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Dual-color fluorescence lifetime correlation spectroscopy to quantify protein-protein interactions in live cell. Microscopy Research and Technique. 74, 788-793 (2011).
  4. Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
  5. Tramier, M., Coppey-Moisan, M. Fluorescence anisotropy imaging microscopy for homo-FRET in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 395-414 (2008).
  6. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94, 2320-2332 (2008).
  7. Nolan, R., Iliopoulou, M., Alvarez, L., Padilla-Parra, S. Detecting protein aggregation and interaction in live cells: A guide to number and brightness. Methods. (2017).
  8. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71, 69-81 (2008).
  9. Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. (2017).
  10. Hur, K. H., et al. Quantitative Measurement of Brightness from Living Cells in the Presence of Photodepletion. PLoS One. 9, (2014).
  11. Amara, J. F., et al. A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10618-10623 (1997).
  12. Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 10437-10442 (1998).
  13. Rollins, C. T., et al. A ligand-reversible dimerization system for controlling protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 7096-7101 (2000).
  14. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82, 518-529 (2015).
  15. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Core. (2017).
  16. RStudio: Integrated Development Environment for R. R Team. (2016).
  17. Nolan, R. nandb R package. Available from: https://CRAN.R-project.org/package=nandb (2017).
  18. Jung, G., Wiehler, J., Zumbusch, A. The photophysics of green fluorescent protein: influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222. Biophysical Journal. 88, 1932-1947 (2005).
  19. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
  20. Butkevich, A. N., et al. Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED. Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics