인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

* These authors contributed equally
Biochemistry
 

Summary

여기, 우리는 실험 프로토콜 바인딩 선호도 동시에 측정 하 여 고정된 고체 지원 bilayers (SLB)와 A2 annexin 레이블 없는 인지질-바인딩 단백질의 상호 작용의 모드를 결정 하기 위해 사용할 수 있는 현재는 대량 통풍 관 및 단백질 annexin a 2의 점 탄성 속성.

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Matos, A. L., Grill, D., Kudruk, S., Heitzig, N., Galla, H. J., Gerke, V., Rescher, U. Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator. J. Vis. Exp. (141), e58224, doi:10.3791/58224 (2018).

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Abstract

되는 낭비 적인 크리스털 중량 기술은 간단 하 고 레이블 없는 접근 방식을 동시에 통풍 관 및 점 탄성 물성 상호 작용의 측정을 허용 하는 센서 표면에 흡수/움직일 질량의 측정 단백질 지질 bilayers, 실시간에서 같은 단단한 지원 표면, 그리고 높은 감도. Annexins는 칼슘 이온의 조화를 통해 부정 청구 headgroups와 역 상호 작용 하는 인지질-바인딩 단백질의 높은 보존된 그룹. 여기, 우리가 양적 annexin a 2의 바인딩 분석을 고용 했다 프로토콜 설명 (AnxA2) 평면 지질 bilayers 석 영 센서의 표면에 준비를. 이 프로토콜 강력 하 고 재현할 수 데이터를 최적화 하 고 자세한 단계별 설명을 포함. 메서드는 다른 막 바인딩 단백질과 bilayer 작곡에 적용할 수 있습니다.

Introduction

세포 막에는 매우 역동적이 고 복잡 한 구조입니다. 막 지질, 함께 주변 및 integrally 관련된 막 단백질의 복합 혼합물 형태 microdomains를 조립 한다. 이러한 멤브레인 microdomains의 조정된 템포 공간 조직 주요 생리 적 프로세스1에 포함 된다. 막 microdomain 역학의 막 지질 작용 뿐만 아니라 인식 하 고 여기서는 microdomains에 농축 지질 주변 막 단백질의 능력에 의해 구동 됩니다. 특정 지질 단백질의 신규 모집은 종종 달성 을 통해 지질 인식 모듈, pleckstrin 상 동 (전화) 또는 C2 도메인2,3등. 생물 분석 방법 막 모델을 사용 하 여 분자 수준에서이 프로세스를 제어 하는 기본 원리를 이해 하는 열쇠는.

Annexins, 큰 multigene 가족, 캘리포니아2 +에서 부정 청구 막 지질, 주로 phosphatidylserine (PS), 바인딩할 그들의 능력에 대 한 잘 알려져 있습니다-제어 방식2. Annexin 가족의 두 번째 특징은 보존된 구조 세그먼트의 존재는 annexin 반복, 즉 현재 4 또는 8 시간 및 캘리포니아2 +-및 인지질 바인딩 사이트4항구. 캘리포니아2 +-종속 지질 상호 작용을 감지 하 고 전달 캘리포니아2 +완벽 한 위치에는 annexins를 배치-중재 대상 세포 막 신호. 일관 되 게, annexins microdomains 세포 및 인공 막 시스템5둘 다 콜레스테롤, phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (PI (4, 5) P2), 및 PS, 농축의 형성을 유발 할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 크리스털 중량 분산 (QCM-D)6,,78을 사용 하 여 annexin 막 상호 작용을 분석 하는 방법을 설명 합니다.

이 중량에 구성 하는 기본 요소는 진동 크리스탈 센서 표면 역할 이다. 흡착 및 바인딩 센서 표면에 분자의 질량에 있는 증가에 비례하여 공명 주파수 (f) 감소 합니다. 표면 균일 하 게 필름으로 코팅 되어, 추가 물질의 바인딩이이 계층의 구조적 무결성을 방해할 수 있습니다 그리고 점 탄성 (에너지 손실 계수 D)에서 이러한 변화는 또한 감시 될 수 있다. 이것은 지질 bilayers와 단백질의 상호 작용을 공부 하는 광범위 한 기술 이다. 이 방법에서는, 지질 소포는 적절 하 게 코팅된 센서 표면에 흡수 된다. 지질 bilayer 형성은 실리 카 기반 자료9,10, 유리한 소포 자주 하지 다른 친수성 표면에 파열 할 금11 UV 오존 노출, 티 오212또는 알 후 산화와 같은 2O313. 병합 vesicles의 파열 질량 및 분산 특성 변화를 선도 하는 수성 단계를 해제 합니다. 고체 지원 (SLB) bilayers 소포 융해에 의하여의 생성은 간단 하 고 강력한 고 모방 세포 막 복잡 한 모델을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.

되는 낭비 적인 크리스털 중량 레이블 및 중요 한 기술입니다. 주요 이점은 따라서 광범위 한 다양 한 연구 분야에 응용 프로그램을 제공 하는 표면에 충분히 박막을 생성 하는 어떤 물자 든 지 코트 가능성 이다. 단백질 막 상호 작용에서 관찰은 실시간, 그리고 결과 직접 분석할 수 있습니다. 동일한 센서 표면 (수행한 후 최소한의 청소이 프로토콜에서 설명), 후속 측정에 사용할 수 있습니다 따라서 정확한 내부 통제 및 analytes 사이 comparability에 대 한 허용.

Protocol

참고: 0.22 μ m 필터를 사용 하 고 1 시간에 대 한 진공에 의해 degassed 버퍼 필터링 할 합니다.

1. 지질 기 준비

  1. 2 mL 유리 튜브를 사용 합니다. 각 지질 분해 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (아빠), 그리고 클로 프롬의 혼합물에 (철), 콜레스테롤 / 메탄올 (50: 50 v/v) 분명 5mm 지질 솔루션을 준비 하. 클로 프롬/메탄올/물 (20:9:1 v/v)의 혼합물에 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol-4',5'-bisphosphate) (PI (4, 5) P2)을 용 해.
  2. POPC/팝 (80/20), POPC/PI (4, 5) P2 의 원하는 어 금 니 비율에서 녹은 지질 결합 (95/5), POPC/팝/철 (60/20/20), POPC/팝/PI (4, 5) P2/Chol (60/17/3/20), 및 POPC/DOPC/팝/PI (4, 5) P2/Chol (37/20/20/3/20) ( 표 1) 10 mL 유리 튜브.
    참고: 총 지질의 최종 금액은 500 µ g.
  3. 질소의 건조 스트림을 사용 하 여 유기 용 매를 증발. 3 h 용의 모든 잔여 자취를 제거를 위한 높은 진공 (동결은) 시스템에 지질 혼합물을 남겨 주세요.
    참고:이 결과 건조 분명 영화.
  4. 구 연산 염 버퍼 (10mm trisodium-시트르산, 150 m m NaCl, pH 4.6)의 1 mL에서 지질 필름을 resuspend. 물 목욕, 소용돌이에 30 분 동안 60 ° C (이 온도 약 10 ° C의 혼합물에서 높은 녹는 지질 위상 전환 온도 이상)에서 지질 정지를 품 어 그것은 적극적으로 모든 5 분.
    참고:이 대형, multilamellar 소포 (MLVs)의 형성 결과입니다. 전환 온도 이상 정지를 유지.
  5. 예 열 (이 경우에 60 ° C)에서 압출 기 30 분에 대 한 전환 온도 (이 여기는 40-50 ° C) 위에 50 nm 직경 구멍 크기 폴 리카 보 네이트 막 장착.
  6. MLV 정지 preheated 압출 기에 로드 하 고 부드럽게 작은 unilamellar 소포 (Suv)14를 폴 리 카보 네이트 막 통해 혼합물 31 x를 통과. 전이 온도 이상의 온도 유지.
  7. 2 mL 플라스틱 반응 배 SUV 정지 전송 및 구 연산 염 버퍼 추가 (단계 1.4 참조) 2 mL를 최종 볼륨을가지고.
    참고:이 250 µ g/mL의 최종 지질 농도 얻을 것입니다.

2. 처리 석 영 센서

참고: 항상 석 영 센서는 족집게를 처리 합니다.

  1. 4 품 어 센서 삽입에 ≥ 30 분 세척에 대 한 2 %SDS 솔루션에 소계 홀더 그들 광범위 하 게 완전히 제거 하는 SDS 고 그들이 말리 면 건조 아르곤 또는 질소의 스트림을 사용 하 여 매우 순수한 물으로.
  2. 플라즈마 클리닝 시스템을 사용 하 여 어떤 오염 물질을 완전히 제거. 플라즈마 청소 챔버에 건조 센서를 삽입 하 고, 챔버, 철수 하 고 그것을 플러시 산소와 3 배. 플라스마 설정에 청소기. 다음 프로세스 매개 변수를 사용 하 여: 1 x 10-4 Torr 압력, 높은 무선 주파수 (RF) 전력 및 프로세스 시간 10 분. 컴퓨터를 끄고 꺼내 센서.

3. 중량 작업

참고: 중량 시스템 병렬 구성, 연동 펌프에 연결 하 고 80 µ L/분의 유량으로 설정에 4 개의 온도 제어 흐름 챔버와 함께 사용 되었다. 오픈 흐름 모드에서 버퍼 받는 탱크로 급지대 저수지에서 펌핑 했다. 루프 모드에서 받는 탱크 폐쇄 루프를 생성 하는 피더 저수지와 연결 되었다. 온도 20 ° c.로 설정

  1. 신중 하 게 도킹 플라즈마 청소 센서 4 흐름 챔버에 핀셋을 사용 하 여. 어떤에 압력 또는 약 실 및 누수가 발생할 수 있는 튜브의 비틀림을 피하십시오.
  2. 시트르산 버퍼 (10mm trisodium-시트르산, 150 m NaCl, pH 4.6 m) 10 분 오픈 흐름 모드에서 시스템을 플러시.
    참고:이 버퍼의 정확 하 게 3.2 mL를 필요 하지만 그것은 버퍼 (10 mL) 초과 사용 하는 것이 좋습니다.
  3. 프로그램을 시작 합니다. 주파수와 첫 번째 기본 톤의 변경한 녹음을 시작 (n = 1) 및 상 음 (n = 3-13) 주파수와 소비 기준을 안정 될 때까지 소프트웨어를 사용 하 여 (이 약 40-60 분을 걸릴 것 이다).
    참고: 주파수 잡음 레벨 (피크-피크)는 0.1·10 보다 낮은 소비에 대 한, 그리고 0.5 Hz 보다 낮은 되어야 합니다.-6, 1/h 주파수 0.3·10의 (수 용액)에서 최대한 드리프트로 분산/h-6.
  4. 베이스 라인은 안정, 시트르산 버퍼 (2 mL 작은 관)에 SUV 정지 적용. 반응 배를 사용 하 여, 죽은 양의 1.5 mL를 제거 합니다. 다음 루프 흐름 모드에서 시스템을 닫습니다. 또 다른 10 분 동안 주파수/소비 변화를 기록 합니다.
    참고:이 기간 동안에 소포 SiO2 표면에 확산 되며 연속 bilayer15,16 ( 그림 1, 그림 2그림 3에서 단계 2)를 융합. 센서의 표면에 Suv 흡착 2 phasic 이며 전형적인 주파수 최소 및 최대는 분산에 있다. 26-29 Hz에서 (지질 구성)에 따라 특성 주파수 변화는 안정적인 새로운 주파수/분산 베이스 표면에 연속 bilayer를 나타냅니다 ( 표 1참조).
  5. SLB는 안정 (단계 3.4 참조) 시스템에 필요한 캘리포니아2 + 농도 (까지 50 µ M에서 최대 1 mM CaCl2, 실험에 따라)에 대 한 오픈 흐름 모드에서 실행 중인 버퍼 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4)을 equilibrate 40 분입니다.
  6. 단백질을 추가 (여기, AnxA2)는 실행 버퍼 포함 캘리포니아2 + (단계 3.5 참조). 평형 안정 상태 ( 그림 1, 그림 2그림 3의 3 단계)에 도달할 때까지 루프 흐름 모드에서 단백질의 응용 프로그램을 수행 합니다.
    참고: 단백질 농도 범위는 수 있습니다 1에서 400 nM. 단백질 흡착 반영 질량 (단백질) 흡착 농도 의존 주파수 변화에서 발생 합니다.
  7. 5 m m EGTA 오픈 흐름 모드 ( 그림 1그림 2에서 단계 4)에서 실행 중인 버퍼에 캘리포니아2 + 이온을 킬레이트 화 하 여 바인딩된 단백질을 분리.
    참고: 주파수의 분산 SLB 기준선을 복구 단백질 바인딩의 총 가역을 나타냅니다. 다른 농도 또는 단백질 비교 하 협회 분리 사이클을 반복할 수 있습니다.

4입니다. 중량 청소

참고: 각 측정 후 최소한의 청소 절차를 수행 합니다.

  1. 재생성 ddH2O 연속 오픈 흐름 모드에서의 50 mL와 중량 시스템, 물 컨테이너에서 튜브를 제거 하 고 건조를 실행 하는 시스템.
  2. 조심 스럽게 크리스탈 센서를 제거 하 고 2 %SDS 솔루션 소계 홀더를 사용 하 여 청소 (단계 2.1 참조).
  3. 센서 배치 했다 흐름 모듈 인테리어의 보이는 부분을 건조.
    참고: 일련의 10 측정 절차를 청소 집중적인을 수행 합니다.
  4. 세제와 확장 된 접촉에 대 한 20 µ L/분의 유량을 사용 하 여 연속 오픈 흐름 (튜브) 모드에서 40 ° C (소프트웨어에서 설치)에서 2 %SDS 솔루션 (50 mL) 시스템을 청소.
  5. DdH2O 160 µ L/min 흐름 속도로 연속 오픈 흐름 모드의 250 mL를 청소 합니다.
    참고: 4 개월 후, 제조업체의 설명서에 따라 광범위 한 청소 절차를 수행 합니다.

Representative Results

공 진 주파수 (δ)에서 감소 Sauerbrey 방정식에 의해 정의 된 흡착된 질량 (Δm)와 선형 방식에 연관 시킵니다. 17

Equation 1

여기, f 공명 주파수, Cf 는 주어진된 석 영과 공 진 주파수의 형상 및 물리적 특성에 의존 하는 상수 이며 A 센서 표면 영역입니다.

대부분의 응용 프로그램에서 흡착된 층 점 탄성 하지만 완전히 딱딱한 아니다. 석 영 센서 진동의 결과 감쇄 라고 하 분산 (D). 모니터링된 소비 변화 (ΔD) 바인딩된 대량18 점 탄성 속성을 연관 되며8을정의 다음과 같습니다.

Equation 2

여기, 전자방출 한 발진 기간 동안 손실 에너지 이며 자유롭게 진동 센서의 총 에너지는 전자저장 .

분석 하 고 바인딩 매개 변수를 계량, 주파수 등온선 평형 주파수 변화 (ΔΔfe) 단백질 농도 대 한 플롯에 의해 파생 됩니다. ΔΔfe 로 정의 됩니다.

Equation 3

여기, δt 1 는 단백질 흡착과 δt 2 평형 상태의 시작을 나타냅니다. 비선형 커브 피팅6,8다음과 같이 Langmuir 방정식의 언덕 확장을 사용 하 여 수행할 수 있습니다.

Equation 4

여기, ΔΔf최대 최대 (포화) 바인딩 결과로 단백질 농도의 ΔΔfe , Kd 는 복잡 한, 단백질/멤브레인에 대 한 명백한 분리 상수 이며 n은 언덕 계수.

힐 계수 (n) 바인딩의 cooperativity에 설명합니다. N = 1, 힐 흡착 모델은 간단한 Langmuir 등온선 (동등한 바인딩 사이트 및 모든 분자 바인딩할 서로 독립적으로 지질 bilayer). N ≠ 1, 바운드 ligand 바인딩 다른 ligands에 대 한 선호도 막 변경, 하나 (n > 1, 긍정적인 cooperativity)를 증가 또는 감소 (n < 1, 네거티브 cooperativity) 선호도.

그림 1 실험 워크플로 동안 캘리포니아2 +공명 주파수에 교대를 측정 하는 우리의 실험실에 있는 사용의 회로도 보여준다-종속 바인딩 및 액체 단계에 있는 지질 bilayer에 AnxA2의 릴리스. 모범적인 녹음은 그림 2에 표시 됩니다. 그림 2 A 주파수 곡선의 녹음 고 그림 2B 분산 교대. 리 (그림 2A [1 단계])의 추가 따라 주파수에 눈에 띄는 드롭 그들의 흡착을 나타냅니다. 때문에 버퍼 가득 vesicles은 딱딱한, 하지만 점 탄성, 고 소비 증가 (그림 2B [단계 1]). 그 후, 병합 소포 파열. 안정적인 고원 (그림 2A [2 단계])에 도달할 때까지 수 반하는 릴리스는 소포 내부 버퍼의 흡착된 질량을 감소 합니다. 메모의 소포 추가 결과 높은 소비 변화는 bilayer에 대 한 응답에 변화는 SLB (그림 2B [2 단계])의 경직 된 동질적인 특성으로 인해 훨씬 작은. 단계 그림 2A2B 기록 3 AnxA2의 바인딩 명확한 주파수 변화에 의해 보이는 것과 같이 질량을 추가 하지만 bilayer 구조와 방해 하지 않는, 지질, 소비에만 작은 변화에 의해 표시 된 대로. 캘리포니아2 + chelating 에이전트 EGTA (그림 1그림 2 [단계 4])에 의해 제거, AnxA2 지질 영화에서 dissociates. 소산 녹음 뿐만 아니라 주파수, AnxA2 바인딩 Ca에 완전히 의존을 나타내는 bilayer (비교 2 단계와 4 단계 그림 2A와 2B)와 본 수준에 이동2 + 와 그 지질 영화 그대로 남아 있습니다.

AnxA2, 가장 할 추 등 부정 청구 지질에 따라 annexins의 이것은 명확 하 게 볼 때 아빠는 결 석 지질 bilayer (그림 3)에서. 그림 3 A 주파수 곡선의 녹음 고 그림 3B 분산 교대. 참고-25 Hz에서 안정 된 기준 주파수 이동 아직 소실 되지 않습니다 적절 한 bilayer 형성 (그림 3B [단계 2]), 표시 변경. 그러나, 주파수 (그림 3A) 또는 분산 (그림 3B) 변경 후의 캘리포니아2 + (그림 3A3B [3 단계]) AnxA2의 추가 또는 EGTA (그림 관찰 된다 3A3B [단계 4]), AnxA2 지질 영화 상호 작용할 수 없습니다.

Figure 1
그림 1 : 실험 워크플로의 그래픽 모델. 이 워크플로 보여줍니다 친수성 센서 표면 (1 단계), 소포 흡수 기 퓨전/파열 SLB 형성 (2 단계), 및 캘리포니아2 +-종속 흡착 (3 단계) 및 AnxA2의 탈 착 EGTA 종속 (4 단계). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 2
그림 2 : 모범적인 녹음. 이러한 패널 표시 (A) 7 상 음 공명 주파수의 시간에 따른 모니터링 및 (B)는 분산 측정 중 석 영 센서의 교대. 리의 응용 프로그램 소비 기준 (1 단계) 증가 하는 반면 주파수 기준선의 급속 한 드롭을 하면 됩니다. 기준의 안정화 bilayer (2 단계)의 형성을 나타냅니다. AnxA2 (200 nM) 흡착 (존재 캘리포니아2 +) 포함 하는 POP 지질 bilayer에 분산, 지질 영화 불안정 하지 나타내는 (3 단계)를 크게 변경 하지 않고 대량 추가. 캘리포니아2 + chelation EGTA와 시 주파수 기준선의 복구 (단계 4) 단백질의 총 탈 착을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 는 AnxA2에 바인딩되지 않기 SLBs 아빠의 부재에서 보여주는 부정적인 제어 실험. 이러한 패널 리와 SLB 형성 (단계 1 및 2)의 추가 보여줍니다. AnxA2의 추가 후 변경 (A) 주파수 또는 (B) 소비는 명백한 (단계 존재 캘리포니아2 +3, 200 nM) 또는 EGTA (4 단계). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

구성 ΔΔF/Hz SLBs의 형성 후 ΔΔD * 10-6 SLB의 형성 후
POPC/팝
(80: 20)
26.3 ± 0.2 0.26 ± 0.03
POPC/PI (4, 5) P2
(95: 5)
26.5 ± 0.5 0.31 ± 0.02
POPC/팝/철
(60: 20: 20)
29.2 ± 0.2 0.45 ± 0.09
POPC/팝/PI (4, 5) P2/Chol
(60: 17: 3시 20분)
29.6 ± 0.6 0.43 ± 0.10
POPC/DOPC/팝/PI (4, 5) P2/Chol
(37: 20: 20: 3시 20분)
29.4 ± 0.4 0.39 ± 0.14

표 1: 지질 구성과 형성 데이터는 SLB의 7 .

Discussion

양적 및 질적으로 모두 세포 막의 구조-기능 관계에 관한 질문에 대답, 세포 생물학 생물 접근의 사용에서 대단히 잘 설립에 따라 이익과 널리 이용 되는 기법 원자를 포함 하 여 현미경 검사 법 (AFM), 표면 플라스몬 공명 (SPR), 고 QCM D 기술을 여기에 고용. 우리는 캘리포니아2 +에서 annexin 단백질 바인딩 이전 연구에서 보여주었다-높은 선호도와 고정된 막에 의존 방식으로. 우리가 사용 하는 주파수 및이 검출 감도 진동 안정성의 좋은 타협을 나타냅니다 때문에 소비 7 상 음 (Δf7)의 교대.

이 기술은 또한 막 단백질 상호 작용의 양적 설명을 허용합니다. 막에 AnxA2 바인딩 보존된 annexin 핵심 도메인에 의해 중재 되 고 콜레스테롤의 존재에 따라 긍정적인 cooperativity 특징 이다. AnxA2와 AnxA8에 보고 됩니다 위한 얻은 정량적 데이터 자세히 다른6,8.

이 프로토콜에는 많은 중요 한 단계가 있습니다. 에 리를 사용 하 여 즉시; 그렇지 않으면, 작은 소포 적은 표면 장력, 지질 bilayer 형성의 억제에 지도 함께 더 큰 소포에 융합 될 수 있습니다. 측정 하는 동안 일정 한 온도 유지 합니다. 온도 있는 작은 탈 각 하지 무시할 주파수와 소비 변화에 발생합니다. 공기 방울; 방지 그렇지 않으면, 시스템은 불안정 하 고 초기 계획을 설정 하지 않습니다.

Sauerbrey 방정식에는 관찰 된 주파수의 직접 변환 질량에서 변화에 변경 하 고, 따라서, 널리 사용 되는 수 있습니다. 그러나, 공 진 주파수에 변화 그리고 추가 질량 사이의 선형 상관 관계의 가정에만 센서 표면에 견고 하 고 균일 한 필름을 형성 하는 구성 요소에 대 한 진정한 보유. Sauerbrey 방정식 점 탄성 adsorbents 물 풍부한 단백질 영화, 통합 물, 지질 층 등에 사용할 수 없습니다 또는 심지어 세포를 흡착. 여기, 더 복잡 한 수학적 모델은 필요. 따라서, 동시에 주파수와 소비 변화를 모니터링 하는 매우 중요 하다. 측정 도중 구조적인 변화를 감지, δ 비율 ΔD 그릴 수 있습니다, 구조적 변경 나타내는 직선으로.

이 기술의 주요 장점은 기판으로 매우 광범위 한 재료를 사용 하는 가능성입니다. 또한, 그것은 안정적이 고 직접적인 방법은 더 단백질 지질 상호 작용 뿐만 아니라 표면 코팅 필름 (SLB), 등의 적절 한 형성으로 다양 한 고분자 상호 작용을 공부 하는 온라인으로 모니터링할 수 있습니다.

이 프로토콜 수에 적용 다른 상호 작용 하는 막 단백질, 예를 들어 도메인 단백질19, 바 막-골격 연계20,21에서에서 중요 한 역할은 ERM (ezrin, radixin, 및 moesin) 단백질 가족 ,22또는 C2 또는 PH 도메인을 포함 하는 단백질. 또한, 다양 한 생물 학적 자료를 공부이 기술의 응용 프로그램 성공적으로 게시 된, 따라서 QCM 더 복잡 한 고분자 어셈블리 또는 상호 작용을 공부 하기 적합된 실험 플랫폼으로 구축 23,24셀이 됩니다.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 보조금 SFB 858/B04, EXC 1003, SFB 1348/A04, 및 SFB 1348/A11 도이치 가운데에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Calciumchloride Merck 017-013-00-2 99%
Chloroform Roth 4432.1 99%
DOPC Avanti 850375P
EGTA PanReac AppliChem A0878 99%
HEPES PanReac AppliChem A1069
Methanol PanReac AppliChem A3493
PiP2 Avanti  850155P
POPC Avanti  850457P
POPS Avanti  840034P
Sodiumchloride PanReac AppliChem A1149
SDS Roth 183
Trisodium citrate PanReac AppliChem A3901
Equipment 
Extruder Liposofast Avestin
Qsense E4 Analyzer Qsense
QSense Dfind Qsense
Pump IPC 4 Ismatec ISM 930
QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm Qsense QSX 303
PC Membranes 0.05μm Avanti polar lipids 610003
OriginPro OriginLab Corporation Version 8 and 9

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References

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