Синтез, характеристика и применение суперпарамагнитных нанозондов оксида железа для обнаружения экстралегочного туберкулеза

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Для улучшения серологических диагностических тестов на антигены Mycobacterium tuberculosis, мы разработали суперпарамагнитные нанозонды оксида железа для выявления внелегочного туберкулеза.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lee, C. N., Chiu, L. H., Fang, C. L., Yeh, S. D., Zuo, C. S., Chen, S. C., Kuo, L. K., Wang, Y. M., Lai, W. F. T. Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection. J. Vis. Exp. (156), e58227, doi:10.3791/58227 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Молекулярный зонд визуализации, состоящий из наночастиц суперпарамагнитного оксида железа (SPIO) и поверхностных антител Mycobacterium tuberculosis (MtbsAb), был синтезирован для повышения чувствительности к визуализации для внелегочного туберкулеза (ETB). Нанозонд SPIO был синтезирован и спрячен с MtbsAb. Очищенный нанозонд SPIO-MtbsAb был охарактеризован с использованием TEM и NMR. Для определения способности к ориентации зонда, нанозонды SPIO-MtbsAb были инкубированы Mtb для анализа в пробирке изображений и введены в Mtb-inoculated мышей для исследования in vivo с магнитным резонансом (MR). Снижение контрастности на магнитно-резонансной томографии (МРТ) клеток Mtb и THP1 показало пропорционально концентрации нанозондов SPIO-MtbsAb. После 30 минут внутривенного инъекционного нанозонда SPIO-MtbsAb в зараженных МТБ мышей, интенсивность сигнала гранулематозного участка была увеличена в 14 раз в T2-взвешенных изображений MR по сравнению с теми, у мышей, получающих инъекции PBS. Нанозонды MtbsAb могут быть использованы в качестве нового метода обнаружения ETB.

Introduction

Во всем мире внелегочная туберкулезная (ВТБ) представляет собой значительную долю случаев заболевания туберкулезом (ТБ). Тем не менее, диагностика ETB часто пропущена или отложена из-за его коварного клинического представления и плохой производительности диагностических тестов; ложные результаты включают мазки косы отрицательные для кислотно-быстрых бацилл, отсутствие гранулематозной ткани на гистопатологии, или неспособность к культуре Mycobacterium туберкулеза (Mtb). По сравнению с типичными случаями, ETB встречается реже и включает в себя небольшое освобождение бацилл Mtb. Кроме того, он обычно локализован в труднодоступных местах, таких как лимфатические узлы, плевры и остеоартикулярные области1. Таким образом, инвазивные процедуры для получения адекватных клинических образцов, что делает бактериологическое подтверждение рискованным и трудным, необходимы2,3,4.

Коммерчески доступные тесты на обнаружение антител для ETB ненадежны для клинического обнаружения из-за их широкого диапазона чувствительности (0.00-1.00) и специфичности (0.59-1.00) для всех внелегочных участков в сочетании5. Фермент-связанные иммунопоза (ELISPOT) анализы интерферона-Я, культуры фильтровного белка (CFP), и раннего секреторного антигенного целевого (ESAT) были использованы для диагностики скрытого и активного туберкулеза. Тем не менее, результаты варьируются между различными местами заболевания для диагностики ETB6,7,8. Кроме того, PPD кожи (очищенный производный белок) и Квантиферон-ТБ часто давали ложные отрицательные результаты9. Квантиферон-ТБ-2G является анализ иммунной реакции всей крови, которая не требует образца из пораженного органа, и это может быть альтернативный диагностический инструмент6,10,11. Другие диагностические методы, обычно используемые при туберкулезном менингите, такие как полимераза цепной реакции, все еще слишком нечувствительны, чтобы уверенно исключить клинический диагноз12,13. Эти обычные тесты демонстрируют недостаточную диагностическую информацию для обнаружения места экстралегочной инфекции. Таким образом, клинически необходимы новые диагностические условия.

Молекулярная визуализация направлена на разработку новых инструментов, которые могут непосредственно экран конкретных молекулярных целей болезни процессов in vivo14,15. Суперпарамагнитный оксид железа (SPIO), T2-взвешенный контрастный агент NMR, может значительно повысить специфичность и чувствительность магнитно-резонансной (МР) визуализации (МРТ)16,17. Эта новая функциональная модальность визуализации может точно эскиз тканей изменения на молекулярном уровне через лиганд-рецепторов взаимодействий. В этом исследовании, новый молекулярный зонд изображения, включающий наночастицы SPIO, был синтезирован для сопряжения с антителами поверхности Mtb (MtbsAb) для диагностики ETB. НАнозонды SPIO минимально инвазивны в тканях и телах, намизиваемых18,19. Кроме того, эти нанозонды могут демонстрировать точные изображения MR при низких концентрациях из-за их парамагнитных свойств. Кроме того, нанозонды SPIO вызывают наименьшие аллергические реакции, потому что наличие ионов железа является частью нормальной физиологии. Здесь чувствительность и специфичность нанозондов SPIO-MtbsAb, нацеленных на ETB, оценивалась как в моделях клеток, так и в животных моделях. Результаты показали, что нанозонды применимы в качестве ультрачувствительных средств визуализации для диагностики Эбб.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Весь протокол, касающийся эксперимента на животных, соответствует стандартным эксплуатационным процедурам для лабораторного животноводства в соответствии с Национальными институтами медицинских руководящих принципов по уходу и использованию лабораторных животных (8-е издание, 2011) и одобрен институционального комитета по уходу за животными и использованию.

1. Синтез наночастиц SPIO

  1. Приготовьте dextran-покрытием магнитных наночастиц оксида железа, энергично перемешивая смесь декеспна Т-40 (5 мл; 50% ж/ч) и ваковая решения FeCl3No6H2O (0,45 г; 2,77 ммоль) и FeCl2No4H2O (0,32 г; 2,52 ммоль) решения при комнатной температуре.
  2. Добавить NH4OH (10 мл; 7,5% v/v) быстро.
  3. Далее перемешать черную подвеску на 1 ч; впоследствии, центрифуга на 17300 х г в течение 10 мин, а затем удалить агрегаты.
  4. Отделить окончательные продукты SPIO от несвязанного dextran Т-40 по гель фильтрации хроматографии20.
  5. Загрузите реакционную смесь (общий объем 5 мл) в столбец 2,5 см и 33 см и утяните буферным раствором, содержащим 0,1 М На ацетат и 0,15 М NaCl при рН 7,0.
  6. Соберите очищенный dextran-покрытием оксида железа магнитных наночастиц в объеме пустоты и просеете колонки eluates для железа и dextran на 330 и 490 nm с помощью соляной кислоты и фенол / серная кислота методы20, соответственно.

2. Синтез SPIO-MtbsAb

  1. Синтезировать SPIO-конъюгированный EDBE с использованием ранее сообщалось методы21,22.
  2. Синтезировать СПИО-EDBE-succinic ангидрид (SA).
    1. Перемешать щелочный раствор (5 МН НаО; 10 мл)) SPIO-EDBE и SA (1 г; 10 моль) при комнатной температуре 24 ч.
    2. Диализ раствор с 20 изменениями 2 л дистиллированной воды с помощью молекулярных пористых мембранных труб (12000-14000 МВт отсечения). 6 ч для каждого изменения.
  3. Наконец, добавьте 100 л SPIO-EDBE-SA (4 мг/мл Fe) до 400 л 4,5 мг/мл MtbsAb для синтеза SPIO-MtbsAb с помощью 1-гидроксибензотриазол и (бензотриазол-1-yloxy) трипирролидинофосфоний гексафторфат в качестве катализаторов и перемешать раствор при комнатной температуре в течение 24 ч.
  4. Наконец, отделить растворы от несвязанных антител через гель фильтрации хроматографии.
  5. Загрузите реакционную смесь (5 мл) на 2,5 см и 33 см колонки и выщелажните с помощью буфера PBS. Подтвердите Ab-nanoparticle комплекс (т.е., нанозонд) с помощью бисинхониновой кислоты белка анализ комплект23.

3. Наблюдение морфологии частиц и измерение уровня релаксации

  1. Изучите средний размер частиц, морфологию и распределение размеров с помощью электронного микроскопа передачи при напряжении 100 кВ.
    1. Drop-cast композитной дисперсии на 200-сетки медной сетки и сухой воздух при комнатной температуре перед загрузкой его на микроскоп.
  2. Измерьте значения времени релаксации(T1 и T2) нанозондов с помощью релаксометра ЯМР при 20 МГц и 37,0 градуса по Цельсию и 0,1 градуса по Цельсию.
    1. Калибровать релаксометром перед каждым измерением.
    2. Запишите значения r1 и r2 из восьми точек данных, генерируемых путем инверсии-восстановления, и последовательность импульса Carr-Purcell-Meiboom-Gill, соответственно, чтобы определить r1 и r2 relaxivities20.

4. Клеточная визуализация

  1. Культивировать человеческие моноциты THP-1 в RPMI 1640 с 10% плода бычьей сыворотки, 50 мкг/мл гентамицин сульфат, 100 единиц / мЛ пенициллин G натрия, 100 мкг сульфата стрептомицина, и 0,25 мкг /мЛ грибизон в 5% CO2 intor.
  2. Инкубировать нанозонды SPIO-MtbsAb (2 мм) с 106 колониями, образующими единицы (CFU) Mycobacterium bovis BCG, предварительно инкубационные с 1 и10 активированными моноцитами в микроцентрифуговых трубках (1 мл) в 5% CO2 инкубаторе при 37-C на 1 ч.
  3. Центрифуговых трубок на 200 х г и отбросить супернатант. Рерастворите гранулы в среде (200 л).
  4. Сканирование образцов с помощью быстрой градиентной последовательности импульса эхо (время повторения (TR) 500; Эхо-время (TE) - 20; Угол флитора - 10 евро) через 3,0-T МРТ, чтобы определить специфичность и чувствительность нанозонда21,22.

5. БКГ (Бацилла Кальметт-Герин) прививка

  1. Восстановите лиофилизированную вакцину или бактериальный запас в среде Sauton, а затем разбавить запас сольным раствором до тех пор, пока должным образом не рассеется, как ранее описано24.
  2. Прививать живой ослабленный штамм M. bovis BCG, полученный из ADIMMUNE (Тайбэй, Тайвань) (Коннот штамм; ImmuCyst Aventis, Пастер Мерье) на объеме 0,1 мл / мышь (т.е., 107 CFU) intradermally в левую или правую царскую лопатку scapular кожи мышей, как описано ранее23. Вводят солин в мышей в качестве отрицательного контроля. Мониторинг животных ежедневно после прививки BCG.
  3. Пожертвование животных через месяц после прививки бактерий с использованием эвтаназии углекислого газа. Урожай ткани из интрейдермальной прививки сайта. Исправить ткани в 10% формалин и вставлять в парафин для серийных разделов на 5-10 мкм. Пятно ткани разделов с гематоксилин / эозин и Зиэль-Нилсен пятна для кислотно-быстрых бактерий24 и с Берлин синий для железа25.

6. In vivo МРТ

  1. Вводят кетамин (80 мг/кг массы тела) и ксилазин (12 мг/кг массы тела) подкожно в мышей для анестезии животных.
  2. Впрыскивать зонды SPIO-TbsAb (2 нмоль/200 л) в хвостовые вены мышей. MR изображения мышей до и сразу после инъекции зонда, а затем каждые 5 минут в течение 30 минут, чтобы приобрести T2-взвешенных быстрых спи-эхо изображений (TR 3000; ТЕ No 90; поле зрения No 8).
  3. Количественно анализировать все Изображения Mr с помощью интенсивности сигнала (SI), измерения определенных регионов, представляющих интерес в сопоставимых местах центра Грануломы Mtb и мышцы спины, прилегающей к гранулематозной области.
  4. Рассчитайте относительные улучшения сигнала с помощью измерения SI до (SIpre; контроль) и 0-3 ч после (SIpost) инъекции контрастных агентов с использованием формулы

    (SIpost - SIpre)/SIpre

    где SIpre является SI поражения на предварительно расширенном сканировании и SIpost является SI поражения на пост-улучшенной сканирования21,22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Синтез и характеристика нанозонда SPIO-MtbsAb
Наночастицы SPIO были разработаны для сопряжения с MtbsAb. Декстран стабилизировался на поверхности наночастиц SPIO, был перекрестным эпиглухохидрином. Наночастицы SPIO были впоследствии включены в EDBE для активации первичных функциональных групп амина на деквенских концах. Затем SA была сопряжена с spiO-EDBE-SA. Нанозонды SPIO-MtbsAb образовались на последнем этапе через спряжение MtbsAb с SPIO-EDBE-SA в присутствии связующих агентов. Изображение tEM нанозондов SPIO-MtbsAb(рисунок 1)показывает, что нанозонды SPIO-MtbsAb имели хорошо рассеянный вид. Средний размер ядра нанозонда SPIO-MtbsAb составил 3,8 и 0,4 нм (200 расчет частиц).

В ваквомом растворе значения релаксивности, r1 и r2,из нанозондов были 23 и 151 и 8 мМ-1s-1, соответственно, при 20 МГц и 37,0 C и 0,1 C. R 1/r2 соотношение нанозондов SPIO-MtbsAb было похоже на соотношение Резовиста; однако, r1 и r2 Resovist (26 и 164 mM-1s-1, соответственно) были несколько выше, чем у нанозондов SPIO-MtbsAb.

Характеристика и визуализация нанозондов in vitro SPIO-MtbsAb
Во-первых, мы обнаружили M. bovis BCG, кислотно-быстрые бактерии, через окрашивание Зил-Нилсена(рисунок 2A). Бактерии были изолированы, а затем культивируется с зондами, содержащими железо, идентифицируемые через Берлин синий окрашивания (Рисунок 2B). Mtb-таргетинг степени SPIO-MtbsAb нанозонд был определен с помощью T2-взвешенный МРТ; отрицательное повышение было пропорционально количеству зондов, прикрепленных к бактериальной клетке. Снижение СИ в присутствии нанозондов произошло в концентрационно-зависимом порядке(рисунок 2С). На 2, 1 и 0,5 мм, нанозонды, спряченные с Mtb выставлены SIs 97,67 и 3,05, 131,67 и 4,51, и 257,33 и 5,03, соответственно, все выше SI 90,75 и 2,47 для 1 Мм неконъюгированных нанозондов. По сравнению с PbS (СИ No 1073,43 и 13,62), почти никакого снижения сигнала не было отмечено только в группе ТБ (СИ No 957,33 и 12,53). Таким образом, зонды SPIO специально нацелены на бациллы Mtb; кроме того, на улучшенных изображениях МР, СИ уменьшилась с увеличением количества наночастиц SPIO.

Аналогичным образом, снижение СИ на улучшенных МР-изображениях было отмечено на 1 ч после культивирования моноцитов THP-1 с помощью нанозондов. Значительное снижение СИ группы ТБ было отмечено при 1 мМ (СИ No 225,33 и 8,58) и 2 мМ (СИ No 104 и 2,16) концентрации нанозондов были использованы по сравнению с группами, управляемыми только с PBS (СИ No 1005,33 и 16,74) или не вводились с нанопрозондами obe (СИ No 991 и 8,98). Снижение МРТ СИ в группах Mtb для 1 и 2 мМ нанозондов было сопоставимо с тем, что в положительной группе нанозонда 1 мМ (SI 112.33 и 3.68). Согласно вышеуказанным результатам, нанозонды SPIO-MtbsAb могли бы помочь в мониторинге контрабанды моноцитов THP-1, активированных нанозондами.

Нанозонд in vivo SPIO-MtbsAb
После визуализации клеток мы определили эффективность In vivo МРТ для ETB. Нанозонды SPIO-MtbsAb были внутривенно введены инфицированным мышам, инфицированным МТБ. Четко обнаруживаемый сигнал Mr был отмечен в области Mtb granulomatous 0.5 h после инъекции; однако, самый высокий SI к фону наблюдался после 1 ч инъекции. Значительное снижение мр сигнализации было отмечено в области Mtb granulomatous(рисунок 3). SI измерялся до (SIpre) и после (SIpost) инъекции контрастного агента. Через час после инъекции зонда, T2-взвешенное повышение снижения сигнала на Гранулуматозных областях Mtb(рисунок 3B) было примерно в 14 раз выше, чем на контрольных участках(рисунок 3A;-1,68% и -23,43% и 7,24%; р Злт; 0,001).

Гистологическая и иммуногистохимическая оценка нанозондов SPIO-MtbsAb
Подкожная гранулема была разработана через месяц после заражения у мышей C57BL/6. Новая васкуляризация крови была отмечена в этих поражениях наряду с лимфоцитами и эпителиоидно-макрофаговых агрегатами. Организованная гранулема постепенно росла(рисунок 4А). Корреляция поражений туберкулеза с сигналами SPIO-MtbsAb MR была дополнительно определена через иммуногистохимическую реакцию поверхностного антигена Mtb с анти-MtbsAb. Положительное выражение MtbsAb было выявлено в гранулеломатных областях(Рисунок 4B), с кислотно-быстрой бациллы окрашивающей положительный на месте поражения (Рисунок 4C). Берлин синий, железо-положительное пятно, был использован для определения чувствительности зондов к Mtb. Берлин сине-положительный зонд SPIO был найден в том же месте, как MtbsAb (Рисунок 4D). Все колокализованные пары были показаны на рисунке 4A-D.

Figure 1
Рисунок 1: Средний размер ядра нанозондов SPIO-MtbsAb в TEM. Средний размер ядра нанозонда SPIO-MtbsAb составил 3,8 и 0,4 нм, измеренного с помощью анализа изображений TEM (200 расчет частиц). Шкала бар 15 нм. Эта цифра была изменена из нашего предыдущего исследования26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: В пробирке характеристика нанозонда SPIO-MtbsAb. Кислотно-быстрые бациллы идентифицируются через (A) Циль-Нилсен окрашивания и (B) спряжение железа нанозонд а бактерий, выявленных через Берлин синий окрашивания. (C) T2-взвешенный МРТ отображения отрицательного повышения после SPIO-MtbsAb нанозонды инкубируются с Mtb. Устранение СИ возникающих дозы-зависимо после включения нанозондов с Mtb: (1) 90,75 и 2,47 (1,0 мм зонд); (2) 97,67 и 3,05 (Mtb 2,0 мМ зонд); (3) 131,67 и 4,51 (Mtb 1,0 мМ зонд); (4) 257.33 и 5.03 (Mtb й 0.5 mM зонд); (5) 957.33 и 12.53 (Mtb 0 mM зонд); (6) 1073.43 и 13.62 (PBS). В контрольной группе PBS не отмечено заметное обнаружение сигнала. (D) Доза-зависимых отрицательное повышение в THP-1 моноцитов 1 ч после инкубации с нанозондами. Шкала баров в (C) и (D) 5 мм. Эта цифра была изменена из нашего предыдущего исследования26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Нанозонды Vivo SPIO-MtbsAb при подкожных поражениях ETB мыши C57BL/6. (A) Контроль и (B) Mtb гранулематозных областях. Значительное 14-кратное сокращение мр сигнализации находится в mtb гранулематозных областях по сравнению с контрольными областями 1 ч после введения зонда (-1,68% и 1,32% против -23,43% и 7,24%, стр. 0,001). Результаты даются в качестве средства SDs. Статистические сравнения использовали двуххвостые студенческая t-тесты. p злт; 0,05 считалось значительным. Эта цифра была изменена из нашего предыдущего исследования26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Корреляции гистологии, иммуногистохимии, кислотно-быстрого и берлинского синего окрашивания. Гистология МТБ гранулеломатных областей преимущественно демонстрирует лимфоциты и эпителиоидные макрофаги. Неоваскуляризация и обильная агрегация лимфоцитов и эпителиоидных макрофагов наблюдаются в этих поражениях. (A)Организованные гранулемы появляются развиваться постепенно. (B) Иммуногистохимические пятна, демонстрирующие выражение MtbsAb в гранулеломатных поражений, в то время как (C) кислотно-быстрые бациллы разбросаны в тех же областях. (D) Берлин синий окрашивая spiO зонды находятся в colocalized MtbsAb областях. Берлин ское синее окрашивание для железа демонстрирует спряжение зонда к Mtb. Шкала баров 100 мкм. Эта цифра была изменена из нашего предыдущего исследования26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Как и в соответствующих исследованиях, наши выводы относительно нанозондов SPIO-MtbsAb продемонстрировали значительную специфичность для Mtb27,28. Подкожная гранулема Mtb была обнаружена через месяц после инъекции туберкулеза в моделях мыши. Типичные результаты гистологии туберкулеза включали инфильтрацию лимфоцитов, наличие эпителиоидных макрофагов и неоваскуляризацию. Кислотно-быстрые бациллы были рассеяны в поражениях туберкулеза, подтверждающие выводы иммуногистохимии MtbsAb. Это указывает на иммунологическую реакцию между поверхностным антигеном Mtb и MtbsAb. Берлинский синий подчеркнул те же области с MtbsAb, подтверждая специфику зондов для спряжения с кислотно-быстрым Mtb.

Примечательно, что степень отрицательного повышения контрастности на МРТ для Mtb и моноцитарных клеток THP1 была пропорциональна концентрации нанозондов SPIO-MtbsAb. Когда мышам с Mtb granulomas вводили нанозонды SPIO-MtbsAb, 14-кратное снижение сигнала на гранулематозном участке было отмечено на T2-взвешенных изображениях MR по сравнению с противоположным участком с инъекцией PBS. Это указывает на значительное накопление контрастного агента. Полученные результаты демонстрируют возможность получения специфической таргетинга контрастного агента, что может снизить дозу для клинической диагностики.

Наши результаты показывают, что эти нанозонды накапливают обнаруживаемый объем при грануломатоусных поражениях Mtb. Эти результаты могут быть подтверждены путем разработки нанозонда SPIO с использованием анти-hMtbsAb. Поскольку магнитное ядро оксида железа SPIO было применено для индуцирования t2 сокращения контрастных агентов МРТ, результаты предлагают практический и неинвазивный подход к выявлению аналогичного поведения клеток для клинического применения диагностики.

Здесь мы предоставляем протокол, состоящий из 2 частей: разделы от 4 до 6 являются клеточными и изображениями животных. Методы охватывают культивирование клеток, эксперименты на животных и оптическую визуализацию. Разделы от 1 до 3 являются зондсинтезами. Некоторые критические шаги помогут воспроизвести эксперимент. Критическим шагом синтеза наночастиц SPIO является подготовка магнитных наночастиц оксида железа с деквентом покрытием; очень важно энергично перемешать и полностью смешать dextran T-40, aqueous FeCl3-6H2O, и FeCl2-4H2O решений при комнатной температуре. Критическим шагом для раздела 2, синтез SPIO-MtbsAb, является совмещение MtbsAb с SPIO-EDBE-SA для синтеза SPIO-MtbsAb. Для выбора соответствующих катализаторов и адекватно перемешать раствор при комнатной температуре также имеют решающее значение. И критический шаг для раздела 3, наблюдение морфологии частиц и измерения уровня релаксации, является калибровка релаксометром перед каждым измерением. Для точного расчета размера зондов, калибровка релаксометры также имеет решающее значение.

В этом исследовании были использованы M. bovis BCG и кролик анти-Mtb. Перекрестная активность бычьего и кроликов была сочтена мягкой, хотя данные доказали, что MtbsAb-конъюгированный SPIO показал сильное взаимодействие с M. bovis BCG. Наш вывод показал, что нанозонды SPIO нацелены на ТБ в частности. Инкубация нанозондов и бактерий Mtb показала отрицательное повышение способ дозы-зависимо, в то время как снижение повышения наблюдается для SPIO нанозондов на МРТ коррелирует с существованием частиц SPIO. На основе наших данных, дальнейшие исследования для изучения возможных подходов к спряжению антител для повышения специфичности нанозонда будет приветствоваться.

Предыдущие исследования показывают, что SPIO показывает минимальную цитотоксичность без изменения активности клеток в концентрации, используемой в этом исследовании29,30. В согласии с предыдущими исследованиями, наши результаты продемонстрировали минимальное влияние нанозондов SPIO на клетки THP-1. Клетки THP-1 инкубировались нанозондами SPIO с спряжением бактерий в течение 1 часа. SI представил значительное снижение в группах Mtb с концентрацией 1 мМ или 2 мМ нанозондов, по сравнению с контрольной группой без лечения нанозондов или PBS в одиночку. Результат поддерживает безопасность нанозонда SPIO, и больше изучений применяя другие бактериальные нагрузки для того чтобы утвердить чувствительность nanoprobe радушно.

Одним из ограничений нашего исследования было то, что мы не количественно биораспределения нанозонда SPIO-MtbsAb у мышей. Кроме того, мы не исследовали внутрисосудистое полувремя и осаждение печени нанозонда, что может изменить время разоблачения зондов для клеток THP-1, расположенных на повреждениях Mtb. Необходимы дальнейшие исследования в области биодеградации. Кроме того, МРТ не может дифференцировать ли SPIO нанозонды могут специально связываться с бактериями или моноцитами или же эти зонды были эндоцитоза.

В заключение мы разработали четкий и осуществимый протокол для подготовки и характеристики биосовместимых нанозондов SPIO-MtbsAb. Эти нанозонды гидрофильные и хорошо расходятся в физиологических условиях; они минимально цитотоксичен при низких концентрациях. Кроме того, эти нанозонды SPIO-MtbsAb позволяют нацеливаться и обнаруживать инфекцию Mtb, о чем свидетельствуют наши исследования in vitro и in vivo. Таким образом, нанозонды SPIO-MtbsAb могут быть применены в качестве контрастных агентов МРТ для обнаружения ETB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ни один из авторов не имеет никакого проприетарного интереса к материалам, рассмотренным в данном исследовании.

Acknowledgments

Авторы благодарны за финансовую поддержку со стороны Министерства экономики Тайваня (гранты НСК-101-2120-М-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) для выполнения этой исследовательской работы. Эта рукопись была отредактирована Уоллес академическим редактированием.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Sigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazole Sigma-Aldrich
dextran(T-40) GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrate Fluka
ferrous chloride tetrahydrate Fluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCG Pasteur Mérieux Connaught strain; ImmuCyst Aventis
MRI GE medical Systems 3.0-T, Signa
NH4OH Fluka
NMR relaxometer Bruker NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300 GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25 GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off Spectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb Acris Antibodies GmbH BP2027
transmission electron microscope JEOL JEM-2000 EX II

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Small, P. M., et al. Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection. New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).
  2. Alvarez, S., McCabe, W. R. Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review of experience at Boston City and other hospitals. Medicine. 63, Baltimore. 25-55 (1984).
  3. Ozbay, B., Uzun, K. Extrapulmonary tuberculosis in high prevalence of tuberculosis and low prevalence of HIV. Clinics in Chest Medicine. 23, 351-354 (2002).
  4. Ebdrup, L., Storgaard, M., Jensen-Fangel, S., Obel, N. Ten years of extrapulmonary tuberculosis in a Danish university clinic. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 244-246 (2003).
  5. Steingart, K. R., et al. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Postgraduate Medical Journal. 83, 705-712 (2007).
  6. Liao, C. H., et al. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease. Journal of Infection. 59, 402-408 (2009).
  7. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis. Archives of Internal Medicine. 167, 2255-2259 (2007).
  8. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. The American Journal of Medicine. 122, 189-195 (2009).
  9. Pai, M., Zwerling, A., Menzies, D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Annals of Internal Medicine. 149, 177-184 (2008).
  10. Kobashi, Y., et al. Clinical utility of a T cell-based assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Respirology. 14, 276-281 (2009).
  11. Paluch-Oles, J., Magrys, A., Kot, E., Koziol-Montewka, M. Rapid identification of tuberculosis epididymo-orchitis by INNO-LiPA Rif TB and QuantiFERON-TB Gold In Tube tests: case report. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 66, 314-317 (2010).
  12. Kaneko, K., Onodera, O., Miyatake, T., Tsuji, S. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (PCR). Neurology. 40, 1617 (1990).
  13. Bhigjee, A. I., et al. Diagnosis of tuberculous meningitis: clinical and laboratory parameters. International Journal of Infectious Diseases. 11, 348-354 (2007).
  14. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. Suppl 1-7 (2003).
  15. Weissleder, R., Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology. 219, 316-333 (2001).
  16. Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
  17. Talelli, M., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated in biodegradable thermosensitive polymeric micelles: toward a targeted nanomedicine suitable for image-guided drug delivery. Langmuir. 25, 2060-2067 (2009).
  18. Cho, W. S., et al. Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging. Toxicology and Applied Pharmacology. 106-115 (2009).
  19. Mahmoudi, M., Simchi, A., Milani, A. S., Stroeve, P. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, 510-518 (2009).
  20. Chen, T. J., et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87, 165-175 (2008).
  21. Chen, T. J., et al. Targeted Herceptin-dextran iron oxide nanoparticles for noninvasive imaging of HER2/neu receptors using MRI. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 14, 253-260 (2009).
  22. Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175, 494-498 (1990).
  23. Wang, J., Wakeham, J., Harkness, R., Xing, Z. Macrophages are a significant source of type 1 cytokines during mycobacterial infection. Journal of Clinical Investigation. 103, 1023-1029 (1999).
  24. Angra, P., Ridderhof, J., Smithwick, R. Comparison of two different strengths of carbol fuchsin in Ziehl-Neelsen staining for detecting acid-fast bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 41, 3459 (2003).
  25. Woods, A. E., Ellis, R. Laboratory Histopathology- A Complete Reference. 1st edn. Churchill Livingstone. 6-11 (1994).
  26. Lee, C. N., et al. Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles for use in extrapulmonary tuberculosis diagnosis. Clinical Microbiology and Infection. 18, 149-157 (2012).
  27. Lee, H., Yoon, T. J., Weissleder, R. Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5657-5660 (2009).
  28. Fan, Z., et al. Popcorn-shaped magnetic core-plasmonic shell multifunctional nanoparticles for the targeted magnetic separation and enrichment, label-free SERS imaging, and photothermal destruction of multidrug-resistant bacteria. Chemistry. 19, 2839-2847 (2013).
  29. Nishie, A., et al. In vitro imaging of human monocytic cellular activity using superparamagnetic iron oxide. Computerized Medical Imaging and Graphics. 31, 638-642 (2007).
  30. von Zur Muhlen, C., et al. Superparamagnetic iron oxide binding and uptake as imaged by magnetic resonance is mediated by the integrin receptor Mac-1 (CD11b/CD18): implications on imaging of atherosclerotic plaques. Atherosclerosis. 193, 102-111 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics