एस्ट्रोजन का उत्पादन प्राथमिक गोजातीय Granulosa कोशिकाओं के एक ऊतक संस्कृति मॉडल

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Summary

सीरम मुक्त शर्तों के तहत गोजातीय granulosa कोशिकाओं का एक दीर्घकालिक संस्कृति मॉडल का वर्णन किया गया है । इस मॉडल के शोधकर्ताओं एस्ट्रोजन उत्पादन गोजातीय granulosa कोशिकाओं के लक्षण पर अलग चढ़ाना घनत्व के रूप में विविध कारकों और शर्तों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है ।

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Baufeld, A., Vanselow, J. A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells. J. Vis. Exp. (139), e58208, doi:10.3791/58208 (2018).

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Abstract

डिम्बग्रंथि granulosa कोशिकाएँ (GC) एस्ट्राडियोल संश्लेषण का प्रमुख स्रोत हैं. preovulatory luteinizing हार्मोन (LH) बढ़ने से प्रेरित, theca की कोशिकाओं और, विशेष रूप से, granulosa सेल परत के अपने रूपात्मक, शारीरिक, और आणविक विशेषताओं को बदलने के लिए और प्रोजेस्टेरोन निर्माण कोष के रूप में पिण्ड कि गर्भावस्था को बनाए रखने के लिए जिंमेदार है । कोशिका संस्कृति मॉडल folliculo-लुटियल परिवर्तन में शामिल अंतर्निहित विनियामक तंत्र का अध्ययन करने के लिए आवश्यक उपकरण हैं । प्रस्तुत प्रोटोकॉल छोटे-से मध्यम आकार के रोम (< 6 mm) से आइसोलेशन प्रक्रिया और गोजातीय GC की cryopreservation पर केंद्रित है । इस तकनीक के साथ, GC के एक लगभग शुद्ध आबादी प्राप्त किया जा सकता है । cryopreservation प्रक्रिया बहुत सेल संस्कृति एक प्रत्यक्ष प्राथमिक ऊतक (अंडाशय) की आपूर्ति के स्वतंत्र काम के समय प्रबंधन की सुविधा । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक सीरम मुक्त सेल संस्कृति मॉडल है कि एस्ट्राडियोल-गोजातीय जीसी के सक्रिय स्थिति की नकल । महत्वपूर्ण शर्तों है कि एक सफल स्टेरॉयड सक्रिय सेल संस्कृति के लिए आवश्यक है प्रोटोकॉल भर में चर्चा कर रहे हैं । यह प्रदर्शित किया जाता है कि कोशिकाओं के चढ़ाना घनत्व में वृद्धि एक बदल जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल और हार्मोन उत्पादन द्वारा संकेत के रूप में एक विशिष्ट प्रतिक्रिया लाती है । इसके अलावा, इस मॉडल GC भेदभाव और अंय अनुप्रयोगों पर आगे की पढ़ाई के लिए एक आधार प्रदान करता है ।

Introduction

सफल ovulation और luteinization पतले देखते है और अच्छी तरह से अलग दैहिक तोंसिल्लितिस कोशिका प्रकार में आणविक परिवर्तन का उद्घोष पर निर्भर हैं । इन विकासात्मक प्रक्रियाओं के विवरण के बाद से अभी तक पूरी तरह से समझ नहीं है, आगे स्पष्टीकरण की आवश्यकता है । vivo दृष्टिकोण में व्यापक और महंगा है और विशेष रूप से, के लिए विशिष्ट आणविक तंत्र है कि folliculogenesis के दौरान होते है पता विफल । इसलिए, reductionistic इन विट्रो मॉडल में जरूरत के अलावा, सेलुलर और आणविक विवरण में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए कर रहे हैं । विभिंन अध्ययनों में पूरे रोम के संदर्भ में संस्कृति का वर्णन इन विट्रो निषेचन तकनीक1,2,3। क्योंकि शोधकर्ताओं भेदभाव के तंत्र में रुचि रखते हैं, कई अध्ययनों के लिए तोंसिल्लितिस पर ध्यान केंद्रित । इन कोशिकाओं, सीधे oocyte के साथ जुड़े, एस्ट्रोजन उत्पादन के प्रमुख स्रोत हैं और, इस प्रकार, folliculogenesis और luteinization4भर में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं ।

GC के अमर सेल लाइनों विभिन्न प्रजातियों से विकसित किया गया है. उनमें से अधिकांश, तथापि, एक पर्याप्त स्टेरॉयड हार्मोन उत्पादन5नहीं दिखा. अब तक, गोजातीय GC के केवल एक सेल लाइन6स्थापित किया गया है, लेकिन इस लाइन कई मार्ग7के बाद अपनी steroidogenic गतिविधि खो दिया है । इसलिए, steroidogenesis के बाद से और, विशेष रूप से, एस्ट्राडियोल उत्पादन GC कार्यशीलता का एक अनिवार्य सुविधा है, यह प्राथमिक सेल संस्कृति मॉडल में इन पहलुओं का अध्ययन करने के लिए सलाह दी जाती है । पिछले अध्ययनों में यह दर्शाया गया था कि एक काफी एस्ट्राडियोल उत्पादन केवल सीरम मुक्त संस्कृति शर्तों8,9के तहत मनाया जा सकता है । इसके अलावा पर, एस्ट्राडियोल संश्लेषण का एक अग्रदूत की पूरकता एक और शर्त है, के रूप में जीसी के लिए आवश्यक एंजाइम कि प्रोजेस्टेरोन androstenedione10में बदल सकते व्यक्त असफल । इसके अतिरिक्त, FSH और IGF-1 अनुपूरण के synergistic प्रभाव इन विट्रो में aromatase के एक अनुकूलित गतिविधि का पता चला, एस्ट्राडियोल संश्लेषण11की कुंजी एंजाइम. वर्तमान प्रोटोकॉल में GC कल्चर मॉडल पर काफी प्रभाव डालने वाले अन्य महत्वपूर्ण कारकों का भी वर्णन किया गया है । विशेष रूप से, सेल चढ़ाना घनत्व प्रयोग12के परिणाम पर जबरदस्त प्रभाव पड़ता है । इसके अलावा, गोजातीय gc के एक cryopreservation तकनीक है कि काफी संस्कृति में gc फिजियोलॉजी के साथ हस्तक्षेप नहीं स्थापित किया जा सकता है । इस तकनीक को सेल संस्कृति के काम के संगठन में सुधार करने के लिए और पसंदीदा चढ़ाना घनत्व का अनुकूलन में मदद करता है ।

Protocol

नोट: गोजातीय अंडाशय एक वाणिज्यिक कसाईखाना से प्राप्त किया गया । वधशाला शोधकार्य के संग्रह को जर्मन कानून के अनुसार किसी नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता नहीं है ।

1. कार्य की स्थिति और तैयारी

  1. बांझपन की गारंटी के लिए, सभी मीडिया और ऊतक तैयार करने के साथ ही एक विशेष सेल संस्कृति प्रयोगशाला में सभी संस्कृति काम एक लामिना फ्लो बेंच का उपयोग कर ।
  2. अंडाशय के परिवहन के लिए 1x फास्फेट बफर खारा (पंजाब, पीएच ७.४) १०० IU पेनिसिलिन, ०.१ मिलीग्राम/एमएल streptomycin और ०.५ µ जी/µ एल amphotericin के साथ पूरक तैयार करें ।
    नोट: अंडाशय प्राप्त करने और GC को अलग करने के बीच अधिक से अधिक अवधि इस सेट-अप में 2 h है ।

2. गोजातीय Granulosa कोशिकाओं का अलगाव

  1. अंडाशय (१०० IU पेनिसिलिन, ०.१ mg/एमएल streptomycin, और ०.५ µ g/µ l amphotericin) के साथ, अलगाव की प्रक्रिया शुरू करने से पहले सतह से किसी भी रक्त को निकालने के लिए डिम्बग्रंथि में कई बार धो लें । एक चोंच का प्रयोग करें, अंडाशय के अंदर जगह है, यह 1x पंजाबियों के साथ भरें, और फिर से पंजाबियों को त्यागें ।
    1. इस धुलाई चरण 3-4x दोहराएं, जब तक अंडाशय किसी भी शेष रक्त से साफ कर रहे हैं ।
  2. एक प्रयोगशाला का उपयोग कर एक अंडाशय पोंछ ७०% शराब के साथ लथपथ, संभव संदूषण को कम करने के लिए ।
  3. एक 3 मिलीलीटर सिरिंज और एक 18 जी सुई के साथ, puncturing छोटे-मध्यम आकार के रोम (< 6 mm, एक शासक के साथ मापा) द्वारा GC महाप्राण, और १ ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में फुफ्फुसीय द्रव पूल ।
    नोट: सिरिंज गीला करने के लिए, 1x पंजाबियों की एक छोटी राशि ले (१०० IU पेनिसिलिन के साथ, ०.१ mg/एमएल streptomycin, और ०.५ µ g/µ l amphotericin). यह तोंसिल्लितिस तरल पदार्थ की छोटी मात्रा में इकट्ठा करने में मदद करता है और सिरिंज के अंदर चिपके से कोशिकाओं को रोकता है ।
  4. कई रोम puncturing के बाद, सिरिंज और मध्यवर्ती सफाई के लिए 1x पंजाबियों के साथ सुई कुल्ला ।

3. कोशिकाओं की Cryopreservation

  1. trypan नीले दाग का प्रयोग करें और एक hemocytometer के तहत कोशिकाओं की गिनती ।
    1. व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए, एक ०.२५% trypan ब्लू समाधान के १.५ µ एल के साथ एक ट्यूब तैयार करते हैं ।
      नोट: जीवित कोशिकाओं को दाग रहेगा क्योंकि trypan ब्लू केवल मृत कोशिकाओं के सेल बैरियर का उपयोग कर सकते हैं, जो फिर नीले रंग दिखाई देते हैं ।
    2. trypan ब्लू समाधान के लिए granulosa सेल निलंबन के 15 µ एल जोड़ें और उंहें धीरे मिश्रण ।
    3. मिश्रण को एक hemocytometer के दोनों चैम्बर्स में रखें । चैंबर प्रति एक बड़ा वर्ग में रहने वाले (जैसे, दाग) कोशिकाओं की संख्या की गणना ।
      नोट: हालांकि कुछ रक्त कोशिकाओं को देखा जा सकता है, वे अपने बहुत छोटे आकार से प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।
    4. सामान्य दिशानिर्देशों के अनुसार दोनों चैंबर वर्गों के माध्य के साथ रहने वाले कोशिकाओं की संख्या की गणना; जीवित कोशिकाओं के अनुपात अंडाशय के बीच भिन्न हो सकते हैं, लेकिन ६०%13से अधिक होना चाहिए ।
  2. आगे विश्लेषण के लिए एक संदर्भ के रूप में ताजा अलग granulosa सेल पूल से एक नमूना ले लो ।
    1. अलग GC के सेल गिनती पर निर्भर करता है, अलग से शाही सेना, डीएनए, या प्रोटीन की तैयारी के लिए संदर्भ नमूने के रूप में कोशिकाओं की एक उपयुक्त संख्या निर्धारित करें ।
      नोट: आरएनए अलगाव और जीन अभिव्यक्ति के बाद के मूल्यांकन के लिए, 1 x 105 कोशिकाओं को पर्याप्त हैं, जबकि अन्य बाद में विश्लेषण अलग, आम तौर पर उच्च कोशिका संख्या की आवश्यकता हो सकती है.
    2. एक ताजा ट्यूब में संदर्भ कोशिकाओं के एक या कई aliquots प्लेस और यह कमरे के तापमान और अधिकतम गति पर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक (१२,००० एक्स जी) एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए । supernatant को त्यागें ।
    3. तुरंत सदमे-तरल नाइट्रोजन में नमूनों फ्रीज । -८० डिग्री सेल्सियस पर नमूना संग्रह ।
  3. cryopreservation निम्नानुसार कार्य करें ।
    1. ८०% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) और 20% dimethyl sulfoxide (DMSO) का उपयोग कर ठंड मध्यम तैयार करें ।
    2. आदेश में धीरे से gc गोली, कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए gc केंद्रापसारक और ५०० x जी
    3. supernatant ध्यान से निकालें और धीरे से १००% FCS (जैसे, 1 मिलीलीटर) में कोशिकाओं को फिर से स्थगित जब तक कोई और अधिक सेल के झुरमुट दिखाई दे रहे हैं ।
    4. सेल सस्पेंशन के लिए तैयार किए गए फ्रीजिंग मीडियम के 1 वॉल्यूम (उदा., 1 एमएल) जोड़ें और इस मिश्रण को एक क्रायोजेनिक शीशी में ट्रांसफर करें ।
      नोट: क्रायो की रक्षा मीडिया की अंतिम एकाग्रता ९०% FCS और 10% DMSO हो जाएगा ।
    5. एक विशेष (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध) ठंड कंटेनर कि तेजी से ठंड से बचाता में क्रायोजेनिक शीशी रखें । नमूनों की शीतलक दर से अधिक नहीं होना चाहिए-1 ° c/न्यूनतम 4 एच के लिए एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में फ्रीजर कंटेनर स्थानांतरण ।
    6. लंबे समय तक भंडारण के लिए, अल्ट्रा कम तापमान कंटेनरों (जैसे, तरल चरण नाइट्रोजन कंटेनरों) में क्रायोजेनिक शीशियों जगह है ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है, के रूप में cryopreservation अब भंडारण की अनुमति देता है ।

4. सेल कल्चर के लिए मीडिया और कल्चरल प्लेट्स की तैयारी

  1. कोट सेल ०.०२% कोलेजन आर के साथ संस्कृति प्लेट
    नोट: कोलेजन आर को संस्कृति में GC के एक बेहतर लगाव के लिए आवश्यक जाना जाता है ।
    1. शुद्ध पानी सेल संस्कृति के लिए उपयुक्त के साथ एक ०.०२% कोलेजन आर समाधान तैयार करें ।
    2. एक 24 अच्छी तरह से थाली में १५० µ एल जोड़ें (= 2 सेमी2/well) और सुनिश्चित करें कि अच्छी तरह से संस्कृति की पूरी सतह कोलेजन आर समाधान के साथ कवर किया जाता है ।
    3. लामिना फ्लो हुड में कुछ घंटे या रात भर के लिए खुला ढक्कन के साथ समाधान सूखी चलो ।
    4. जब संस्कृति प्लेटें पूरी तरह से सूख रहे हैं, उंहें 10 के लिए यूवी प्रकाश के साथ विकीर्ण-15 मिनट के लिए संदूषण को कम ।
    5. यदि आवश्यक हो, प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 महीने के लिए स्टोर ।
  2. तैयार मीडिया और एक लामिना प्रवाह हूड के तहत संस्कृति के काम के लिए पूरक । GC की एक सफल वसूली के लिए, वे गल के बाद तुरंत कार्रवाई की है ।
  3. निंन मीडिया तैयार करें ।
    1. अनुपूरक α-ंयूनतम आवश्यक माध्यम (α-मेम) 2 मिमी L-glutamine के साथ, ०.०८४% सोडियम बिकारबोनिट, ०.१% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA), 20 मिमी HEPES, 4 एनजी/एमएल सोडियम selenite, 5 µ जी/एमएल कैल्सीटोनिन, 10 एनजी/एमएल इंसुलिन और 1 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड ।
    2. साथ ही, जोड़ें १०० IU पेनिसिलिन और ०.१ मिलीग्राम/एमएल streptomycin मीडिया के लिए ।
      नोट: एंटीबायोटिक दवाओं, एक बार गर्म, लगभग ४८ एच के लिए स्थिर हैं । इसलिए, कल्चर सेट-अप और नियोजित मीडिया एक्सचेंज के लिए मीडिया की इच्छित मात्रा aliquot । पूर्व गर्म केवल एक पानी के स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए मीडिया aliquots । तैयार मीडिया 4 डिग्री सेल्सियस पर अब से 3 महीने के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
    3. α-मेम के साथ 20 एनजी/एमएल कूप उत्तेजक हार्मोन (FSH), ५० एनजी/एमएल आर3 IGF-1, और 2 µ एम androstenedione के साथ साथ स्टेरॉयड गतिविधि को प्रेरित करने के लिए,.
      नोट: हमेशा एक संस्कृति या मीडिया विनिमय की शुरुआत से पहले शीघ्र ही इन घटकों के पूरक । FSH और IGF-1 स्टॉक समाधान के लिए दोहराया फ्रीज और गल चक्र से बचें, के रूप में यह स्टेरॉयड गतिविधि समझौता हो सकता है.

5. सेल कल्चर का काम

  1. एक पानी के स्नान में जल्दी से गल कर कोशिकाओं को 3-4 मिनट के लिए ३७ ° c में और सेल निलंबन ३७ ° c पूर्व गर्म α-मेम (हार्मोन अनुपूरक के बिना) में स्थानांतरण । केंद्रापसारक के लिए, 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा की सिफारिश की है ।
  2. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए GC केंद्रापसारक और ५०० x gपर supernatant को त्यागें । पूर्व गर्म और पूरक α-मेम जोड़ें और कोशिकाओं को ध्यान से resuspend ।
  3. बीज 1 x 10 के एक घनत्व पर GC5 या 1 एक्स 106 प्रति अच्छी तरह से ५०० के एक अंतिम मात्रा में कोशिकाओं µ एल हालत के अनुसार कम से कम तीन संस्कृति कुओं की प्रतिकृति तकनीकी शामिल हैं ।
  4. एक मशीन में ३७ ° c के साथ 5% CO2 के लिए 8 डी के लिए सेल संस्कृति की मशीन ।
  5. हर दूसरे दिन एक मीडिया एक्सचेंज निष्पादित करें । केवल दो-तिहाई संस्कृति मीडिया के तनाव को कम करने के लिए और ताजा मीडिया के लिए कोशिकाओं के अनुकूलन में ढील करने के लिए प्रतिस्थापित करें ।
    नोट: GC फार्म एक ठेठ fibroblast-संस्कृति में कुछ दिनों के बाद phenotype की तरह है और एक साथ क्लस्टर के लिए करते हैं । उच्च कोशिका में घनत्व संस्कृति, बड़े समूहों के रूप में सामांय घनत्व GC संस्कृति की तुलना में अधिक बार पाए जाते है (चित्रा 1, दाएं पैनल बनाम छोड़ दिया) ।

6. बाद में कल्चरल Granulosa कोशिकाओं का विश्लेषण

  1. स्टेरॉयड हार्मोन विश्लेषण करने के लिए, मीडिया इकट्ठा और-20 डिग्री सेल्सियस पर इसे फ्रीज. एस्ट्राडियोल और खर्च मीडिया में प्रोजेस्टेरोन एकाग्रता का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त तरीकों का उपयोग करें [उदा., radioimmunoassay (रिया)]14.
  2. विभिंन लक्षित अणुओं (आरएनए, डीएनए, प्रोटीन, आदि) के बाद के विश्लेषण के लिए, लाइसे के रूप में आपूर्तिकर्ता द्वारा अनुशंसित एक उपयुक्त lysing एजेंट के साथ संस्कृति डिश में सीधे कोशिकाओं
    नोट: सबसे अलगाव प्रक्रियाओं के लिए, यह प्रोटोकॉल को रोकने के लिए संभव है, के रूप में लीजड ड कोशिकाओं को 1 सप्ताह के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । लंबे समय तक भंडारण के लिए, कोशिकाओं पर रखा जाना चाहिए-८० ° c ।
  3. प्रतिलिपि बहुतायत निर्धारित करने के लिए, संश्लेषित सीडीएनए और मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR)15तकनीक द्वारा विशिष्ट टेप उपाय । एक सांख्यिकीय मूल्यांकन अलग सेल संस्कृतियों की कम से कम तीन प्रतिकृतियां शामिल करना चाहिए, विभिंन सेल तैयारियों (जैविक प्रतिकृति) से उत्पंन ।

Representative Results

GC 1 x 105 कोशिकाओं पर चढ़ाया/अच्छी तरह से एक ठेठ fibroblast उपस्थिति की तरह प्रदर्शन के रूप में वे एक सेल fibroblasts के लिए तुलनीय विस्तार फार्म और समूहों (आंकड़ा 1a और 1c) का निर्माण करते हैं । 10 गुना से चढ़ाना घनत्व में वृद्धि 1 x 106 कोशिकाओं को/खैर आकृति विज्ञान पर अधिक सेल क्लस्टर (आंकड़ा 1b और 1 डी, तीर) देखा जा सकता है बदल नहीं किया । के रूप में पहले से ही एक पिछले प्रकाशन में दिखाया गया है, संस्कृति व्यंजन की कोलेजन कोटिंग मोटे तौर पर13कोशिकाओं के लगाव में सुधार ।

प्रारंभिक cryopreservation काफी संस्कृति में कोशिकाओं की शारीरिक विशेषताओं को बदलने के रूप में सीधे उन की तुलना में हौसले से अलग नमूनों से संस्कृति नहीं था । इस प्रतिलेखन बहुतायत के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है (qPCR द्वारा मापा) कई मार्कर जीन के अलग नहीं किया जब या तो जमे हुए या हौसले से अलग पूल से व्युत्पंन प्रसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना ।

चित्रा 3 स्टेरॉयड हार्मोन विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है (रिया द्वारा मापा) गोजातीय GC में सामान्य बनाम उच्च घनत्व पर संस्कृत. एस्ट्राडियोल एकाग्रता उच्च घनत्व संस्कृति की तुलना में सामान्य घनत्व संस्कृति में काफी कमी आई है, जबकि प्रोजेस्टेरोन उत्पादन के लिए उच्च हो जाता है.

कई जीन का एक तुलनात्मक विश्लेषण (qPCR द्वारा मापा) उच्च बनाम सामांय घनत्व संस्कृतियों में एक महत्वपूर्ण प्रभाव (चित्रा 4) का पता चला । CYP19A1, एस्ट्राडियोल के प्रमुख एंजाइम एंकोडिंग aromatase, साथ ही साथ गोनॉडोट्रॉफिन रिसेप्टर FSHR, काफी नीचे विनियमित थे । इसके विपरीत, जीन RGS2 और VNN2 एक महत्वपूर्ण अप-विनियमन दिखाया । इन परिणामों को स्पष्ट रूप से सुझाव है कि सेलुलर भेदभाव की विशिष्ट प्रक्रियाओं कोशिका चढ़ाना घनत्व बढ़ाने के द्वारा प्रेरित कर रहे हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: सामान्य (बाएँ पैनलों) और उच्च कोशिका घनत्व (सही पैनलों) में कल्चरल गोजातीय granulosa कोशिकाओं. ( और सी) कोशिकाओं 1 x 105 कोशिकाओं के एक घनत्व पर संस्कृति/अच्छी तरह से एक ठेठ fibroblast phenotype की तरह प्रदर्शित किया । (बी और डी) जीसी एक उच्च चढ़ाना घनत्व पर संस्कृत (1 x 106 कोशिकाओं/) के रूप में अधिक बार एक सामांय घनत्व (बाएं पैनल) के तहत कोशिकाओं की तुलना में बड़े सेल समूहों (तीर) के रूप में खड़ा था । स्केल बार्स = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 2
चित्रा 2: अलगाव और cryopreservation के बाद सीधे प्रसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना. कोशिकाओं 1 x 105 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से एक घनत्व पर संस्कृति थे । कई मार्कर टेप के जीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया गया था और साथ या एक प्रारंभिक cryopreservation के बिना संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं के बीच कोई अंतर नहीं पता चला । boxplot n = 3 के माध्य से पता चलता है । दो पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट, पी-मान शामिल हैं । यह आंकड़ा Baufeld और Vanselow16से reproduced है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: स्टेरॉयड हार्मोन एकाग्रता granulosa कोशिकाओं में अलग चढ़ाना घनत्व पर प्रसंस्कृत. एस्ट्राडियोल (E2) एकाग्रता में काफी कमी आई जब GC एक उच्च कोशिका घनत्व पर थे, जबकि प्रोजेस्टेरोन (पी 4) एकाग्रता केवल उच्च होने के लिए खड़ा था । हार्मोन एकाग्रता अलग सेल संख्या के लिए सामान्य करने के लिए डीएनए सामग्री के लिए ठीक किया गया था. n = 3 का मतलब है और SEM दिखाया जाता है । पी > ०.०५, दो पूंछ छात्र टीपरीक्षण । यह आंकड़ा Baufeld एट अल से reproduced है । 15. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: granulosa कोशिकाओं में कार्यात्मक कुंजी टेप की बहुतायत एक उच्च चढ़ाना घनत्व बनाम एक सामांय में प्रसंस्कृत । गोजातीय GC सीरम मुक्त शर्तों के तहत 8 डी के लिए प्रसंस्कृत कई चयनित मार्कर जीन के एक विशिष्ट विनियमन से पता चला । boxplot के माध्य प्रदर्शित करता है n = 3 व्यक्ति प्रतिकृति । p < ०.०५, दो-पुच्छ छात्र का t-परीक्षण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

प्रस्तुत सेल संस्कृति मॉडल एक उपकरण के लिए इन विट्रो मेंgranulosa सेल भेदभाव का विश्लेषण प्रदान करता है । कई अध्ययनों से पता चला है कि एक सीरम मुक्त खेती के लिए एक शर्त है कि कानूनी गोजातीय gc या अंय प्रजातियों8,9के जीसी में स्टेरॉयड गतिविधि बनाए रखने । इसके अतिरिक्त, extracellular मैट्रिक्स के घटकों के साथ संस्कृति पकवान कोटिंग (जैसे, कोलेजन आर)13, कोशिकाओं के लगाव काफी सुधार हुआ । एक अंय महत्वपूर्ण विशेषता लंबे समय तक संस्कृति अवधि है । हाल ही में, यह प्रदर्शित किया गया है कि एक दीर्घकालिक संस्कृति के लिए पर्याप्त steroidogenic गतिविधि और granulosa सेल पहचान मार्करों की एक संतुलित अभिव्यक्ति17प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । ऐसा लगता है कि GC अलगाव प्रक्रिया के दौरान शारीरिक तनाव से उबरने के लिए समय की आवश्यकता है ।

मीडिया की खुराक FSH, IGF-1, और androstenedione कल्चरल जीसी में aromatase गतिविधि पैदा करने के लिए जाना जाता है. विशेष रूप से, androstenedione के साथ पूरकता बिल्कुल आवश्यक है, के रूप में GC एस्ट्राडियोल संश्लेषण के लिए एक अग्रदूत की जरूरत है. यह पहले से प्रकाशित किया गया है11,18 और, इसलिए, आगे वर्तमान अध्ययन के दौरान जांच नहीं की गई । हालांकि, FSH के एक अनुकूलन, IGF-1, और androstenedione सांद्रता अन्य प्रयोगात्मक सेट अप के लिए आवश्यक हो सकता है.

यहां वर्णित cryopreservation तकनीक से अंडाशय के साथ बदलती आपूर्ति से उन्हें और स्वतंत्र बनाकर टिशू कल्चर प्रयोगों के संगठन को बेहतर बनाने में मदद मिल सकती है । पिछले परीक्षण के अनुसार, cryopreservation GC phenotype या स्टेरॉयड उत्पादन संस्कृति में प्रभावित नहीं करता है. इसके अलावा, प्रसंस्कृत कोशिकाओं में मार्कर टेप की बहुतायत महत्वपूर्ण पहले cryopreservation16के अधीन उन लोगों के साथ हौसले से पृथक कोशिकाओं से तैयार नमूनों की तुलना अंतर प्रकट नहीं किया ।

वर्तमान जीसी संस्कृति मॉडल के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर कोशिका चढ़ाना घनत्व है । के रूप में प्रतिनिधि परिणामद्वारा दिखाया गया है, चढ़ाना घनत्व बढ़ाने शारीरिक और आणविक विशेषताओं के उल्लेखनीय परिवर्तन प्रेरित किया । कई जीन एक विशिष्ट तरीके से विनियमित रहे हैं, परिवर्तन है कि vivo4,19में LH उत्तेजना द्वारा प्रेरित कर रहे है जैसी । तथ्य यह है कि एक बढ़ती सेल घनत्व भेदभाव ड्राइव कर सकते है संस्कृति गोजातीय gc में प्रक्रियाओं की तरह है सावधानी से इस में GC में विचार किया जाना है इन विट्रो मॉडल के बीच परस्पर विरोधी परिणामों से बचने के लिए दोहराने । इसलिए, अंय अध्ययनों के साथ विरोधाभासी परिणाम अलग सेल घनत्व के लिए जिंमेदार माना हो सकता है और अधिक बारीकी से जांच की जानी चाहिए ।

संस्कृति मॉडल यहां वर्णित गैर को LH के लिए उत्तरदाई हो, रिसेप्टर LHCGR के टेप के रूप में पता लगाने की सीमा के करीब हैं । इसलिए, एक जैसे LH वृद्धि का अनुकरण vivo स्थिति में 13विभेद पैदा करने में विफल रहा है । बहरहाल, इस मॉडल को एक उपयोगी उपकरण के लिए प्राथमिक संस्कृति में एस्ट्राडियोल-सक्रिय gc, विशेष रूप से कोई कार्यात्मक गोजातीय gc लाइनों वर्तमान में मौजूद के रूप में अध्ययन प्रदान करता है ।

विभिंन उपचार प्रोटोकॉल वर्तमान gc संस्कृति मॉडल है कि स्टेरॉयड उत्पादन या जीसी भेदभाव के विनियामक तंत्र को जानने में मदद में परीक्षण किया जा सकता है । इसके अलावा, एक कारक है कि विकास प्रक्रियाओं में शामिल कर रहे है अलग से विश्लेषण किया जा सकता है । इसलिए, इस संस्कृति मॉडल कई विभिंन अनुप्रयोगों के लिए एक आधार प्रदान करता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उसे उत्कृष्ट तकनीकी सहायता और स्थापित cryopreservation तकनीक और सेल संस्कृति मॉडल के सहायक संशोधनों के लिए वेरोनिका Schreiter धंयवाद । इसके अतिरिक्त, हम बाद में विश्लेषण में उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मरेन ऐंडर्स और Swanhild Rodewald शुक्रिया अदा करना पसंद करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ Merck-Millipore L 182-05 originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/mL) Merck-Millipore A 2213 originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
amphotericin (250 µg/mL) Merck-Millipore A 2612 originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
3 mL syringe (Omnifix Luer) Braun 4616025V
18 G needle Roth C724.1
fetal calf serum Merck-Millipore S 0115 originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
cryo-preservation vials (2 mL) TPP Faust TPP 89020
CoolCell LX cell freezing container Corning 432004
culture dish, 24-well, flat bottom TPP Faust TPP 92424
collagen R (0.2 %) Serva 47254
α-MEM Merck-Millipore F 0915 originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
L-Glutamin (200 mM) Merck-Millipore K 0282 originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
sodium bicarbonate Merck-Millipore L 1713 originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
BSA Sigma A3311
HEPES Merck-Millipore L 1603 originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
sodium selenite Sigma S9133 dissolved in sterile water
transferrin Sigma T1283 dissolved in sterile water
insulin (10 mg/mL) Sigma I0516 dissolved in 1x PBS
NEA Merck-Millipore K 0293 originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists
FSH Sigma F4021 we prefer to use a stock solution of 2 µg/mL, diluted in 0.9 % NaCl
LR3-IGF-1 Sigma I1146 we use a stock solution of 2 µg/mL, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/mL BSA
androstenedione Sigma 46033 we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol

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References

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