Ansette trykksatt varmtvann utvinning (PHWE) for utforske naturprodukter kjemi i Undergraduate laboratoriet

* These authors contributed equally
JoVE Journal
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her, brukes en trykksatt varmtvann utvinning (PHWE) metode, som benytter en uendret husholdning espressomaskin å innføre studenter til naturprodukter kjemi i laboratoriet. Presenteres to eksperimenter: PHWE eugenol og acetyleugenol fra nellik og PHWE av seselin og (+)-epoxysuberosin av australske anlegget Correa reflexa.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ho, C. C., Deans, B. J., Just, J., Warr, G. G., Wilkinson, S., Smith, J. A., Bissember, A. C. Employing Pressurized Hot Water Extraction (PHWE) to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory. J. Vis. Exp. (141), e58195, doi:10.3791/58195 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En nylig utviklet trykksatt varmtvann utvinning (PHWE) metode som benytter en uendret husholdning espressomaskin for å lette naturprodukter forskning har også funnet programmer som en effektiv pedagogisk verktøy. Denne teknikken er spesielt brukt å introdusere andre - og tredje-års studenter til aspekter av naturprodukter kjemi i laboratoriet. I denne rapporten presenteres to eksperimenter: PHWE eugenol og acetyleugenol fra nellik og PHWE av seselin og (+)-epoxysuberosin fra endemisk australske plantearter Correa reflexa. Ved å bruke PHWE i disse eksperimentene, råolje fedd ekstrakt, beriket eugenol og acetyleugenol, ble oppnådd i 4-9% w/w fra fedd av andre år studenter og seselin (+)-epoxysuberosin ble isolert gir opptil 1,1% w/w og 0,9% w/w fra C. reflexa av tredje års studenter. Tidligere øvelsen ble utviklet som en erstatning for tradisjonell steam destillasjon eksperiment gir en introduksjon til utvinning og separasjon teknikker, mens sistnevnte aktiviteten kjennetegnet guidet henvendelse undervisningsmetoder å simulere naturlige produkter bioprospecting. Hovedsakelig avledet fra rask natur av denne PHWE teknikk i forhold til tradisjonelle utvinning metoder som er ofte inkompitabel med tidspress forbundet med lavere laboratorieforsøk. Denne rask og praktisk PHWE-metoden kan brukes effektivt isolere ulike klasser av organiske molekyler av en rekke plantearter. Utfyllende natur denne teknikken i forhold til mer tradisjonelle metoder har også vist tidligere.

Introduction

Isolasjon og identifikasjon av naturlige produkter er av grunnleggende betydning for det vitenskapelige miljøet og samfunnet generelt. 1 Bioprospecting, Søk etter verdifulle organiske molekyler som finnes i naturen, forblir en uunnværlig prosess i oppdagelsen av nye stoffet kunder og potensielle terapeutiske agenter. Det anslås at fra 1981-2014, ~ 75% av alle godkjente små molekyl legemidler var naturlige produkter, naturlig produkt-avledet eller naturlig produkt-inspirert. 1 videre naturlige produkter har enorme strukturelle og kjemiske mangfoldsdirektoratet. Derfor representerer de også verdifulle kjemiske stillaser som kan brukes direkte i Organisk syntese eller utvikling av chiral ligander og katalysatorer. 2 , 3

Relativt tidkrevende prosedyrer som maserasjon, Soxhlet utvinning og damp destillasjon har tradisjonelt vært bærebjelke i forskningen fokusert på isolasjon av sekundær metabolitter fra planter. 4 mer moderne utvinning teknikker, inkludert akselerert løsemiddel utvinning, har fokusert på å redusere utvinning ganger og etablere grønnere protokoller. 4 , 5 i 2015, en opprinnelige trykksatt varmtvann utvinning (PHWE) metoden ble rapportert. 6 denne teknikken ansatt en uendret husholdning espressomaskin til rette for rask og spesielt effektiv utvinning av shikimic syre fra stjerneanis. Espressomaskiner er spesielt utviklet og konstruert for å trekke ut organiske molekyler fra riktig bakken kaffebønner. Å oppnå dette, disse instrumenter varme vann ved temperaturer opp til 96 ° C og presset av vanligvis 9 bar. 7 med dette i tankene er det kanskje ikke overraskende at espressomaskiner kan brukes til å effektivt pakke naturlige produkter fra en rekke plantemateriale.

Studier som involverer en rekke bakkesendte plantearter har vist kapasiteten til denne PHWE teknikken å effektivt pakke naturlige produkter over et relativt bredt polaritet spekter. 6 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 videre forbindelser som inneholder noe følsom funksjonelle grupper, som aldehyder, epoksider, glykosider og potensielt epimerizable stereogenic sentre var vanligvis upåvirket av utpakkingen. Utfyllende natur denne teknikken i forhold til mer tradisjonelle metoder har også blitt demonstrert. 12 , 16 dette PHWE metoden har også vært ansatt å isolere flere gram mengder av naturlige produkter, som har blitt brukt til å forberede romanen naturprodukt derivater og komplekse molekyl syntese mer generelt. 8 , 11 , 17

Det ble oppdaget at denne nye PHWE-metoden kan tjene som et nyttig pedagogisk verktøy som kunne innarbeides i undergraduate laboratoriet. Hovedsakelig avledet fra rask natur denne teknikken i forhold til tradisjonelle utvinning metodene som er ofte inkompitabel med tidspress forbundet med lavere laboratorieforsøk. Derfor fortrengt denne teknikken tradisjonell undervisning kjemi laboratory eksperimentet fokusert på utvinning av eugenol fra fedd ansette damp destillasjon på University of Tasmania. 9 , 18 siden den gangen-varianter av dette eksperimentet har blitt adoptert av andre universiteter og en modifisert eksperimentet fokuserer på PHWE av cloves nå funksjoner i programmet undergraduate kjemi laboratorium ved University of Sydney (vide infrarød ).

For å vise de praktiske og gjennomførbarheten ved å bruke denne nye PHWE tilnærming til undervisning formål, er to protokollene presentert som en del av denne studien. Den første delen av denne rapporten belyser et eksperiment på PHWE eugenol og acetyleugenol fra fedd som er en del av programmet andre år undergraduate laboratorium ved University of Sydney (figur 1). Dette eksperimentet tjener til å introdusere elevene til naturprodukter kjemi samtidig utvikle grunnleggende praktiske ferdigheter. Den andre delen har et eksperiment på PHWE av endemisk australske plantearter Correa reflexa som er en del av programmet tredje års undervisning laboratorium ved University of Tasmania (figur 2). Dette eksperimentet er utformet for å simulere naturprodukter bioprospecting og forsterke kjernen laboratorium teknikker. 11

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Det anbefales at alle prosedyrer er utført i avtrekksvifte. Studenter må ha riktig personlig verneutstyr til alle tider i laboratoriet og HMS-Datablad (SDS) tilknyttet hvert reagens må konsulteres før bruk.

1. PHWE av cloves: isolering av eugenol og acetyleugenol

  1. Utvinning av eugenol og acetyleugenol fra nellik
    1. Plass coarsely bakken cloves (12.5 g) i en 250-mL kanne.
    2. Legge til sand (12.5 g) fedd sliper og bland godt.
    3. Samle en portafilter (utvalg rom) og laste kurven med hele fedd-sand blandingen. Lett komprimere prøven med brutt.
      Merk: Komprimer ikke blandingen for mye eller væske flyte ikke gjennom.
    4. Plasser i portafilter i espressomaskin og plassere en ren 250 mL kanne under den. Legge til en 30% etanol/T2O løsning i vanntanken av espressomaskin hvis det er mindre enn halvfull.
    5. Bruk espressomaskin samle 100 mL ekstrakt.
      Merk: Se instruktør Hvis maskinen ser ut til å være tette.
    6. Tillate portafilter å fullføre dryppende og deretter fjerne den fra espressomaskin.
      Advarsel: Sliper og metall omegn vil bli varm.
    7. Bruker en slikkepott, fjerne fedd sliper fra i portafilter og kast i avfall bin.
    8. Skyll ut resterende faste stoffer fra i portafilter med H2O under en kran i vasken og returnere den for neste person å bruke.
    9. Kul fedd ekstrakt i en isbadet til temperaturen har redusert til minst 30 ° C.
    10. Legg ekstraktet i 250 mL separatory trakt, legge til 30 mL Heksan og riste forsiktig.
    11. Sted skiller trakten i en ring klemme montert en retorten stand og tillate vandige og organiske lagene å skille så samle vandig (lavere) laget tilbake i 250 mL begeret.
      Merk: Det kan ta 10 minutter for lagene å skille. Studentene anbefales å utføre løsemiddel optimalisering av TLCs mens du venter første separasjon oppstår (se trinnene 1.2).
    12. Overføre organisk (øverst) laget (som inneholder produktet) til en ren 250 mL konisk kolbe, og så helle den nederste (vannbasert) laget tilbake i separatory trakten.
    13. Ekstra vandig laget ytterligere to ganger med heksan (2 x 30 mL).
    14. Kombiner den organiske (øverste) lag i samme flasken etter hver utvinning.
    15. Tredje væske-flytende utvinning, hell den kombinerte organiske ekstrakt i separatory trakten og vaskes med 100 mL H2O ved å riste kraftig. Samle organisk (øverst) laget i en ren 250 mL konisk kolbe og tørr ved å legge MgSO4 og virvler kolbe.
    16. Filtrere påfølgende blandingen gjennom riflet filter papir inneholdt i en glass trakt i en pre-veie 250mL runde bunn kolbe.
      Merk: Solid rester (hydrert MgSO4) kan kastes i avfallet.
    17. Fordampe løsemiddelet (Heksan) fra den innsamlede filtratet bruker en roterende fordamperen (vann badevann: 60 ° C, tomrommet trykket: 350 mbar) og nytt veie kolbe som inneholder den resulterende oljen.
  2. Optimalisering av tynne lag kromatografi (TLC) løsemiddel
    Merk: Som en gruppe studenter tilordnes et løsemiddel system fra 100:0 aceton: cyclohexane 0:100 aceton: cyclohexane av instruktøren å identifisere forholdet som gir oppløsning av eugenol fra acetyleugenol.
    1. Få en TLC referanse løsning av ren eugenol og acetyleugenol.
      Merk: Nødvendig TLC referanse løsninger av ren eugenol og acetyleugenol ble utarbeidet av lab-teknikere før lab økten.
    2. På en TLC plate, kan du merke en planlagt ~1.5 cm fra bunnen med en myk blyant. Merk av for tre like linjeavstand punkter.
    3. Bruk en TLC spotter oppdager en dråpe rene eugenol TLC referanse løsning i ett kjørefelt, en flekk av ren acetyleugenol TLC referanse løsning i tredje kjørefelt og en flekk av hver i andre kjørefelt (co stedet).
    4. Se etter eugenol og acetyleugenol på TLC platen ved å vise platen under en UV-lampe (254 nm) i TLC viser regjering.
      Merk: Det bør være lite (1-2 mm bredt) svarte flekker på tallerkenen der TLC referanse løsninger ble oppdaget. Hvis det er ingen flekker eller flekker vises svakt, gjelde et annet sted i den riktige løsningen for TLC til en svart flekk er observert under UV-lys.
    5. Legge til 10 mL av tilordnede løsemiddel blandingen i en ren, tørr TLC krukke.
      Merk: Kontroller løsemiddel høyden i glasset ikke overstiger ~ 1 cm.
    6. Ved hjelp av pinsett, plassere forberedt TLC platen i TLC glasset. Lukk lokket på glasset.
      Merk: Løsemiddelet må ligge under grunnlinjen TLC platen.
    7. La løsemiddelet til å reise opp TLC platen. Når løsemiddelet er ~ 1 cm fra toppen av platen, fjerne TLC platen fra glasset med pinsett og merke linjen av løsemiddel foran med en blyant.
    8. La løsemiddelet til å fordampe fra TLC platen (~ 1 min) og deretter vise TLC platen under en UV-lampe (254 nm). Bruke en blyant, sirkel svarte flekker observert på TLC tallerkenen.
    9. Beregne oppbevaring faktoren (Rf) eugenol og acetyleugenol ved å dele avstanden reist av sammensatte avstanden reist av løsemiddelet.
    10. Beregn forskjellen mellom Rf -verdiene for eugenol og acetyleugenol (ΔRf).
    11. Dele resultatene med resten av klassen. Registrere oppbevaring verdiene av andre studenter med andre løsemiddel prosenter.
    12. Identifisere hvilke løsemiddel system vil være best å analysere råolje eugenol løsning og påfølgende rensing trinnene.
      Merk: Beste TLC løsemiddel forholdet vil gi den største avstanden mellom eugenol og acetyleugenol angitt av den største ΔRf verdien. Hvis ΔRf er plottet mot løsemiddel komposisjon, skal diagrammet ligne en klokkekurve.
  3. Separasjon av eugenol og acetyleugenol av væske-flytende utvinning
    1. Legg heksan (10 mL) til det rå eugenol inneholder ekstrakt fra trinn 1.1.17, og hell den påfølgende løsningen i 250 mL separatory trakt.
    2. Skyll runde bunn flasken heksan (10 mL) og legge dette til separatory trakten.
    3. Ekstra Heksan løsningen med 3 M vandig NaOH (2 x 25 mL) via væske-flytende utvinning. Samle og kombinere vandig nederste lagene i en 250-mL konisk kolbe fra hver utvinning. Samle organisk laget i en 50-mL konisk bolle og tørk ved å legge MgSO4 og virvler kolbe.
      FORSIKTIG: NaOH er etsende. Unngå kontakt med hud.
      Merk: Acetyleugenol fortsatt i organisk laget, mens eugenol er nå i alkaliske vandig ekstrakt (nederste lag).
    4. Beholde økologisk lag (organisk løsning A) for senere TLC analyse.
    5. Swirl konisk kolbe som inneholder alkaliske vandig brøken fra trinn 1.3.3 i en is-vannbad og sakte legge 10 M vandig HCl til en hvit emulsjon er dannet; Sjekk surheten med Kongo rødt papir, bruker en pipette for å overføre en dråpe løsningen på pH papiret (det bør aktivere blå).
      FORSIKTIG: HCl er etsende. Unngå kontakt med hud. Tillegg av HCl føre energisk bobler, HCl burde være addert nøye, holde konisk kolbe på is.
      Merk: Totalt 20-30 mL HCl (10 M til en vandig løsning) vil være nødvendig.
    6. Pakk ut den melkeaktig vandige emulsjonen med heksan (2 x 30 mL), bruke væske-flytende utvinning i en 250 mL skille kolbe. Kontroller at temperaturen i vandig ekstrakt ved romtemperatur eller nedenfor før du legger Heksan. Kombinere to Heksan ekstrakter til en ren 100 mL konisk kolbe.
      Merk: Eugenol vil nå bli kombinert organisk (øverst) lag (organisk løsning B).
    7. Legge til MgSO4 til tørk organisk løsning B.
    8. Analysere organisk løsning A, organisk løsning B, ren eugenol TLC referanse og acetyleugenol TLC referanse av TLC bruker optimalisert TLC løsemiddel forholdet identifisert i forrige økt.
    9. Filtrere organisk løsning A og B gjennom riflet filter papir i egen pre vektet 250mL runde bunn flasker. Kast solid rester (hydrert MgSO4) i avfallet.
    10. Fjerne løsemiddelet fra runde bunn flasker med en roterende fordamperen (vann badevann: 60 ° C, tomrommet trykket: 350 mbar).
    11. Legg diethyl Eter (5 mL) til hver runde bunn kolbe og overføre renset acetyleugenol (organisk løsning A) og eugenol (organisk løsning B) i en umerket, preweighed hetteglass med en trakt.
    12. Skyll flasken ytterligere diethyl Eter (5 mL) i ampullen. Fordampe løsemiddelet bruker en roterende fordamperen (vann badevann: 50 ° C, tomrommet trykket 800 mbar) med en flaske vedlegg. Registrere avkastningen og Merk ampullen korrekt.
    13. Analysere organisk løsning A, organisk løsning B, ren eugenol TLC referanse og acetyleugenol TLC referanse av TLC bruker optimalisert TLC løsemiddel forholdet identifisert i forrige økt.
      Merk: Vandige løsninger kan helles ned i vasken for avhending. Heksan og Eter avfall skal fjernes i ikke-klorerte organisk avfall flaskene.

2. PHWE av Correa reflexa : isolering av seselin og (+)-epoxysuberosin

  1. Økt 1. PHWE av Correa reflexa
    1. Grind Correa reflexa blader (10 g) i en elektrisk krydder jeksel og deretter overføre plantemateriale bakken til en 250-mL kanne.
      Merk: Sliping bør ta 20-30 sekunder.
    2. Legge til ~ 2 g med grov sand for begeret inneholder plantemateriale.
    3. Blanding og pakke i kurven i portafilter (utvalg rom). Komprimere prøven med brutt.
      Merk: Ikke pakke prøven for hardt.
    4. Legge til ~ 300 mL 35% etanol/T2O løsning espresso maskin tanken.
    5. Plasser i portafilter i espressomaskin og plassere en ren 250 mL kanne under den.
    6. Samle ~ 100 mL av ekstrakt, vent ~ 1 minutt og deretter samle en ytterligere 100 mL.
      FORSIKTIG: Maskinen og ekstrakter være varme på dette punktet.
    7. Avkjøle denne blandingen i isbadet og fordampe etanol ved hjelp av en roterende fordamperen (vann badevann: ~ 40 ° C).
    8. Overføre vandig pakke til en separatory trakt og pakke med ethyl acetate (4 x 50 mL).
      Merk: Tid kan være nødvendig å tillate emulsjoner skille mellom utdrag.
    9. Kombinere organisk ekstrakter, tørr ved å legge MgSO4 og virvler kolbe, filtrere ved hjelp av sintered glass trakt og fordampe bruker en roterende fordamperen (vann badevann: ~ 35 ° C) å gi det rå ekstrakt.
    10. Få en 1H kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) spektrum (se instruktør for assistanse). 11
    11. Utføre TLC analyse av det rå ekstrakt å finne et passende løsemiddel system å isolere forbindelsene som er hentet.
      Merk: TLC analyse er utført av analogi til prosedyrer i trinn 1.2.
  2. Økt 2. Skillet mellom seselin og (+)-epoxysuberosin av flash kolonne kromatografi11,19
    Merk: Følgende protokollen involverer bruk av flash kolonne kromatografi for separasjon av organiske forbindelser. Kontakt instruktør for å demonstrere hvordan å pakke en flash silica gel-kolonne.
    1. Sted kolonnen (~ 30 mm i diameter) i en klemme montert retorten stå. Plass en 100-mL konisk kolbe under kolonnen.
    2. Fyll kolonnen med silica gel (60 μm flash grad) til et nivå av ~ 10 cm og deretter legge til hexanes (~ 100 mL) i kolonnen.
    3. Sett et glass stopper i kolonnen, fjerne kolonnen fra klemmen og rist for å få en slurry. Plasser kolonnen i klemme og deretter la blandingen til å bosette seg.
    4. Åpne kranen på kolonnen, og bruke en gass-adapter knyttet til en komprimert luft linje, tomme kolonnen la ~ 2 mm løsemiddel over sengen med silica gel. Fjern gass adapteren og lukke kranen.
    5. Bruk hexanes i konisk kolbe (~ 5 mL) til å vaske ned noen silica gel fra veggene i kolonnen med en Pasteur pipette utstyrt med en gummi septum.
    6. Gjenta trinn 2.2.4 deretter legge et lite lag av sand (~ 1 cm) til kolonnen.
    7. Legge til diklormetan (~ 1mL) til kolbe som inneholder råoljen utdrag fra trinn 2.1.9. Nøye laste påfølgende løsningen på kolonnen bruker en Pasteur pipette utstyrt med en gummi septum. Åpne kranen på kolonnen og lar prøve å adsorberes på silica gel.
    8. Gjenta trinn 2.2.7 ytterligere to ganger.
    9. Forsiktig legge til hexanes (~ 20 mL) i kolonnen. Gjenta trinn 2.2.4.
    10. Forsiktig legge (~ 180 mL av en 15% ethyl acetate/hexanes løsning). Åpne kranen på kolonnen og bruke en gass-adapter knyttet til en komprimert luft linje, tomme kolonnen la ~ 2 mm løsemiddel over sengen med silica gel, samle fraksjoner i 10-mL reagensglass.
      Merk: Dette vil tillate seselin å være isolert.
    11. Kombinere reagensglasset fraksjoner som inneholder seselin i en 250-mL runde bunnen bolle og fordampe bruker en roterende fordamperen (vann badevann: ~ 35 ° C).
      Merk: TLC analyse brukes til å bestemme dette og utføres ved analogi prosedyrer i trinn 1.2.
    12. Forsiktig legge (~ 75 mL av en 25% ethyl acetate/hexanes løsning). Åpne kranen på kolonnen og bruke en gass-adapter knyttet til en komprimert luft linje, tomme kolonnen la ~ 2 mm løsemiddel over sengen med silica gel, samle fraksjoner i 10-mL reagensglass.
      Merk: Dette vil tillate (+)-epoxysuberosin å være isolert.
    13. Kombinere reagensglasset fraksjoner som inneholder (+)-epoxysuberosin i en 250-mL runde bunnen kolbe og fordampe bruker en roterende fordamperen (vann badevann: ~ 35 ° C).
      Merk: TLC analyse brukes til å bestemme dette og utføres ved analogi prosedyrer i trinn 1.2.
    14. Prøver av de isolerte forbindelsene analyseres ved hjelp NMR spektroskopi. 11
      Merk: NMR spektroskopi eksperimenter utføres av en lab tekniker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PHWE av cloves. Når du prøver å utføre væske-flytende utvinning trinnet, møtte studenter ofte emulsjoner (tillegg av saltlake ikke var vanligvis effektiv). På dette stadiet, studentene ble bedt om å la blandingen stå i skiller trakten mens de utforsket effekten av eluent komposisjon på separasjon av eugenol og acetyleugenol av TLC. Det bør bemerkes at Heksan kan erstattes med enten heptane eller diklormetan i væske-flytende utvinning trinn. 9 elevene ble tildelt TLC løsemiddel forholdet aceton og cyclohexane og utstyrt med ren standarder for eugenol og acetyleugenol og har utført TLC analyse (Figur 3). Resultatene var ordnet på en tavle, og effekten av løsemiddel komposisjon på oppbevaring faktoren (Rf) og den optimale eluent ble vurdert i en Gruppediskusjon (tabell 1). Optimal løsemiddel komposisjonene identifisert av studenter vanligvis varierte fra 5 til 20% aceton/cyclohexane med en ΔRf mellom 0,1-0.2.

Etter TLC eluent optimalisering, studenter vendte tilbake til sin eugenol utdrag. Råolje fedd ekstrakt (som består hovedsakelig av eugenol og acetyleugenol) ble isolert i 4-9% w/w. I den andre økten dette eksperimentet utnyttet studenter på ulike syre-base egenskaper av to store organiske molekyler å skille dem av væske-flytende utvinning. Vanligvis ble eugenol isolert i en avkastning på 45-65% w/w med det rå ekstrakt mens acetyleugenol ble isolert i en avkastning på 5-10% w/w med det rå ekstrakt. Studenter deretter utnyttet den optimaliserte eluent (identifisert som beskrevet ovenfor) fastslå suksessen til deres væske-flytende utvinning ved sammenligning av deres ekstrakter ren referanse prøvene av TLC (Figur 3). Studenter også analysert sine råolje fedd ekstrakt og deres renset eugenol og acetyleugenol-prøver ved å utføre Fourier-transform infrarødspektroskopi (FTIR). 9 løsemiddel eller vann topper var tidvis observert i IR spectra på grunn av dårlig utført arbeidet opp prosedyrer (eller dårlig eksempel forberedelse).

Viderekomne studenter forpliktet omtrent halvparten av sin isolerte råolje til væske-flytende utvinning beskrevet ovenfor og den andre delen underlegges flash kolonne kromatografi (mer informasjon er tilgjengelig i den støttende informasjonen). Selv om fullført væske-flytende utvinning og flash kolonne kromatografi trinn i en enkelt fire timers økt kan virke ganske ambisiøse var dette oppnåelig for de fleste avansert studentene gjennomføre dette eksperimentet. Fullstendig separasjon av eugenol fra acetyleugenol av flash kolonne kromatografi ble sjelden oppnådd sin nære oppbevaring faktorene (Figur 4). Studentene var imidlertid vanligvis kunne samle noen fraksjoner som inneholder ren eugenol. Viderekomne studenter ble så bedt om å kommentere på to forskjellige rensing teknikker som del av sin rapport.

PHWE i Correa reflexa. Studentene utført PHWE av Correa reflexa med minimal hjelp av laboratoriet instruktør. Under det flytende-flytende utvinning steget emulsjoner vanligvis dannet og studenter ofte ble pålagt å la blandingen stå i separatory trakten (~0.25 h) med periodiske uro i blandingen med glass stang. Brukt kromatografiske rensing av det rå ekstrakt ble komfortabelt fullført i firetimers laboratorium økten av studenter. Seselin og (+)-epoxysuberosin ble isolert gir opptil 1,1% w/w og 0,9% w/w, henholdsvis og isolert prøver av både forbindelser ble analysert av 1H og 13C NMR og FTIR spektroskopi (figur 2). Mens studenter gjennomførte FTIR spektroskopi eksperimenter og forberedt prøver for NMR spektroskopi, utført laboratorieteknikere NMR spektroskopi eksperimenter. Resultatene av studenter var i samsvar med tidligere publiserte arbeider. 11

Selv om dette ikke er presentert i denne rapporten, i praksis har dette eksperimentet også en andre delen som utfordrer elevene framførte utvinning en plantearter som ikke har blitt studert ansette PHWE (mer informasjon finnes i støttefilene informasjon).

Figure 1
Figur 1. PHWE av cloves. 9 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. PHWE i Correa reflexa. 11 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . En representant TLC plate utarbeidet av student. (10% aceton / cyclohexane elueringsrør). Lane 1 (E): eugenol standard; Lane 2 (råolje): råolje fedd pakke; Lane 3 (A): acetyleugenol standard). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

aceton / cyclohexane (%v/v) mener acetyl-eugenol Rf acetyl-eugenol Rf (σ) mener eugenol Rf eugenol Rf (σ) mener ΔRf antall TLC analyser
0 0,06 0,08 0,04 0,06 0,02 12
5 0,34 0,11 0,27 0.09 0.07 15
10 0.45 0.07 0,34 0,05 0,12 20
20 0,51 0.07 0.41 0,06 0,10 20
30 0.58 0,10 0.49 0,12 0,10 19
40 0,63 0,08 0,56 0,08 0.07 16
50 0.76 0,08 0.73 0,08 0,03 17
60 0.77 0,13 0.73 0,15 0,04 12
70 0.84 0,13 0,81 0,13 0,03 11
80 0.90 0,06 0.87 0,08 0,02 10
90 0,88 0,06 0.87 0,05 0,01 11
100 0.87 0,13 0,86 0.14 0,02 6

Tabell 1. Tabell over oppbevaring faktorer skisserte effekten av eluent komposisjon på Rf.

Figure 4
Figur 4 . Representant TLC plater utarbeidet av studenter. Venstre: En TLC plate analysere resultatet av væske-flytende utvinning trinn (10% aceton / cyclohexane elueringsrør). Lane 1 (E): eugenol referanse standard. Lane 2 (LEB): eugenol inneholder organisk trekke ut. Lane 3 (A): acetyleugenol referanse standard. Lane 4 (LEN): acetyleugenol inneholder organisk ekstrakt. Høyre: En TLC plate analysere resultatet av flash kolonne kromatografi trinn (10% aceton / cyclohexane elueringsrør). Tallene på TLC platen gjelder hvor reagensglasset brøkdel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Klassisk fremgangsmåten for å isolere eugenol fra fedd av damp destillasjon har vært en del av programmet mellomliggende kjemi laboratorium ved University of Sydney i flere tiår, men ble modernisert for å ansette PHWE metodikk i 2016 (figur 1). 9 , 18 dette gitt et antall fordelene. Først utnytte husholdning espressomaskiner i laboratoriemiljø umiddelbart fascinert og engasjert studenter ved å illustrere anvendelsen av en ikke-klassiske, alternativ metode å påvirke en tradisjonell vitenskapelig studie. Dessuten, denne nye metoden redusert tiden det tar å fullføre utvinning og aktivert inkorporering av flere øvelser i denne nye gjennomkøyring av eksperimentet. Spesielt tillot dette tynne lag kromatografi (TLC) innføres (og flash kolonne kromatografi for viderekomne studenter).

Eksperimentet fokuserer på PHWE av cloves ble utformet som en innledende laboratorium opplever for andre år undergraduate kjemi studenter og derfor det funksjoner Resonnerende undervisningsmetoder. 9 dette mer preskriptiv, oppskrift-stil prosedyren kan studenter med noe begrenset erfaring i organisk kjemi effektivt fullføre utvinning av eugenol fra cloves. I dette eksperimentet, er begreper som syre-base utvinning av Sure forbindelser, utnytte TLC å identifisere egnet eluent komposisjon for kromatografi, og bruk av en roterende fordamperen innført eller forsterket av en kombinasjon av online pre lab-video trening og personlig demonstrasjoner. Utfyllende komponenter under de to tildelte øktene, studenter i avanserte strømmen av mellomledd kjemi også atskilt eugenol og acetyleugenol med kolonnen kromatografi og bestemt identitet utdraget komponentene bruke TLC. I den andre økten sammenligne studenter kritisk metodene to separasjon. Generelt, var studenter kjøpedyktig fullstendig samlede eksperimentet innenfor tildelt to firetimers periodene med minimal instruksjon.

Eksperimentet fokuserer på PHWE og isolering av seselin og (+)-epoxysuberosin fra Correa reflexa ble utviklet for mer erfarne studenter tredje års undervisning kjemi studenter. Spesielt var denne læring øvelsen resultatet av en studie som stammer i forskningslaboratoriet. 11 den første gjentakelsen av eksperimentet ble innlemmet i programmet tredje års undervisning kjemi laboratorium ved University of Tasmania i 2015. Etter to år med revisjoner og evaluering, ble dette eksperimentet utført av en tredje års undervisning klasse for tredje gang i 2017.

Dette eksperimentet ble spesielt utformet som en guidet-inquiry-basert aktivitet som streber etter å etterligne noen av tilnærmingene i naturlige produkter forskningslaboratorier og har minimal skrevet instruksjoner. Dette er en student-rettet erfaring og laboratoriet instruktøren spiller en nøkkelrolle i å hjelpe studenter som de jobber gjennom eksperimentet ved å gi retning som kreves. I dette eksperimentet, studentene utvikle viktige laboratorium ferdigheter i kromatografi og ansette NMR spektroskopi utføre struktur forklaring. Dette laboratoriet erfaring forsterker konseptet med bioprospecting som presenteres for studenter i klasserommet og denne kan utvides til studier av tidligere unstudied plantemateriale å gi et mer representativt opplevelse av naturlige produkter bioprospecting. C. reflexa er en endemisk australske plantearter, men dette eksemplet kan erstattes for aktuelle blad materiale fra andre terrestriske plantearter i dette eksperimentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne bekrefter den School of Natural Sciences - kjemi, University of Tasmania og School of Chemistry, Universitetet i Sydney for økonomisk støtte. B.J.D. og JJ takke den australske regjeringen for forskning Training Program Scholarships.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
espresso machines Breville/Sunbeam Breville espresso machine model 800ES / Sunbeam EM3820 Café Espresso II
rotary evporators Buchi and Heidolph
cloves (plant material) Dijon Food Pty Ltd Cloves must be ground in a food processor for students.
Correa reflexa (plant material) sample obtained in Tasmania Sample collected from mature shrubs in the Thomas Crawford Reserve at the University of Tasmania
sand Ajax 1199
ethanol Redoc Chemicals E95 F3
hexanes Ajax 251
magnesium sulfate Ajax 1548
diethyl ether Merck 1009215000
silica on aluminium TLC plates Merck 1055540001
eugenol Merck 1069620100
eugenyl acetate Aldrich W246905
acetone Redox Chemicals Aceton13
cyclohexane ChemSupply CA019
silica gel 60 Trajan 5134312 40 - 63um (230-400mesh)
Congo red paper ChemSupply IS070-100S
32% hydrochloric acid Ajax 256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014. Journal of Natural Products. 79, 629-661 (2016).
  2. Barnes, E. C., Kumar, R., Davis, R. A. The use of isolated natural products as scaffolds for the generation of chemically diverse screening libraries for drug discovery. Natural Product Reports. 33, 372-381 (2016).
  3. DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 9295-9304 (2016).
  4. Bucar, F., Wube, A., Schmid, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2013).
  5. Sticher, O. Natural product isolation. Natural Product Reports. 25, 517-554 (2008).
  6. Just, J., Deans, B. J., Olivier, W. J., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. New Method for the Rapid Extraction of Natural Products: Efficient Isolation of Shikimic Acid from Star Anise. Organic Letters. 17, 2428-2430 (2015).
  7. Caprioli, G., Cortese, M., Cristalli, G., Maggi, F., Odello, L., Ricciutelli, M., Sagratini, G., Sirocchi, V., Tomassoni, G., Vittori, S. Optimization of espresso machine parameters through the analysis of coffee odorants by HS-SPME-GC/MS. Food Chemistry. 135, 1127-1133 (2012).
  8. Just, J., Jordan, T. B., Paull, B., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical isolation of polygodial from Tasmannia lanceolata: a viable scaffold for synthesis. Organic Biomolecular Chemistry. 13, 11200-11207 (2015).
  9. Just, J., Bunton, G. L., Deans, B. J., Murray, N. L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of Eugenol from Cloves Using an Unmodified Household Espresso Machine: An Alternative to Traditional Steam Distillation. Journal of Chemical Education. 93, 213-216 (2016).
  10. Deans, B. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Practical Isolation of Asperuloside from Coprosma quadrifida via Rapid Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 69, 1219-1222 (2016).
  11. Deans, B. J., Just, J., Chetri, J., Burt, L. K., Smith, J. N., Kilah, N. L., de Salas, M., Gueven, N., Bissember, A. C., Smith, J. A. Pressurized Hot Water Extraction as a Viable Bioprospecting Tool: Isolation of Coumarin Natural Products from Previously Unexamined Correa (Rutaceae). ChemistrySelect. 2, 2439-2443 (2017).
  12. Deans, B. J., Olivier, W. J., Girbino, D., Bissember, A. C., Smith, J. A. Extraction of carboxylic acid-containing diterpenoids from Dodonaea viscosa via pressurised hot water extraction. Fitoterapia. 126, 65-68 (2018).
  13. Deans, B. J., Kilah, N. L., Jordan, G. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Arbutin Derivatives Isolated from Ancient Proteaceae: Potential Phytochemical Markers Present in Bellendena, Cenarrhenes and Persoonia Genera. Journal of Natural Products. 81, 1241-1251 (2018).
  14. Deans, B. J., Tedone, L., Bissember, A. C., Smith, J. A. Phytochemical profile of the rare, ancient clone Lomatia tasmanica and comparison to other endemic Tasmanian species L. tinctoria and L. polymorpha. Phytochemistry. 153, 74-78 (2018).
  15. Deans, B. J., Skierka, B., Karagiannakis, B. W., Vuong, D., Lacey, E., Smith, J. A., Bissember, A. C. Siliquapyranone: a Tannic Acid Tetrahydropyran-2-one Isolated from the Leaves of Carob (Ceratonia siliqua) by Pressurised Hot Water Extraction. Australian Journal of Chemistry. 71, (2018).
  16. Olivier, W. J., Kilah, N. L., Horne, J., Bissember, A. C., Smith, J. A. ent-Labdane Diterpenoids from Dodonaea viscosa. Journal of Natural Products. 79, 3117-3126 (2016).
  17. Rihak, K. J., Bissember, A. C., Smith, J. A. Polygodial: A viable natural product scaffold for the rapid synthesis of novel polycyclic pyrrole and pyrrolidine derivatives. Tetrahedron. 74, 1167-1174 (2018).
  18. Ntamila, M. S., Hassanali, A. Isolation of Oil of Clove and Separation of Eugenol and Acetyl Eugenol. Journal of Chemical Education. 53, 263 (1976).
  19. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution. Journal of Organic Chemistry. 2923-2925 (1978).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics