סינתזה, אפיון, ויישום של Nanoprobes תחמוצת ברזל Superמגנטית לאיתור שחפת הריאות חוץ

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כדי לשפר בדיקות אבחון סרולוגית עבור אנטיגנים שחפת של פטרת , פיתחנו superparamagnetic ברזל תחמוצת הnanoprobes כדי לזהות שחפת הריאות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lee, C. N., Chiu, L. H., Fang, C. L., Yeh, S. D., Zuo, C. S., Chen, S. C., Kuo, L. K., Wang, Y. M., Lai, W. F. T. Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection. J. Vis. Exp. (156), e58227, doi:10.3791/58227 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הדמיה מולקולרית בדיקה הכוללת מתכת ברזל superparamagnetic (SPIO) חלקיקים ונוגדן פטרת פני השטח של שחפת (MtbsAb) היה מסונתז כדי לשפר את רגישות ההדמיה עבור שחפת הריאות חוץ (etb). Nanoprobe SPIO היה מסונתז ומצועם עם MtbsAb. SPIO-MtbsAb nanoprobe מטוהרים התאפיין באמצעות TEM ו NMR. כדי לקבוע את היכולת המיקוד של החללית, SPIO-MtbsAb nanoprobes היו מודבטים עם Mtb עבור הדמיה מלאכותית ומוזרק לתוך עכברים Mtb-מחוסן עבור בחקירת vivo עם תהודה מגנטית (MR). הפחתת שיפור הניגודיות על דימות תהודה מגנטית (MRI) של תאים Mtb ו THP1 הראו ביחס לריכוז SPIO-MtbsAb nanoprobe. לאחר 30 דקות של הזרקה SPIO-MtbsAb nanoprobe לתוך עכברים נגועים Mtb, עוצמת האות של האתר גרגירומי היה משופר על ידי 14-קיפול ב-T2 תמונות משוקלל MR לעומת זאת בעכברים מקבל הזרקת PBS. Nanoprobes MtbsAb יכול לשמש כמודאליות הרומן עבור זיהוי ETB.

Introduction

באופן גלובלי, שחפת מחוץ לריאות (ETB) מייצגת שיעור משמעותי של מקרי שחפת (TB). עם זאת, האבחון ETB הוא החמיץ לעתים קרובות או מתעכב בגלל המצגת הקליני חתרני שלה ביצועים ירודים על בדיקות אבחון; תוצאות כוזבות כוללות רוק סמארים שליליים עבור חומצה-באקל מהיר, חוסר של רקמת גרגירואיד על histopathology, או כישלון בתרבות שחפת בתרבית (Mtb). ביחס למקרים טיפוסיים, ETB מתרחשת בתדירות נמוכה יותר וכרוכה שחרור קטן של Mtb bacilli. בנוסף, הוא מותאם בדרך כלל באתרים קשים לגישה, כגון בלוטות לימפה, pleura, ואזורים האוסטארטיקולריות1. כך, הליכים פולשניים להשגת דגימות קליניות נאותה, מה שהופך את אישור בקטיולוגי מסוכן וקשה, הם חיוניים2,3,4.

בדיקות לזיהוי נוגדנים זמין מסחרית ETB אינם אמינים עבור זיהוי קליני בגלל מגוון רחב של רגישות (0.00-1.00) וספציפיות (0.59-1.00) עבור כל האתרים הריאתי בשילוב5. חיסוני מקושר אנזים (elispot) בחני-γ, התרבות פילטרט חלבון (CFP), ואת היעד מוקדם אנטיגניים הסוד (esat) שימשו לאבחון TB הסמויה פעיל. עם זאת, התוצאות משתנות בין אתרי מחלות שונים לאבחון etb6,7,8. בנוסף, העור PPD (מטוהר חלבון נגזרות) ו בדיקת קוונטיפט-TB סיפקה לעתים קרובות תוצאות שליליות שווא9. בדיקת קוונטיפלון-TB-2g הוא שלמות הדם החיסונית החיסון המערכת, אשר אינו דורש דגימה מן האיבר המושפע וזה עשוי להיות כלי אבחון אלטרנטיבי6,10,11. שיטות אבחון אחרות המשמשות בדרך כלל עבור TB דלקת קרום העין, כגון תגובת שרשרת פולימראז, עדיין רגישות מדי כדי למנוע בביטחון אבחון קליני12,13. אלה בדיקות קונבנציונליות להפגין מספיק מידע אבחוני כדי לגלות את האתר זיהום חוץ לריאות. לפיכך, נדרשות הבדיקות הקליניות של האבחון החדשני.

הדמיה מולקולרית שואפת לעצב כלים חדשניים שיכולים להקרין ישירות מטרות מולקולריות ספציפיות של תהליכי מחלות ב vivo14,15. Superמגנטית תחמוצת ברזל (spio), הסוכן הניגוד T2 משוקלל nmr, יכול לשפר באופן משמעותי את הספציפיות והרגישות של תהודה מגנטית (MR) הדמיה (MRI)16,17. זה חדש הדמיה תפקודית מודאליות יכול בדיוק לשרטט שינויי רקמות ברמה המולקולרית באמצעות אינטראקציות ligand-הקולטן. במחקר זה, הדמיה מולקולרית חדש בדיקה, הכוללת חלקיקי SPIO, היה מסונתז למשלים עם נוגדן Mtb פני השטח (MtbsAb) עבור אבחון ETB. Spio nanoprobes הם מינימלית פולשנית לרקמות וגופים במבחן18,19. יתר על כן, nanoprobes אלה יכולים להדגים תמונות מדויקות של MR בריכוזים נמוכים בשל התכונות פאראמגנטיות שלהם. בנוסף, SPIO nanoprobes מופיעות לפחות תגובות אלרגיות משום שנוכחותם של יוני ברזל היא חלק מהפיזיולוגיה הנורמלית. כאן, הרגישות והספציפיות של SPIO-MtbsAb nanoprobes מיקוד ETB הוערכו הן תא והן דגמי בעלי חיים. התוצאות הראו כי הnanoprobes היו ישימים כמו סוכני הדמיה ultrasensitive עבור אבחון ETB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקול בנוגע לניסוי בעלי חיים עוקב אחר הליכי ההפעלה הסטנדרטיים של גידול בעלי חיים במעבדה בהתאם למוסדות הלאומיים של הנחיות בריאות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה (8 ה Edition, 2011) והוא מאושר על ידי ה טיפול בבעלי חיים מוסדיים והוועדה לשימוש.

1. הסינתזה של SPIO ננו-חלקיק

  1. הכנת דטרן מצופה תחמוצת ברזל מגנטי חלקיקי על ידי ערבוב נמרצות תערובת של תוספי T-40 (5 מ ל; 50% w/w) ו מימית פוריות3× 6h2o (0.45 g; 2.77 mmol) ו-ליטר2×4h 2o (0.32 g; 2.52 mmol) פתרונות בטמפרטורת החדר.
  2. הוסף את NH4הו (10 מ"ל; 7.5% v/v) במהירות.
  3. עוד לערבב את ההשעיה השחורה עבור 1 h; לאחר מכן, צנטריפוגה ב 17,300 x g עבור 10 דקות ולאחר מכן להסיר את האגרגטים.
  4. הפרד את מוצרי spio הסופי מ-תוספי T-40 בלתי מאוגד על-ידי ג'ל סינון כרומטוגרפיה20.
  5. טען את תערובת התגובה (נפח כולל = 5 מ ל) לתוך 2.5 ס מ × 33 ס"מ עמודה ו elute עם פתרון מאגר המכיל 0.1 M Na אצטט ו0.15 M הנאל ב-pH 7.0.
  6. לאסוף את הברזל מטוהרים דטרן מצופה תחמוצת ברזל חלקיקים מגנטיים בנפח הריק והוא מקבל את הטור משחרל ברזל תוספי ב 330 ו 490 nm באמצעות חומצה הידרוכלורית ו-פנול/חומצה גופרתית שיטות20, בהתאמה.

2. הסינתזה של SPIO-MtbsAb

  1. לסנתז את spio-מצוכן באמצעות שיטות שדווחו בעבר21,22.
  2. לסנתז את ספיאו-אדבה-סוהילי-סואדאין (SA).
    1. מערבבים פתרון אלקליין (5 מ NaOH; 10 mL)) של SPIO-EDBE ו-SA (1 גרם; 10 μm) בטמפרטורת החדר עבור 24 שעות.
    2. Dialyze הפתרון עם 20 שינויים של 2 L של מים מזוקקים באמצעות צינורות מולקולריים נקבובי ממברנה (12000-14000 MW החיתוך). 6 h עבור כל שינוי.
  3. לבסוף, להוסיף 100 μL של SPIO-EDBE-SA (4 מ"ג/mL של Fe) כדי 400 μL של 4.5 mg/mL MtbsAb כדי לסנתז SPIO-MtbsAb באמצעות 1-hydroxybenzotriazole ו (בbenzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate כזרזים ומערבבים את הפתרון בטמפרטורת החדר
  4. לבסוף, הפרד את הפתרונות מהנוגדן הלא מאוגד דרך כרומטוגרפיה של סינון ג'ל.
  5. לטעון את תערובת התגובה (5 מ ל) על 2.5 ס מ × 33 ס"מ עמודה ו-elute באמצעות מאגר PBS. אשר Ab – ננו-חלקיק מורכבים (כלומר, nanoprobe) באמצעות חומצות חלבון בניה שיטת החומציות ערכת23.

3. התבוננות במבנה החלקיקים ומדידת רמת ההרפיה

  1. לבחון את גודל החלקיקים הממוצע, מורפולוגיה, והפצת גודל באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני שידור במתח של 100 kV.
    1. Drop-הטל את הפיזור מורכב על רשת נחושת 200-mesh ואוויר יבש בטמפרטורת החדר לפני טעינת אותו על המיקרוסקופ.
  2. למדוד את ערכי זמן ההרפיה (t1 ו- t2) של nanoprobes באמצעות מדידת nmr במהירות 20 מגה-הרץ ו 37.0 ° c ± 0.1 ° c.
    1. כיול את מדידת ההרגעת לפני כל מדידה.
    2. תעד את ערכי r1 ו- r2 מתוך שמונה נקודות הנתונים שנוצרו באמצעות היפוך-שחזור ורצף הדופק קאר-פורסל-מייבום-גיל, בהתאמה, כדי לקבוע r1 ו- r2 relaxivities20.

4. הדמיית תאים

  1. לטפח את מונוציטים האדם THP-1 ב RPMI 1640 עם הסרום העוברי 10% העובר, 50 μg/mL ג'אמיאמסינ ' סולפט, 100 יחידות/מml פניצילין G נתרן, 100 μg של סטרפטומיצין סולפט, ו-0.25 μg/mL fungizone 5% שיתוף2 חממה ב 37 ° c.
  2. שיטת המשחק (2 ממ) עם 106 המושבה ויוצרים יחידות (cfu) של בואנטי bcg מראש עם 1 × 107 מונוציטים מופעל בצינורות מיקרוצנטריפוגה (1 מ ל) בחממה 5% CO2 ב 37 ° c עבור 1 h.
  3. צינורות צנטריפוגה ב 200 x g ולהיפטר supernatant. התמוססות מחדש את הפלטות במדיום (200 μL).
  4. סריקת הדגימות באמצעות רצף מהיר של מעבר הדרגתי של ההד (זמן חזרה (TR) = 500; זמן ההד (TE) = 20; להעיף זווית = 10 °) דרך 3.0-T-MRI כדי לקבוע את הספציפיות של nanoprobe ורגישות21,22.

5. BCG (באקלוס מקרתגו-גירין) החיסון

  1. ליצור מחדש את החיסון ליאופאו מלאי בקטריאלי במדיום של סאוטון ולאחר מכן לדלל את המניה עם תמיסת מלח עד התפזרו כראוי כפי שתוארה בעבר24.
  2. האיחסן זן חי מחליש של M. סטרפטקוקוס bcg, המתקבל adimmune (טאיפיי, טייוואן) (מאמץ קונוט; ImmuCyst אונטיס, פסטר מועלם) בנפח של 0.1 mL/עכבר (כלומר, 107 cfu) הפנים לתוך העור שמאלה או ימינה השכמה של עכברים, כפי שמתואר בעבר23. הכנס תמיסת מלח לעכברים כפקד שלילי. עקוב אחר בעלי חיים מדי יום לאחר החיסון BCG.
  3. להקריב בעלי חיים 1 חודש לאחר חיידקים החיסון באמצעות המתת-תחמוצת הפחמן דו חמצני. . לקצור את הרקמה מהאתר הפנימי תקן את הרקמה בתוך 10% פורמלין ולהטביע פרפין עבור סעיפים סידוריים ב 5-10 μm. מקטעים רקמה עם המטאוקסילין/אאוזין ו-יציבת חומצה הכתמים על חיידקים מהירים של חומצה מהירה24 ועם כחול ברלין עבור ferric ברזל25.

6. ב-MRI vivo

  1. הכנס קטמין (80 מ"ג/ק"ג של משקל הגוף) ו xylazine (12 מ"ג/ק"ג משקל הגוף) תת-עורי לתוך עכברים עבור הרדמה לבעלי חיים.
  2. הכנס את הבדיקות של SPIO-TbsAb (2 nmol/200 μL) לתוך ורידים בזנב של עכברים. MR. עכברים תמונה לפני ומייד לאחר הזרקת בדיקה ולאחר מכן כל 5 דקות עבור 30 דקות כדי לרכוש T2 משוקלל מהיר תמונות ספין-הד (TR = 3000; TE = 90; שדה תצוגה = 8).
  3. לנתח את כל התמונות MR באמצעות עוצמת אות (SI), מדידה של אזורים מוגדרים של עניין במיקומים דומים של מרכז גרגירומה Mtb ואת השריר האחורי סמוך לאזור גרגירומי.
  4. חישוב שיפורי אותות יחסיים באמצעות מדידת SI לפני (שליטה בקרה) ו-0-3 h לאחר הזרקה של סוכני הניגודיות באמצעות הנוסחה

    [(SIpost-Sipost)/sipost] × 100

    כאשר sipre הוא si של הנגע על הסריקה מוגברת מראש sipre הוא si של הנגע על סריקה לאחר משופרת21,22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SPIO-MtbsAb nanoprobe סינתזה ואפיון
חלקיקי SPIO תוכננו למשלים עם MtbsAb. תוספי התייצב על פני השטח של חלקיקי spio היה מקושר על ידי אפיכלורוהידרסין. חלקיקי spio שולבו לאחר מכן עם edbe כדי להפעיל קבוצות העיקרי של האמין העיקריים בקצוות תוספי. לאחר מכן הייתה מצומנת ליצור את SPIO-EDBE-SA. SPIO-MtbsAb nanoprobes הוקמה בשלב הסופי באמצעות הקונקטורים של MtbsAb עם SPIO-EDBE-SA בנוכחות סוכני צימוד. תמונת TEM של SPIO-MtbsAb nanoprobes (איור 1) ממחיש כי spio-mtbsab nanoprobes היה מראה מפוזר היטב. הגודל הממוצע של SPIO-MtbsAb nanoprobe הליבה היה 3.8 ± 0.4 ננומטר (200 החלקיקים חישוב).

בתמיסה מימית, הערכים השיבועיים, r1 ו- r2, של nanoprobes היו 23 ± 3 ו 151 ± 8 מ"מ-1s-1, בהתאמה, ב -20 מגה-הרץ ו 37.0 ° c ± 0.1 ° c. יחס r1/r2 של spio-mtbsab Nanoprobes היה דומה לזה של resovist יסט; עם זאת, r1 ו- r2 של Resovist יסט (26 ו 164 mM-1s-1, בהתאמה) היו קצת יותר גבוה מאלה של spio-mtbsab nanoprobes.

לאפיון והדמיה nanoprobe מחוץ למבחנה
הראשון, גילינו M. סטרפטקוקוס bcg, חיידקים מהירים חומצה, באמצעות מכתים זיגהל-יציבת חומצה (איור 2א). החיידק היה מבודד ולאחר מכן מתורבת עם הבדיקות המכילות ברזל ferric, הניתן לזיהוי דרך ברלין כחול מכתים (איור 2ב). Mtb מידת המיקוד של SPIO-MtbsAb nanoprobe נקבע באמצעות MRI משוקלל-T2; שיפור שלילי היה בפרופורציה לכמות הרגשים המחוברים לתא חיידקי. הירידה ב-SI בנוכחות הnanoprobes התרחשה בצורה תלוית ריכוז (איור 2ג). ב 2, 1, ו 0.5 מ"מ, nanoprobes מצועם Mtb הציגו SIs של 97.67 ± 3.05, 131.67 ± 4.51, ו 257.33 ± 5.03, בהתאמה, כל גבוה יותר SI של 90.75 ± 2.47 עבור 1 מ"מ מnanoprobe. לעומת PBS (SI = 1073.43 ± 13.62), כמעט ללא הפחתת אות צוין בקבוצה TB בלבד (SI = 957.33 ± 12.53). כך, הגששים SPIO ממוקדות באופן ספציפי Mtb לי; יתר על כן, על תמונות משופרות MR, SI ירד עם עלייה בכמות של חלקיקי SPIO.

באופן דומה, הפחתת SI על תמונות MR משופרת צוינו 1 h לאחר culturing של THP-1 מונוציטים עם nanoprobes. ירידה משמעותית SI של הקבוצה TB צוין כאשר 1 מ"מ (SI = 225.33 ± 8.58) ו 2 mM (SI = 104 ± 2.16) ריכוזי הnanoprobes היו מועסקים בהשוואה לקבוצות מנוהל PBS בלבד (SI = 1005.33 ± 16.74) או לא מנוהל עם nanopr adobe (SI = 991 ± 8.98). הפחתת MRI SI בקבוצות Mtb עבור 1 ו 2 mM nanoprobes היה דומה לזה חיובי 1 מ"מ nanoprobe קבוצה לבדה (SI = 112.33 ± 3.68). על פי התוצאות הנ ל, SPIO-MtbsAb nanoprobes יכול לסייע בניטור המופעל nanoprobe THP-1 סחר מונוציט.

ב vivo SPIO-MtbsAb nanoprobe הדמיה
לאחר דימות התא, קבענו את היעילות של vivo MRI עבור ETB. SPIO-MtbsAb nanoprobes היו מוזרק באופן מידי לעכברים נגועים Mtb. אות מר ברור לזיהוי בבירור צוין באזור Mtb גרגירומי 0.5 h לאחר ההזרקה; עם זאת, SI הגבוהה ביותר לרקע נצפתה לאחר 1 h של הזרקה. הפחתה משמעותית ב-MR איתות צוין באזור Mtb גרגירומי (איור 3). SI נמדד לפני (SIpre) ואחרי (Sipre) הזרקת סוכן ניגודיות. שעה אחת לאחר הזרקת בדיקה, שיפור משוקלל T2 של הפחתת אות באזורים Mtb גרקהאוס (איור 3B) היה כ 14-קיפול גבוה יותר מאשר באתרי הבקרה (איור 3A;-1.68% ± 1.32% ו-23.43% ± 7.24%; p < 0.001).

הערכה היסטולוגית ואימונוהיסטובכימיה של SPIO-MtbsAb nanoprobes
גרגירומה תת עורית פותחה 1 חודש לאחר זיהום ב C57BL/6 עכברים. דם חדש vascularization היה ציין בתוך נגעים אלה יחד עם לימפוציט ו אפיתל-מקרופאג אגרגטים. הגרגירומה המאורגן התבגר בהדרגתיות (איור 4א). המתאם של נגעים TB עם SPIO-MtbsAb MR האותות נקבע עוד באמצעות התגובה האימונוהיסטוכימיה של אנטיגן פני השטח Mtb עם anti-MtbsAb. חיובי MtbsAb הביטוי נחשף באזורים הגרגירומי (איור 4ב), עם חומצה מהירה בקרה מכתים חיובי באתר הנגע (איור 4ג). ברלין כחול, כתם חיובי ברזל, שימש כדי לקבוע את רגישות הבדיקות של Mtb. ברלין כחול חיובי SPIO בדיקה נמצאה באותו מיקום כמו MtbsAb (איור 4ד). כל הזוגות המותאמים לשפות אחרות הוצגו באיור 4א-ד.

Figure 1
איור 1: משמעות גודל הליבה של SPIO-MtbsAb nanoprobes ב TEM. הגודל הממוצע של הליבה SPIO-MtbsAb nanoprobe היה 3.8 ± 0.4 ננומטר, נמדד באמצעות ניתוח תמונה TEM (200 החלקיקים חישוב). סרגל קנה מידה = 15 ננומטר. דמות זו שונתה ממחקר הקודם שלנו26. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: באפיון חוץ גופית של Spio-MtbsAb nanoprobe. בדיקת חומצה מהירה מזוהה באמצעות (א) זיגהל-יציבת חומצה כתמים ו (ב) הקוניוגציה של ברזל ferric של הnanoprobe לחיידקים שזוהו באמצעות כתמים בברלין כחול. (ג) T2-MRI משוקלל הצגת שיפור שלילי לאחר spio-MtbsAb nanoprobes מודבטים עם Mtb. חיסול מינון SI המתרחשים-בהתלהבות לאחר השילוב של Nanoprobes עם Mtb: (1) 90.75 ± 2.47 (1.0 מ"מ בדיקה); (2) 97.67 ± 3.05 (Mtb + 2.0 מ"מ בדיקה); (3) 131.67 ± 4.51 (Mtb + 1.0 מ"מ בדיקה); (4) 257.33 ± 5.03 (Mtb + 0.5 מ"מ בדיקה); (5) 957.33 ± 12.53 (Mtb + 0 מ"מ בדיקה); (6) 1073.43 ± 13.62 (PBS). לא צוין הפחתת אות שנרשמה בקבוצת הביקורת של ה-PBS. (ד) מינון-שיפור שלילי תלוי thp-1 מונוציטים 1 h לאחר הדגירה עם nanoprobes. סרגל הקנה מידה (ג) ו-(ד) הם 5 מ"מ. דמות זו שונתה ממחקר הקודם שלנו26. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ב vivo spio-MtbsAb nanoprobes בנגעים etb תת עורית של C57BL/6 עכבר. (א) שליטהו (ב) Mtb משטחי גרגירואיד. הפחתה משמעותית של 14 מקפלים ב-MR איתות נמצא באזורים גרגירומי Mtb בהשוואה לאזורי השליטה 1 h לאחר הממשל בדיקה (-1.68% ± 1.32% vs.-23.43% ± 7.24%, p < 0.001). התוצאות מתקבלות כאמצעי ± SDs. השוואות סטטיסטיות השתמשו במבחני t דו-זנבי של סטודנט. p < 0.05 נחשב למשמעותי. דמות זו שונתה ממחקר הקודם שלנו26. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: יחסי היסטולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, חומצה מהירה וכתמים בברלין. היסטולוגיה של האזורים Mtb גרגירומי בעיקר להפגין לימפוציטים ומקרופאאידים אפיתל. Neovascularization וצבירה שופע של לימפוציטים ומקרופאגים אפיתל נצפתה אלה נגעים. (א) גררומותמאורגנתלהופיע להתפתח בהדרגתיות. (ב) אימונוהיסטויוכימיים מכתים הפגנת הבעה של מניות הביטוי בנגעים הגרגירומי, ואילו (ג) חומצה מהירה מפוזרים בתוך אותם אזורים. (ד) ברלין מכתים כחול spio רגשים מצויים באזורים MtbsAb המותאמות לשפות אחרות. ברלין כתמים כחול עבור ברזל ferric מדגים בדיקה בניין כדי Mtb. סרגל הסרגלים הם 100 μm. דמות זו שונתה ממחקר הקודם שלנו26. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בדומה למחקרים רלוונטיים, הממצאים שלנו לגבי spio-mtbsab nanoprobes הפגינו ספציפיות משמעותית עבור Mtb27,28. הMtb גרגירומה התת עורית נמצא 1 חודש לאחר הזרקת TB בדגמי העכבר. ממצאי היסטולוגיה של שחפת החומרים הטיפוסיים כללו הסתננות לימפוציטים, נוכחות של מקרופאגים אפיתל, ו neovascularization. חומצת באקל מהירה היו מפוזרים בנגעים בשחפת, מחזק את הממצאים של MtbsAb ממצאים אימונוהיסטוכימיה. זה הצביע על התגובה החיסונית בין Mtb הפנים אנטיגן ו-MtbsAb. ברלין כחול הדגיש את אותם האזורים עם MtbsAb, מחזק את הקשר הספציפיות של הבדיקות עבור הקוניוגציה עם חומצה מהירה Mtb.

בעיקר, היקף השיפור בניגוד שלילי ב-MRI עבור Mtb ו monocytic THP1 תאים היה יחסי הריכוז SPIO-MtbsAb nanoprobe. כאשר עכברים נושאת Mtb omas היו מנוהל SPIO-MtbsAb nanoprobes, 14-מקפלים הפחתת האות באתר הגרגירומי היה ציין ב-T2 תמונות משוקלל MR לעומת אתר מנוגדות עם הזרקת PBS. הדבר מצביע על הצטברות משמעותית של סוכן הניגודיות. התוצאות להפגין אפשרות להשגת מיקוד ספציפי של סוכן ניגודיות, אשר יכול להפחית את דרישת המינון לאבחון קליני.

הממצאים שלנו מצביעים על כך nanoprobes אלה לצבור נפח לזיהוי בנגעים Mtb גרגירומי. תוצאות אלה ניתן אישר על ידי פיתוח SPIO nanoprobe באמצעות anti-hMtbsAb. כמו ליבת תחמוצת הברזל המגנטי של SPIO הוחל כדי לגרום לקיצור T2 בסוכני בניגוד MRI, הממצאים מצביעים על גישה מעשית ולא פולשנית כדי לזהות התנהגויות תא דומה עבור יישומים אבחון קליני.

כאן אנו מספקים את הפרוטוקול המורכב משני חלקים: סעיפים 4 עד 6 הם הדמיה של תאים ובעלי חיים. הטכניקות מכסות את הטיפוח-תרגול של התאים, ניסויים בבעלי חיים ודימות אופטי. סעיפים 1 עד 3 הם סינתזות בדיקה. חלק מהשלבים הקריטיים יסייעו לשכפל את הניסוי. השלב הקריטי של הסינתזה Spio ננו-חלקיק היא להכין מצופה דקטרן תחמוצת ברזל מגנטית חלקיקים; זה חיוני למהומה נמרצות ולערבב לחלוטין את תוספי T-40, מימית בגובה3-6h2o,ו-4h 2-4פתרונות o פתרוןבטמפרטורת החדר. הצעד הקריטי עבור סעיף 2, spio-MtbsAb סינתזה, הוא מעלה מעלה מ TBSAB כדי SPIO-EDBE-SA כדי לסנתז את Spio-mtbsab. כדי לבחור את הזרזים המתאימים ולערבב כראוי את הפתרון בטמפרטורת החדר הם קריטיים גם. והצעד הקריטי לסעיף 3, התבוננות במבנה החלקיקים ומדידת רמת ההרפיה, היא לכייל את מדידת ההרגעה לפני כל מדידה. כדי לחשב במדויק את גודל הבדיקות, כיול של מדידת הזמן הינו קריטי גם כן.

במחקר זה, M. סטרפטקוקוס bcg וארנב anti-Mtb שימשו. פעילות הצלב של מקורות שור וארנבת נחשב מתון, למרות הנתונים הוכיחו כי mtbsab-מצועם מעלה מעלה חשף אינטראקציות חזקות עם M. סטרפטקוקוס bcg. הממצא שלנו הציע כי SPIO nanoprobes מטרה TB באופן ספציפי. הדגירה של חיידקים nanoprobe ו Mtb הראו מינון שלילי באופן השיפור בצורה מתונה, בעוד הירידה בשיפור שנצפתה עבור SPIO nanoprobes ב-MRI היה מתואם עם קיומו של חלקיקי SPIO. בהתבסס על הנתונים שלנו, מחקר נוסף כדי לחקור גישות האנטי נוגדן אפשרי כדי לשפר את הספציפיות של nanoprobe יהיה מבורך.

מחקרים קודמים להדגים כי spio מראה מינימלי הרעלת ציטומל מבלי לשנות את פעילות התא בריכוז המשמש במחקר זה29,30. בהסכם עם מחקר קודם, התוצאות שלנו הפגינו השפעה מינימלית של SPIO nanoprobes כדי THP-1 תאים. THP-1 תאים היו מודבטים עם SPIO nanoprobes עם חיידקים הקוניוגציה 1 שעה. SI הציג ירידה משמעותית בקבוצות Mtb עם ריכוז של 1 מ"מ או 2 מ"מ nanoprobes, השוואה לקבוצת שליטה ללא nanoprobe טיפול או PBS לבד. התוצאה תומכת בטיחות של SPIO nanoprobe, ומחקרים נוספים החלת המון חיידקים אחרים כדי לאמת את הרגישות של הnanoprobe הוא בברכה.

מגבלה אחת של המחקר שלנו היה שאנחנו לא לכמת את הביוהתפלגות של SPIO-MtbsAb nanoprobe בעכברים. יתר על כן, אנחנו לא לחקור את intravascular החיים ואת התצהיר הכבד של nanoprobe, אשר עשוי לשנות את הזמן חשיפת של הגששים כדי THP-1 תאים ממוקם על נגעים Mtb. מחקר נוסף על ההתדרדרות ביולוגית מוצדקת. יתר על כן, MRI לא הצליח להבדיל אם SPIO nanoprobes יכול במיוחד לאגד חיידקים או מונוציטים או אם הבדיקות האלה היו מידי.

לסיכום, פיתחנו פרוטוקול ברור וריאלי כדי להכין ולאפיין את SPIO-MtbsAb nanoprobes תואם ביולוגי. הnanoprobes האלה הם הידרופיפילית ולהתפזר היטב תחת תנאים פיזיולוגיים; הם מינימלית ציטוטוקסיים בריכוזים נמוכים. גם, אלה SPIO-MtbsAb nanoprobes לאפשר פילוח וזיהוי של זיהום Mtb, כפי שניתן להדגים על ידי מבחנה שלנו במחקרים vivo. כך, SPIO-MtbsAb nanoprobes יכול להיות מיושם כסוכני ניגודיות MRI עבור זיהוי ETB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לאף אחד מהמחברים אין עניין קנייני בחומרים שנבדקו במחקר זה.

Acknowledgments

המחברים מודים על התמיכה הפיננסית של משרד הכלכלה טייוואן (מענקים המועצה לבטחון לאומי-101-2120-M-038-001, רוב 104-2622-B-038-007, רוב 105-2622-B-038-004) כדי לבצע עבודת מחקר זו. כתב היד הזה נערך על ידי העריכה האקדמית וולאס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Sigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazole Sigma-Aldrich
dextran(T-40) GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrate Fluka
ferrous chloride tetrahydrate Fluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCG Pasteur Mérieux Connaught strain; ImmuCyst Aventis
MRI GE medical Systems 3.0-T, Signa
NH4OH Fluka
NMR relaxometer Bruker NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300 GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25 GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off Spectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb Acris Antibodies GmbH BP2027
transmission electron microscope JEOL JEM-2000 EX II

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Small, P. M., et al. Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection. New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).
  2. Alvarez, S., McCabe, W. R. Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review of experience at Boston City and other hospitals. Medicine. 63, Baltimore. 25-55 (1984).
  3. Ozbay, B., Uzun, K. Extrapulmonary tuberculosis in high prevalence of tuberculosis and low prevalence of HIV. Clinics in Chest Medicine. 23, 351-354 (2002).
  4. Ebdrup, L., Storgaard, M., Jensen-Fangel, S., Obel, N. Ten years of extrapulmonary tuberculosis in a Danish university clinic. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 244-246 (2003).
  5. Steingart, K. R., et al. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Postgraduate Medical Journal. 83, 705-712 (2007).
  6. Liao, C. H., et al. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease. Journal of Infection. 59, 402-408 (2009).
  7. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis. Archives of Internal Medicine. 167, 2255-2259 (2007).
  8. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. The American Journal of Medicine. 122, 189-195 (2009).
  9. Pai, M., Zwerling, A., Menzies, D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Annals of Internal Medicine. 149, 177-184 (2008).
  10. Kobashi, Y., et al. Clinical utility of a T cell-based assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Respirology. 14, 276-281 (2009).
  11. Paluch-Oles, J., Magrys, A., Kot, E., Koziol-Montewka, M. Rapid identification of tuberculosis epididymo-orchitis by INNO-LiPA Rif TB and QuantiFERON-TB Gold In Tube tests: case report. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 66, 314-317 (2010).
  12. Kaneko, K., Onodera, O., Miyatake, T., Tsuji, S. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (PCR). Neurology. 40, 1617 (1990).
  13. Bhigjee, A. I., et al. Diagnosis of tuberculous meningitis: clinical and laboratory parameters. International Journal of Infectious Diseases. 11, 348-354 (2007).
  14. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. Suppl 1-7 (2003).
  15. Weissleder, R., Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology. 219, 316-333 (2001).
  16. Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
  17. Talelli, M., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated in biodegradable thermosensitive polymeric micelles: toward a targeted nanomedicine suitable for image-guided drug delivery. Langmuir. 25, 2060-2067 (2009).
  18. Cho, W. S., et al. Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging. Toxicology and Applied Pharmacology. 106-115 (2009).
  19. Mahmoudi, M., Simchi, A., Milani, A. S., Stroeve, P. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, 510-518 (2009).
  20. Chen, T. J., et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87, 165-175 (2008).
  21. Chen, T. J., et al. Targeted Herceptin-dextran iron oxide nanoparticles for noninvasive imaging of HER2/neu receptors using MRI. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 14, 253-260 (2009).
  22. Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175, 494-498 (1990).
  23. Wang, J., Wakeham, J., Harkness, R., Xing, Z. Macrophages are a significant source of type 1 cytokines during mycobacterial infection. Journal of Clinical Investigation. 103, 1023-1029 (1999).
  24. Angra, P., Ridderhof, J., Smithwick, R. Comparison of two different strengths of carbol fuchsin in Ziehl-Neelsen staining for detecting acid-fast bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 41, 3459 (2003).
  25. Woods, A. E., Ellis, R. Laboratory Histopathology- A Complete Reference. 1st edn. Churchill Livingstone. 6-11 (1994).
  26. Lee, C. N., et al. Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles for use in extrapulmonary tuberculosis diagnosis. Clinical Microbiology and Infection. 18, 149-157 (2012).
  27. Lee, H., Yoon, T. J., Weissleder, R. Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5657-5660 (2009).
  28. Fan, Z., et al. Popcorn-shaped magnetic core-plasmonic shell multifunctional nanoparticles for the targeted magnetic separation and enrichment, label-free SERS imaging, and photothermal destruction of multidrug-resistant bacteria. Chemistry. 19, 2839-2847 (2013).
  29. Nishie, A., et al. In vitro imaging of human monocytic cellular activity using superparamagnetic iron oxide. Computerized Medical Imaging and Graphics. 31, 638-642 (2007).
  30. von Zur Muhlen, C., et al. Superparamagnetic iron oxide binding and uptake as imaged by magnetic resonance is mediated by the integrin receptor Mac-1 (CD11b/CD18): implications on imaging of atherosclerotic plaques. Atherosclerosis. 193, 102-111 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics